锌和镉在烟草根部的积累与锌/镉的状态有关，并伴随锌和镉的特异性表达gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba基因gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

锌(Zn)和镉(Cd)的根到茎的转运取决于这两种金属在培养基中的浓度。先前有关烟草的研究(gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba)指出的贡献gydF4y2BaNtZIP1、NtZIP2 NtZIP4gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtIRT1-likegydF4y2Ba在调节这一现象。为了进一步了解锌和镉的积累、根/梢分布和表达gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba研究了根尖、中根和基根的基因分布。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

研究表明，这两种金属的根冠分布与Zn/Cd状态的依赖性与根系部分明显的金属积累有关。在锌、镉含量较低的培养基中，根尖部金属含量最高;在较高的浓度下，中部和底部是过量金属的主要吸收区。同时伴随根部分特异性表达模式的修饰gydF4y2Ba拉链gydF4y2Ba（gydF4y2BaNtZIP1-like, NtZIP2, NtZIP4A/B, NtZIP5A/B, NtZIP5-like, NtZIP8, NtZIP11, NtIRT1gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtIRT1-likegydF4y2Ba)，就根部分而言，可分为四类。此外，对于较低的Zn/Cd浓度，也注意到了变化gydF4y2BaNtZIP5A / BgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5-likegydF4y2Ba只有gydF4y2Ba，gydF4y2Ba但锌和镉含量较高gydF4y2Ba像ntzip1, ntzip5, NtZIP8, NtZIP11, NtIRT1gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtIRT1-like。NtZIP1,gydF4y2Ba这里改名为gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba克隆并进行了表征。我们发现它是一种锌缺乏诱导的转运蛋白，主要通过中根部分从土壤溶液中吸收锌和镉。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

研究结果表明，Zn和Cd纵向分布的调节具有高度特异性，根尖、根中和根基部在Zn/Cd状态依赖性的控制下对金属向嫩枝的转运效率起着不同的作用，包括在Cd存在下对Zn向嫩枝转运的刺激作用。这些结果为研究Zn和Cd在根部位特异性的独特作用提供了新的认识gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba和其他gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba锌和镉纵向分布的基因及其在调控根-茎易位中的作用。gydF4y2Ba

已知烟草比许多其他物种更能有效地在空气中积累金属(包括锌和镉)[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．因此，它经常被用于植物提取目的[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．另一方面，这些特性使吸烟者有暴露在枝条中积累的镉的风险。因此，深入了解控制金属向芽部转运速率的分子机制，可能产生未来以生物技术为基础的烟草植物地上部分Zn/Cd积累的修饰。gydF4y2Ba

锌稳态的调节途径并不是这种金属特有的。相反，它通过共同途径的调节与其他金属以及包括Cd在内的一些有毒金属的内稳态密切相关。这被称为金属交叉内稳态。它的基础是受多种金属调控的一种金属转运基因，以及具有不同底物特异性的金属转运蛋白或螯合化合物[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．Zn和Cd之间存在着强烈的竞争性相互作用。在整个植株水平上，这些关系主要表现为Zn和Cd的吸收变化和向嫩枝的转运，其方式取决于这两种金属在培养基中的浓度[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．例如，过量的锌会影响Cd. In的吸收和根/梢分布gydF4y2Ba答:hallerigydF4y2Ba或gydF4y2Bat . caerulescensgydF4y2Ba(当前名称,gydF4y2BaNoccaea caerulescens)gydF4y2Ba， Cd向嫩枝的转移受到Zn的竞争性抑制[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．介质/土壤中镉的存在也干扰了锌的吸收和转运。据报道，在镉存在的情况下，锌转移到嫩枝的减少gydF4y2Ban .黄花gydF4y2Ba而且gydF4y2Bat . caerulescencegydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，但在风滚草或gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

尽管这种现象经常发生，但这种现象背后的机制只被零星地描述过。为了进一步了解烟草中这些金属的锌/镉供给依赖的根到茎易位的调控机制，本研究的目的是探讨锌/镉在烟草中可能的作用gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba基因(编码属于ZRT\ irt相关蛋白家族的蛋白质)与两种金属在不同金属浓度下的根/梢分布有关。关注gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba基因来源于基于SSH(抑制性消减杂交)的烟草鉴定gydF4y2BaNtZIP1、NtZIP2 NtZIP4gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIRT1-likegydF4y2Ba在低锌/镉浓度和高锌/镉浓度组合下具有不同表达的基因。这伴随着两种金属的根/梢分配的变化[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．来自ZIP家族的蛋白质介导一系列金属，包括锌和镉，从细胞外空间或从内部存储到细胞质的运输[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba， AtZIP1(定位于液泡体)参与Zn和Mn的转运，Zn-和fe缺乏上调了其表达[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．检测到转运Cd的能力，例如MtZIP1 [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba和OsZIP1 [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba但不是针对新烟草gydF4y2BaNtZIP1-likegydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP11gydF4y2Ba编码锌(而非镉或铁)吸收蛋白的基因[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．AtZIP2从gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba和MtZIP2gydF4y2BaMedicago truncatulagydF4y2Ba是定位于质膜的锌吸收蛋白，尽管AtZIP2也能够运输Mn, Cu，和潜在的Cd [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．作为比较，NtZIP4转运Zn和Cd的能力也已被证明[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba), MnZIP4(从gydF4y2Ba桑属notabilisgydF4y2Ba)[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba], AtIRT1 [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba和PsIRT1 (fromgydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在本研究中，我们重点研究了与Zn和Cd根/芽分区变化和表达模式相关的根特异性过程gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba基因依赖于介质中两种金属的低浓度和高浓度的组合。这是第一次没有对整个根进行分析，而是对根的部分(根尖、中间、基部)进行分析。在这里,九gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba基因(gydF4y2BaNtZIP1-like, NtZIP2, NtZIP4A/B, NtZIP5A/B, NtZIP5-like, NtZIP8, NtZIP11, NtIRT1gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtIRT1-likegydF4y2Ba)被纳入分析。此外，作为详细分析的结果gydF4y2BaNtZIP1gydF4y2Ba改名为gydF4y2BaNtZIP5,gydF4y2Ba和两份副本,gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba,被确定。gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba被克隆和功能鉴定。我们的结果为研究根的三个部分在Zn/Cd状态依赖的积累和表达中的作用提供了新的见解gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba与不同的锌和镉根/梢分配模式相关的基因。gydF4y2Ba

依赖于锌/镉供给的根/冠金属分布gydF4y2Ba

本研究的目的是确定培养基中锌和镉的含量在多大程度上影响这两种金属的根到茎的转运。结果表明，在Zn (0;1;5;10;50 μM)和Cd (0;0.1;0.25;1;4 μM)浓度处理17天，Zn/Cd的积累和转运效率取决于这两种金属的配对组合(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-gydF4y2Ba2gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

随着培养基中Cd浓度的增加(无论伴随的锌水平如何)，植物体内Cd浓度的增加(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa-c)伴随的是根-茎易位效率的降低(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).在每种测试Cd水平下生长的植物的嫩枝中Cd的浓度被伴随的锌浓度所改变(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, b)。有趣的是，在0 Zn/4 μM Cd条件下，枝条中Cd的浓度比含Zn的变体低3- 4倍(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一个);这并不是因为易位率降低(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)，但很可能是由于缺锌情况下缺乏锌时Cd摄取较低所致(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).此外，50 μM Zn的存在减少了Cd的易位(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)，以及随之而来的根部高水平Cd(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)表明Cd在该器官的滞留增强。gydF4y2Ba

镉的存在还改变了锌的茎根分布(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba模拟)。然而，这种模式并不统一。在高(4 μM) Cd的存在下，Zn向枝条的转运减少(相对于不含Cd的培养基)，但只有暴露在5-50 μM Zn的植株。值得注意的是，相反的效果是，在低/中锌浓度(0 ~ 1 μM)下生长的植物，在0.25和1 μM Cd的存在下，观察到锌转运的增加(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

长期暴露于锌和镉对锌向嫩枝转运的镉依赖性刺激的影响gydF4y2Ba

接下来，重点研究了在Zn/Cd组合下检测到的依赖于Cd的Zn根-茎易位刺激(0 Zn + 0.25 μM Cd;1 μM Zn + 0.25 μM Cd;1 μM Zn + 1 μM Cd vs无Cd介质)。金属在根系中的滞留效率是控制其根枝转移速率的关键因素之一。Zn和Cd在不同根系部位的积累主要取决于Zn/Cd浓度的组合。在缺锌条件下，无Cd和0.25 μM Cd存在的植株根尖、中、基部根系中Zn的分布相似，其中根尖部分Zn的浓度最高(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa1)。Zn和Cd含量较高时，Zn分布发生变化，1 μM Zn + 1 μM Cd时，根系中部和基部成为Zn和Cd的主要存储部位(图3a2, b2)。在较低的Zn/Cd浓度(0 Zn + 0.25 μM Cd)的培养基中，Cd在三个根部位的积累保持在相同的水平(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab1)。这些结果表明，在锌缺乏的情况下，根尖部分对锌吸收的重要性，而在较高的金属浓度下，基部部分对金属积累的贡献更大。gydF4y2Ba

九的表达gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba在上述条件下进行基因测定。根尖、中根和根基部之间的差异允许分类gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba基因分为四组(图4)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba模拟)。第一个包含gydF4y2Ba拉链gydF4y2Ba在根尖部分表达最高的(gydF4y2BaNtZIP2 NtZIP5A / B, NtIRT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtIRT1-likegydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa1-a5)。第二个包括gydF4y2BaNtZIP1-likegydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP8gydF4y2Ba在基根部分优先表达(图4b1-b2)。第三种是用gydF4y2BaNtZIP4gydF4y2BaA/B在三个根部分表达相等(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac1)。剩下的gydF4y2BaNtZIP5-likegydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP11gydF4y2Ba为第四组，其特征为中间表达，在不同Zn/Cd浓度组合下根系部分发生不同的变化(图4)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad1-d2)。gydF4y2Ba

此外，每个测试的成绩单水平gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba根尖、中、基根部分的基因依赖于Zn/Cd在培养基中的组合，但程度不同(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．表达被锌的有效性(所有gydF4y2Ba拉链gydF4y2Ba,除了gydF4y2BaNtZIP2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP11,gydF4y2Ba锌缺乏性和锌/Cd浓度比均对其有上调作用。在这里我们研究了根部分特异性表达gydF4y2Ba拉链gydF4y2Ba在不同Zn到Cd浓度的组合(0.25 μM Cd + 0 Zn, 0.25 μM Cd + 1 μM Zn, 1 μM Cd + 1 μM Zn)下，伴随Cd依赖的Zn根-茎转运刺激(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad).在这三种组合中，每一种都不同gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba发现了表达模式。在缺锌培养基中加入0.25 μM Cd可降低gydF4y2BaNtZIP5A / BgydF4y2Ba在所有三个根部(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba就是,)gydF4y2BaNtIRT1gydF4y2Ba在根尖(图4a4)和gydF4y2BaNtZIP5gydF4y2Ba-like在中间部分(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad1)，但在含1 μM Zn的培养基中，其存在导致表达较低gydF4y2BaNtZIP2gydF4y2Ba只在根底部生长。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa1)。此外，在1 μM Cd + 1 μM Zn(相对于0 μM Cd + 1 μM Zn)的组合下，3个根部位的转录水平均显著增加(gydF4y2BaNtZIP11gydF4y2Ba；无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaD2)，在顶端和中部(gydF4y2BaNtZIP8gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB2)，在基部和中部(gydF4y2BaNtZIP1gydF4y2Ba例如;无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB1)，或只在顶端(gydF4y2BaNtZIP5-likegydF4y2Ba，gydF4y2BaNtIRT1-like、NtIRT1 NtZIP5AgydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaD1, a5, a4, a2)。gydF4y2Ba

检测到的根系部位特异性变化表明，在培养基中锌含量低/充足和有毒镉存在/不存在的情况下，根系各部位在矿物质营养中具有不同的功能gydF4y2Ba拉链gydF4y2Ba在学习中发挥具体作用。gydF4y2Ba

Cd短期暴露:表达和积累研究gydF4y2Ba

检测到的几种转录水平增加gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba在1 μM Cd中暴露17天后，基因会发生变化。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba1 μM Cd + 1 μM Zn的短期处理(3 h, 1 d, 3 d)(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)表明cd诱导的gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba(顶端部分)gydF4y2BaNtZIP1gydF4y2Ba-样(所有根部分-图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac, f，和叶-图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).相反的效果，下调gydF4y2BaNtIRT1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtIRT1gydF4y2Ba-样生长在根中部(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad, e)。为了补充研究，确定了锌和镉的根/梢分布(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．结果表明:1 μM Cd + 1 μM Zn暴露3 d后(与不含Cd的培养基相比)，Zn的易位已经增强。gydF4y2Ba

隔离gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba和生物信息学分析gydF4y2Ba

上述实验表明，cd依赖性刺激Zn向嫩枝转运的同时，也伴随着Zn向嫩枝转运的下调gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba特别是在缺锌的情况下。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa3)。为了进一步了解该基因的生理功能，对其进行了克隆和表征。烟草是异位四倍体物种[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，并且在两个副本中存在大量的基因。因此，我们在这里找到了两份gydF4y2BaNtZIP5gydF4y2Ba：gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．详细的生物信息学分析表明gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba核苷酸序列是否与gydF4y2BaNtZIP1gydF4y2Ba之前由Sano等人发现。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，在这里我们提供了基于的数据gydF4y2BaNtZIP1gydF4y2Ba改名为gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们的研究表明gydF4y2BaNtZIP1gydF4y2Ba(acc)。no AB 505626)与描述为NM_001325745.1的核苷酸序列相同gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba锌转运蛋白5-like (LOC107803903) mRNA，与预测的同源性最高(95%)gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba锌转运蛋白5-like (LOC107774100) mRNA (XM_016593570gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．以NM_001325745.1和XM_016593570的核苷酸序列及相应的氨基酸(aa)序列作为Blast搜索烟草同源性最高的基因/蛋白的查询。如附加文件所示gydF4y2Ba2gydF4y2Baa和2b，识别的基因/蛋白代表其他ZIP5gydF4y2Ba-gydF4y2Ba比如烟草和其他物种的ZIP5，它们有100到83%的同一性。这些结果连同来自系统发育分析的数据(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)是更改序列A/B 505626.1/NM_001325745.1名称的基础gydF4y2BaNtZIP1gydF4y2Ba来gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba，命名序列XM_016593570.1gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

的开放阅读框(ORF)gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba/gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba由1017/1029 bp组成，识别率96.46%，编码一个预测蛋白339/343 aa，识别率98.23%。在基因组序列中发现了三个外显子(附加文件2e;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．系统发生关系在一个系统发生树上被证明(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)，并在表中显示了核苷酸和氨基酸水平的序列一致性(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．结果表明，来自不同植物种类的ZIP5蛋白形成了两个不同的分支。首先，NtZIP5A和NtZIP5B与CaZIP5、MnZIP5和MtZIP5聚类，具有83.63 ~ 69.62%的同一性;此外，AtZIP5和AtZIP3位于最近的子分支上。第二个ZIP5枝包括gydF4y2Ba单子叶植物的gydF4y2BaHvZIP5和OsZP5的一致性最低(56.13 ~ 54.13%)。同样，NtZIP5A/B与位于最近分支的ZIP1蛋白(类似ntzip1、AtZIP1和VvZIP1)同源性较低(54.03 ~ 62.54%)。gydF4y2Ba

NtZIP5A/B的aa序列与系统发育树中识别的ZIP5和ZIP1蛋白序列一致(图5。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．与其他植物ZIP家族成员的结构一致，鉴定出8个跨膜结构域(TMD)，一个非常短的c端尾，以及TM结构域III/IV之间的亲水性区域。NtZIP5A/B蛋白的TM III和IV含有潜在的金属结合组氨酸残基。NtZIP5A/B中该区域的长度分别为51/55 aa，这属于工厂zip的典型aa编号范围gydF4y2Ba2gydF4y2Bae).此外，NtZIP5A/B的TM-IV结构域内的氨基酸与提议的ZIP签名结构域匹配[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．然而，在III/IV tdd之间的可变区域内，NtZIP5A有3个组氨酸残基，而NtZIP5B有5个(图4)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在硅分析的启动子区域gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba(1797 bp和1726 bp)，确定了几种gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-受金属和其他非生物应力调节的作用调节元件，在元素的位置和类型方面具有高度的相似性gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在两个拷贝中，我们都在相同的位置发现了ZDRE(缺锌相关元素)、IDE2(缺铁响应元素2)、ABRE和ABRE4(脱落酸响应元素)、MYBgydF4y2Ba-gydF4y2Balike sequence (MYB binding region fromgydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba)、Box 4和GT1(非生物胁迫，如伤害和病原体响应元件)、STRE(应激响应元件)用于热、渗透、低pH值和营养饥饿，以及CAAT-box(常见的顺式作用元件在启动子和增强子区域gydF4y2BaPisum一gydF4y2Ba)，而在不同的位置检测到光响应G-box [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．Box-4和STRE在gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba，而IDE2、ABRE和GT-1占主要地位gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba．此外,四个不同gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-作用元素仅存在于的启动子中gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba: Box-S和W-box(伤害和病原体反应元素)，P-box(吉培林反应元素)，TCT(光反应元素)。启动子区域的排列gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba从三个不同的品种(K326，巴斯马Xanthi和K326)的序列显示相同(附加文件4b-d)。gydF4y2Ba

使用ProtComp程序进行生物信息学分析，以确定NtZIP5B的亚细胞定位[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．如附加文件所示gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，预测NtZIP5B蛋白定位于质膜。gydF4y2Ba

酵母中NtZIP5B的功能分析gydF4y2Ba

表达pAG426-的野生型酵母DY1457对Cd的敏感性增加gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba与野生型表达的pAG426比较(图。gydF4y2Ba10gydF4y2Baa) NtZIP5B参与Cd摄取。表达pAG426 -gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba在gydF4y2Bazrt1zrt2ΔgydF4y2Ba随着EGTA浓度的增加，突变系在最小培养基上的生长得到改善(图。gydF4y2Ba10gydF4y2Bab).此外，它还增强了对高锌的敏感性(图5)。gydF4y2Ba10gydF4y2Bac).这两个结果都表明NtZIP5B介导了Zn的吸收。gydF4y2Ba

组织的表达gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba

分析gydF4y2BaNtZIP5Bprom-GUSgydF4y2Ba转基因烟草(7个纯合子T2系)在对照条件下无表达(图。gydF4y2Ba11gydF4y2Baa1-a2)，在缺锌时诱导(g. 11b1, b2)。gydF4y2Ba

在基根部分未检测到GUS活性(图。gydF4y2Ba11gydF4y2Bab1-a b1-b)。在根尖的所有组织(除了静止的中心和根冠)和新形成的侧根中都发现了高水平的多糖。gydF4y2Ba11gydF4y2BaB1-c, b1-d, b1-e, b1-f, b1-g, b1-h)。在距离根尖约4mm处表皮的染色强度增加，在更成熟的区域进一步上升，主要定位于表皮(图。gydF4y2Ba11gydF4y2Bab1-i b1-j)。这些结果表明，NtZIP5B有助于表皮细胞从培养基中吸收矿物质，也有助于由内部组织组成的细胞从外质体吸收矿物质。这种功能只针对某些根部分，主要是根尖部分的成熟节段。gydF4y2Ba

有趣的是，在叶片中，GUS活性低且分布不均匀(图11b2)。这样的分布gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba通过直接对新鲜叶片切片进行组织化学染色来确定表达位点(图1)。gydF4y2Ba11gydF4y2Bab3)。各组叶肉细胞可见蓝色染色。gydF4y2Ba11gydF4y2Bab3-a b3-b)。因此视觉上难以区分的叶肉细胞吸收锌的能力不同。gydF4y2Ba

根尖、根中、根基部是根的不同组成部分，对锌、镉的吸收和镉对锌向嫩枝转运的依赖有特定的作用gydF4y2Ba

我们的研究表明，在缺乏锌和培养基中锌含量为1 μM的烟草中，镉的存在增加了锌向嫩枝的转运。在较高的锌浓度下，这种效应消失(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad). Zn和Cd之间的竞争性相互作用改变了这两种金属的根-茎易位效率[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]，但其潜在机制仍不清楚。两个基本过程对金属根/梢分配的调节起决定性作用;(i)在根细胞中的隔离，这决定了金属对木质部装载的有效性，(ii)装载到木质部的效率[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．目前的大多数研究都是在纵向上由处于不同发育阶段(分生组织、分化、一级和二级结构)的区域组成的整个根上进行的。目前尚不清楚是否每个区域在金属根枝分布的调节中起着不同的作用。gydF4y2Ba

在本研究中，比较了不同Zn/Cd浓度组合下Zn和Cd在三个根部位的积累情况。因此，添加了Cd的实验变体(其中发生了Zn易位的刺激)与不添加Cd的参考组合(0 μM Zn + 0.25 μM Cd)进行了比较gydF4y2BavsgydF4y2Ba0 μM Zn + 0 μM Cd);(1 μM Zn + 0.25 μM CdgydF4y2BavsgydF4y2Ba1 μM Zn + 0 μM Cd);(1 μM Zn + 1 μM CdgydF4y2BavsgydF4y2Ba1 μM Zn + 0 μM Cd)。我们发现，根尖、根中和根基部积累锌和镉的能力是不同的，取决于土壤溶液中这两种金属的浓度(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．Zn和Cd的根系部分特异性分布取决于Zn/Cd的状态，这表明根尖、中、基根系部分在这两种金属的保留中起着不同的作用，从而调节它们向嫩枝的转运。在缺锌条件下，根系整体锌浓度较低(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)，因此以顶端部分金属含量最高为特征的分布模式(图3a1)可能反映了向分化细胞提供锌的必要性。当Zn和Cd浓度增加时，根的中部和基部承担了吸收多余金属的主要作用(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA2, b2)，这可能保护幼尖区免受它们的毒性。尚不清楚在较高的金属状态下是否涉及到金属的再分布，或者是否直接由中间部分(甚至基底部分)从介质中吸收受到了刺激。机制仍然未知，因为迄今为止，既没有考虑到根部分的金属积累能力，也没有考虑到它们的特定表达模式。只有少数研究证实了金属流入的纵向变化。例如，Laporte等[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba的纵向易位效率gydF4y2Ba^109gydF4y2BaCd局部施用量低，吸收量大gydF4y2Ba^109gydF4y2Ba一级向日葵根尖的Cd含量是基部的2.9倍。根系部分对锌、镉的特异保留和有效再分配较少gydF4y2Ba^109gydF4y2BaCd比gydF4y2Ba^65gydF4y2BaPage和Feller也报告了Zn [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．他们提出了木质部到韧皮部的转移的作用gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba锌和gydF4y2Ba^109gydF4y2BaCd在根系中所占的比例调节着两种金属在根系中的纵向分布。gydF4y2Ba

重要的是发现了这两种金属在根系部分之间的锌/镉状态依赖分布(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)伴随而来的是gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba的表达模式，可分为四类(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．第一类包括gydF4y2BaNtZIP2gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtIRT1 NtZIP5A / BgydF4y2Ba，gydF4y2BaNtIRT1-likegydF4y2Ba最高的:在顶端部分表达最高的;第二组为基底部表达量最高的(gydF4y2BaNtZIP1-likegydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP8gydF4y2Ba）;第三个代表是gydF4y2BaNtZIP4A / BgydF4y2Ba三根部表达一致;第四种是由对根的任何部分都没有特异性表达的基因(gydF4y2BaNtZIP5gydF4y2Ba例如,gydF4y2BaNtZIP11gydF4y2Ba)．这些观察揭示了金属转移在整个根及其组织中随金属状态变化而调节的复杂性，并表明在特定的锌和镉浓度组合下，根尖、中间和基部部分存在特定的信号。纵向分布的调控需要大量基因参与金属的吸收、金属在特定根部的保留或有效的再分配，以及金属向茎部的转移。gydF4y2Ba

七个gydF4y2Ba拉链gydF4y2Ba缺锌诱导，仅在根尖部分有上调gydF4y2BaNtIRT1-likegydF4y2Ba，到顶端和中间的部分gydF4y2BaNtIRT1,gydF4y2Ba到中间和基部的部分gydF4y2BaNtZIP8gydF4y2Ba，并到所有根部分为gydF4y2BaNtZIP1-like, NtZIP5A/B, NtZIP5-like, NtZIP4A/BgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．此外，我们检测到在1 μM Cd的环境中暴露17天后，其表达上调gydF4y2BaNtIRT1 NtZIP1-like,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP11gydF4y2Ba在所有三个根部分，gydF4y2BaNtZIP5A / BgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5-likegydF4y2Ba在根尖部分，和gydF4y2BaNtZIP8gydF4y2Ba根尖和中部(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．我们知道，长期治疗后转录本水平的提高不一定表明Cd本身的上调，但可能是金属稳态的次生变化[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]，进行短期暴露(3 h或1天)。检测到的upregulationgydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba在根尖部分，和gydF4y2BaNtZIP1gydF4y2Ba-like在所有根部位，并下调gydF4y2BaNtIRT1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtIRT1-likegydF4y2Ba在中间的根部(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)建议Cd对根部分的特异性调节。gydF4y2Ba52gydF4y2Ba的表达上调gydF4y2BaNtIRT1gydF4y2Ba和Barabasz等人。[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba的差别,对这些gydF4y2BaNtZIP4A / BgydF4y2Ba叶片暴露在4 μM Cd下3 d，根系不受影响。gydF4y2Ba

从这里描述的结果，我们得出结论，锌和镉的纵向分布的调节是高度特异性的，根尖、中间和基部部分在积累中发挥特定的作用，并很可能在控制金属向嫩枝转运的效率方面发挥特定的作用，包括检测到的在镉存在时锌向嫩枝转运的刺激(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在此，根据不同的表达进行测试gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba在含Cd培养基和不含Cd对照培养基的组合中，根系部分基因的变化，gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba转运蛋白被确定为参与锌易位刺激的候选者(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．然而，如图形摘要(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，结果表明，对于每种锌/镉浓度的组合，是不同的gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba确定了表达修饰的基因:(i)gydF4y2BaNtZIP5gydF4y2Ba例如,gydF4y2BaNtZIP5A / BgydF4y2Ba0 μM Zn + 0.25 μM Cd;(2)gydF4y2BaNtZIP2gydF4y2Ba1 μM Zn + 0.25 μM Cd， (iii)gydF4y2BaNtZIP11, NtZIP8, NtZIP1-like, NtIRT1, NtIRT1-like，gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5 -gydF4y2Ba因此，在不同的Zn和Cd浓度组合(0 μM Zn + 0.25 μM Cd;1 μM Zn + 0.25 μM Cd;1 μM Zn + 1 μM Cd)与不同的修饰表达gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba基因在根部分特定的方式(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．这表明，在不同的Zn/Cd浓度的培养基中，不同的分子机制或调控过程可能参与了Cd依赖性刺激Zn向嫩枝转运的过程。这可能与测试组合中不同的金属状态有关(包括由于Cd的存在而暴露在低和严重的压力下)，这些金属状态决定了参与不同防御机制的基因的表达模式[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．为了充分理解潜在的机制，需要进一步的研究来确定金属跨稳态网络的所有调控成分。gydF4y2Ba

NtZIP5A / BgydF4y2Ba一种新的锌缺乏症诱导转运蛋白，参与锌和Cd的摄取gydF4y2Ba

NtZIP1gydF4y2Ba(AB505626 / NM_001325745.1)首次由Sano等人克隆。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba从烟草的BY-2细胞中提取。然而，他主要关注gydF4y2BaNtNRAMP1gydF4y2Ba，并仅作初步研究gydF4y2BaNtZIP1gydF4y2Ba是执行。在我们的研究中，我们重新命名了基因gydF4y2BaNtZIP1gydF4y2Ba作为gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba基于详细的生物信息学分析和克隆。首先，与NM_001325745.1(在NCBI数据库中识别)同源性最高的序列均属于NM_001325745.1gydF4y2BaZIP5gydF4y2Ba基因(附加文件2c-e)。其次，对预测蛋白的系统发育分析表明，烟草NtZIP5A/NtZIP5B与双子子CaZIP5、MnZIP5、MtZIP5、AtZIP5和AtZIP3形成了一个独特的分支。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)，而两个单子科HvZIP5和OsZIP5则形成了一个单独的分支。这些表明功能上的分歧gydF4y2Ba双子叶gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba单子叶植物的gydF4y2BaZIP5转运蛋白。此外，预测的NtZIP5A/NtZIPB的氨基酸与其他ZIP蛋白的对齐(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)也表现出高度的序列保守性，具有典型的ZIP结构(8个跨膜结构域，一个短的c端尾，一个包含组氨酸残基的TM3-TM4之间的可变区域)[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

此外，酵母生长试验使用gydF4y2Bazrt1zrt2gydF4y2Ba突变系和野生型表达gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba表明Zn和Cd是底物(图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．结合硅片生物信息学分析，提示NtZIP5B在质膜中的定位gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，这些结果指出了这种蛋白质在锌和镉的摄取中的作用。作为对比，HvZIP5、OsZIP5、MtZIP5和ZmZIP5也被证明是锌吸收蛋白，而且HvZIP5、OsZIP5和ZmZIP5已经定位于质膜[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在烟草基因组中，大多数基因存在于两个拷贝中，来自于两个祖先中的一个，gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba或gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba［gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在这里,两个gydF4y2BaNtZIP5gydF4y2Ba同源基因,gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba，被识别(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，这与gydF4y2BaNtMTP1agydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtMTP1bgydF4y2Ba,或gydF4y2BaNtHMA4gydF4y2Baα,gydF4y2BaNtHMA4gydF4y2Baβ(gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．在我们的研究中，比较的表达模式gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba存在于根的顶端、中部和基部(图4a1-a5)，在叶中无表达(图4a1-a5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，表明它们在调节金属稳态方面具有相似的功能。的分析gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-作用元件在启动子区域内的newgydF4y2BaNtZIP5A / BgydF4y2Ba在缺锌条件下，ZDRE基因中负责上调的ZDRE元件数量和定位相同[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]和两个ide2(缺铁反应型元素2)[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．因此,这两个gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba可能在调节金属内稳态中起着类似的作用。许多其他调控序列也显示出身份，然而，四个元素的例外，只在gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba启动子，它们是对损伤和病原体(Box S和W-box)、光(TCT motif)和赤霉素(P-box)反应的调节因子(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．因此相比之下,gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba，有人可能会这么推测gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba是否可以更广泛地参与由多种因素诱导的信号传导途径gydF4y2Ba．gydF4y2Ba有趣的是，负责对各种非生物和生物胁迫以及脱落酸(ABA)响应的序列的存在，可能不仅表明了金属转运蛋白受多种因素调节的机制的存在，而且也表明了锌稳态在植物对这些胁迫响应中的重要性。这可能是跨稳态的表现，不仅在不同的金属之间，而且在非生物和生物胁迫之间。gydF4y2Ba

此外，通过GUS表达分析，NtZIP5B在缺锌条件下主要向根组织提供Zn(图5)。gydF4y2Ba11gydF4y2Bab1)。在所有组织的顶端分生组织中均检测到强表达(图。gydF4y2Ba11gydF4y2Bab1-e, b1-f, b1-g)和更上面的表皮(图。gydF4y2Ba11gydF4y2BaB1-i, b1-j)指出它在从介质中吸收矿物质方面的作用。NtZIP5B是一种新的ZIP蛋白，它直接参与了从土壤溶液中吸收Zn的过程。这种功能最初被归因于IRT1蛋白[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，亦转至IRT3 [gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]，最近为NtZIP4B，它为整个根提供锌直到其基部，除了极顶端分生组织[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．NtZIP5B也向栅栏薄壁组织细胞提供金属，但有趣的是，并不是横跨整个叶片(图11b2, b3)，这表明叶肉细胞具有独特的储存锌的能力，正如Siemianowski等人所认为的那样。[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

结果表明，根尖、根中和根基部对Zn和Cd的固存作用不同，其固存作用取决于两种金属浓度的倒数组合。检测到的金属在根内的分布规律可以被认为是保护根尖内年轻分生组织细胞的一种机制。此外，它可能有助于调节Zn/Cd根-茎分布，可能是通过形成一个金属池可转运到嫩枝。其次，确定了烟草根部位特异性表达模式的种类gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba依赖于Zn/Cd状态的基因首次揭示了Zn和Cd之间调控交叉对话的复杂性。这是决定金属在根系部位之间分布的关键因素，也是调控金属根-茎易位的基础过程的贡献，包括在Cd存在时Zn易位的刺激和相关的表达水平的变化gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba基因。我们是第一个发现gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba基因在这一过程中，虽然要得到一个完整的图像，不仅需要充分了解它们的生理作用，而且还需要识别其他协同作用的基因。gydF4y2Ba

此外，我们得出结论，新克隆的烟草gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba是一种缺锌诱导转运蛋白，参与从土壤溶液中吸收锌和Cd。它在根表皮发挥吸收功能，但也向根内部组织如木质部薄壁组织和叶片栅栏薄壁细胞群提供锌。的不规则表达gydF4y2BaNtZIP5gydF4y2Ba栅栏实质内显示这些细胞具有明显的吸收金属的能力。需要进一步的研究来揭示这些细胞的特性。gydF4y2Ba

植物材料、生长条件和处理gydF4y2Ba

这些实验是在烟草(gydF4y2Ba烟草gydF4y2Bavar。萨丁)植物。种子于2002年从波兰华沙生物化学和生物物理研究所获得，此后在华沙大学的温室中进行繁殖，用于我们的实验。植物在上文所述的受控环境室中培育[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在8%次氯酸钠(w/v)中表面灭菌的种子在垂直放置的培养皿中生长三周，培养皿中含有四分之一浓度的Knop 's培养基，2%蔗糖(w/v)和1%琼脂(w/v)。然后将植株转移到加气水培对照培养基(1 / 4强度Knop 's;Barabasz等人给出了合成。[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba])。它们被种植在2 L的花盆中(每盆5株)，时间取决于实验(详情如下)。营养液每3天更换一次。gydF4y2Ba

每次实验结束时收集植物样本。为了进行表达分析，植物材料被冷冻在液氮中，并保存在−80°C。实验在三个独立的生物重复中进行。对于每个实验变种，植物材料被收集和汇集从10到30个总共的植物。gydF4y2Ba

为了测定锌和镉的浓度，根被洗在冰冷的5毫米氯化钙gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba根据Barabasz等人的研究[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．植物样品在50°C干燥，室温(RT)保存，直到分析。gydF4y2Ba

长期的实验gydF4y2Ba

将3周龄的幼苗从琼脂固化培养基转移到水培对照培养基上生长3天，然后暴露在添加不同锌(ZnSO)的对照培养基中17天gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)和Cd(如CdClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)浓度。gydF4y2Ba

为了确定锌和镉的根/梢分配，植物暴露于锌(0;1;5;10;50 μM)和Cd (0;0.25;1;4 μM)浓度，采集全根、全梢。gydF4y2Ba

测定烟草中锌、镉的含量及表达gydF4y2Ba邮政编码gydF4y2Ba根系顶端(远端)、中部(近端)和基部(近端)的基因，暴露于Cd (0;0.25;在1 μM Zn存在或不存在Zn时，收集根系的以下部分:(i)距主根和侧根2.5 cm的根尖(远端)部分(含分生组织、分化区和年轻的原生组织);(ii)基部(近端)部分等于主根总长度的1/4(包括初级组织和在中心圆筒内的次级导电组织);(iii)中间部分构成主根的其余部分(包括初级组织)。根的基部和中间部分仅从主根采集(不定根切除)。考虑到暴露在一组Zn和Cd浓度培养基中的植物根系分枝模式的变化，为了能够比较不同培养基成分下生长的植物的根系样本，只从主根中采集根的基部和中部。gydF4y2Ba

短期实验gydF4y2Ba

将3周龄的幼苗从琼脂固化培养基转移到水培对照培养基上2.5周，然后暴露于锌(0;1 μM)和Cd (0;1 μM) 3 h, 1天，或3天。将叶片(从基部计数的第2和第3个)和根(如上所述收集的)冷冻进行表达分析。Cd处理3 d后，采集处理根和嫩枝，测定Zn和Cd浓度。gydF4y2Ba

记录分析gydF4y2Ba

根据Papierniak等人的描述，进行基于实时定量PCR (qRT-PCR)的分析。[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．简单地说，样本中各转录本的相对数量是根据比较ΔCt(阈值周期)方法计算的[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．作为一种内部控制烟草gydF4y2BaNtPP2AgydF4y2Ba（gydF4y2Ba蛋白磷酸酶2;gydF4y2Ba采用AJ007496)，并在附加文件中给出了其在应用金属浓度范围内的稳定性gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．引物序列列在附加文件中gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．对于每个样本，在三次重复中设置反应来计算平均值。研究至少进行了三次生物重复。gydF4y2Ba

金属浓度的测定gydF4y2Ba

根据Barabasz等人的研究，采用原子吸收分光光度法(AAS)矿化和测定锌和镉浓度。[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．为了比较在不同培养基成分下生长的植物根与根之间锌和Cd的转运效率，将转运因子(TF)确定为根/根锌和Cd浓度的比值[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

克隆gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba以及构造的生成gydF4y2Ba

在本研究中，全长开放阅读框(ORF)gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba用Phusion HF聚合酶(Thermo Scientific)从总RNA上转录的cDNA进行PCR扩增。引物序列在附加文件2c、d和附加文件中给出gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．完整的长度gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba包含STOP密码子的克隆到载体pENTR™/D-TOPO中gydF4y2Ba^RgydF4y2Ba(Invitrogen)，质粒pENTR/D-TOPO-中存在正确的插入gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba通过测序(Genomed，波兰)进行检查。gydF4y2Ba

酵母互补试验用载体pAG426-gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba是由pENTR/D-TOPO-gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba和目的载体pAG426GAL-cccB-EGFP。gydF4y2Ba

的组织特异性表达gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba使用pENTR定向TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)克隆启动子序列。利用基因组序列AWOK01252628.1特异性引物扩增起始密码子上游1726 bp的启动子序列，克隆到载体pENTR/D-TOPO上。CACC序列被添加到正向引物(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．一次全球gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba转换为pENTR/D::gydF4y2BaZIP5BgydF4y2Ba_{毕业舞会gydF4y2Ba}然后对插入物进行测序。的gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba在翻译融合中克隆了启动子gydF4y2BauidAgydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba在目标二进制载体pMDC163中，通过LR重组和插入序列在构造pMDC163::gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba_{毕业舞会gydF4y2Ba}::GUS再次被检查。gydF4y2Ba

NtZIP5序列分析gydF4y2Ba

的核苷酸cDNA序列gydF4y2BaNtZIP5AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba用ExPASy翻译工具翻译成蛋白质序列(gydF4y2Bahttp://web.expasy.org/translate/gydF4y2Ba)．相似性搜索使用BLAST算法进行。使用CLustalW对来自选定植物的NtZIP5A/B和ZIP蛋白进行多重序列比对[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．系统发育树由MEGA 7.0软件构建[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]使用最大似然方法进行1000次自助复制。潜在跨膜结构域用Phobius软件识别[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．识别gydF4y2Ba烟草拉链gydF4y2BaNCBI数据库中的序列，BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool)根据已知序列的同源性进行搜索gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba序列。使用ProtComp v. 9.0在线预测NtZIP4B蛋白的亚细胞定位;gydF4y2Bahttp://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=prolocgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

酵母生长试验gydF4y2Ba

两个gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba实验菌株:(i)野生型DY1457 (MATa, ade1 can1 his3 leu2 trp1 ura3)， (ii)突变型zy3 -gydF4y2Bazrt1zrt2gydF4y2Ba(DY1457 + zrt1::LEU2, zrt2::HIS3)在高和低亲和吸收锌方面存在缺陷。准备的构造pAG426-gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba和空载体pAG426GAL使用醋酸锂协议进行酵母转化[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的gydF4y2Bazrt1zrt2ΔgydF4y2Ba利用高和低亲和力锌吸收缺陷菌株来确定NtZIP5B是否介导锌吸收。按照Barabasz等人的描述来培养酵母。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．简单地说，野生型(WT) DY1457与空载体pAG426GAL转化，突变体gydF4y2Bazrt1zrt2gydF4y2BapAG426 -gydF4y2BaNtZIP5B。gydF4y2Ba然后，在含有0.2 mM锌的SC-URA培养基上与半乳糖培养。将液体培养物置于含有SC-URA的琼脂固化板上，GAL添加0.5 ~ 2mm EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N '，N ' -四乙酸)或0.1 ~ 2mm锌浓度。gydF4y2Ba

为了验证NtZIP5B是否能传递Cd，将WT菌株DY1457与空载体pAG426GAL和载体pAG426-进行转化gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba．在琼脂固化的SC-URA培养基上用含5 ~ 50 μM Cd (CdCl)的GAL培养基培养酵母gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)是监控。gydF4y2Ba

组织的表达gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba_{毕业舞会gydF4y2Ba}：：gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba

pMDC163::gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba_{毕业舞会gydF4y2Ba}：：gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba利用结构对烟叶圆盘进行了转化gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba-中介方法，如前所述[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．选择耐湿霉素转化株。从T1株系中选取T2纯合子系，分离比为3:1(耐受性:敏感性)。gydF4y2Ba

将3周龄的转化株(7系)和野生型从琼脂固化培养基转移到对照水培培养基中3天，然后暴露于无锌(与对照平行)培养基中4天。整株幼苗进行GUS组织化学染色。对具有代表性的个体进行了拍照。使…的表达形象化gydF4y2BaNtZIP5BgydF4y2Ba在组织/细胞水平，染色根片段嵌入3%琼脂糖中，150 μ切片在Vibratome (Leica VT1000S, Heidelberg, Germany)上切割，用于显微镜分析(OPTA-TECH显微镜)。此外，用振动器将新鲜的未染色的叶片横截面进行组织化学染色。根据Barabasz等人的描述，确定了GUS活性。[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

统计显著性评价在0.05概率水平使用Student 'sgydF4y2BatgydF4y2Ba以及。实验至少进行了三个独立重复。gydF4y2Ba

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。gydF4y2Ba

Aa:gydF4y2Ba

氨基酸gydF4y2Ba

原子吸收光谱法:gydF4y2Ba

原子吸收分光光度法gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

ABRE:gydF4y2Ba

脱落acid-responsive元素gydF4y2Ba

爆炸:gydF4y2Ba

基本本地对齐搜索工具gydF4y2Ba

Cd:gydF4y2Ba

镉gydF4y2Ba

铜:gydF4y2Ba

库珀gydF4y2Ba

EGTA:gydF4y2Ba

乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N '，N ' -四乙酸gydF4y2Ba

加:gydF4y2Ba

半乳糖gydF4y2Ba

格斯:gydF4y2Ba

β-glucuronidasegydF4y2Ba

IDE:gydF4y2Ba

铁deficiency-responsive元素gydF4y2Ba

红外热成像:gydF4y2Ba

铁监管转运体gydF4y2Ba

米歇尔。内格罗蓬特:gydF4y2Ba

锰gydF4y2Ba

MYB-like:gydF4y2Ba

Myeloblastosis-likegydF4y2Ba

子:gydF4y2Ba

开放阅读框gydF4y2Ba

RT:gydF4y2Ba

室温gydF4y2Ba

RT-qPCR:gydF4y2Ba

逆转录定量聚合酶链反应gydF4y2Ba

SSH:gydF4y2Ba

差减杂交gydF4y2Ba

压力:gydF4y2Ba

应激反应的元素gydF4y2Ba

战区导弹防御系统:gydF4y2Ba

跨膜域gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

ZDRE:gydF4y2Ba

deficiency-related锌元素gydF4y2Ba

邮政编码:gydF4y2Ba

ZRT /红外热成像相关的蛋白质gydF4y2Ba

锌:gydF4y2Ba

锌gydF4y2Ba

ZRT:gydF4y2Ba

锌相关转运体gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

该研究得到了波兰国家科学中心的资助(授权OPUS 8 No. 2014/15/B/NZ9/02303给DMA)。DMA撰写的拨款提案已被波兰国家科学中心接受资助。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 华沙大学生物学院，实验植物生物学和生物技术研究所，波兰华沙Miecznikowa街1号，02-096gydF4y2Ba

   mayorgorzata palusievska, Anna Barabasz, Katarzyna Kozak, Anna Papierniak, Karolina maievska和Danuta Maria AntosiewiczgydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

MP进行所有实验，进行数据分析;AB贡献了研究概念、表达分析和基于原子吸收法的测量，监督了大部分实验;AP、KK和KM对水培实验有贡献;DMA设计研究概念，协调研究和监督实验，进行数据分析并撰写稿件。所有作者都对手稿进行了严格的修改，并批准了最终版本。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaDanuta玛丽亚AntosiewiczgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用署名4.0国际许可协议发布(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您适当地注明原作者和来源，提供创作共用许可的链接，并说明是否有更改。创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条提供的资料。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba