位置感:转录组学确定了赤霞珠浆果果皮成熟后期的环境特征

背景

葡萄浆果的成熟受气候的影响，气候是一个地方“风土”的主要组成部分。光照和温度是影响葡萄果实发育和果实代谢产物组成的主要因素。

结果

为了更好地理解“位置”对浆果成熟后期转录丰度的影响，在波尔多和雷诺种植的赤霞珠浆果在相似的糖水平(19 - 26°Brix(总可溶性固形物))进行了比较。里诺的白天温度更高，晚上温度更低。在被认为最适合收获的成熟度水平上，波尔多浆果的白度比雷诺低。通过RNA-Seq分析，在波尔多和雷诺葡萄皮22°Brix温度下鉴定出5528个差异表达基因。对所有4个°Brix水平的所有表达转录本的加权基因共表达网络分析表明，大多数(75%)的转录本表达在两个位置之间存在显著差异。常见转录集的主要基因本体分类为翻译、光合、DNA代谢和分解代谢。22°Brix差异表达基因的主要基因本体分类包括对刺激的响应、生物合成和对胁迫的响应。一些差异表达基因编码萜烯合成酶、细胞壁酶、激酶、转运体、转录因子和光受体。波尔多地区大部分生物钟基因转录丰度较高。波尔多浆果的转录丰度较高，与种子休眠、光照、生长素、乙烯信号、白粉病感染、苯丙素、类胡萝卜素和萜类代谢相关的差异表达基因，而雷诺浆果的转录丰度较高，与水分剥夺、低温反应、ABA信号和铁稳态有关的差异表达基因。

结论

果实成熟时的转录丰度呈高度动态变化。RNA-Seq分析确定了一个较小的(25%)的共同核心成熟基因集，似乎不依赖于砧木、葡萄园管理、植物年龄、土壤和气候条件。这两个位置的大部分基因表达不同，可能与环境条件的多种差异有关，这些环境条件可能影响了这两个位置的浆果;其中一些基因可能会被酿酒人以不同的方式控制，以调整最终的浆果成分，达到预期的结果。

葡萄葡萄藤起源于大约6500万年前的欧亚大陆，至少在过去8000年里，它的果实被碾碎用来酿酒[1］．葡萄藤现在生长在世界各地的许多环境中。

葡萄浆果的发育是一个复杂的过程，涉及三个发育阶段和多种激素[2，3.］．许多涉及风味和香气的化合物是在成熟后期合成、共轭或分解的。这些化合物大多存在于浆果的表皮中，似乎是在浆果发育的最后阶段产生的[4，5，6］．

香气和风味是葡萄酒的重要感官组成部分。它们来源于葡萄中的多种化合物，包括葡萄中的重要挥发性化合物以及葡萄发酵过程中的酵母代谢[5，6］．每个葡萄品种都会产生一套独特的挥发性和风味化合物，其浓度不同，代表其葡萄酒类型或典型的品种特征[6］．酯类和萜烯类是挥发性的化合物，它们在很大程度上造成了葡萄酒的果味和花香[5，6］．酯主要是在酵母发酵过程中从葡萄衍生产品(如脂肪醇和醛)中产生的[7，8］．葡萄脂氧合酶被认为为合成水果香气提供脂肪酸的六种碳前体，乙酸己酯[8在葡萄酒发酵过程中，在酵母中。萜烯主要来源于葡萄，有游离和结合(糖基化)两种形式。植物脂肪酸和萜类代谢途径对环境都非常敏感[9，10，11，12，13］．

气候对浆果的发育和组成有很大的影响[14，15，16］．除了葡萄遗传因素外，其他因素也可能影响代谢产物组成，包括当地的葡萄浆果微生物组[17，土壤类型[15和根茎[18，19，20.，21，22］．虽然有证据表明砧木可以影响果实成分和转录丰度，但相对于其他环境因素，这种影响似乎是次要的[18，19，21］．葡萄种植者使用的许多栽培措施可能直接或间接地影响葡萄藤感知的环境(行方向、种植密度、修剪、叶片去除等)。温度和光是“风土”的主要贡献者。风土指的是环境对葡萄的影响，以及它如何使葡萄酒具有鲜明的特征[2，14，15，23］．风土这一术语包括生物和非生物因素、土壤环境以及葡萄栽培方法。在目前的工作中，我们将使用“地点”这个术语来解决上述所有问题，除了葡萄栽培实践。

最近，一种转录组学方法被用于阐明浆果发育后期的共同基因亚网络，此时葡萄通常是在其最高成熟期收获的[4］．与成熟相关的一个主要亚网络涉及自噬、分解代谢、RNA剪接、蛋白质水解、染色体组织和生物钟。本研究建立了光感应与生理时钟相结合的综合模型，强调光环境对浆果发育的重要性。在这篇报告中，为了更好地了解赤霞珠浆果果皮中的基因表达在多大程度上受环境影响，我们测试了一个假设，即赤霞珠浆果成熟后期的基因表达在两个非常不同的地点之间存在显著差异:一个在美国NV的雷诺(RNO)，另一个在法国波尔多(BOD)。分析揭示了一组核心基因，它们不依赖于地理位置、气候、葡萄园管理、嫁接和土壤特性。此外，分析还揭示了两个位点之间表达差异的关键基因。其中一些差异与温度和其他环境因素的影响有关，已知这些环境因素会影响芳香物质和其他质量性状相关途径。许多基因家族存在差异表达，这可能为葡萄种植者调节浆果成分提供有用的杠杆。其中，这些家族包含氨基酸和苯丙素代谢以及香气和风味合成的基因。

“场所感”的背景数据

为了验证两个不同环境条件的葡萄果实成熟后期转录丰度存在差异的假设，我们比较了葡萄果实果皮中BOD和RNO转录丰度。葡萄园最初于2004年在RNO种植，2009年在BOD种植。RNO藤蔓在自己根上生长，BOD藤蔓嫁接在SO4砧木上。两个地点都采用了垂直拍摄定位格架设计。这两个地方有许多不同的环境变量。BOD比RNO位于略偏北纬的位置。这导致了收割开始时按需耕种天数略长，收割结束时略短1)．在最终采收期，RNO和BOD的日长相差约30 min。

RNO的月平均最高气温高于BOD，但9月最低气温低于BOD (Table1)．因此，在收获期，RNO的平均日昼夜温差较大，为20°C，而BOD的平均日昼夜温差较小，为10°C。RNO的白天温度比BOD高约6°C，夜间温度比BOD低约4°C。

RNO葡萄园的位置要比BOD葡萄园的位置干燥得多(表1)．9月RNO月降水量为2.03 mm, BOD月降水量为65.5 mm;RNO和BOD的平均相对湿度分别为34和74%。RNO葡萄园的土壤为深砂壤土，pH值为6.7;BOD葡萄园为砾石土，pH为6.2。在这两个地点的藤上或藤内均未观察到病原菌、营养缺乏或中毒症状。

转录组

对2012年9月在RNO采收的赤霞珠葡萄的转录谱分析曾有过报道[4］．研究人员立即将单个浆果的果皮从整个浆果中分离出来，并测定浆果中主要由糖组成的总可溶性固形物(Brix°)水平。赤霞珠果皮从BOD以类似的方式收获RNO浆果的果皮。按需种植的莓皮采收时间为2013年9月中旬至10月第一周1)．分离浆果皮，用与RNO相同的方法分析Brix°。葡萄的BOD(19.5 - 22.5°Brix)比RNO(20 - 26°Brix)的收获温度更低，因为用于酿酒的果实成熟通常是在BOD区域的低糖水平。

使用Salmon软件估算RNO和BOD中RNA-Seq读取的转录丰度[24]与赤霞珠的组装和基因模型注释[25，26］．计算每个实验重复的每个基因的TPM(每百万份转录本)(n= 3)从不同的糖水平从19到26°Brix(额外文件1)．转录组数据的主成分分析显示，草莓皮样本按位置(主成分1 (PC1) = 51%方差)和°Brix(主成分2 (PC2) = 22%方差)分别对实验重复进行了清晰的分组(图2)。1)．

为了获得不同角度的数据，我们使用了三种方法来进一步分析转录组数据。其中一项研究关注的是两个部位的糖水平相似的表达。另一项研究发现了一组共同的基因，它们的转录丰度在两个位置都发生了变化。第三个是更全面的网络分析使用了所有的糖水平和两个位置。

我们选择了两个非常相似的糖水平来确定两个位置之间的差异基因表达，因为收获时糖水平并不完全相同。我们在最接近22°Brix水平(BOD为21.5°Brix, RNO为22°Brix)的糖水平上，利用DESeq2 [(FDR padj值< 0.05)在两个接近1的位置之间发现了5528个差异表达基因(DEGs, FDR padj值< 0.05)。27)(附加文件2)．DEGs将在整个手稿中引用这组差异表达基因。利用topGO进行基因集富集分析，确定了这5528个基因生物过程的顶级基因本体(GO)类别3.)．从基因数量上看，GO的最高分类为细胞代谢过程(3126个基因，padj-value = 2.3E-03)、生物合成过程(2371个基因，padj-value = 7.7E-09)和对刺激的反应(2324个基因，padj-value = 1.21E-26)。其他重要和高度显著的基因类别包括对胁迫的反应(1514个基因，padj-值= 5.69E-24)和发育过程(1280个基因，校正后)p值= 8.09 e-12)。总共有910个GO类别显著丰富(附加文件3.)．GO前25个类别之间的关系可以在附加文件中看到4．在本文中，我们使用术语“显著”表示padj值为0.05或低于0.05时统计显著。非生物刺激反应基因数量最多(950个基因;padj-value = 9.1E-29)、内源刺激反应(835个基因，padj-value = 1.43E-21;其中与脱落酸反应相关的基因256个，与外界刺激反应相关的基因719个，padj-value = 1.08E-24，与生物刺激相关的基因520个，padj-value = 5.29E-22。其他一些显著的环境刺激类别包括光刺激反应(234个基因)、渗透胁迫反应(171个基因)和温度刺激反应(158个基因)。

在方法2中，我们检测了在两个位置上哪些基因的表达随着Brix°水平的变化而变化，以确定一组在不同环境条件下浆果发育过程中表达差异的共同基因。以最低度数Brix采样为对照，DESeq2检测各位点转录本丰度的显著差异。例如，RNO中的对照样品是20°Brix时最低的糖样品;将3个倾角较高的样本的转录本丰度与对照的转录本丰度进行比较。至少在其中一个比较中，在RNO和BOD中发现了与对照相比转录丰度显著不同的基因。比较了这些基因列表，确定了两个位置共有的1985个基因集(ap2 tab在附加文件中)5)．将该共同基因列表(ap2)与方法1的DEGs进行比较，发现907个基因与两组基因相同，表明该子集在22°Brix位置存在差异表达。其他1078个基因在不同位置之间没有显著差异。这个1078基因子集列表可以在附加文件中找到5(ap2-ap1选项卡)。该基因集中富集最多的氧化石墨烯类别包括对无机物的反应、对非生物刺激的反应和药物代谢过程。

在方法3中，加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Coexpression Network Analysis, WGCNA)利用更强大的方法精细区分所有糖水平的表达数据，确定了BOD和RNO之间共同(基于相关性)的基因集和不同的基因表达谱。所有°Brix水平的表达基因(附加文件1)被用于此分析。在材料和方法部分描述了分析的其他细节。定义了21个模块或基因子网络(附加文件6)，生成显示模块-性状关系的热图(附加文件7)．灰色模块并不是一个真正的模块，而是一个将所有不适合的基因放入真正模块的地方;因此，它不被计算为上述21个基因模块之一。8个模块BOD和RNO基因表达谱相似(padj-value > 0.05);这些颜色包括青色、午夜蓝、粉色、绿黄色、三文鱼色、蓝色、灰60和宝蓝色。该基因集由8017个基因组成(见附加文件中的ap3选项卡)5查看基因列表)。将WGCNA的这组共同基因与方法1的DEGs进行比较，发现两组共有524个基因。将该子集从WGCNA中移除，得到了两个位点共有的7492个基因列表，它们在22°Brix的转录丰度没有差异(ap2-ap1)。这代表了所有模块中29929个基因的25%。将该基因集与方法1的ap2-ap1基因集进行比较，发现两者共有845个基因。ap2-ap1基因与ap3-ap1基因相比增加了232个不受位置影响的基因，共表达7724个基因，占基因表达量的25.8%。该基因集列在附加文件中的ap2-ap1_union_ap3-ap1选项卡中5．该基因集中富集最多的GO类别包括有机物质生物合成过程和细胞器组织等一般类别。总共有785个富集GO类。

方法3采用基因集富集分析方法对WGCNA中每个模块的kME > 0.80的基因进行进一步分析8)．随着糖水平的增加(与Brix°负相关)，这两个位置的相似基因集的转录丰度降低(与Brix°负相关)，富集了涉及生长和水运输的GO类别(蓝色模块)和翻译(灰色60模块)。随着糖水平的升高，转录丰度增加的常见基因集被富集，其中包括基因沉默(青色模块)、芳香化合物代谢(午夜蓝)、有机物分解代谢(粉色模块)和DNA代谢(三文鱼)。

大部分模块与莓类(如黑色、黄色、红色、绿松石等)的BOD和RNO呈正或负相关。绿松石模块最大，共有5029个基因;BOD和RNO的正相关和负相关分别最高7)．该基因集与DESeq2定义的DEGs相似，BOD与RNO在22°Brix处差异最大。对绿松石模块中kME为0.80或更高(1090个基因)的基因集富集分析显示，与DEGs(附加文件)有许多共同的GO类别8）;来自绿松石模块子集的81%(594个中的481个)的GO类别也在deg的910个GO类别中被发现(总数的53%)。绿松石模块中氧化石墨烯含量最高的类别包括有机酸代谢、类黄酮代谢、脂类生物合成、对非生物刺激的反应、类异戊二烯代谢、对光刺激的反应和光合作用。该模块的基因表达谱随着糖浓度的增加而降低(与Brix°负相关)。

黄色模块是另一个大模块(3008个基因)，与BOD正相关程度第二高。该模块富含涉及生物合成、防御反应和分解代谢过程的氧化石墨烯类别。的WRKY75基因(g104630;这个g#术语在本文中被用作赤霞珠基因组中基因位点名称的缩写)在黄色模块中位于前4个中心基因(kME = 0.97)(附加文件6)．WRKY75是一种正向调控叶片衰老的转录因子。它由乙烯、活性氧(ROS)和水杨酸(SA)诱导，是EIN3(乙烯不敏感3)的直接靶标[28］．

绿色(2287个基因)和棕色(4147个基因)模块也是与RNO呈正相关的大模块(分别为0.92和0.9)。绿色模块的氧化石墨烯含量很高，涉及对化学物质的反应。棕色模块富含涉及多种分解代谢过程的氧化石墨烯类别。

因此，利用所有倾角Brix水平表达的所有基因的WGCNA结果与DESeq2结果一致，DESeq2结果仅比较了22°Brix或位置之间的转录丰度。WGCNA的结果更全面，通过确定中心基因和基因亚网络补充了方法1和方法2的结果。这些子网络通过高度相关的共表达谱和丰富的GOs进一步联系和定义。

转录组谱随糖水平动态变化

在糖水平之间转录丰度增加最多的DEGs

作为检验5528°DEG数据集的第一种方法，确定了两个位置上白利度水平最低和最高的浆果转录丰度之间的差异(附加文件2)．与BOD和RNO转录丰度差异最大的多个deg中的8个例子(EXL2(绪论像2，g068700),HB12(g223410同源框12日),BSMT1水杨酸(苯甲酸酯/甲基转移酶1，g336810),有(卤酸脱卤酶样水解酶蛋白，g070140)，STS24二苯乙烯合成酶24,g435870NAC073(NAC结构域包含蛋白73,g125400)，TPS35(萜烯合酶35,g087040)和MAT3(蛋氨酸腺苷转移酶3,g013310))，如图所示。2．展示这张图的主要目的是强调这些基因的糖水平不断增加的转录丰度的总体趋势;对于BOD和RNO浆果，这些基因中有一半在20°Brix左右的相似转录丰度水平开始，在BOD葡萄中，随着糖水平的增加，转录丰度以更高的速度增加。另一半在两个位置上的增长速度大致相同，但在相同的糖水平上，BOD位置的数量更高。这些数据通过线性回归拟合，以比较直线的斜率。坡度明显高于EXL2，BSMT1，STS24,TPS35与RNO浆果的BOD相比，但其他四个基因没有(数据未显示)。BOD浆果中转录本丰度的显著增加的变化率表明，BOD浆果的成熟速度可能比糖水平更快。

为了更深入地了解BOD和RNO的这些动态基因集，我们对每个位置转录丰度从最低糖水平到最高糖水平增加最多的前400个DEGs进行了基因集富集分析。BOD浆果的前400个DEGs在氨基酸和苯丙素代谢的生物合成过程中高度富集9）;防御反应、对真菌的反应和乙烯刺激的反应是其他高度富集的类别。RNO浆果的前400个DEGs在含氧化合物、激素和脱落酸的反应中富集10)．

在糖水平之间转录丰度下降最大的DEGs

图中展示了8个随糖水平增加转录丰度下降最大的DEGs例子。3.．它们包括脂质和细胞壁蛋白(如延伸蛋白和脂质转移酶蛋白)和水通道蛋白(TIP1;1，液泡膜内藏蛋白1;1)。用线性回归法拟合数据，统计比较BOD和RNO的斜率。在某些情况下，DEGs的线性回归曲线斜率没有统计学差异(双功能抑制剂脂转移蛋白和DUF642(未知函数642定义域);但在其他病例中，在20°Brix附近有相似的转录丰度，但有显著不同的斜率。此外，相对于糖水平，BOD浆果中许多这些基因的转录丰度的变化趋势比RNO浆果更显著。

BOD与RNO自噬基因的差异

浆果成熟涉及自噬[4］．一般来说，随着糖水平的升高，自噬相关基因的转录丰度会增加，在相同糖水平下，BOD浆果的转录丰度相对于RNO浆果更高(图3)。4)．这些趋势与BOD浆果比RNO浆果相对于糖水平成熟更快的假设是一致的。

香气和味道相关的DEGs

许多香气和风味相关化合物是在浆果成熟后期合成的，对环境敏感。影响葡萄和葡萄酒风味和香气的主要代谢途径包括萜类、类胡萝卜素、氨基酸和苯丙素途径[6］．topGO发现，这些途径在deg和绿松石模块中高度富集。这些途径涉及到一些deg，将在以下小节中介绍。

BOD与RNO之间转录丰度差异最大的萜烯合酶基因

浆果的品种差异通常归因于香气化合物的差异。品种特有香气化合物的主要种类之一是萜烯族[29］．与RNO浆果相比，BOD浆果中许多萜烯合酶的转录丰度更高。5)．除了一种(萜烯合酶55;TPS55)的转录丰度随着糖水平的增加而增加。TPS35是β-奥亚胺合成酶(β-奥亚胺是骁龙花香气的主要成分[30.])。TPS08为γ-cadinene合成酶，TPS26为cubebol/δ-cadinene合成酶，TPS4和10为(E)-α-柠檬烯合成酶，TPS07和28为吉马烯- d合成酶;这些酶产生植物精油中发现的倍半萜(见[29，并参考其中所有萜类基因的功能)。TPS55是芳樟醇/橙花醇合成酶，用于合成无环萜醇;芳樟醇对葡萄浆果和葡萄酒的花香有重要的贡献。TPS68是一种参与二萜类生物合成的共酰基二磷酸合酶，TPS69是一种烯-考兰合酶。TPS68和69都是二萜合成酶，是ent-kaurene生物合成途径的一部分。

其他与萜类和类胡萝卜素代谢相关的基因

类胡萝卜素代谢是另一种生物合成途径，有助于葡萄的风味和香气[31］．有许多关键基因有助于萜类和类胡萝卜素代谢具有较高的转录丰度(附加文件2)与RNO相比。例如，DXR(1-脱氧-d -木酮糖5-磷酸还原异构酶，g360850)催化第一步和HDS(4-羟基-3-甲基-2-烯-1-基二磷酸合酶;g379980)酶通过甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径控制异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)生物合成的倒数第二步。其他例子有两种植物烯合成酶(PSY)， g180070和g493850;PSY是类胡萝卜素生物合成途径中的限速酶。

氨基酸和苯丙素代谢基因

氨基酸有助于葡萄和葡萄酒的香气和风味[7］．氨基酸代谢功能的GO类在BOD和RNO之间的DEGs组中高度富集(附加文件3.)，更具体地说，在前400个BOD DEGs(附加文件9)．一些涉及氨基酸代谢的基因在BOD浆果中具有较高的转录丰度(见图)。6)为苯丙氨酸解氨酶1 (PAL1， g533070和其他8个辅助程序可以在附加文件中找到2)，催化苯丙素生物合成的第一步，支链氨基酸转氨酶5 (BCAT5， g220210)，参与异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物合成，3-脱氧-d -阿拉伯-七氟松氨酸7-磷酸合酶1 (DHS1， g082490)，它催化芳香氨基酸生物合成的第一步)和酪氨酸转氨酶7 (TAT7；G116950)，参与酪氨酸和苯丙氨酸的代谢。这组包括44种二苯乙烯合酶(STS)，是苯丙素途径的一部分;这些STSs与RNO相比，BOD浆果的转录丰度更高，与PAL1(见附加文件11举两个典型的例子)。

与非生物刺激相关的DEGs

Light-responsive基因

在之前的分析中，WGCNA定义了一个与葡萄浆果晚熟转录丰度高度相关的生物钟子网[4］．为了比较两个不同位置的生物钟反应，我们绘制了早期模型的所有基因[4］．大多数核心时钟基因(附加文件12)和光敏和外围时钟基因(附加文件13在相同的糖水平下，BOD浆果与RNO浆果的转录丰度存在显著差异(图中为红框)。除了一个以外的所有这些(PHYCBOD浆果中，光敏色素C, g088040)的转录本丰度高于RNO浆果。其他基因的转录丰度几乎相同(没有在红框中括起来)。这些数据总结在一个简化的时钟模型(图。7)，它将PHYB集成为一个关键的光感受器和温度传感器[32，33]可以调节核心生物钟的携带性和节律性，尽管需要澄清的是，调节生物钟的是PHYB的蛋白活性，而不是转录丰度。

Chilling-responsive基因

RNO的温度低于BOD，在清晨达到低温。许多先前发现的低温响应基因[34与BOD浆果相比，赤霞珠赤霞珠中RNO浆果的转录本丰度更高(图3)。8)．这些基因包括CBF1(C-repeat/DRE结合因子1,g435450;以前叫CBF4，但更名为与拟南芥同源性一致)，一种调节冷胁迫调节的转录因子[35),IDD14(不确定结构域14,g000790)，一种产生调控淀粉代谢的抑制剂的转录因子[36),CML41(类钙调素41,g041290)，编码类钙调素蛋白，CYSB(cystatin B, g023260)，一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，过表达时具有冷耐受性[37),XTH23(木葡聚糖内转葡萄糖苷酶/水解酶23,g572510)，编码细胞壁松动酶，和SULTR3; 4(硫酸盐转运体3;4,g392710)。

与生物刺激相关的DEGs

来自BOD的浆果的顶级DEGs富含生物刺激的GO类别，包括编码发病蛋白的基因(公关)．这些基因在BOD浆果皮中的转录丰度高于RNO浆果(图1)。9)．转录丰度PR10(g212910)随含糖量增加而增加。赤霞珠的叶子受到白粉病(白粉菌属necator) ［38］．白粉病诱导其他基因，如PR3蛋白(IV类几丁质酶)，PR5蛋白(类苏马汀)和许多二苯乙烯合成酶(见上文苯丙素代谢部分和附加文件)11)．这些基因在BOD浆果中的表达量也远高于RNO浆果。MLA10(胞内霉菌A 10, g343420;Affymetrix探针设置38)与来自的真菌蛋白质匹配大肠necator。在该研究中，它被用作检测白粉病存在的控制探针组[38］．BOD浆果中g343420的转录丰度高于RNO浆果。这些结果表明，BOD浆果可能有较高的白粉病侵染率，同时苯丙素途径的诱导率也较高。

与激素刺激相关的DEGs

生长素信号传导基因

生长素转运(38个基因;padj-value = 4.43E-08)和细胞对生长素刺激的反应(45个基因，padj-value = 9.12E-05)是DEGs高度富集的GO类别(附加文件)3.)．生长素对葡萄浆果成熟有多种影响[39，40］．生长素在浆果成熟初期即变熟阶段具有延缓浆果成熟的作用。部分生长素代谢(GH3.1；GH3家族蛋白，g538930)和信号基因等IAA13(吲哚乙酸13,g527400)IAA27(g326620),ARF5(生长素反应因子，g075570)在RNO浆果中具有较高的转录丰度(附加文件1)．其他生长素代谢(GH36,JAR1(茉莉酸抗性1)、g170030)和生长素信号基因在BOD中转录丰度较高ARF2(g469780),ARF8(g180460),ARF11(g380160),IAA16(g318830),ARAC1(拟南芥RAC-like 1, g320970)和GID1B(赤霉素不敏感的矮化1b, g071190)，赤霉素受体(附加文件1)．

ABA代谢和信号基因

ABA是一种应对葡萄水分不足的应激激素[41］．许多aba相关基因在浆果皮的两个位置之间有差异表达(附加文件14)．NCED3(9 -cis环氧类胡萝卜素双加氧酶3,g221190)和NCED5(g404590)，以应付缺水情况[42，43]在RNO和RNO中具有较高的转录丰度NCED6(g203160)，在胚胎中高度表达[42]，在BOD中具有较高的转录丰度。NCED6而非NCED3参与种子ABA和种子休眠[43］．此外，参与ABA信号通路的其他一些基因在BOD中具有较高的转录丰度，包括—ABF2(脱落酸响应元件结合因子2,g286950)ABF4(g312300)和ABCG40(三磷酸腺苷结合盒g40, g143240) [44，45］．有趣的是，BAM1(大麦任何分生组织1)被确定为一种根系信号肽激素(CLE25, clavata3/esr相关25)的受体，该激素对水分亏缺和上调作出反应NCED3拟南芥叶片转录丰度[46］．转录丰度BAM1(g220020) RNO显著高于BOD(附加文件14)．在转录丰度上无显著差异CLE25(g007470);变化很大。

乙烯信号基因在BOD中含量较高

有71种DEGs在乙烯氧化石墨烯类反应中富集(附加文件3.)．乙烯是一种应激激素，对多种生物[47和非生物的[48]除了强调其在果实发育和成熟中的作用外[49］．许多乙烯相关基因在BOD浆果中具有较高的转录丰度。这些包括乙烯生物合成、乙烯受体和ERF(乙烯反应因子)转录因子(图。10)．ERF1和ERF2位于乙烯信号通路的起点，是EIN3的直接靶点[45，50］．其他ERF转录因子(如:ERF98；g156210)被确定为拟南芥叶片乙烯信号通路的枢纽[51的表达方式也有差异，类似于ERF1(g060690)和ERF2(g482650)在两个位置之间(数据未显示)。

与矿物质营养相关的DEGs

Iron-related基因

14个DEGs与对铁离子反应富集的基因相关(附加文件3.）;图中显示了8个参与铁稳态的DEGs的例子。11．铁稳态的基因SIA1(盐诱导ABC激酶，g336700)，VIT1(液泡铁转运蛋白1,g001160)，ATH13（拟南芥ABC2同源物13,g146610), IREG3(铁规3,g098530)，和ABCI8(atp结合盒I8, g163790)在BOD浆果中转录丰度高于RNO浆果。铁稳态的基因YSL3(黄色条纹3,g223320)，FER1(铁蛋白1,g606560)和NRAMP3(天然抗性相关巨噬细胞蛋白3,g413920)在RNO浆果中比BOD浆果有更高的转录丰度。其他几种铁蛋白基因表达类似FER1(数据没有显示)。与RNO葡萄园土壤相比，BOD葡萄园土壤的平均有效铁浓度约高5倍(表1)．

两个位置的共同基因集(ap2-ap1_union_ap3-ap1)约占糖水平或位置差异表达基因的25%。推测这些基因组代表的基因不受位置(环境)的影响，但受浆果发育或糖水平的影响。本研究的局限性在于一个季节只调查了两个地点。随着未来对更多的位点进行比较，这些基因集的大小可能会进一步缩小。这些基因组或模块涉及的过程包括分解代谢的增加、转译和光合作用的下降。很明显，这些过程在浆果成熟过程中起着重要作用。基因组中大多数基因的转录丰度随糖水平和浆果成熟度的增加而变化，其中大多数基因随葡萄园地点的不同而变化。许多deg富含与环境或激素刺激相关的基因本体。

葡萄果实果皮的DEG表达谱与环境因素和种子发育有关

植物暴露在多种影响其生理的因素中，即使是在葡萄园等受控制的农业领域。在BOD和RNO的葡萄园暴露在非常不同的环境(包括气候);这些环境影响反映在一些具有丰富基因本体论的DEG集合中。本研究的结果与浆果成熟后期浆果皮的转录丰度对当地环境对葡萄藤的影响敏感的假设相一致。

虽然大多数浆果的转录丰度在很大程度上受遗传或基因型的影响，环境也发挥了很大的作用[2］．本研究的实验设计不可能确定每种环境因素对这两个位置差异表达量的贡献。有太多的变量和太多的潜在的相互作用，以至于无法最终确定任何事情。在其他季节的复制将不能帮助分析，因为气候是高度变化的，将产生不同的结果。我们所能说的是，这些基因在两个位置之间有差异的表达，这可能是由于已知和未知的因素(对地点或风土的感觉)。随着未来在不同的地点和季节进行更多的研究，荟萃分析可以提供更确切的结论。

本研究中发现的一些DEGs可能是由于在这两个地点使用的不同赤霞珠无性系和砧木之间的遗传差异造成的。由于不知道这些基因可能是什么，我们无法从以前的研究中得出任何线索。这些因素和其他因素肯定在一定程度上影响了浆果。这项研究的数据表明，除了来自成熟种子的潜在信号外，葡萄莓皮还会对两个葡萄园的多个潜在环境因素做出反应。我们说潜在的环境因素是因为我们没有控制这些因素;我们将转录丰度与两个地点不同的因素联系起来。转录丰度谱和基因的功能注释为我们提供了影响浆果的因素的线索，然后与已知的环境变量建立联系。需要进一步的实验来跟踪这些观察结果。

我们能够将两个位点之间的转录丰度(DEGs)差异联系起来。这些deg可能与温度、光、湿度和生物胁迫有关。其他与转录丰度相关的因素涉及生理反应和浆果性状，如种子和胚胎发育、激素信号(ABA、乙烯和生长素)、苯丙素代谢和生理时钟。在接下来的章节中，我们将更详细地讨论一些可能的环境因素，这些因素反映在本研究中发现的基因库中富集的基因本体中。

光敏基因的转录丰度

光调节植物中许多基因的转录丰度。据估计，20%的植物转录组受白光调控，这包括来自大多数代谢途径的基因[52］．光可被植物的各种光感受器所感知[33];有红色/远红色，蓝色和紫外光受体。PHYB是一个关键的光传感器，调节大多数光敏基因[53]及透过红光与远红光的比率及温度来感应环境[33，54］．PHYB抑制昼夜节律钟，影响每日周期的速率[55以及许多生物钟基因的表达[53];PHYB诱导晨相基因，抑制晚相基因。其他光感受器也能控制生物钟[33］．

PHYB和生物钟是植物发育的许多方面的核心调节因子，包括种子萌发、幼苗生长和开花[33，55，56］．昼夜节律钟影响光合作用、糖运输和代谢、生物和非生物胁迫、甚至铁稳态等相关基因的每日转录丰度[55］．

在浆果成熟后期，光信号在浆果皮肤转录组中是非常动态的，在BOD浆果中，许多光信号基因的转录丰度较高。许多与生物钟相互作用的光感受器在BOD浆果中有更高的基因表达。在昼夜节律时钟模型中，昼夜节律时钟相关1（CCA1)是一种“清晨基因”，在一天开始时表达量最高。它是在一天中昼夜节律核心时钟进程的开始，而CAB表达时序1 (Timing of CAB Expression 1)的转录丰度(TOC1)在一天结束时是最高的，并且完成了核心时钟进程。7)．在这两种情况下，这些基因在BOD中的转录丰度都高于RNO。

黄昏复合体是由早花期3 (ELF3)、早花期4 (ELF4)和植物时钟1 (PCL1，也称为LUX)组成的多蛋白复合体，在黄昏时达到峰值。这些蛋白在两个位点之间的转录丰度都没有显著差异(图。7；额外的文件12)．ELF3的转录丰度随着糖水平和白昼长度的缩短而增加(较高的糖水平出现在季节的后期，因此白昼长度较短)。ELF3作为夜复合体(EC)的一部分，与PHYB、COP1(本构光形态形成1)和TOC1有直接的物理相互作用[57将光和温度信号通路与生物钟直接联系起来。有趣的是，除了构成晚间时钟的三种蛋白质外，大部分时钟成分在BOD和RNO之间的转录丰度都存在显著差异。

的转录丰度、莓类的BOD和RNO含量相似。7)，但BOD浆果的转录丰度随糖水平的变化发生在低糖水平。有逐渐下降的趋势、转录丰度随着糖水平的增加而增加，直到完全成熟阶段的最后一次测量，此时转录丰度大幅增加。起床号(RVE1)．拟南芥中RVE1促进种子休眠，PHYB通过抑制RVE1的表达与RVE1相互作用[58］．PIF7(光敏色素相互作用因子7)与PHYB直接相互作用抑制PHYB蛋白水平[59］．同样，PIF7的活动受生物钟的调节[60］．PIF7与RNO浆果相比，BOD的转录本丰度更高，且通常随着糖水平的增加而增加。另外两种葡萄光敏色素(巴而且PHYE)在两个地点之间或在不同的糖水平上没有显著差异。PHYC在RNO浆果中具有较高的转录丰度，且在不同糖水平下变化不大。许多其他的光感受器(例如:CRY3(隐花色素3),FAR1(远红受损反应1)，FRS5(far1相关序列5)等)在BOD浆果中具有较高的转录丰度(附加文件13)．因此，通过生物钟感知光线是一个复杂的过程，需要多种输入。

RVE1遵循昼夜节律[61］．它的行为类似于一个早晨阶段的转录因子，并与EE元件结合，但目前尚不清楚它是否直接受到核心时钟的影响(如TOC1或EC，它们抑制其他类似于早晨的基因CCA1而且LHY(晚期伸长下胚轴))或通过PHYB作用或两者兼而有之。、会使RVE1;RVE1促进生长素浓度和降低赤霉素(GA)浓度[58］．较暖的夜间温度(如BOD)会使PHYB的活性形式更快地转化为非活性形式[33]，因此可能促进RVE1表达/活性的提高。P_r(红色形式的光敏色素，是生理上不活跃的形式)似乎加速了时钟的节奏[55］．目前尚不清楚光敏色素在葡萄种子和果实发育中的作用。

一般来说，人们对PHY对果实发育的影响知之甚少。在一项番茄研究中，果实发育体育突变体加速[62]，这表明PHYB作为温度/光传感器和昼夜节律时钟的调节器可能影响果实发育。在这些突变体中，类胡萝卜素浓度也受到影响，但糖浓度没有受到影响。

光周期影响转录丰度巴而且、葡萄叶[63］．在本研究中，包括红色、蓝色和紫外光受体在内的大部分光感受器基因在BOD浆果中转录丰度较高(附加文件)13)．目前尚不清楚PHYB和生物钟对葡萄浆果的发育有什么影响。但是，这两个地点之间有明显的差别;似乎PHYB和生物钟是葡萄浆果环境的关键传感器，影响果实的发育和成分。

温度响应基因的转录丰度

葡萄浆果的转录组对温度很敏感[2，3.］．在我们的研究中，温度相关的基因在这两个位置存在差异表达。与BOD浆果相比，RNO浆果暴露在昼夜温差大得多的环境中，在浆果成熟的后期阶段，也暴露在凌晨的低温环境中(表)1)．RNO浆果皮中某些冷响应基因的转录丰度高于BOD浆果皮(图4)。8),包括CBF1．

CBF1转录丰度对低温非常敏感;它是冷调节的主调节器，提高植物的耐寒性[35，64，65］．PIF7与的启动子结合CBF1,抑制CBF1转录丰度，连接光敏色素，生物钟和CBF1表达式[60］．我们的数据与这个模型一致;大量的记录PIF7是更高的,CBF1BOD浆果皮的转录本丰度低于RNO浆果皮(图3)。7)．

种子脱水和休眠基因的转录丰度

植物体内ABA浓度随着脱水而增加，ABA触发了渗透胁迫反应和种子发育的主要信号通路[66］．种子胚中ABA的含量只有在种子发育末期，胚脱水进入休眠时才会增加。ABA浓度居高不下，抑制种子萌发。ABA信号基因的转录丰度—ABF2而且SnRK2(SNF1相关蛋白激酶2)激酶在细胞培养液中添加ABA后升高[67和对脱水的反应[45赤霞珠(Cabernet Sauvignon)的叶子。

这项研究的数据与BOD浆果在低糖水平下更成熟的假设是一致的。BOD浆果中ABA信号基因的转录丰度更高，这表明BOD中ABA浓度高于RNO浆果，即使RNO浆果暴露在更干燥的条件下(表)1)．基于编码ABF2、SnRK2激酶和NCED6的重要ABA信号和生物合成基因的转录丰度较高，BOD浆果皮肤中的ABA浓度可能更高。我们假设这可能是种子来源的ABA，因为在最近的降雨和高湿度下，BOD的水分亏缺不明显。相比之下,NCED3而且NCED5在RNO浆果皮中有较高的转录丰度，这可能是由于湿度非常低和大的蒸汽压亏损(葡萄藤被灌溉)的结果。的下表达式NCED6RNO浆果的种子比BOD浆果更不成熟。其他种子发育和休眠基因的高表达。RVE1，ARF2，ARF10等)支持了BOD浆果(和种子)比RNO浆果在较低的糖水平下成熟的论点。

浆果皮中ABA的含量与生物合成、分解代谢、结合和运输有关。种子中的ABA随着种子成熟而增加，其中一些ABA可能被运输到果皮。事实上，有一些ABCG40编码ABA转运蛋白的基因在BOD浆果皮中的转录丰度高于RNO(附加文件2而且14)．果皮中的ABA一部分来自种子，一部分来自果皮中的生物合成。NCED6BOD浆果的果皮转录本丰度较高。也许是大量的文字记录NCED6在表皮中受到与胚胎相同的信号调节，反映了种子成熟的增加。AtNCED6拟南芥的转录丰度对水分亏缺不敏感AtNCED3而且AtNCED5是(43］．这与更高的是一致的NCED3, NCED5而且BAM1RNO浆果的转录丰度(附加文件14)．因此，ABA的代谢和信号传导有复杂的反应。可能有两种不同的ABA途径影响ABA的浓度和信号:一种与胚胎发育有关，另一种与皮肤中的水分状态有关。

在种子胚胎发育后期，生长素也参与ABA信号的传递。生长素信号应答是复杂的。ABF5是一种生长素受体，可降解Aux/IAA蛋白，后者是ARF转录活性的抑制因子[68］．因此，生长素浓度的升高释放Aux/IAA抑制ARF转录因子，激活生长素信号。在浆果皮中，有多种多样的转录反应辅助/ IAA而且东盟地区论坛两个位点上的基因，有的转录丰度增加，有的转录丰度降低。与ABA信号一样，可能有多种生长素信号通路同时起作用。

其中一种途径似乎与种子休眠有关。ARF2在BOD浆果中有较高的转录丰度。ARF2通过ABA信号通路促进休眠[69］．这与BOD浆果比RNO浆果在较低糖水平下成熟的假设是一致的。

生物胁迫基因的转录丰度

葡萄对病原体有非常动态的基因表达反应[70，71］．BOD浆果的前150个DEGs富含生物胁迫基因。与RNO相比，BOD葡萄园的降雨量和相对湿度更高，这些条件可能更适合真菌生长。我们检测到BOD浆果中白粉病应答基因的转录丰度更高，这可能与乙烯和苯丙素基因的转录丰度更高有关，这是防御反应的一部分。其中一些基因的转录丰度谱(例如:PR10，PAL1，STS10，ACS6,ERF2；参见无花果。5，8，9和额外的文件11)都非常相似。

葡萄中乙烯信号的增加与白粉病感染和苯丙素代谢有关，并似乎为植物抵抗真菌提供了保护[72，73］．特别是与苯丙素代谢有关的基因朋友而且STS基因似乎对环境中的多重压力非常敏感[74］．在拟南芥中有四个朋友基因(75］．这些朋友拟南芥类黄酮合成与抗病相关的基因。十个不同的PAL1和两个PAL2同源基因在BOD浆果皮中转录丰度较高;许多STS基因在BOD浆果皮肤中也有较高的转录丰度(附加文件11)．二苯乙烯是一种植物抗毒素，可对葡萄和葡萄中的病原菌产生抗性STS基因受到病原体的强烈诱导[70］．因此，白粉病基因较高的转录丰度可能与乙烯和苯丙素途径中较高的转录丰度基因有关。

铁稳态基因的转录丰度

在这两个位置，许多铁稳态基因的转录丰度显著不同。11)，两个地点的土壤有效铁浓度也存在差异。然而，植物对铁的吸收和运输是复杂的，受多种因素的影响，如pH、土壤氧化还原状态、有机质组成、韧皮部中的溶解度等。因此，如果不直接测量，就不可能预测浆果中的铁浓度。这些基因在铁稳态和植物生理功能中的作用是多种多样的。铁供应可以影响赤霞珠浆果皮中的花青素浓度和苯丙素途径基因的转录丰度[76］．其中一位deg，SIA1，位于拟南芥叶绿体中，在质体形成和铁稳态信号转导中起作用ATH13(又称OSA1) [77］．另一个度,YSL3，从事铁的运输[78］．它在SA信号通路中起作用，并参与对病原体的防御反应。它也在铁转运到种子中起作用[79］．FER1是在拟南芥中发现的铁蛋白家族(铁结合蛋白)之一[80］．VIT1和NRAMP3是液泡铁转运蛋白[81也与种子中的铁储存有关。其他DEGs也对铁的供应有反应。IREG3(也称为MAR1)似乎参与了质体中铁的运输;其转录本丰度随着铁浓度的增加而增加[82］．ABCI8是一种铁刺激atp酶，位于叶绿体中，在铁稳态中起作用[83］．

目前还不清楚这些铁平衡基因在葡萄莓皮中起什么具体作用，但它们似乎参与了种子中的铁储存和对氧化应激反应的保护。80，81］．对于BOD和RNO浆果皮中转录丰度的一个可能解释是，铁蛋白可以结合铁，并被认为可以降低叶绿体中的自由铁浓度，从而减少由芬顿反应引起的ROS生成[80］．随着叶绿体在浆果成熟过程中衰老，铁浓度可能上升作为一个结果含铁蛋白在类囊体膜分解代谢;因此，浆果皮可能需要较高浓度的铁蛋白，以保持自由铁浓度较低。这可能解释了随着糖水平的增加，铁蛋白转录丰度的增加。

大多数土壤含2 - 5%的铁，包括有效铁和不可用铁;15和25 μg g的土壤⁻¹可用铁的含量被认为对葡萄适度[84，但浓度较高的土壤不被认为是有毒的。因此，对于本研究中的两种土壤，可以认为铁浓度很高，但没有毒性。BOD葡萄园中较高的有效铁浓度可能与潮湿的条件(更多的还原性条件)和较低的土壤pH值有关。

环境对转录丰度的影响

其他研究人员使用组学方法已经确定了影响葡萄浆果转录丰度和代谢物的环境因素。一项研究调查了在同一地区的11个不同葡萄园中，Corvina(一种制造红葡萄酒的黑皮葡萄品种)浆果转录丰度的差异。85］．他们确定，大约18%的浆果转录丰度受到环境的影响。气候有压倒性的影响，但葡萄栽培也很重要。苯丙素代谢对环境非常敏感朋友转录丰度与STS转录丰度。

在另一项对白葡萄品种Garganega的研究中，利用转录组和代谢组学方法分析了浆果[86］．浆果选自不同海拔和土壤类型的葡萄园。同样，苯丙素代谢受到环境的强烈影响。类胡萝卜素和萜类代谢也受到影响。

两项研究在中国西部干旱地区和东部湿润地区对葡萄果实成熟期的转录组进行了研究[87，88］．这两个地点反映了我们研究中条件的一些差异，即湿度、光照和海拔，尽管干燥的中国西部地区比非常干燥的RNO地点有更高的夜间温度和更多的降雨。在赤霞珠研究中[87，他们比较了两个区域的三个不同阶段的浆果转录组(去掉种子后):豌豆大小、版本和成熟。成熟期TSS略低于20°Brix;与我们的研究类似，在这两个位置之间的成熟浆果中，氧化石墨烯类对刺激、苯丙素和二萜代谢的反应高度丰富。NCED和PR蛋白的转录丰度也存在差异。与我们的研究一样，作者将这些蛋白的转录丰度分别与干(干旱反应)和湿(病原体防御)位点联系起来。

第二项研究比较了中国这两个地区[88]，研究了两个季节环境对麝香勃朗à小颗粒浆果代谢组和转录组的影响;具体来说，以萜类代谢为目标。就像在我们的研究中一样，萜类的转录本在潮湿的地方含量更高。转录丰度与萜类化合物浓度相关，构建了一个共表达网络。鉴定出一组特定的候选调控基因，包括一些萜烯合成酶(TPS14)、糖基转移酶和1-羟基-2-甲基-2-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)。我们在自己的数据中检查了其中一些候选基因的转录丰度，但没有发现两个位点之间的显著差异。我们的研究和Wen等人(2015)之间的对比结果可能是多种原因造成的，比如不同的品种反应、浆果和皮肤样本，或不同的环境条件影响萜类的产生。

萜类代谢受小气候影响[89]，并参与植物对病原体和昆虫的防御反应[29，90］．对白苏维浓葡萄(一种白葡萄品种)进行光照处理，去除相邻的叶子，没有任何可检测到的浆果温度差异[89］．光照增加会增加浆果中特定的类胡萝卜素和萜烯的浓度。类胡萝卜素和萜类的产生对温度的反应还不太清楚。温度对类胡萝卜素和萜类的产生有一定的影响，但影响程度不如光照[89］．高浓度的倍半萜(一种倍半萜)与较低的温度有关[91］．水分不足也会改变葡萄的类胡萝卜素和萜类代谢[11，92］．萜烯可以作为昆虫攻击的信号，吸引昆虫捕食者[90］．因此，萜类代谢对环境高度敏感，受多种因素影响。

与这些研究相反，过量的光和热会影响转录丰度并损害浆果的品质。除了较高的苹果酸分解代谢率外，花青素浓度和与之相关的一些转录丰度也会下降[93，94］．

温度对浆果成熟度和总可溶性固形物的影响

BOD浆果成熟度低于RNO浆果;原因很可能是RNO白天变暖，夜晚变凉。较高的白天温度可能会增加光合作用和糖的运输，而较低的夜间温度可能会减少果实的呼吸作用。°Brix或TSS近似于浆果含糖量%，是任何地点浆果成熟度的可靠标志[95];然而，当比较不同气候条件下的葡萄时，TSS是一个不可靠的浆果成熟度标志。BOD和RNO的TSS差异与其他温度对浆果发育影响的研究一致。间接研究已经将上个世纪的逐渐变暖与葡萄浆果中加速的物候变化和糖浓度的增加联系起来[96，97，98，99］．温度升高可以加速糖的代谢，包括糖的生物合成和转运，但代谢的增加是不均匀的。例如，在成熟阶段花青素浓度的增加不像糖浓度的增加那么受影响[One hundred.］．这些反应因品种而异[97，使这种分析进一步复杂化。

温度对赤霞珠浆果成分影响的直接研究也与我们的数据一致。在一项研究中，在20或30°C的温度下(与本研究中出现的BOD和RNO温度非常相似的温度)生长的植物trons中，赤霞珠浆果的成分被大幅改变[101］．较低的温度促进花青素发育和苹果酸浓度(抑制苹果酸分解代谢)，较高的温度促进TSS(°Brix)和脯氨酸浓度[101］．在第二项研究中，葡萄藤在白天20或30°C的温度下生长，夜间温度比白天低5°C。102］．在这项研究中，较高的温度增加了浆果的数量，并且在3到4周之前就开始改变[102］．作者的结论是，温度升高会加速浆果的发育。在第三项研究中，赤霞珠的浆果成分也受到土壤温度的类似影响，土壤温度相差13°C [103］．

TSS浓度也受光照和藤蔓水分状况的影响。光通常不是一个因素，因为通常有足够大的叶面积和足够的光水平来饱和这个源和汇的关系[104，105］．在日光下曝晒的赤霞珠果实的TSS高于遮荫的果实[104］．这种阳光效应主要归因于浆果温度的增加，而不是通量率本身的增加。葡萄藤水分含量越高，果实越大，含糖量越低[106而水分不足会增加赤霞珠中的糖浓度[11］．然而，温度被认为对糖浓度影响最大[16］．

本研究中的其他转录组数据表明，BOD浆果在较低的糖水平下比RNO浆果更成熟。这些基因包括自噬、生长素和ABA信号、铁稳态和种子发育相关基因的转录丰度谱。这些deg中的许多都加速了BOD浆果的变化速度。虽然这些转录本在皮肤中，但它们可能会受到来自种子的信号的影响。此外，BOD浆果中大多数与生物钟相关的基因转录丰度较高。PHYB可调节生物钟[55]， PHYB活性对夜间温度非常敏感(BOD夜间温度较高);在较暖的温度下，PHYB会加速还原为非活性形式[33］．光敏色素的不活性促进RVE1的表达，从而促进生长素浓度和种子休眠[58］．综上所述，温度和/或昼夜温差很可能是造成这两个地区浆果发育速度和糖积累速度差异的重要原因。

是否有可靠的标记来在成熟时收获浆果?

确定葡萄的成熟度是一个困难和容易出错的过程。可靠的标记有助于决定何时收获葡萄。“最佳”成熟度是一个主观判断，最终取决于酿酒师或种植者的具体目标或偏好。经验因素的组合可以被利用，包括度数，总酸度，浆果口味的香气和单宁，种子颜色等。度数或总可溶性固形物本身可能不是浆果成熟的最佳标志，因为它似乎与浆果成熟的温度分离。苯丙素代谢，包括花青素代谢，对非生物和生物胁迫也高度敏感，可能不是完全成熟的良好指标。因此，颜色也不是一个好的指标。来自种子或胚的特定发育信号，如生长素和ABA信号，可能为不同环境下的浆果成熟提供更可靠的标记，但在无籽葡萄中并不有用。芳香族化合物也可能是可靠的标记，但它们需要是不受环境影响的一般性发育标记。这项研究揭示了许多基因并不是可靠的标记，因为它们在不同的环境中表达不同。一个值得注意的候选标记是ATG18G (g071260)。 Its transcript abundance increased and was relatively linear with increasing °Brix and these trends were offset at the two locations relative to their level of putative fruit maturity (Fig.4)．自噬过程需要ATG18G [107在水果成熟阶段可能很重要。研究发现它是一个与果实成熟和叶绿体降解相关的基因亚网络中的中心基因[4］．进一步的测试将需要知道它是否对果实成熟至关重要，以及它的转录丰度是否受到非生物和生物胁迫的影响。

果实的终极功能是产生完全成熟的种子，以便繁殖下一代植物。成熟的浆果表现出多种特征，当果实可以食用和种子传播时，这些特征会向其他生物发出信号。在本研究中，我们证明了在两个不同的位置和不同的环境中，葡萄皮的转录本丰度存在较大的差异，证实了我们最初的假设。我们还在这两个位置确定了一组具有公共配置文件的deg。本研究的观察结果提供了这样的基因列表，并产生了大量的假设，以供未来检验。WGCNA尤其强大，增强了我们的分析。在浆果成熟后期的转录丰度是非常动态的，可能对本研究中确定的许多环境和发育因素作出响应。基因功能分析和氧化石墨烯富集分析是阐明这些因素的有效工具。确定的一些因素是温度、湿度、光和生物胁迫。这项研究的结果表明，在浆果成熟的后期阶段，浆果仍然有一种“地方感”。 Future studies are required to follow up on these observations. It appears that fruit ripening is very malleable. Manipulation of the canopy (time and intensity of leaf removal at different locations on the plant) may offer a powerful lever to adjust gene expression and berry composition, since these parameters are strongly affected by light and temperature.

植物材料

Grant R. Cramer获得雷诺葡萄(葡萄l .简历。赤霞珠的克隆品种，生长在内华达大学里诺分校的内华达农业实验站。葡萄藤是在自己的根上生长的，最初是作为认证材料从内陆沙漠苗圃，本顿，市，华盛顿，美国。葡萄在2012年9月10日至10月之间采收，取决于成熟度大约在太阳中午(正负1小时)。°Brix由数字折射计(HI 96811，汉纳仪器，Woonsocket, RI，美国)测定。压榨浆果分离果皮，同时测定果汁的Brix度，按糖水平(1±0.5°Brix增量;19至27°Brix)。用这种方法，在多天的时间里从葡萄园里三个不同的独立滴灌区块的多个葡萄藤上的多个簇上收集浆果。每周测量茎水势，以确保灌溉水平充分维持藤蔓的水分状况。定期喷洒葡萄藤以预防真菌。葡萄园里的每个街区都被认为是一个实验副本。 Soil testing was performed by A & L Western Agricultural Laboratories (Modesto, CA, USA).

在BOD中，他们使用赤霞珠无性株CA33 412，在SO4砧木上生长。这些葡萄是在法国国家农业研究研究所(INRA)研究站(Villenave d 'Ornon, France)的VitAdapt葡萄园种植的。为了减轻土壤变异，该站点内存在5个重复块体。有关VitAdapt计划的其他详情，请参阅[108］．3个重复于每天14:00采集浆果。Reno和BOD葡萄园的环境条件和变量列于表中1．定期喷洒葡萄藤以预防真菌。土壤测试由Aurea Agroscience (Blanquefort, France)进行。

RNA提取

在RNO中，从20、22、24和26°Brix的浆果皮中提取总RNA(每个实验重复3次)，并评估其数量和质量，如前所述[109从大约250毫克的冷冻、磨碎的皮肤组织中提取。

根据Reid等人的研究，在BOD中，分别从19.5、20.5、21.5和22.5°Brix的浆果皮中提取三个实验重复的总RNA。110]从1克冷冻的，磨碎的浆果皮。根据制造商的说明书(Ambion TURBO DNA-free DNAse, Life Technologies)对RNA提取物进行DNAse I处理。RNA的质量用1.8%的琼脂糖凝胶进行验证，并用Nanodrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific)进行定量。

RNA-Seq文库制备及测序

使用Illumina TruSeq RNA文库准备试剂盒(Illumina Inc.， San Diego, CA, USA)从赤解珠浆果皮肤的RNA中制备条形码文库(50 bp单端)，由加州大学洛杉矶分校神经科学基因组学核心对RNO样本进行测序，由加州大学戴维斯分校基因组中心使用Illumina TruSeq化学(3.0版)和HiSeq2000测序仪(Illumina Inc.， San Diego, CA, USA)对BOD样本进行测序。

转录丰度和统计分析

FastQC [111]用于生成fastq文件，并检查和验证序列质量。Trimommatic [112]版本0.36用于从序列中修剪Illumina适配器。鲑鱼(24版本0.14.1被用来估计修剪fastq文件的转录丰度，设置为——gcBias，−-seqBias，−-fldMean = 50，−-fldSD = 1，−- validatemdings——rangeFactorizationBins 4。一个增强的混合fasta文件是从葡萄简历。赤霞珠基因组[26]，使用取自沙门氏菌工具的generateDecoyTranscriptome.sh。该文件用于构建k-mer大小为15的量化索引文件。三文鱼输出(量化文件)导入DESeq2 [27使用tximport版本1.10.1 [113]用于差异表达基因(DEGs)的测定。

Coexpression网络分析

WGCNA 1.68版本[114，115]被用于利用每个位置的所有文库构建基因网络。在分析前，所有文库中以最少10个计数阈值去除低表达基因。利用DESeq2包的variancestablilizingtransformation函数对计数数据进行转换，利用DESeq2包的blockwisemomodules函数构建基因网络(基因模块)。使用优化的双重中相关与以下设置产生邻接矩阵:β等于8和maxPoutliers参数等于0.05。使用DynamicTreecut算法检测基因模块，设置如下:最小模块大小为30，分支合并切割高度为0.25。该分析产生的模块特征基因被用来确定基因模块(22)与各种实验性状(如Brix°和位置)的关联。

基因功能注释添加

利用DIAMOND version 0.9.19软件的blastx功能在不同的蛋白质数据库中检索赤霞珠注释的基因模型[116]使用默认参数，并在最高对齐分数的1%范围内报告对齐。对于每个基因模型，保留最佳的blast hit(1对1)，并在当前注释的基础上进行报告。对于具有相同分数的多次命中，第一次命中将作为代表性结果，但其他命中仍然是可访问的。使用的数据库是Araport11, release 06.17.16， [117)和葡萄IGGP 12X来自EnsemblPlants 38，一个ensemblgenomic的一部分[118］．对应的基因注释来自Araport11 gff文件(06.22.16版本)、TAIR10功能描述(01.16.13版本)和PN40024的手工管理和实现的葡萄V1注释。

GO类别功能丰富

基因本体(GO)富集使用topGO版本2.34.0 [119］．通过FDR调整丰富了功能类别pFisher’s检验后-value > 0.01，进行进一步分析。对于基因本体(GO)分类分配，GO已经在赤霞珠注释文件[25]与之前人工编辑的PN40024 V1基因模型的GO注释相结合。P40024的GO归为赤霞珠(Cabernet Sauvignon)基因模型的原因是，如果爆炸的结果显示出超过95%的同一性百分比，以及代表查询和主题长度的比对超过95%。

RNA-Seq数据存储在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的序列读取档案(SRA)数据库中，SRA登录号为PRJNA260535 [120]表示RNO数据，SRP149949表示BOD数据。

阿坝:

脱落酸

ABCG:

三磷酸腺苷结合Casette G

沛富:

脱落酸反应元件结合因子

前言:

不正常的拍摄

ACO1:

ACc氧化酶1

埃珂叫牌法:

ACc Oxidase-Like

APG9:

自噬9

ARAC1:

拟南芥RAC-like 1

东盟地区论坛:

生长素响应因子

ATG:

自噬

重点注意:

拟南芥abc2同族体

BAM:

大麦任何分生组织

BCAT:

Branched-Chain-amino-acid转氨酶

身体:

波尔多

英国石油公司:

碱基对

BSMT1:

水杨酸苯甲酸酯/甲基转移酶1

CBF1:

C-repeat/DRE结合因子

CCA1:

与生物钟相关的1

继续教育:

CLavata3 / Esr-related

CML:

CalModulin-Like

COP1:

本构Photomorphogenic 1

CRY3:

隐花色素3

简历:

品种

CYSB:

半胱氨酸蛋白酶抑制物B

度(s):

差异表达基因(年代)

国土安全部:

3-deoxy-D-arabino-Heptulosonate 7-phosphate合酶

DMAPP:

DiMethylAllyl二磷酸

DUF642:

未知函数的定义域

DXR:

1-deoxy-D-Xylulose 5-phosphate Reductoisomerase

电子商务:

晚上复杂

情感表达:

晚上元素

静脉:

乙烯不敏感

精灵:

早期开花

小块土地:

乙烯反应的因素

EXL2:

绪论就像2

FAR1:

远红受损反应1

罗斯福:

错误发现率

带:

FERrittin

FOP1:

折叠花瓣1

FRS:

FAR1-Related序列

GH3:

GH3家族蛋白质

GIDB1:

赤霉素不敏感Dwarf1B

走:

基因本体论

有:

HaloAcid脱卤酶样水解酶蛋白

HB12:

同源框12

HDS:

4-Hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl二磷酸合酶

国际宇航科学院:

吲哚乙酸

IDD14:

InDeterminate-Domain 14

IPP:

IsoPentenyl焦磷酸

IREG:

铁的监管

JAR:

JAsmonate耐

LHY:

晚细长的下胚轴

MAT3:

蛋氨酸AdenosylTransferase 3

议员:

MethylErythritol 4-Phosphate

MLA:

细胞内发霉了

NAC073:

NAC结构域含有蛋白73

NCBI:

国家生物技术信息中心

nc:

Nine-Cis Epoxycarotenoid加双氧酶

NRAMP3:

天然抗性相关巨噬细胞蛋白

朋友:

苯丙氨酸裂解酶

PCL1:

PhytoCLock 1

体育:

光敏色素

论坛:

光敏色素相互作用的因素

公关:

发病机制相关

PRR:

Psuedo-Response调节器

小组:

八氢番茄红素合成酶

优化:

里诺

ROS:

活性氧

RVE1:

起床号1

山:

水杨酸

新加坡航空:

盐诱导Abc激酶

SnRK:

SNF1相关蛋白激酶

STS:

芪合酶

SULTR:

硫酸运输车

TAIR:

拟南芥信息资源

答:

TyrosineAmino转移酶

目录:

Cab表达时机

TPL:

袒胸

TPM:

记录每百万

16:

海藻糖磷酸酶D

TPS:

萜烯合酶

TSS:

总可溶性固体

维特:

空泡的铁转运蛋白

WGCNA:

加权基因共表达网络分析

XTH:

Xyloglucan endoTransglucosylase /水解酶

伊夫圣罗兰:

黄色Stripe-Like

我们要感谢Aude Habran在收集浆果皮和BOD浆果RNA提取方面的帮助，并感谢许多UNR生物化学专业高年级论文本科生在RNO浆果中帮助浆果分离。

本研究的设计、浆果样品的采集和处理、数据的分析和解释以及论文的撰写都得到了内华达大学里诺分校农业实验站的支持，并获得了美国多州USDA-Hatch赠款NEV00383A给GRC。

从属关系

1. 美国内华达大学生物化学与分子生物学系，内华达州里诺89557

   Grant R. Cramer, Noé Cochetel & Ryan Ghan

2. UMR生态生理和葡萄功能基因组学，波尔多大学葡萄与葡萄科学研究所，维伦纳夫，奥农，法国

   Agnès destract - irvine & Serge Delrot

贡献

实验由GRC、SD和AD-I设计。RG在RNO中采集浆果，分析白度水平，提取RNA。原始数据使用GRC的PN40024基因组注释进行分析，而NC使用新的赤霞珠基因组注释进行分析，进行WGCNA，并辅助TPMs的估计。GRC对数据进行处理和分析，撰写论文主体。所有作者审查，编辑和批准最终版本的手稿。

相应的作者

对应到格兰特·r·克莱默．

伦理认可和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们之间没有利益冲突。第一作者是BMC植物生物学栏目编辑。第一作者在编辑过程中没有任何作用

出版商的注意

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