通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)、SDS-PAGE和MS/MS多肽测序对小麦颗粒白蛋白/球蛋白部分的燕麦样蛋白(ALPs)进行表征gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

小麦谷物类燕麦蛋白是近年来发现的一类小麦谷物贮藏蛋白。小麦籽粒中的alp不仅对面团品质有一定的改善作用，而且还表现出一定的抗真菌活性，这是小麦贮藏蛋白研究的新发现。以前的研究表明，阿尔卑斯可能存在于白蛋白/球蛋白的总蛋白提取小麦粉。然而，这些alp在成熟小麦籽粒中的积累特征尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，共分离了13种阿尔卑斯醛同源物，并在小麦蛋白提取物的白蛋白/球蛋白级分中表征。包括RP-HPLC，SDS-PAGE，MALDI-TOF和肽测序的多种技术的组合用于对个体ALP同源物的准确分离和鉴定。C末端TAALP-BY-4AL / 7DS，TAALP-BY-4AL / 7AS / 7DS，TAALP-BX / 4AL / 7AS / 7DS，TAALP-AY-7DS，TAALP-AY-4AL，TAALP-AX-4AL，Taalp-AX-7AS和Taalp-Ax-7ds首次用小麦粉分离为单独的蛋白质带。将这些独特的AlPS肽映射到IWGSC数据库中的最新小麦基因组组件。还发现白蛋白和球蛋白级分中存在的特征防御相关蛋白，例如蛋白质二硫键 - 异构酶（PDI），晶粒柔软蛋白质（GSP），α-淀粉酶抑制剂（AAIS）和内源性α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂。用这些鉴定的阿尔卑斯醛，饲笛-3和α-胶质剂隔离。与含有Tryp_alpha_amyl结构域（PF00234）的蛋白质和胶质蛋白结构域（PF13016）的蛋白质相比，AlP的分子量范围和电泳分离性质的特征在于，其在植物免疫和粒度质量中起作用。基于其功能域的比对，我们检查了AAI，GSP，Avenin-3，α-Gliadins和AlP的系统发育关系。MALDI-TOF分析表明某些ALP亚基的某些翻译后修改（PTMS）的发生。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们首次报道了存在于小麦颗粒蛋白提取物的白蛋白/球蛋白部分的alp的完整图谱。我们的结论是，大多数阿尔卑斯同源基因在小麦粒中表达。我们在几个阿尔卑斯多肽中发现了PTMs的明确证据。在成熟形式的AlP中鉴定Gliadin结构域（PF13016）和TRYP_ALPHA_AMYL结构域（PF00234）突出了籽粒质量和抗病性的ALP的多功能性质。gydF4y2Ba

多态脯氨酸由几组结构相关的蛋白质组成[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．已知大多数丙嗪含有独特的N-和C末端和重复的中央域[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．脯氨酸超家族最初是在一个共享的半胱氨酸残基骨架的基础上定义的[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．最近，Juhász等人。［gydF4y2Ba8gydF4y2Ba基于IWGSC面包小麦参考基因组序列RefSeq v1.0，建立了新的免疫刺激小麦籽粒脯氨酸和非脯氨酸蛋白参考图谱。在这些重新定义的种子传变应原中，含有疏水种子域的蛋白表现出抗真菌特性，包括皮质细胞圈定蛋白[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，富含甘氨酸的蛋白质[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]和富含脯氨酸的蛋白质[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．卵细胞分泌蛋白[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]也有一个类脯蛋白结构域。脂质转移蛋白(LTP)和非特异性LTP [gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba]有一个LTP-2域。19 kda球蛋白[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，富含半胱氨酸的小蛋白质[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]属于无域富胱氨酸蛋白。相比之下,gydF4y2Baω.gydF4y2Ba-麦胶蛋白和HMW-GSs是无域贫胱氨酸蛋白。的gydF4y2Baα.gydF4y2Ba- 淀粉酶抑制剂（AAI），gydF4y2Baα.gydF4y2Ba-TLYPSIN抑制剂（ATIS）[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba]，GSP [gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba]，嘌呤吲哚啉[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]，gydF4y2Baα.gydF4y2Ba-gliadins [gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba甲苯蛋白样蛋白（A1Ps）均含有探测器α-淀粉域（PF00234）。同时，嘌呤吲哚胺，gydF4y2Baα.gydF4y2Ba麦、流明瓦麦谷gydF4y2Baγ.gydF4y2Ba-gliadins和Alps还有Gliadin域（PF13016）。到目前为止，除了种子萌发过程中营养的储层活性外，胶质蛋白域的功能性尚不清楚。同时，由于小麦粉蛋白的复杂性，这些个体丙蛋白蛋白的完全概况的提取，量化和鉴定挑战，由于小麦粉蛋白的复杂性。gydF4y2Ba

尽管从谷物中提取的水溶蛋白和盐溶蛋白传统上是用稀释的盐溶液提取的[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]，采用新的方法分析和鉴定这些蛋白质组的成分。从小麦粉中提取的水溶性和盐溶性蛋白质已经使用一系列的蛋白质分析方法进行了表征，包括SDS-PAGE、反相高效液相色谱和NH差异沉淀gydF4y2Ba_4gydF4y2BaAc-Meoh，然后是丙酮能够分离来自Gliadins的最丰富的蛋白质[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]．在白蛋白/球蛋白部分中鉴定出了Purothionins、GSP和几种AAIs蛋白，以及几种cm3型α胰蛋白酶抑制剂(ATIs)和一种与燕麦中的燕麦蛋白相关的蛋白[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．众所周知，白蛋白有许多不同的功能，并共享不同的类型，如糖蛋白，淀粉酶抑制剂，丝素，嘌呤硫苷，酶，如碳水化合物酶gydF4y2Baα.gydF4y2Ba- 和gydF4y2BaβgydF4y2Ba- 淀粉酶或蛋白水解酶[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]．在白蛋白的部分中，个别蛋白质组分的代表被证明具有抗病原体的功能。白蛋白，如AAIs和ATIs [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]，蛇素[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]和嘌呤硫苷[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]被认为具有贮藏养分和抑制发芽种子受虫、病原侵害的作用。尽管在其他研究中首次在谷蛋白提取物中发现了少量的阿尔卑斯蛋白[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，阿尔卑斯蛋白与aai、ATIs和avenin-3的进化关系密切，与其他麦胶蛋白相比，阿尔卑斯蛋白缺乏重复基序，提示它们可能也富集在白蛋白和球蛋白提取物中。然而，很难从小麦贮藏蛋白混合物中有效分离出阿尔卑斯蛋白，而且阿尔卑斯蛋白在不同小麦品种中的总体积累情况仍不清楚。到目前为止，在不同小麦品种中分离同源阿尔卑斯各亚基的报道很少。gydF4y2Ba

麸质是在小麦，大麦和黑麦的淀粉胚乳中发现的储存蛋白质。在小麦中，可以在富含贫化的级分中检测到阿尔卑斯醛，包括各种胶林蛋白，谷蛋白，蛋白酶抑制剂和LTPS [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]．ALPs是由于与燕麦中的燕麦蛋白序列同源而命名的[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]，最接近Avenin-3 [gydF4y2Ba46gydF4y2Ba),而gydF4y2Baα.gydF4y2Ba-，gydF4y2Baγ.gydF4y2Ba-gliadins [gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]．卡萨达等人[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba[表征了一种名为Farinin的新型Alp，由两种二硫化物连接的小多肽组成，随后在ASN-Glu（N-E）肽键处的前体多肽的蛋白水解裂解之后。研究主要是通过将Farinins（Alps）掺入谷蛋白的氨基聚合物（GMP）中的面团功能质量改善[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]．此外，发现Taalp-7a的功能等位基因变化与更好的加工质量相关[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]．综上所述，利用已有的知识，改性alp是一种潜在的方法，可以为粮食工业制造更好的面团。gydF4y2Ba

ALP蛋白及其在面团品质的功能吸引了越来越多的研究人身注意力。古等人。［gydF4y2Ba51gydF4y2Ba发现一些储存蛋白，如HMW谷蛋白，球蛋白和阿尔卑斯毒素，显示出在水缺乏环境下的上调表达，这可能会使面包质量受益。最近的蛋白质组学研究表明，早期的干旱胁迫会影响小麦储存蛋白的表达，如授粉后3天的胶林蛋白，谷蛋白和阿尔卑斯毒素（DAP），此外，误导表达与开发中的细胞骨架组织和谷物质量蛋白相关种子[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]．使用Mixolab-面团分析系统，Wang等人。［gydF4y2Ba53gydF4y2Ba据报道，淀粉表面蛋白（Gliadins，B型AlPS，LMW-GSS和部分球蛋白）在普通小麦和蜡质小麦中显示出不同的性能与混合和热处理。最近，许多储存蛋白质，包括HMW-GS，Gliadins，球蛋白，阿尔卑斯毒素，脑片和gydF4y2Baω.gydF4y2Ba-secalin在小麦胚乳和胚中已被鉴定，在粒重和面团质量不同的两种小麦之间，在蛋白质水平上表现出差异积累，表明阿尔卑斯在一定程度上是造成品质差异的原因[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]．基于Altenbach等人的研究。［gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]，淀粉蛋白(alp)在sds可提取聚合蛋白(EPP)中占2.6 ~ 3.1%，在sds不可提取聚合蛋白(UPP)中占1.9 ~ 2.4%，且受花期后施肥影响。据报道，alp的b型亚基(bx和by)均具有非功能性假基因gydF4y2BaBrachypodium distachyongydF4y2BaL登记入册,gydF4y2Ba小麦属植物dicoccoidesgydF4y2Ba,gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]．最近，更多的新的等位基因gydF4y2Ba高山gydF4y2Ba被发现在gydF4y2Ba山羊草属tauschiigydF4y2Ba肋骨。加入[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]．尽管阿尔卑斯对面团质量有影响，但也有人研究了阿尔卑斯的多功能特性。Gao等人发现[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba利用酵母双杂交文库筛选干旱胁迫反应转录因子TaERFL1a与a型碱性磷酸酶之间潜在的蛋白-蛋白互作。同时，Zhang等人[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]筛选了WEW系的ALP基因多态性，发现ALP基因进化与环境参数之间的关系。此外，对全基因组进行了详细的系统发育分析gydF4y2BaTaalps.gydF4y2Ba基因及其亲密亲属与小麦和其他单焦炭物种[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，提示alp可能具有类似的蛋白酶抑制活性gydF4y2Baα.gydF4y2Ba-淀粉酶抑制剂(aai)，而alp的底物可以进一步确定。Zhang等人研究了alp及其潜在的抗枯萎病功能[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，进一步说明其抗真菌性能。其他研究表明ALP b型是次要贮藏蛋白，对保护胚乳淀粉储备不被降解很重要[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]．据报道，一种假定的ALP b型，包括谷类型aai，以及蛇形蛋白z1c类防御蛋白，因CO升高而增加gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]．另一项新的研究表明，在冬小麦(品种)中诱导一种碱性磷酸酶和一种几丁质酶。(博洛尼亚)谷物，不仅仅是因为CO的增加gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，但可能与微生物种群相关联[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]，例如某些具有抗菌活性的多功能储存球蛋白的积累[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和SDS-PAGE (SDS-PAGE)分离技术，对两个不同品质的澳大利亚小麦品种的ALPs进行了鉴定，并对ALPs的电泳迁移率、组成和提取特性进行了表征。采用多肽和蛋白质质量鉴定方法MALDI-TOF和MS/MS对ALPs基因组的不同亚基进行了鉴别。gydF4y2Ba

普通小麦品种中阿尔卑斯山的等位基因变异gydF4y2Ba

确定等位基因变异gydF4y2BaTaALPgydF4y2Ba不同小麦品种之间的基因，共克隆了总共15个推定的ALP基因用于桑切尔测序。通过序列比对揭示了两种小麦品种烟雾和芯片中所推断的AlPS氨基酸序列的等位基因变化。仅针对3个候选基因鉴定氨基酸取代：gydF4y2BaTaalp-BX-7asgydF4y2Ba，gydF4y2BaTaalp-by-7asgydF4y2Ba和gydF4y2BaTaALP-ax-4ALgydF4y2Ba．如图1所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa，spitfire显示了一个预先成熟的密码子gydF4y2BaTaalp-by-7asgydF4y2Ba，而Mace含有一个过早成熟的终止密码子gydF4y2BaTaalp-BX-7asgydF4y2Ba．此外，在Spitfire和Mace之间也观察到一些非同义突变gydF4y2BaTaalp-BX-7asgydF4y2Ba和gydF4y2BaTaalp-by-7asgydF4y2Ba．基于序列对准（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab），gydF4y2BaTaALP-ax-4ALgydF4y2Ba等位基因可分为三种类型（等位基因-a，-b和-c）。对于该基因，鉴定了Spitfire和MacegydF4y2BaTaalp-Ax-4al-BgydF4y2Ba和gydF4y2BaTaalp-Ax-4al-CgydF4y2Ba,分别。除选定的3个ALP基因外，Spitfire和Mace的其他基因均无变异gydF4y2BaTaALPgydF4y2Ba小麦基因组存在的基因。gydF4y2Ba

通过序列比对和三级蛋白结构建模分析，研究了TaALP-ax-4AL等位变异在CS(−a)、Spitfire(−b)和Mace(−c)中的潜在蛋白功能效应。如图1所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa，在三个Taalps中总共14个半胱氨酸残基严格保守。在CS和芯片之间鉴定出11种残基取代。在Cs和Spitfire的Taalp-Ax-4蛋白中存在单个氨基酸取代（S169 N）。为CS和MACE中的Taalp-Ax-4产生三级结构模型。烟雾中Taalp-Ax-4的蛋白质结构由CS模型表示。结构叠加（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）表明，Taalp同源物的三级结构通常是保守的。CS和MACE蛋白质模型包括4个主要alpha-螺旋，以及2个短螺旋。在C末端的Cs和Spitfire之间的单个氨基酸取代（S169N）位于C-末端的柔性环区域，表明对蛋白质功能几乎没有影响。在CS和MACE之间的11个替换中，4（Q79H，A92S，M136 T和G137R）位于螺旋区域。疏水性剖面比较（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac）表明，所有这4个取代使2个蛋白质之间的疏水性变化，表明酶功能的潜在方差。其他氨基酸取代主要在柔性环区域中发现，在G125R中鉴定出显着的疏水性变化（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。在Cs和Spitfire中的Taalp-Ax-4Al蛋白之间的单个氨基酸取代S169n显示出疏水性变化，表明这2个蛋白质的潜在相同的酶功能。gydF4y2Ba

白蛋白和球蛋白蛋白的分离和鉴定gydF4y2Ba

为研究小麦贮藏蛋白的蛋白质组成，从小麦面粉(品种Mace)中提取白蛋白和球蛋白。建立了蛋白质分离的反相高效液相色谱法。如图1所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa，共选择20个HPLC峰进行分析。收集的峰样品在SDS-PAGE凝胶上进行分离。每个峰的一维SDS-PAGE图谱如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB（峰值1-11）和图1。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac(峰值12-20)。值得注意的是，每个HPLC峰都有多个条带。根据分子量(MW)预测，推测的ALPs蛋白被鉴定为分子量在17-19 kDa和28-32 kDa左右的蛋白条带，对应于1a、1b、6a、11b和13e条带(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）。这些蛋白质显示在17-26.5分钟的保留时间（RT）（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab,额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.此外，推测的AAIs如CM2和CM3被认为是蛋白条带(2a, 6b和7a，图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）MW低于17 KDA。这些蛋白质落入峰值2,6和7，在23.8-25分钟的室温下（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.同样，1b和2a蛋白条带被鉴定为GSP (MW低于17 kDa)，分别位于峰1和峰2,RT时间为15.6-18.3 min(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Baα.gydF4y2Ba-醇溶蛋白的分子量在31-40 kDa左右，在9-14峰中发现大量的-醇溶蛋白，对应于在22.4-27.5 min的RTgydF4y2Baγ.gydF4y2Ba-醇溶蛋白(MW 31-40 kDa)在峰15-19中含量丰富，RT在28.2-38 min(另加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.从蛋白质带13d和16d中发现饲笛-3（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac)在第13和16峰，RT在29.4-32.5 min(附加文件1)。综合这些结果，这些结果表明，同源ALPs的各种类型和亚基都存在，并与aai、GSP、gydF4y2Baα.gydF4y2Ba醇溶蛋白和avenin-3。gydF4y2Ba

阿尔卑斯和其他白蛋白和球蛋白蛋白的分类gydF4y2Ba

阿尔卑斯蛋白包含一个信号肽和两个蛋白结构域:麦醇蛋白结构域(PF13016)和Tryp_alpha_amyl结构域(PF00234)，这些结构域也存在于其他白蛋白和球蛋白中，如燕麦蛋白3、麦醇蛋白、GSP和aai。为了研究不同类型的阿尔卑斯蛋白的进化关系，以及它们与其他共分离的白蛋白和球蛋白的关系，基于Gliadin结构域(PF13016)的序列比对，构建了两个最大似然(Maximum likelihood, ML)系统发育(图13016)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa）和tryp_alpha_amyl结构域（pf00234）（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba分别b)。域序列可以在附加文件中找到gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．值得注意的是，B类ALP序列含有2个富含半胱氨酸的胶质蛋白域（R1和R2）[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]．如图1所示。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA和b，两种系统发育的整体拓扑结构高度一致和保守，表明这两个结构域已经垂直进化，并在不同蛋白亚家族之间发生分化之前就已经存在。系统发育分支分别为GSP、aai、avenin-3/gliadin和ALPs。在这两种系统发育中，GSP和AAIs首先分化，其次是avenin-3和gliadin。后两组蛋白表现出密切的相互关系。在这两种系统发育树中，alp被发现是最新进化的蛋白质，进一步分为6个分支:c型、ax型、ay型、bx-R1型、bx-R2型和by型。其中，c型、ax型和ay型聚在一起，而另一种b型阿尔卑斯形成一个分支。有趣的是，在这两种系统发育情况中，alp的R2结构域与bx alp的R2结构域的关系更密切，而alp的R1结构域与R2结构域的关系更密切。这一观察结果支持了alp的类型可能来源于by- r1型域和bx-R2型域的相邻。gydF4y2Ba

小麦品种中的RP-HPLC分馏的ALP鉴定烟雾和术gydF4y2Ba

为研究alp在不同小麦品种中的组成变化，分别从Mace和Spitfire两个小麦品种中提取了总白蛋白和球蛋白。Mace是高产稳产品种，Spitfire则是产量稍低但蛋白质含量较高(≥13%)的品种[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]．这两个品种具有不同的面包制作特性[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]．在本试验中，Mace和Spitfire的籽粒蛋白质含量分别为12.14和14.22%。Mace和Spitfire的含水率分别为12.67和12.31%。采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)、SDS-PAGE、多肽测序和MALDI-TOF技术对ALPs进行鉴定。小麦品种锏(Mace)的不同色谱谱图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba通过使用两个RP-HPLC柱（相同的型号）导致。我们将旧柱用于20峰（从15分钟到38分钟）靶向所有蛋白质和球蛋白。后来我们购买了一个新栏，并获得了相同样本的36个峰值（0-38分钟）。如图1所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB, 0-15分钟内1-7峰无目标蛋白。所以这个时间差异并不影响我们的结果。根据这个观察，在随后的运行中，只有15-38分钟是目标。这第二次运行是用来明确识别阿尔卑斯山的。gydF4y2Ba

对于Mace，共36个洗脱峰(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa)经反相高效液相色谱分离鉴定。这些峰被加载到SDS-PAGE凝胶上进一步分离。如图1所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab，大多数HPLC馏分含有不同分子量的蛋白质混合物。这些蛋白的MWs接近或低于预测的阿尔卑斯MWs(两个域~ 33 kDa和一个域~ 19 kDa)被选为假设的阿尔卑斯，并从PAGE凝胶中提取，通过肽测序和MALDI-TOF分析进一步鉴定。多肽测序结果显示，有27条目的蛋白带被鉴定为真正的阿尔卑斯蛋白(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA-B，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.这些蛋白条带分布在21个HPLC峰中，峰数为8-20和24-30。在Mace中发现的ALPs中，a型和b型ALPs均存在。值得注意的是，对于小麦品种Mace来说，a型阿尔卑斯与之前预测的小麦基因组中ALP同源物相比，显示出等位变异gydF4y2BaTaalp-Ax-4al-CgydF4y2Ba而b型阿尔卑斯在7A染色体上有一个伪基因gydF4y2BaTaalp-BX-7asgydF4y2Ba沉默的等位基因。特别是，在HPLC峰值数10-11,17-20＆24-30的14个带中发现了5型AlpS旁边度（Taalp-Ay-7ds / 4AL，Taalp-Ax-4AL / 7A / 7ds）（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA-B，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.通过MALDI-TOF分析验证这些阿尔卑斯醛的MWS（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab-f)，与TaALP-ay-7DS (18.42 kDa)、TaALP-ay-4AL (18.47 kDa)、TaALP-ax-4AL (19.47 kDa)、TaALP-ax-7AS (18.75 kDa)和TaALP-ax-7DS (17.90 kDa)的理论预测值一致gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.另有15条蛋白条带(8a, 9a, 11a-18a, 20a)被& bx鉴定为b型(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.有趣的是，另外3个波段(8b, 9b和10 b)被鉴定为部分TaALP-by-4AL/7DS，显示约18.34 kDa的MW(图)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)，而典型的全长b型阿尔卑斯山TaALP-by-4AL和TaALP-by-7DS的MW分别为31.84 kDa和31.95 kDagydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这一观察结果表明TaALP-by-4AL/7DS发生了专门的畴间劈裂。此外，8a、9a、11a和12a蛋白条带中还发现了两种不同MWs (~ 33.32 kDa和~ 28.19 kDa)的ALPs。这一观察仅涉及TaALP-by-4AL/7AS/7DS，并被MALDI-TOF分析证实(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).有趣的是，在MALDI-TOF分析中也检测到这3种alp的第三种形式(TaALP-by-4AL/7AS/7DS)，其分子量约为28.62 kDa。gydF4y2Ba6gydF4y2BaC）。这些异常形式的逐alp可能是由于在MyRistoylation地点的全长B Alp的裂解中产生的，预计仅在某些阿尔卑斯山（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.然而，当肉豆素酰化位点发生裂解时，“by”ALP亚基、TaALP-by-4AL、TaALP-by-7AS、TaALP-by-7DS的理论计算分子量分别为26.10 kDa、27.01 kDa和27.41 kDa，均小于MALDI-TOF谱gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.与by型ALPs相比，在13a-18a和20a波段所鉴定的-bx型ALPs (TaALP-bx-4AL/7DS)均为全长ALPs, MW在32.81 kDa左右(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)，而全长“bx”阿尔卑斯TaALP-bx-4AL和TaALP-bx-7DS的MW分别为32.86 kDa和32.46 kDagydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这一观察结果与bx型alp未预测豆蔻酰化位点的事实相一致(见表1)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.虽然已确定了肉豆蔻酰化位点，但实际的生化反应是假设的，需要进一步研究。gydF4y2Ba

除了MACE，还在喷头上进行了类似的分析。已经鉴定了烟雾中蛋白质提取的30个HPLC峰（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac)，比梅斯的36个峰要少。通过SDS-PAGE凝胶进一步分离还表明，这些HPLC峰组分中大多数含有不同分子量的蛋白质混合物(图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad).使用相同的策略选择目标ALPs蛋白，从而选择24个SDS-PAGE条带进行肽测序和MALDI-TOF分析。测序结果显示，阿尔卑斯蛋白存在23个波段，分布在15个峰中，HPLC峰数为7,9 - 10,12 - 14和16-24gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac - d,附加的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.值得注意的是，对于小麦品种烟雾，B型和型阿尔卑斯型阿尔卑斯阿尔卑斯山脉与以前预测的小麦基因组中的ALP同源物相比显示了等位基因变异gydF4y2BaTaALP-bx-7AS-spitfiregydF4y2Ba功能等位基因,gydF4y2BaTaALP-by-7AS-spitfiregydF4y2Ba沉默的等位基因和gydF4y2BaTaalp-Ax-4al-BgydF4y2Ba等位基因。与Mace相似，HPLC峰数9 - 10,12 - 13,18 - 24分别鉴定出5种a型阿尔卑斯(TaALP-ay-4AL/7DS, TaALP-ax-4AL/7AS/7DS)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac - d,附加的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，显示出与计算计算一致的mww，这被MALDI-TOF分析进一步证实。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac, f-h)。值得注意的是，TaALP-ax-4AL在Spitfire中的分子量和MALDI-TOF谱分别为19.20 kDa和19.27 kDa，小于同系物Mace等位基因(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baf,表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.此外，将Taalp-Ax-4AL-B Spitire等位基因与α-胶质蛋白一起洗脱，同时用AAI洗脱同源术术等位基因Taalp-Ax-4Al-C（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.在烟雾中，分别在带19c和22c中鉴定部分轴亚基，Taalp-ax-7as肽1和Taalp-ax-7as肽2，其可能是由MyRistoylation切割位点的存在产生的（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.共鉴定出8个SDS-PAGE条带(7a-b, 12a, 13a, 14a, 16a-b, 17a)与Mace中的14个条带为b型阿尔卑斯，其中包含type-by和type-bx(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.Taalp-by-4Al和Taalp-By-7ds的计算的MW分别分别为31.84kDa和31.95 kda（表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.然而，MALDI-TOF剖面揭示了32.43 kDa、28.28 kDa和18.41 kDa的MWs的存在(图3)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个)。这表明在术中也观察到了Taalp-By-4AL和Taalp-By-7ds的全长和部分形式的发生。类似地，这两种阿尔卑斯醛的部分形式可能是由肌中织物切割位点的存在产生的（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.MALDI-TOF在Mace中只发现完整的-bx型阿尔卑斯，而Spitfire中则同时发现了-bx型阿尔卑斯的全长和部分形式。其中，计算得到的TaALP-bx-4AL、TaALP-bx-7AS和TaALP-bx-7DS的分子量分别为32.86 kDa、32.39 kDa和32.46 kDagydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.MALDI-TOF剖面鉴定出MWs分别为32.78 kDa、32.67 kDa、31.52 kDa、30.26 kDa、25.97 kDa和27.61 kDa的bx型阿尔卑斯山脉(图)。gydF4y2Ba7gydF4y2BaC-E）。仅在25.97kDa和27.61kDa的检测中的检测仅为Taalp-Bx-7as，并支持对该类型 - BX阿尔卑斯山阿尔卑斯山的MyRistoylation位点切割的发生（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，而在Mace中未观察到。有趣的是，在本研究中，Mace和Spitfire均未发现c型ALP。gydF4y2Ba

HPLC、UPLC和MALDI-TOF技术已应用于小麦脯氨酸的分离[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]．以前曾报道过从小面粉样品中依次提取和回收蛋白质组分的程序[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．na -丙醇溶液溶解了几乎所有的麦胶蛋白、白蛋白和球蛋白，以及少量的谷蛋白[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．本研究使用反相高效液相色谱、SDS-PAGE、MALDI-TOF和肽测序等多种技术鉴定了水溶和盐溶蛋白。除了之前在白蛋白/球蛋白提取中描述的蛋白质外，最近发表的小麦基因组组装(IWGSC, RefSeq v1.0)已经将蛋白质肽测序结果与更多注释的基因联系起来。此前，已鉴定和鉴定的蛋白质包括α -淀粉酶和蛋白酶抑制剂、高分子量白蛋白和其他非储存组和酶，它们具有特定的合成、代谢、调节或保护作用[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]．在本研究中，我们使用序列分离方法，在白蛋白/球蛋白部分中鉴定了一系列积累的ALP亚单位。在此之前，对谷蛋白提取物中ALP b型蛋白的鉴定是通过获取合理数量的胰蛋白酶肽序列以及测定的和预期的分子量之间的匹配来支持的gydF4y2BaPI.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]．在这项研究中，我们在白蛋白/球蛋白部分鉴定了大多数阿尔卑斯蛋白，而不是谷蛋白和麦胶蛋白部分，这是主要由典型的谷蛋白。gydF4y2Ba

在我们的分析中，当所有获得的片段模式与各自的ALP氨基酸序列对齐时，大多数SDS-PAGE条带可以被解析(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.相反，身份的认定gydF4y2Baα−/β-gydF4y2Ba和gydF4y2Baγ.gydF4y2Ba-醇溶蛋白和质谱分析的lw - gs倾向于给出较低的预期得分，这是由于n端区域的重复基序和富含脯氨酸的模式，难以被胰蛋白酶消化[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．在阿尔卑斯鉴定中，由于7A、4A和7D的氨基酸序列高度相似(> 93%)，同源蛋白的准确测定仍未实现[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]．有可能的是,该地区的许多个别蛋白质的分子质量33至48 kD(主要是麦胶蛋白和LMW-GSs)没有通过sds - page来解决,可能是由于重叠的分数,rp山峰(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.一些单独的阿尔卑斯苜蓿在17至32kd的表观分子量中明确地分辨，并由染色体7a / 4a / 7d基因座（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.16kd以下的蛋白带包括低分子量白蛋白，如质量从13到18 kD不等的aai和ATIs复合物家族成员。分子质量范围为28 ~ 32 kD的蛋白带包括同源染色体7A/7D/ 4a编码的b型ALPs和gydF4y2Baα-gydF4y2Ba和gydF4y2Baγ.gydF4y2Ba-gliaDins，GSP和LMW-GSS。目前尚不清楚同源染色体4a-编码的taalp-by-4alwere在与taalp-by-7ds相同的条带中分辨（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.很可能，我们无法区分c端TaALP-by-4Al和c端TaALP-by-7DS(图4)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

作为用4-乙烯基吡啶的蛋白质烷基化的结果，通过在每个ALP中添加所有半胱氨酸残基的烷基化质量来计算阿尔卑斯族的理论MWS（每个吡啶基乙基通过105.1Da增加分子量）来计算。通过匹配MWS，鉴定TaALP-AY-7DS和TaALP-AY-4AL的独特条带，分别由染色体7d和4a编码，分子量为约18kd（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.同样，“ax”阿尔卑斯亚基，TaALP-ax-4AL, TaALP-ax-7AS和TaALP-ax-7DS也被清楚地识别出来，计算的MWs与MALDI-TOF谱相匹配(图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.半胱氨酸残基烷基化后的ALPs的理论值与MALDI-TOF测量值仍有差异(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.因此，它们之间的质量差异可能与质谱分析中通常发生的蛋氨酸氧化、n端乙酰化或磷酸化有关[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

蛋白鉴定结果表明，一个蛋白可以在多个反相高效液相色谱峰中被鉴定出来。TaALP-ay-7DS蛋白在峰5-7处被洗脱;TaALP-ay-4AL蛋白在小麦品种Mace的8-10峰中分离得到;在小麦品种锏(Mace)的13 - 17,20 - 21峰中检测到b型阿尔卑斯(TaALP-bx-4AL/7DS)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.这表明重叠的级分几乎对应于色谱图的整个区域。显然，不实现使用色谱曲线的单个ALP亚基的定量。此外，与其他白蛋白/球蛋白和胶质蛋白的不同ALPS亚基的共分离性质表明变异的物理化学性质。阿尔卑斯alps“ay”，“by”，c-terminal“by”和“bx”亚基与蛋白酶抑制剂如aais，或者gydF4y2Baα.gydF4y2Ba-，gydF4y2BaβgydF4y2Ba-枯草杆菌素抑制剂和丝素，小麦素，而阿尔卑斯“斧”亚基更类似于avenin-3和gydF4y2Baα.gydF4y2Ba麦。gydF4y2Ba

小麦品种钉锤和喷头之间的洗脱时间差异可能是由于基因型差异。为了gydF4y2BaTaALPgydF4y2Ba结果表明，3个基因在反相高效液相色谱(RP-HPLC)和SDS-PAGE凝胶中存在等位基因变异，导致相应蛋白在凝胶中的分布不一致gydF4y2BaTaalp-Ax-4al-BgydF4y2Ba(喷火式战斗机等位基因)和gydF4y2BaTaalp-Ax-4al-CgydF4y2Ba(Mace等位基因)，分别在24.41 min和27.30 min首次鉴定gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.这与两个等位基因之间的3D蛋白质建模结果一致(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.不同的疏水性分布在水和非极性溶剂中解释了它们的溶解度差异。另外两种等位基因是识别的静音等位基因gydF4y2BaTaalp-BX-7as-MacegydF4y2Ba和gydF4y2BaTaalp-by-7as-spitfiregydF4y2Ba分别为Mace和Spitfire的编码基因，导致实际蛋白产品的缺失(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

基于反相高效液相色谱MALDI-TOF分析，以分子质量为基础对ALPs的PTMs进行鉴定。具体来说，对ALPs肉豆蔻酰化位点的预测(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）支持在MyRistoylation地点的阿尔卑斯山的后翻译切割。不幸的是，我们对阿尔卑斯山的MyRistoylation没有直接的实验证据。而“通过”在SDS-PAGE凝胶上鉴定的C末端ALP肽确认“通过”ALPS亚基的链间切割，这表明ALPS可能用作蛋白酶相互作用的基材。据报道，C终端BY-7DS ALP正在与之交互gydF4y2Ba镰刀菌素graminearumgydF4y2Ba基于酵母双杂交分析的β -葡萄糖苷酶和小麦metacaspase-4 [gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]．此外，计算的MWS与MALDI-TOF分析结果的差异进一步表明了多于一种PTM的发生，例如乙酰化，甲基化，甲硫氨酸氧化，磷酸化，泛素和糖基化，其可能发生在阿尔卑斯山（桌子gydF4y2Ba2gydF4y2Ba图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.未来对阿尔卑斯山的PTM的研究可以向该领域提供更多信息。gydF4y2Ba

在这里，RP-HPLC分离的单个蛋白质的身份也与其他工作所分辨的蛋白质的相同。雪松等人。［gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]通过n端测序对不同小麦种的某些种子蛋白进行了表征，发现其中一些属于aai和ATIs家族。通过使用小麦的无基因系，Singh和Skerritt [gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]确定了它们的几个基因在单个染色体上的白蛋白和球蛋白的位置。水溶性蛋白的SDS-PAGE分析表明，不同分子量的多肽和蛋白质的染色体位置分别为:1D, 2A, 2B, 2D, 3AL, 3BS, 3DS, 4AL, 4BS, 4DS, 4DL, 5DL, 6DS, 7BS或7DL [gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．在我们的研究中，除了在染色体臂7DS, 4AL和7AS上的阿尔卑斯蛋白的鉴定外，我们的分析也显示了其他的水溶和盐溶蛋白位于染色体1A/1B/1D (Avenin-3, Gamma-gliadin B，gydF4y2Baγ-gydF4y2Ba2A/2B/2D (α -淀粉酶/枯草菌素抑制剂)，3A/3B/3D (α -淀粉酶抑制剂)，4B/4D (AAIs CM3)， 5A/5B/5D (GSP)， 6A/6B (gydF4y2Baα-gydF4y2Bagliadins），7a / 7b / 7d（60s酸性核糖体蛋白，Aais cm2）。免疫学和N-末端测序表征鉴定了属于家庭的大多数水溶性蛋白质gydF4y2Baaai公司gydF4y2Ba，丝氨酸羧肽酶III同源蛋白，而盐溶性蛋白与大麦胚球蛋白匹配，其他蛋白包括LTP、过氧化物酶BP-1前体和组蛋白H4蛋白[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]．鉴定的蛋白质序列可用于分子标记发育和育种计划中的选择。有关遗传和调节该蛋白质的遗传和调节是必要的，以了解其在谷物中的作用和功能。具有相似的物理性质的蛋白质可能在相同的级分中积聚。与白蛋白和球蛋白级分中的其他抗真菌蛋白一起鉴定的阿尔卑斯植物可能表示类似的抗真菌功能。本研究提供了未来ALP功能研究的分离解决方案。结果可以通过培育小麦质量和抗病性改善的育种计划直接使用。gydF4y2Ba

随着多种技术的组合，我们首次报道了存在于白蛋白和小麦籽粒蛋白提取物的白蛋白和球蛋白分数中的ALP的完全分析。我们的结论是，大多数阿尔卑斯同源基因在小麦粒中表达。我们在几个阿尔卑斯多肽中发现了PTMs的明确证据。在成熟形式的AlP中鉴定Gliadin结构域（PF13016）和TRYP_ALPHA_AMYL结构域（PF00234）突出了籽粒质量和抗病性的ALP的多功能性质。gydF4y2Ba

植物原料、试剂及化学品gydF4y2Ba

所有小麦材料均由澳大利亚粮食研究开发公司提供。2014-2015年APH田间试验的澳大利亚Prime Hard (APH)品种Spitfire和澳大利亚Hard (AH)品种Mace分别在昆士兰州Macalister和新南威尔士州Bellata收获。未抛光的成熟谷物样品被整粒研磨以提取蛋白质。除非另有说明，所有用于样品制备的溶剂和化学品都是HPLC级或分析质量。二硫苏糖醇(DTT)、三氟乙酸、4-乙烯基吡啶(4VP)和乙腈、芥子酸(SA)购自美国MO圣路易斯Sigma Chemical Co.。gydF4y2Ba

基因克隆及测序gydF4y2Ba

本研究使用的引物对与Zhang等发表的引物对相同[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]放大gydF4y2BaTaALPgydF4y2Ba小麦品种的基因组DNA的碎片，生物石，中国春天（CS），Spitfire，Drysdale，RAC875，林肯，Kauz，Excalibur，Chara，Baxter，Mace，Bonnie Rock，Gliadius，Gregory，Kukri，Westonia，Yitpi，Wyalkethem，伯格林和鹰岩。PCR扩增循环由1个循环组成= 3分钟95°C;35循环= 30 s 95°C，30 s 60-62°C，1分72°C;1周期= 5分72°C。将靶PCR产物分离1.5％（w / v）琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶提取试剂盒（Promega，Madison，Wi，USA）从凝胶中纯化预期的片段。随后，使用BigDye @ 3.1终止剂混合物（应用生物系统）扩增纯化的PCR产物，并提交Sanger测序。使用肌肉加入工具（v10.2.2），使用肌肉加载工具进行阿尔卑斯植物的对准。gydF4y2Ba

序列对准和蛋白质建模gydF4y2Ba

使用多序列对准工具进行氨基酸序列对准[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba] 在gydF4y2Bahttp://multalin.toulouse.inra.fr/gydF4y2Ba并使用ESPript 3.0工具进行了进一步注释[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]．使用具有在I-Tasser Server实现的默认参数的模板线程方法进行三级结构建模。gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba] 在 （gydF4y2Bahttps://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/i-tasser/gydF4y2Ba）.识别和用于建模的结构模板包括PDB: 2LVF, 1W1Q, 1PSY, 1SM7和5 U87。每个提交的氨基酸序列生成5个模型，其中使用排名第一的模型进行结构分析。在CS和Mace中选取的TaALP-ax-4AL模型的C-score分别为−2.18和−2.26。考虑到N端和c端区域的灵活性和未建模性，生成的整体质量是高质量的。使用PyMol V1.7.4.5软件实现蛋白质结构可视化[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

系统发生gydF4y2Ba

hmmscan在Pfam数据库中检索到AAIs (CM2和CM3)、Avenin-3、alpha-gliadin、GSP和ALPs的PF00234和PF13016结构域[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]并用于系统发育发育。使用具有默认设置的肌肉软件进行密码子的CDS序列比对和氨基酸序列比对。使用最大可能性（ml）进行系统发育分析[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba在MEGA7中[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]．采用JTT + G(5类)氨基酸替代模型，进行500次自举试验。gydF4y2Ba

近红外透射光谱(NIRS)分析gydF4y2Ba

小麦品种钉锤和烟雾颗粒样品用于没有研磨的NIRS分析。每个样品记录三次重复。通过使用作物3000F粉和晶粒分析仪通过NIR测定谷物蛋白质含量（％）和水分含量（％）。gydF4y2Ba

蛋白质提取gydF4y2Ba

根据杜邦等人的程序从100毫克面粉中提取白蛋白/球蛋白[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．简单地说，用1 mL 0.3 M na7.5 -丙醇(NaI-丙醇)提取100 mg面粉，并在4500 g下离心10分钟，两次提取后，上清液混合在15 mL试管中，用4体积的冰冷(−20℃)nhh沉淀gydF4y2Ba_4gydF4y2BaAc-MeOH (0.1 M乙酸铵，100%甲醇)，−20℃保存至少48 h，如上所示离心。将上清液转入50ml管中，用四体积冰冷丙酮沉淀，−20℃孵育过夜。孵育后，按上述方法离心，得到白蛋白/球蛋白颗粒。该提取物的收率估计为10%。gydF4y2Ba

rp -gydF4y2Ba

将冻干的蛋白质颗粒溶解在500 μL 6 M盐酸胍(浓度为1 mg mL)中gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba})用TRIS调整pH至8.0，加50 mM DTT，然后用4VP烷基化，然后进行HPLC分析[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．采用反相高效液相色谱法对Spitfire和Mace种子提取的白蛋白和球蛋白进行分析。采用1200系列四元高效液相色谱系统，采用SB-C8反相分析柱(5 μm, 4.6 × 250 mm)，二极管阵列紫外- vis检测器(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)。柱温设置为40℃。采用两种流动溶剂进行线性梯度分离，溶剂A和溶剂B分别为0.1% TFA (v/v)在超纯水(18 MΩ)和0.1% TFA (v/v)在ACN中。流速设置为0.6 mL/min。在210 nm波长处检测蛋白的吸光度。洗脱梯度条件为:洗脱液B从0 ~ 51 min增加到20 ~ 60%;从51分钟到53分钟，洗脱液B从60分钟增加到80%，然后保持在80%，洗涤5分钟，然后在1分钟内降低到起始B浓度，并保持10分钟，进行下一次运行。进样量为100 μL。 The proteins eluted from individual peaks were collected with reference to the chromatographic profile captured in real time and pooled from three runs. RP-HPLC chromatographic fingerprint profiles showed no variation between runs, thus the elution of each run could be combined to increase the amount of protein in the final sample for later analysis. Samples were immediately frozen at − 80 °C for 24 h and lyophilized. Lyophilized samples were stored at room temperature before MALDI-TOF and SDS-PAGE analyses.

Maldi-Tof.gydF4y2Ba

使用MALDI-TOF-MS获得白蛋白/球蛋白组分的质谱谱，从单独的HPLC峰(馏分)有和没有4VP烷基化。制备白蛋白/球蛋白部分的蛋白提取物进行MALDI-TOF-MS测试，而反相高效液相色谱洗脱的颗粒状蛋白样品稀释20倍进行MALDI-TOF-MS测试。将洗脱液冻干，用10 μL超纯水溶解，1 μL MALDI-TOF-MS分析，保留残留进行SDS-PAGE分析。样品制备按干滴法进行[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]，使用锡丁酸（SA）作为基质。通过在ACN / H中溶解SA来制备基质溶液gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度为20mg / mL的O / MeOH（60：8：32 v / v）。所有样品，包括RP-HPLC洗脱液，原料白蛋白/球蛋白提取物和烷基化白蛋白/球蛋白萃取物以单独的1：9（v / v）的比例混合，并且首先是1μl的该蛋白质 -将SA混合物沉积在100样品MALDI探针尖端上。干燥后，加入另外1μL该蛋白质-A混合物，然后在室温下干燥。每个样品的质谱在Voyager De-Pro Tof Mass Spectromet（Applied Biosystems，CA，USA）上使用正线线性离子模式记录在25kV的加速电压和700ns的延迟时间通过捕获单次激光器的1000个光谱，质量范围为15,000-45,000 m / z。gydF4y2Ba

SDS-PAGE.gydF4y2Ba

为了从反相高效液相色谱洗脱液中鉴定阿尔卑斯蛋白，使用SDS-PAGE分离每个反相高效液相色谱洗脱液的蛋白混合物，并切割SDS-PAGE条带进行蛋白多肽测序。12% SDS-PAGE是按照Fling和Gregerson的方法制备的[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]．将上述HPLC洗脱液的颗粒样品与10μl2×Laemmli样品缓冲液SDS加载缓冲液（BioRad）混合。电泳在改进的Laemmli系统中进行[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]．使用25mm Tris-HCl，192mM甘氨酸的运行缓冲液进行运行，在120V下进行25mM甘氨酸和0.1％SDS 2小时。凝胶染色于Coomassie亮蓝（CBB）溶液（R-250）。使用蛋白质标准（Bio-rad）来估计蛋白质的分子大小。通过凝胶蛋白质组学成像系统“图像实验室5.0”（Bio-rad）扫描凝胶。gydF4y2Ba

MS/MS蛋白鉴定gydF4y2Ba

感兴趣的蛋白质带是从SDS-Page凝胶手动切除的，并由澳大利亚Perth，Perth Perthions International Ltd. Pty分析。蛋白质样品是胰蛋白酶消化，如前所述提取所得肽[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]．对于每种蛋白质带样品，添加125纳克喹啉胰蛋白酶用于消化。MS / MS的蛋白质点鉴定如前所述[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。gydF4y2Ba

雨:gydF4y2Ba

乙腈gydF4y2Ba

CS:gydF4y2Ba

中国的春天gydF4y2Ba

衣冠楚楚的:gydF4y2Ba

几天后授粉gydF4y2Ba

EPP:gydF4y2Ba

可推断出的高分子蛋白质gydF4y2Ba

KDA：gydF4y2Ba

KilodaltongydF4y2Ba

MALDI-TOF:gydF4y2Ba

基质辅助激光解吸/电离-飞行时间gydF4y2Ba

MW：gydF4y2Ba

分子量gydF4y2Ba

反:gydF4y2Ba

反相高效液相色谱法gydF4y2Ba

TFA：gydF4y2Ba

三氟乙酸gydF4y2Ba

UPP：gydF4y2Ba

Unextractable高分子蛋白质gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

声明gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

该研究得到了澳大利亚粮食研究和开发公司项目UMU00043和默多克大学战略博士学位（为Yujuan Zhang）的经济支持。该资助者没有参与研究，数据收集，分析和解释的实验设计，以及写作稿件。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 玉娟张和辛胡同样贡献了这项工作。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 澳大利亚-中国小麦改良联合中心，西澳大利亚州农业生物技术中心，默多克大学兽医与生命科学学院，珀斯，澳大利亚，6150gydF4y2Ba

   玉娟张，辛胡，安吉拉·朱萨兹，沙发伊斯兰，宗通宇，云昭＆武金马gydF4y2Ba

2. 浙江农林大学农业与食品学院，浙江省农产品品质改良重点实验室，浙江临安311300gydF4y2Ba

   鑫胡gydF4y2Ba

3. 阿德莱德大学，阿德莱德大学农业，葡萄酒学院，5005，澳大利亚gydF4y2Ba

   李刚gydF4y2Ba

4. 霍恩海姆大学作物科学研究所营养作物生理学，70599，德国斯图加特gydF4y2Ba

   Wenli叮gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

WM构思了这项研究。YZ和WM共同开发了这份手稿。YZ和XH进行基因测序。YZ、AJ和WD进行了系统发育、进化和蛋白质模型分析。YZ、XH、YunZ、ZY进行反相高效液相色谱实验，XH进行MALDI-TOF分析。SI和GL对肽序列结果进行了解释。所有作者均已阅读并批准本稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba吴俊马gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba