摘要
背景
外源6-苄基腺嘌呤(6-BA)可提高叶片防御系统活性。为了更好地了解外源6-苄基ladenine (6- ba)对涝渍夏玉米的调控机制,采用对照(CK)、第三叶期6 d涝渍(V3-6)和100mg / dm处理−3以夏玉米杂交种登海605 (DH605)为试验材料,采用涝渍6 d后6- ba (V3-6-B)。我们采用基于标记液相色谱的定量蛋白质组学方法和串联质量标记来测定抽雄期叶片蛋白质丰度水平的变化。
结果
渍水显著阻碍了植物生长,降低了SOD、POD和CAT活性。此外,涝渍后LOX活性显著提高。结果表明,MDA和H2O2对夏玉米细胞膜和细胞代谢造成了严重的破坏。浸水显著降低了叶片出苗率、株高和籽粒产量。而6-BA的施用有效地缓解了内涝带来的这些不利影响。与v3 - 3 - 6相比,V3-6 - b的SOD、POD和CAT活性分别提高6.9、12.4和18.5%,LOX降低13.6%。结果表明,MDA和H2O2与V3-6相比,V3-6 - b分别降低了22.1和17.2%。此外,施用6-BA显著提高了小麦叶片出苗率、株高和籽粒产量。蛋白质组学分析表明,6-BA显著调控了蛋白质代谢、ROS清除和脂肪酸代谢相关蛋白,表明6-BA在蛋白质组学水平上夸大了夏玉米的防御反应。
结论
结果表明,6-BA对涝渍夏玉米有显著的对照效应。6-BA通过调节与活性氧清除和脂肪酸代谢相关的关键蛋白,有效提高了涝渍夏玉米防御系统活性,进而平衡了蛋白质代谢,提高了植株生理性状和产量。
背景
全球变暖已得到许多前所未有的观测变化的明确证实,如温室气体浓度增加、大气变暖和数十年至数千年的极端降雨事件[1].在中国,近50年来平均地表温度上升了1.1°C,升温速率达到0.22°C/10a [2].降雨的时空分布趋于极端,预计将发生包括内涝、干旱、热害、低温和冻害在内的不利气候事件[3.].这些极端事件对环境、农业生产和经济的长远前景造成了不可估量的破坏[4,5,6,7].20世纪80年代以来,中国大部分地区极端暴雨事件发生的频率和强度都有所增加,其中20世纪90年代以来,长江以南地区和豫西、豫北、豫中地区暴雨日数明显增加[8].此外,暴雨和极端降水事件在34°N以南有增加的趋势[9].暴雨是造成内涝最典型的原因,由于其突发性和不可预测性,造成严重的粮食减产[10].因此,在气候变化和灾害事件增多的背景下,黄淮海平原玉米生产体系面临着巨大的挑战和风险。在黄淮海平原玉米生产的全生命周期中,内涝发生的频率高达30%,尤其是从苗期到拔节期和拔节期到抽雄期,内涝对植株生长的损害,使籽粒产量损失显著增加[9].
玉米在不同的生长阶段一般容易发生内涝。既往研究表明,不同生育阶段的涝渍对夏玉米生长和产量的影响是不同的[11,12].为了应对涝渍胁迫,植物会启动一系列的应激防御过程,伴随着植物细胞活动的广泛变化。植物防御系统在保护植物免受胁迫破坏方面起着关键作用[13].由于抗氧化防御系统在非生物胁迫下遭到破坏,引发玉米叶片中ROS积累显著增加,导致脂质过氧化和膜通透性[14].首先,在不利条件下(如干旱、盐碱、寒冷、阴凉等),活性氧(reactive oxygen species, ROS)作为次生信使在植物中启动后续防御反应,在植物对非生物胁迫的防御反应中起着重要作用[15].然而,随着应激时间的延长,ROS清除系统被打破,破坏了ROS产生与熄灭之间的平衡,导致氧化损伤[16,17,18,19,20.].抗氧化酶能有效降低植物活性氧损伤,其活性可能与植物对非生物胁迫的耐受性直接相关[15].
6-苄基ladenine (6-BA)是一种合成的类细胞分裂素(CTK)植物生长调节剂,可显著提高植物细胞分裂素(CTK)的水平,而植物细胞分裂素在胁迫下会急剧下降。CTKs是一种重要的生长促进化合物,参与抑制和清除活性氧自由基,延缓叶片衰老。有报道称CTK通过增加超氧化物歧化酶活性和减轻脂质过氧化来维持活性氧自由基产生和清除之间的平衡,从而促进胁迫下植物的生长[21,22,23].施用6-BA有利于减少干旱、盐、低温、涝等环境胁迫的不利影响[23,24,25].在我们之前的研究中,施用6-BA有效地促进了涝渍胁迫下夏玉米的生长,提高了夏玉米的籽粒产量[26].但对6-BA对植物生长影响的研究较多,而对外源6-BA对涝渍夏玉米生长发育调控分子机制的研究较少。
蛋白质组是通过基因转录表达的所有蛋白质的总和。蛋白质组学是一种在更深层次上研究蛋白质组以更好地表征生命真实特征的技术。探索和发现生物活动的调节规律、重要的生理和病理现象具有重要意义[27].蛋白质组学分析为探索增强抗应激能力的潜力提供了新的见解[28,29,30.].蛋白质组学分析可以研究植物不同阶段生理代谢过程的变化,因为高通量蛋白质组学研究不仅可以揭示与胁迫相关的代谢反应机制,还可以反映不同胁迫因子的特异性[30.,31].因此,蛋白质组学引起了学术界的广泛关注。特别是植物蛋白组的不同表达模式,为了解植物在不同环境胁迫下的调控机制和保护策略提供了思路[32].
迄今为止,已有不少研究对夏玉米的涝渍机理进行了研究,但从蛋白质水平研究6-BA对涝渍夏玉米的防御响应机制仍有待进一步研究。为了弥补这方面的知识空白,采用比较蛋白质组学研究了6-BA在涝渍夏玉米上的分子机制。鉴定出与植物防御系统活性相关的蛋白质,其丰度受6-BA调控。本研究结合生理性状,有助于更好地了解外源6-苄基ladenine (6-BA)对涝渍夏玉米防御系统活性的调控作用。
结果
夏玉米植株生长与籽粒产量
田间试验结果表明,涝渍显著抑制了植株的生长,降低了叶片出苗率和株高。VT时,淹水处理(v3 ~ 6)株高比对照降低25.9%。而喷施6-BA有利于缓解涝渍玉米株高的下降。V3-6 - b株高较v3 - 3 - 6提高了12.3%。淹水延迟了叶片出苗率,V6、V9、V12的生长发育阶段在V6、V9、V12的处理中分别比对照推迟了1、2、2天。V3-6-B中,V6、V9、V12生长发育阶段均较CK延迟1天(图1)。1).
活性氧清除系统
涝渍后土壤SOD、POD和CAT活性显著降低。SOD、POD和CAT活性较对照分别降低14.0、16.3和41.0%左右。v3 ~ 6组MDA含量较CK增加38%。而6-BA的施用减轻了涝渍胁迫对抗氧化酶活性的影响。与淹水处理相比,6-BA处理的土壤SOD(约6.9%)、POD(约12.4%)和CAT(约18.5%)含量显著增加。6-BA处理对MDA含量有一定的缓解作用,V3-6 - b处理MDA含量较v3 - 3 - 6处理降低了22.1%(图3 - 6)。2).
LOX活性和H2O2含量
在本研究中,淹水后LOX活性提高了23.4%,但6-BA的施用有效抑制了这一提高。此外,H2O2V3-6处理比CK高约52.3%,V3-6 - b比V3-6低约17.2%(图2)。3.).
差异积累蛋白的鉴定
质谱质量检测结果显示,肽质量误差中心分布在10ppm以下范围,大部分肽分布在8-20个氨基酸残基中1:图S1)。此外,各处理间Pearson的定量相关性结果也表明我们的样本达到了进一步研究的要求(附加文件1:图S2)。共检测到5322个叶片蛋白,以折叠变化≥1.5的蛋白作为差异丰度蛋白的标准,对4437个进行了定量。在涝渍胁迫(V3-6 - 6)下,有152个和28个叶片蛋白被鉴定为显著上调和下调蛋白,在V3-6 - b处理下,分别有48个和67个蛋白被鉴定为显著上调和下调蛋白,其中222个蛋白在v3 - 3 - 6和V3-6 - b处理中存在差异(附加文件)1:图S3)。在差异积累蛋白中,约4%参与抗氧化活性,10%参与对刺激的反应,30%与代谢过程有关,这些蛋白大多与植物防御系统有关2而且3.).
差异丰度蛋白质的生物信息学分析
GO注释用于鉴别差异丰度蛋白中显著富集的GO官能团。与对照相比,v3 - 3 - 6和V3-6 - b处理的上积累蛋白在“植物对胁迫的反应”、“对有毒物质的反应”、“对氧化应激的反应”、“对刺激的反应”、“过氧化氢代谢过程”等防御相关蛋白中富集较强,主要在过氧化物酶活性、四吡啶结合和氧化还原酶活性中起作用。这些蛋白质在保护植物免受损害方面起着关键作用。4).
参与ROS清除系统的差异丰富蛋白
蛋白质组学数据显示,与CK相比,V3-6处理中ROS清除系统相关的过氧化物酶(A0A1D6E530、B4FBH0、B4FKV6、B4FVT1、C0HHA6)等蛋白显著增加。与CK相比,V3-6处理中l -抗坏血酸过氧化物酶(A0A1D6QMU5)、谷胱甘肽过氧化物酶(C0P3R8)和apx3 -过氧化物酶体抗坏血酸过氧化物酶(B6TM55)均下降积累。但与V3-6 - 6处理相比,V3-6 - b处理中上述过氧化物酶的积累下降。V3-6 - b处理中l -抗坏血酸过氧化物酶(A0A1D6QMU5)、谷胱甘肽过氧化物酶(C0P3R8)和apx3 -过氧化物酶体抗坏血酸过氧化物酶(B6TM55)较v3 - 3- 6处理增加,但积累不明显(表3- 6)1).
差异丰富的蛋白质参与脂肪酸代谢
与CK相比,在V3-6 - b和v3 - 3 - 6中向上积累的蛋白在亚油酸代谢和α -亚麻酸代谢中富集,包括α -双加氧酶1(H9BG22和A0A1D6P493)和脂氧合酶(Q9LKL4)。此外,酰基载体蛋白(B6UHG1、B6SJF5、B4FDG2)、二磷酸核苷酸磷酸酶1 (C0PES7)、甘油三酯脂肪酶(A0A1D6JA03)等脂肪酸代谢相关蛋白在v3 - 3 - 6中向上积累,在V3-6 - b中向下积累。然而,脂肪酸去饱和酶8在V3-6和V3-6 - b中被下调2;无花果。5).
差异丰富的蛋白质参与蛋白质代谢
与V3-6相比,V3-6 - b的下堆积蛋白富集为26个官能团,其中分子功能和生物过程分别占GO项的8和14个。有趣的是,累积最多的蛋白质参与蛋白质代谢,包括“未折叠蛋白质结合”、“蛋白质结合”、“蛋白质转运体活性”、“蛋白质二硫异构酶活性”和“蛋白质折叠”(表4)3.;无花果。6).
讨论
植物不断受到环境波动的影响,在适应各种环境条件,特别是干旱、内涝、寒冷、炎热等不利条件方面面临着巨大的挑战。植物的氧化状态在一定程度上反映了植物抵抗生物或非生物胁迫的能力[33,34,35].活性氧的产生和清除是植物抵御非生物胁迫的机制之一。当植物面临环境胁迫时,会产生具有较高化学活性的ROS,激活植物的防御机制。但过多的ROS会对蛋白质、核酸、脂类等生物大分子造成极大的损伤,从而影响其正常的生理生化功能[33,36].此外,脂肪酸代谢通过维持细胞膜的完整性在植物防御中发挥着重要作用。蛋白质代谢通过调控一系列植物防御活动,在植物防御中发挥着重要作用[37,38].6-BA和蛋白质组学分析的应用使我们能够更深入地了解夏玉米对涝渍的植物防御机制。在本研究中,我们发现6-BA通过调节多个参与ROS清除系统、脂肪酸和蛋白质代谢过程的蛋白质来改善涝渍防御系统。
ROS清除系统活性
过量的活性氧积累是应激条件下预期的常见损伤,也可能对叶绿体、线粒体和质膜等细胞器造成严重损害[39].最初,ROS积累通过启动体内信号级联来刺激保护机制。但当ROS积累到一定水平时,它们会以各种方式攻击蛋白质,导致蛋白质发生氨基酸残基过氧化、硫基氧化等修饰。从而改变蛋白质的结构和功能,最终导致细胞结构扭曲,加速植物衰老。已有研究表明,ROS可引起膜过氧化损伤,同时对植物生长产生一系列损害,如叶绿素降解、衰老加速、光合作用减弱等[40,41,42].利用SOD、POD、CAT等保护酶以及抗坏血酸、谷胱甘肽等具有清除ROS功能的抗氧化剂,减轻氧化损伤,保护细胞。过氧化物酶通过催化H的氧化还原反应参与ROS的还原2O2有不同的氢气供体[43].由于植物细胞中有许多编码过氧化物酶的基因,许多类型的过氧化物酶在植物抗逆性中起着重要作用。例如,过氧化物酶21和过氧化物酶42在黄瓜植株对涝渍胁迫的响应中发挥了显著作用[44].而且,细胞质中的抗坏血酸过氧化物酶或与细胞壁结合的抗坏血酸过氧化物酶在抗坏血酸-谷胱甘肽循环中起着关键作用,作为终端氧化酶。抗坏血酸过氧化物酶受多种信号分子调控,能有效清除体内多余的H2O2[45,46].
本研究发现过氧化物酶(A0A1D6E530, B4FBH0, B4FKV6, B4FVT1, C0HHA6)在v3 - 3 - 6中表达上调,在V3-6 - b中表达下调。与CK相比,v3 - 3- 6中l -抗坏血酸过氧化物酶(A0A1D6QMU5)、谷胱甘肽过氧化物酶(C0P3R8)和apx3 -过氧化物酶体抗坏血酸过氧化物酶(B6TM55)表达下调,而V3-6 - b中这些蛋白表达均未明显上调。SOD、POD、CAT活性显著降低,MDA、H含量显著降低2O2v3 ~ 6与CK相比显著增加。这些酶活性升高,MDA、H2O2与淹水处理相比,6-BA处理可有效降低其含量。这些结果提示,除了调节活性氧清除系统的蛋白表达水平外,可能还存在其他复杂的机制来调节活性氧清除系统活性。
脂肪酸代谢
膜在应力下的完整性的维持广泛反映了固有的耐受性[47].脂肪酸代谢方面,α -双加氧酶1 (A0A1D6P493和H9BG22)和细胞色素P450 CYP74A19 (A0A096PQR7)在v3 - 3 - 6和V3-6 - b处理中均上调,且在V3-6 - b处理中上调幅度大于v3 - 3 - 6。此外,脂氧合酶(Q9LKL4)在v3 - 3 - 6和V3-6 - b中也有升高。而脂氧合酶(A0A1D6JQF2)和酰基载体蛋白(B4FDG2和B6SJF5)在v3 - 3 - 6中表达上调,在V3-6 - b中表达下调。植物α -双氧合酶将脂肪酸转化为2-过氧化氢产物,在植物信号通路中发挥重要作用[48].细胞色素P450s普遍存在于所有生物体内,在许多生物过程中发挥着重要作用。例如,细胞色素P450 A2在高等植物的信号和防御反应中起着关键作用[49].这两种酶在V3-6和V3-6 - b处理中表达上调,表明植物对涝渍胁迫具有积极的响应机制。在脂肪酸生物合成途径中富集酰基载体蛋白(B4FDG2和B6SJF5)、脂氧合酶(A0A1D6JQF2和Q9LKL4)和细胞色素P450 CYP74A19 (A0A096PQR7)。蛋白-蛋白相互作用网络显示脂氧合酶(A0A1D6JQF2)可能与细胞色素P450 CYP74A19 (A0A096PQR7)结合,发挥其功能。此外,脂氧合酶(A0A1D6JQF2和Q9LKL4)和细胞色素P450 CYP74A19 (A0A096PQR7)也在α -亚麻酸代谢中富集。此外,脂氧合酶(A0A1D6JQF2和Q9LKL4)与α -双加氧酶1 (A0A1D6P493和H9BG22)相互作用,在α -亚麻酸代谢中也发挥重要作用(图)。7).结果表明,脂氧合酶(A0A1D6JQF2和Q9LKL4)在α -亚麻酸代谢和脂肪酸生物合成途径中都起着重要作用。
α -亚麻酸是细胞信号分子茉莉酸的重要前体,可诱导茉莉酸的积累。此外,α -亚麻酸似乎是生物膜完整性和功能所必需的,在保护植物免受环境胁迫损害方面起着关键作用。植物的抗寒性随着不饱和酸的减少而减弱,如拟南芥通过突变叶绿体sn−2-棕榈酰去饱和酶和△12-去饱和酶基因[50,51].增加植物中脂肪酸去饱和基因的表达可以增加-亚麻酸的产量[52,53].亚油酸和α -亚麻酸作为膜组分,特别是磷脂,在维持膜完整性方面起着关键作用。此外,它们也是脂氧合酶(LOX)的底物。因此,LOX会对细胞膜和其他细胞成分造成破坏性损伤[54].脂氧合酶的增加总是伴随着不饱和脂肪酸的损伤,因为脂氧合酶可以氧化不饱和脂肪酸,引起脂质过氧化以及一系列的次生反应[55].此外,脂氧合酶反应也是ROS的来源[56].过量的LOX和ROS会引起脂质过氧化和膜完整性的丧失,这在小麦、大豆、棉花、玉米等广泛的植物中已得到证实。有趣的是,LOX和ROS之间也有密切的联系[54].
根据我们的蛋白质组学数据,在v3 - 3 - 6和V3-6 - b处理中,α -亚麻酸相关蛋白上调。且V3-6 - b组上调幅度高于v3 - 3 - 6组。而参与脂肪酸生物合成途径的脂氧合酶(A0A1D6JQF2)和其他蛋白(酰基载体蛋白(B4FDG2和B6SJF5)在v3 - 3 - 6中上调,在V3-6 - b中下调。α -亚麻酸相关蛋白的上调可能在一定程度上维持植物膜结构。然而,脂氧合酶(A0A1D6JQF2)表达的增加可能导致膜结构和功能的破坏。为了验证上述蛋白质丰度结果,LOX活性及其副产物(H2O2和MDA)含量分析。结果表明,涝渍后水体LOX活性显著提高,其副产物MDA和H2O2)相应增加,提示内涝对膜结构的破坏。而LOX的活性和H2O26-BA有效降低了MDA含量,这与标记液相色谱定量蛋白质组学分析和LC-MS/MS的结果相吻合。总的来说,本研究证明了夏玉米在涝渍胁迫下激发了一些积极的响应策略。然而,内涝损害也得到了明确确认。6-BA处理有利于涝渍植物正反应机制蛋白(α -双加氧酶1 (A0A1D6P493和H9BG22)和细胞色素P450 CYP74A19 (A0A096PQR7)的上调,对植物有伤害作用的蛋白(LOXs)的下调。生理结果是LOX活性降低,H含量降低2O2V3-6-B中的MDA)进一步证明6-BA通过调节脂肪酸代谢相关蛋白的表达,在减少ROS产生中起关键作用。喷施6-BA在一定程度上有利于保护植物膜免受过氧化损伤。
参与蛋白质代谢的蛋白质
蛋白质代谢过程通过调节一系列生物活性与植物的生长发育密切相关[57].锌指蛋白是一种转录调节因子,通过将锌和铁中心与DNA结合来调节基因表达[58,59],通过调节基因表达来调节植物的生长发育[60,61].它在植物对生物和非生物胁迫的反应中也起着非常重要的作用[59,62,63,64].在水稻中,两种锌指蛋白(Q67TK9、Q10N88)的上调和另一种锌指蛋白(Q5YLY5)的下调导致了灌浆过程中夜间耐热时间的延长。结果表明,RING/FYVE/PHD锌指超家族蛋白(A0A1D6GZM9)在v3 - 3 - 6处理中升高,在V3-6 - b处理中降低,这可能与夏玉米耐涝性有关。此外,在v3 - 3 - 6和V3-6 - b中,MBF1转录因子(C0P5I3)和nmra样阴性转录调节家族蛋白(A0A1D6L6U7)均降低。然而,V3-6组下降幅度高于V3-6 - b组。MBF1转录因子是一种转录协同激活因子MBF1c,具有耐热功能拟南芥[65].
NmrA是一种负性转录调控因子,通过调控AreA(一种gata型转录因子)在各种真菌中控制氮代谢产物的抑制。Reiner等人(2016)证明了一种具有nmra样结构域的新蛋白质参与了Dictyostelium discoideum的细胞分化和发育[66,67].这些结果表明,在V3-6中,参与胁迫反应或细胞发育过程的基因显著下调,可能是夏玉米耐涝的原因。但与CK相比,在V3-6中,核小体组装蛋白1 (C0HF19和A0A1D6MBB0)、延伸因子1- β (B6SLK4和B4FNT1)、30S核糖体蛋白S1 (B4FUZ5)、60S核糖体蛋白L22-2 (B4FCK9)、核酸结合obf -fold-like蛋白(A0A1D6H4K9和B4FT80)等翻译过程相关蛋白均显著升高,而喷撒6-BA可有效缓解这些升高。
大多数蛋白质需要折叠成精细的三维结构来执行功能活动。然而,许多蛋白质在压力条件下会异常折叠甚至聚集[68,69].在高温和干旱等环境胁迫下,蛋白质异常折叠和聚集的发生频率越来越高[70].因此,植物需要进化出多种机制来处理异常的折叠和聚集。Hsp90和小型Hsps已被证明具有在不利条件下防止聚集和促进有效折叠的功能[71].最近的研究也表明,干旱引起玉米叶片中某些sHSPs的显著增加[72].在我们的研究中,浸水植物叶片中的Hsps (O64960, B6TDB5和P24631)显著下调,而6-BA则缓解了这些下调。然而,26S蛋白酶体亚基(A0A1D6HCE3, B6T9G1, A0A1D6KA58和A0A1D6GTD7)在涝渍植物中表达上调,而在V3-6-B处理中没有观察到显著变化。此外,与未折叠蛋白结合、磷酸酶、蛋白水解和泛素化相关的蛋白(A0A1D6E942和B4FUZ5;B6UG10;A0A1D6H5B6、B4FKB3)显著降低。这些结果表明,涝渍影响了蛋白质的折叠和其他加工过程,阻碍了蛋白质的功能发挥。而6-BA的施用有利于减轻涝渍对这些蛋白的影响。
这些结果表明,涝渍引起了蛋白质代谢过程的显著变化,包括蛋白质合成、蛋白质加工、蛋白质稳态和蛋白质降解过程。蛋白质代谢过程的广泛变化可能导致细胞代谢活动如物质合成、转运和次生代谢过程的紊乱。在我们之前的研究中,淹水显著影响了碳氮代谢过程,扰乱了细胞活动的平衡,影响了物质的合成和运输,从而限制了植物的生长。本研究还观察到涝渍引起的植物生长障碍,而喷洒6-BA可以缓解这种障碍[26,73].
综上所述,本研究证明6-BA通过调节ROS和脂肪酸代谢相关蛋白的表达来提高细胞膜的防御系统活性,从而共同维持细胞膜的完整性。相反,细胞膜完整性的提高改善了蛋白质代谢过程,这可能是涝渍夏玉米植株生长速度和产量提高的原因。
结论
基于我们的研究,我们证明了6-BA对涝渍夏玉米具有对比效应(图5)。8).涝渍对夏玉米生长有明显的阻碍作用,降低了夏玉米SOD、POD和CAT的活性。此外,LOX活性显著提高。结果表明,MDA和H2O2对细胞膜和细胞代谢造成了严重的损害。此外,涝渍还显著降低了植株生长速率和籽粒产量。而6-BA的施用有效地缓解了内涝带来的这些不利影响。根据蛋白质组学分析,参与蛋白质代谢、ROS清除和脂肪酸代谢的蛋白质均受到6-BA的显著调控。结果表明,6-BA在蛋白质组学水平上夸大了夏玉米的防御反应,改善了植株生长性状,提高了产量。虽然6-BA对涝后夏玉米的调控机制有待进一步研究,但本研究结果为进一步研究奠定了基础。
方法
实验设计
野外试验在山东农业大学试验场(北经36°10′,东经117°09′)进行,符合当地法规,并获得山东农业大学批准,符合《濒危野生动植物种贸易公约》。本试验以夏玉米杂交种登海605 (DH605)为材料。DH605是山东登海种业有限公司选育的DH351(选自自育多代DH158/107)与DH382(选自自育多代美国种质X1132)的杂交种。该品种于09年通过中国国家农作物品种审批委批准th适合在山东省和中国大部分地区种植。6月播种玉米,种植密度为67,500株公顷−1而且管理得很好。设置3个处理:对照(CK)、第三叶期淹水6 d (V3-6)和100 mg / dm−3淹水后加6-BA (V3-6-B)。在抽穗期,从每个处理中取3个重复的新鲜穗叶组织,冷冻在液氮中,保存在- 80°C,待进一步使用。获取我们的工厂样品不需要许可或许可证。
生理性状测定
抗氧化酶活性和丙二醛含量
以三种植物的功能叶中部为样品,测定其保护酶活性和丙二醛含量。根据Giannopolitis和Ries(1977)、Hammerschmidt等人(1982)和Durner和Klessing(1996)描述的方法分别测定SOD、POD和CAT的活性[74,75,76].另外,MDA含量的测定参照Du等(1992)[77].每个样本的三个生物重复被用于分析。在LSD测试后进行单因素方差分析和均值之间的比较P< 0.05,用SPSS V.21.0进行统计。
LOX活性和H2O2内容
LOX活性和H2O2根据Fu等人(1996)描述的方法确定含量[78和Bizzi等人。[79),分别。单因素方差分析(One-way ANOVA)和均值之间的比较P< 0.05,用SPSS V. 21.0进行统计。
植物生长速率和产量
在对照的V6、V9、V12生长期(以达到生长期的试验田所有植株的50%为基础),观察到完全伸展的叶片数量。在VT时测量15株代表株高。每个地块采收30穗,计算R6时的产量。单因素方差分析(One-way ANOVA)和均值之间的比较P< 0.05,用SPSS V. 21.0进行统计。
蛋白质组学分析
将每个处理的3种植物的叶片样品混合后暴露于液氮中,研磨成细胞粉,然后在细胞粉中加入4体积的裂解缓冲液(8 M尿素,1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒)提取蛋白质。然后用胰蛋白酶消化提取的蛋白溶液。消化后,用TMT标记多肽,然后用Thermo Betasil C18色谱柱(5 μm颗粒,10 mm ID, 250 mm长度;Bellefonte, PA, USA)和使用Orbitrap FusionTM (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)进行LC-MS/MS分析。MS/MS数据通过UniProt进行搜索玉米L数据库(99,450序列,201,706)与使用Maxquant搜索引擎的反向诱骗数据库连接(v.1.5.2.8)。胰蛋白酶/P被指定为一种切割酶,允许最多2个缺失的切割。前体离子在第一次搜索和主要搜索的质量公差分别设置为20 ppm和5 ppm。取0.02 Da为破片质量公差。Cys上的氨基甲酯和Met上的氧化(或n端乙酰化)分别被指定为固定修饰和可变修饰。错误发现率(FDR)设置为< 1%,肽的最低评分设置为> 40,以评估肽的置信度[80].在Mascot中使用TMT 10-plex对鉴定出的蛋白质进行量化。蛋白质P-value < 0.05, fold change > 1.5或< 0.667被认为差异显著。筛选差异丰度倍数后,对差异丰度蛋白进行蛋白质注释、功能分类、功能富集和聚类分析等生物信息学分析。在GO数据库(www)中检索鉴定蛋白的基因本体功能注释(GO)和京都基因与基因组分析百科(KEGG)。http://www.ebi.ac.uk/GOA/)和KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)使用Blast2GO程式(https://www.blast2go.com/)和Blastx/Blastp 2.2.24软件。Wolfpsort (PSORT/PSORT II的更新版本)用于预测亚细胞定位。然后,对DAPs进行GO和KEGG途径富集分析P-value < 0.05 [81].每个样品进行三次技术重复。蛋白质组学分析由Jingjie PTM BioLabs, Inc提供。在附加文件中描述了更详细的方法4.
数据和材料的可用性
支持本文结论的数据包含在本文及其附加文件中。此外,质谱数据集已通过PRIDE存放在蛋白质交换联盟[82数据集标识符PXD016743 "https://www.ebi.ac.uk/pride/profile/reviewer85471).
缩写
- 6-BA:
-
6-benzyladenine
- 方差分析:
-
方差分析
- 猫:
-
过氧化氢酶
- CK:
-
控制
- 半胱氨酸:
-
半胱氨酸
- 衣冠楚楚的:
-
差异丰度蛋白
- DH605:
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夏玉米杂交种登海605
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错误发现率
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过氧化氢
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京都基因和基因组百科全书
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抽雄期
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致谢
我们感谢PTM Biolabs, Inc.在生物信息学方面的建议。
资金
本研究获得国家重点研发计划项目(2017YFD0300304、2018YFD0300603)、国家自然科学基金项目(31671629、31801296)、国家现代农业技术与产业体系项目(CARS-02-18)、山东省“双一流”计划项目(SYL2017YSTD02)资助。资助机构不参与设计研究、测量、数据分析和起草手稿,只是提供资金支持。
作者信息
从属关系
贡献
JZ构思并设计了实验;JH进行了实验并起草了手稿;BR和BZ在概念和实验设计上做出了很大的贡献,BR、SD和PL帮助讨论并修改了手稿。所有作者均已阅读并认可该手稿。
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胡建军,任斌,董少兵,董建军。et al。蛋白质组学分析表明,外源6-苄基ladenine (6-BA)提高了涝渍夏玉米的防御系统活性。植物生物学20.44(2020)。https://doi.org/10.1186/s12870-020-2261-5
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DOI:https://doi.org/10.1186/s12870-020-2261-5
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