谷物Fe和Zn增强QTL可用于营养致密稻米育种的联动不平衡测绘

背景

高产水稻品种通常在谷物铁（Fe）和锌（Zn）含量低。这两种微量营养素涉及许多酶活性，缺乏在人体中引起许多疾病。生物强化是一种更便宜和更简单的方法来提高水稻籽粒中这些营养素的含量。

结果

制备群体小组，代表来自485种种质系的谷物Fe-Zn含量的所有表型类别。研究了碾磨稻米谷物Fe-Zn含量的遗传多样性，人口结构和结合映射的小组。人口显示膨胀不平衡显示Hardy-Weinberg对水稻中Fe-Zn含量的期望偏差。K = 3的人口结构将面板人群分为与其谷物Fe-Zn含量的不同次级群体。结构分析显示每个子人群的常见主要祖先。新颖的量化特质基因座（QTL）即QFE3.3.和qFe7.3对于粮食Fe和qZn2.2,qZn8.3和qZn12.3使用关联映射检测Zn内容。四个QTL，即QFE3.3.,qFe7.3,qFe8.1和qFe12.2对于谷物Fe含量被检测到共同定位QZN3.1.,QZN7.,qZn8.3和qZn12.3QTL分别控制谷物Zn内容。另外，使用的一些FE-Zn控制QTLS与产量组分QTLS共同定位，qTBGW,OSSP1和qPN.QTLQFE1.1.,QFE3.1.,qFe5.1, qFe7.1, qFe8.1, qZn6, qZn7和gRMm9-1对早期研究报道的晶粒Fe-Zn含量进行了验证。

结论

新的QTL，QFE3.3.和qFe7.3对于粮食Fe和qZn2.2,qZn8.3和qZn12.3对这两个性状进行锌含量检测。共定位了4个Fe-Zn调控qtl和少数产量构成qtl。法,QFE1.1.,QFE3.1.,qFe5.1、qFe7.1、qFe8.1、qFe3.3、qFe7.3、qZn6、qZn7、qZn2.2、qZn8.3和qZn12.3将有助于微量营养素的生物强化。水稻产量构成性状可能同时提高铁锌含量。

全球人口的大多数人每天消耗大米，特别是在亚洲国家。但是，稻粒是微量营养素的差异，如铁（Fe）和锌（Zn）。抛光米饭作为印度主食的实践加剧了营养不良。在研磨过程中除去大量的铁和锌。抛光的水稻含有约2毫克千克^{- 1}铁的推荐摄入量为10-15 mg kg^{- 1}.同样，精米含有约12 镁 公斤^{- 1}Zn，而人类推荐的摄入量为12-15毫克千克^{- 1}[1.]．铁是红细胞中血红蛋白的重要组成部分，对于身体中几种酶的正常运作至关重要。锌是300个酶的代谢活性所必需的，并且对于参与细胞分裂，蛋白质合成和生长的酶至关重要[2.]．到目前为止，还没有对改善稻米中的这些微量元素给予适当的注意。关于水稻籽粒铁、锌含量存在多样性的文献调查在水稻天然种质中报道较多[3.,4.,5.,6.,7.,8.,9,10,11,12,13]．在发展中国家，通过育种提高稻米中的铁和锌含量是一种更便宜、更容易的减少营养不良的选择。在水稻育种计划中，利用具有巨大Fe-Zn含量遗传潜力的优秀种质，提高水稻Fe和Zn含量是可能的[5.,6.,13,14,15]．

流行的大米品种通常含有与传统品种和体育群体相比谷物中较小的微量营养素[16,17]．需要鉴定和使用负责进一步增强这些营养物质的QTL，并需要识别和使用。通过经典的育种方法，在这种背景下可以实现非常有限的成功。早先关于低贫化性浓度的报告，与高籽粒产量和基因型和环境相互作用的负面关系是这些营养素遗传增强的主要局限性[18,19,20,21]．然而，CR Dhan 311、DRR Dhan 45和Chhattishgarh Zinc Rice-1的开发是印度最近的高产品种，其籽粒锌含量较高。但是，这些成就是通过非靶向的经典育种方法取得的。由于涉及许多效应小且与环境因子相互作用强的数量性状位点(qtl)，微量元素富集育种的成功受到限制。精细育种是实现优质水稻品种微量元素富集的较好途径。获得不同qtl和潜在供体的健壮标记信息是精确育种成功的先决条件。在不同种内和种间杂交遗传背景的水稻中已经报道了几个与Fe和Zn相关性状的qtl [6.,9,13,14,15,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30.,31.,32.,33.,34.,35.,36.]在现代分子育种中几乎没有应用。

水稻中Fe-Zn含量的映射报告表明使用各种双重父母测绘群体来检测控制这两个微量营养素的基因。使用双重父母映射群体的基因映射比关联映射更耗时，昂贵和较小的分辨率[17,37.,38.,39.,40]．这些限制可以通过链接不平衡映射或关联映射来克服。关联映射是基于自然种群或发达种群中存在的关联不平衡或变异[17,37.,39.,40]．关联作图的主要目的是估计分子标记与籽粒铁和锌含量之间的相关性，这两个性状具有相当多的变异性的代表性水稻群体。晶粒Fe-Zn含量关联作图的研究报道较少[41.,42.]．但是，通过关联作图对水稻籽粒产量和农艺性状进行QTL定位的报道是可行的[29,41.,43.,44.];幼苗阶段冷耐受[40,45.]；萌发期和孕穗期的耐寒性[46.];高温胁迫耐受性[39.]；籽粒品质性状[47.];盐度宽容[48.];耐旱性特征[49.,50.];早期幼苗活力[51.]籽粒蛋白质含量[17]．然而，对水稻籽粒铁、锌含量的关联作图信息缺乏。利用100个SSR标记和基因特异性分子标记，对485份材料中102个基因型组成的面板群体进行遗传多样性、群体结构和铁、锌含量关联作图分析。

精米籽粒铁和锌含量面板群体的表型分析

通过基于Fe-Zn含量的485种种质系的筛选结果，通过从不同表型基团中筛选基因型来制备面板群。从每个Fe-Zn表型组合使用几乎相等的基因型与含有102种种质线的面板的体制的检查品种。面板群的平均铁含量从1.07变化到5.38 mg kg^{- 1}在湿季节，2016和2017的碾米米表型结果中。较高的Fe含量> 4毫克千克^{- 1}在精米中观察到13种基因型。,Chittimuthylu, IET25450, IET 24775, IET 24760, IET 24316, BPT5204, IET 23832, Kalanamak, IET25441和IET25465, IET 23829和IET 24779(附加文件3.：表S1）。用于微量营养素的检查品种，Chittimuthylu和Kalanamak显示平均晶粒Fe含量为4.8和4.48 mg kg^{- 1}分别地基因型≥25 镁 公斤^{- 1}锌和/或≥10mgkg^{- 1}糙米中的铁与PAR或较高的产量相比，被认为是理想的生物强化水稻品系。≥4. 镁 公斤^{- 1}铁≥20 mg kg^{- 1}锌和产量高于产量对照品种被认为是理想的基因型。表中所列基因型中>含量为4 mg kg^{- 1}发现碾米的Fe in Cred Rice与> 12 mg kg^{- 1}在糙米中。同样，面板中的基因型> 20 镁 公斤^{- 1}碾米的锌含量显示> 25 mg kg^{- 1}从结果来看，九个生物强化水稻基因型、两个微量营养素检查品种和长白Sadakadam显示超过4 镁 公斤^{- 1}在我们的研究中，碾米中的铁被归类为高含铁基因型（表1）1.).42种基因型，包括中度组（3-4 镁 公斤^{- 1}碾米的Fe），而48显示低值（<3毫克千克^{- 1}Fe）。碾米的平均锌含量从7.43-27.97 mg kg变化^{- 1}显示≥20mg kg^{- 1}在14个基因型中(附加文件3.：表S1）。这14个基因型属于高粒含锌水稻。微量营养素的两个对照品种Chittimuthylu和Kalanamak的平均值为22.3 镁 公斤^{- 1}和25.91毫克千克^{- 1}谷物的锌分别。在研究的面板中，56个基因型显示中等水平为15-20 mg kg^{- 1}籽粒锌含量较低(< 15 mg kg)的品系有32个^{- 1}谷物Zn）。评估102种基因型的籽粒产量和2岁以上的Fe-Zn含量揭示了两种生物化线，即IET24779和IET25465以产量检查含量检查品种IR64（表1.）.可以选择含有高Fe或高Zn的基因型，并在培养方案中选择含有产率检查品种的PAR籽粒产量。具有高Fe含量和良好谷物产量的理想基因型是IET23829，IET 23832，BPT5204，IET24316，IET24760，IET2475，IET24779，IET25441和IET25465。具有高Zn含量和高颗粒产量的基因型是IET23824，IET24391，IET25446，IET25461，IET25465，IET25457，IET25477，Mumih送，Sneha，Lalat和Chittimuthyalu。基因型IET24779，IET25465和Chittimuthyalu以标准的标准率在Par产量中产生，Check FinteR IR64以及高晶粒Fe-Zn含量。具有低，中等和高晶粒Fe和Zn含量的基因型的频率在蜘蛛图和直方图中描绘（图。1.）.

籽粒产量与铁锌含量的基因型相关性分析

在前两个主成分轴上绘制散点图，以生成面板中102个基因型的籽粒铁、籽粒锌浓度和籽粒产量的基因型-性状双批次图（图。2.）.第一和第二主成分具有87.82和8.08％的总可变性，分别为10.18和0.937（附加文件）1.：图S1）。在主成分分析的3个特征中，籽粒产量促使最大多样性，然后在面板群中进行谷物Fe含量和谷物Zn含量（图。2.）.从4次象限中的基因型的散射模式揭示了基因型的放置在相反方向上的高籽粒产率和Fe含量。含有更高的Zn的基因型在籽粒产率和Fe含量之间。然而，存在一些基因型，其位于具有更高的谷物产量和谷物Fe-Zn含量的估计估计的原因。这些基因型已在图中环绕（图。2.）.右上方（我^英石右下角(第二象限)和右下角(第二象限)的基因型占多数，籽粒铁、锌含量较高，籽粒产量较高。第3象限(左下)和第4象限(左上)适应的基因型大多是籽粒铁和锌含量低、产量低的基因型。2.）.在第二象限中发现了许多具有中等的Fe和Zn含量的基因型。含有中度至高晶粒Fe-Zn和谷物产率的理想基因型位于X轴的两侧，并在散点图中环绕（图。2.）.

利用100个分子标记研究群体的遗传多样性

使用100个分子标记（包括25个基因特异性标记和75个SSR标记）对102个种质系进行了基因分型，这些种质系在籽粒铁和锌含量方面表现出广泛的遗传变异。用于遗传多样性的位点和计算参数如表所示（表1）2.)共获得244个扩增子，每个位点的平均等位基因数为2.44。每个标记的等位基因数从1到6不等，RM340显示了面板基因型中最高的等位基因数。铁和锌连锁多态性标记的平均主等位基因频率为0.675，范围为0.4023（RM152）和1.0000（RM309、RM452、RM137、RM1789和RM441）（表1）2.）.PIC值从0.000 (RM6209, sZIP8, RM3409, RM309, RM452, RM137, RM1789, RM556, RM23, RM34, RM441和GRMM9-2)到0.6713 (RM407)，平均PIC为0.3553。观察到的平均杂合度Ho为0.0496，范围为0.00-0.6714。在所使用的标记中，只有36个标记的异质性值大于零，而64个标记的异质性值为零。平均基因多样性(He)从0.0000 (RM309、RM452、RM137、RM1789、RM44、RM590和RM258)到0.6711 (RM3392)，平均为0.35。

人口结构

通过使用structure 2.3.6软件获取可能的子种群（K）和更高的delta K值，采用贝叶斯聚类方法估计遗传结构。随后，针对遗传结构评估了面板中表现出谷物铁和锌含量变化的基因型。它将基因型分为两个亚群体（图。3.a，b）在假设的k中具有495.2的高Δk峰值，在k = 2中（图。3.一种）。但是，对基因型中的Fe-Zn含量并不稳健。然而，在k = 3时，ΔK值为117.9分类为具有完美分组的三个不同的子群。在k = 3，分别包括18,44和40个基因型的亚群1（SP1），亚群2（SP2）和亚群3（SP3），而11个基因型是具有三个主要遗传成分的混合物类型子组（图。3.C;桌子3.）.SP1和SP2主要为中、高粒含铁锌基因型，总高铁含量为100% (> 4 mg kg)^{- 1})基因型，占中等铁总量的97.3%（3-4 镁 公斤^{- 1})基因型，90%高锌(> 20 mg kg)^{- 1}）基因型和总中等Zn的69.2％（15-20 mg kg^{- 1}基因型。两种副群（净核苷酸距离）1-2,1-3和2-3之间的最大等位基因频率分别为0.1239,0.1813和0.2480。簇1，簇2和簇3中个体之间的平均距离（预期杂合子）分别为0.3140,0.3051和0.3115。三个子群显示固定指标值（f_英石SP1为0.287,SP2为0.385,SP3为0.4853。alpha值较低(alpha = 0.0388)。面板群体中α值的分布呈尖峰对称，而F值的分布呈尖峰对称_英石在亚种群中的值几乎是对称的形状，从中间向左和向右相同(附加文件2.：图S2）。此外，在ΔK值为3.946的k = 7时，该软件将整个人口分类为7个不同的子群，根据谷物Fe-Zn内容将人群分类为更细微的类别。

分子方差分析（AMOVA）和LD衰变图

分子方差分析(AMOVA)显示，各亚居群在K = 2、K = 3和K = 7时存在遗传变异4.）.2个亚群体间和群体内的遗传变异(K = 2)在群体间为41%，个体间为50%，群体内个体间为9%。在3个亚居群中，群体间变异占38%，个体间变异占52%，个体内变异占10%。在K = 7时，种群间变异率为39%，个体间变异率为51%，个体内变异率为10%。赖特的F统计量被用来计算与哈迪-温伯格预测的偏差。F._是和F_它所有100个基因座的值分别为0.844和0.904，而F_英石在三个次级人口分析中的群体中是0.385。f的值_英石， F_是和F_它对于7个亚种群水平分别为0.386,0.831和0.897。F._英石k = 3和k = 7的值可以识别彼此之间的子群，揭示它们之间的差异。一个温和的线性化f_英石为子群计算k = 3和k = 7时，k = 3和0.386处的值为0.385。F._英石每个子群的值及其分发模式在彼此的子群体中显示出明显的差异（附加文件2.：图S2）。

连锁不平衡衰减率对于维持群体不平衡的关键是至关重要。这提供了通过标记特征协会映射复杂性状的范围。通过绘制同步产生群体的纳入不平衡图R.2符合物理距离的值百万条基对。在1-2M碱基对的连接标记中获得LD衰变的急剧下降，随后显示出非常缓慢和逐渐衰减（图。4.）.

通过主坐标和聚类分析分组面板人口

主坐标分析（PCoA）采用100个标记进行二维描述，用于确定基因型之间的遗传相关性（图。5.）.前两个组件占总惯性的36.45和6.16％。含有在研究中使用的102个基因型的面板群分布在四个象限中，显示三个主要群体（图。5.）.第1，第2，第3和第4象限分别由24,46,24和8个基因型组成。属于三种不同的子群的基因型被分组在不同的象限中。将第二象限基因型分为两组，其中一个组是更接近轴1的组，另一组是轴2.更靠近轴2的轴线2.如轴线2更靠近轴线的基因型是以红色描绘的混合型（图。5.一种）。

大多数含中高铁和锌的基因型位于PCoA的第1象限(右上)和第2象限(右下)。所有对锌和铁都是中等或高含量的基因型，分别是:IET23834、Chittimuthyalu、IET24780、IET24771、IET24766、IET24783、IET24772、IET25443、IET25444、IET25447、IET25449、IET25450、IET25452、IET25453、IET25463、IET25465、IET25469、IET25471、IET25474、除位于第一象限(右上)的5个基因型Kalanamak、IET24557、IET24787、IET25454和IET25473和位于第三象限的CR Dhan 907(图)外，IET25479和Safed Luchai-2被置于红色圈区。5.b）。基因型即Chittimuthyalu，IET25450，IET25450和IET25455含有高锌和铁的IET25465被置于红色环绕区域，包括Kalojeera，Kalonunia，Swarnakranti和IET25464。由含有基因型的中等谷物Fe和/或Zn组成的绿环环绕区域，而覆盖第3和第4象限的蓝色环绕区域主要包括低至Fe和/或Zn含量的种质系（图。5.b）。

进行了基于与100个标记的面板群基因分型的聚类分析，以确定其集体判别能力。用未加权邻接加入方法构建的树可以将基因型分化为3种不同的簇（图。6.)聚类I、II和III分别由32、51和19个基因型组成。这三个聚类清楚地分隔了通过结构分析获得的三个亚群。亚群SP1、SP2和SP3分别分组在聚类III（绿色）、II（蓝色）和I（粉色）下（图。6.a） 。混合基因型Kalonunia、Kalanamak、Kalojeera、Swarnakranti、IET25464在簇II下与SP2形成一个独特的子簇。水稻籽粒铁和锌含量与聚类模式显著相关（图。6.b，c）。在红色的红色表示的群体表示高，绿色为树中的低铁/锌含量为适中和蓝色。当比较铁含量时，簇I组合了30个低铁和2（Cr Dhan 907和Nuadhusura）中等的含铁含有基因型，簇III包括大部分高级和中等Fe的基因型。在簇II中的51个基因型中，超过80％的谷物Fe含量低至中等。因此，簇II和III可以被分类为中度至高Fe含有组。类似地，当与聚类模式进行比较水稻谷物的Zn含量时，簇II和III包括大部分基因型，高Zn（图。6.c)。在簇III中，Zn含量仅为19种基因型中的三种基因型低，其中剩余均为中等至高Zn。在树的簇II中包含具有高和28个基因型的六种基因型（图28个具有中等Zn含量的基因型（图。6.c)。

标记等位基因与水稻籽粒铁、锌含量的关联

谷物Fe，Zn含量，圆锥/ m的关联^2.利用TASSEL 5软件对分子标记的产量进行了估算，关联参数基于广义线性模型（GLM）和混合线性模型（MLM/K） + 标记性状比较以小于5%的误差（即95%的置信度）进行筛选(P.值<0.05）。GLM方法计算平均R.^2.值为0.1133，上下限为0.6095，下下限为0.0386^2.值范围为0.0392至0.146，平均值为0.0622（附加文件5.：表S3;附加文件6.：表S4）。带r^2. > 0.10 andP. ≤ 0.05 filter, 42 and 3 markers showed association with grain Fe and Zn content respectively by using GLM model (Additional file5.：表S3）。然而，拍摄MLM模型，只有一个标记GRMM9-1显示与谷物ZN含量相关的关联（表5.）.但是当r.^2. > 0.05 was taken into account, 11 (RM243, RM122, RM234, RM80, RM315, RM339, RM1132, GRMM9–1, OsZIP8A, OsYSL2A, OsZIP6A) and 3 (RM80, RM300, RM1132) markers were associated with grain Fe and Zn content, respectively (Additional file5.：表S3;附加文件6.:表S4)。同时考虑GLM和MLM，分别有10个和7个标记与籽粒铁、锌含量显著相关P. < 0.05(桌子5.).四个引物，即RM80、RM300、RM1132和GRMM9-1，以及六个引物，即。RM243、RM234、RM80、RM339、OsZIP8B、OsZIP6A分别与籽粒锌和铁含量相关，与r^2.两种模型的> 0.05和p≤0.05滤波器5.）.Q-Q曲线还证实了标记与水稻中的晶粒Fe和Zn含量的关联（图。7.）.

种子特征如圆锥形/ m^2.而产量也分别与44个和25个引物显著相关P< 0.05(附加文件5.：表S3）。当使用传销模型分析时，每个特征的数量减少到13个（附加文件6.:表S4)。但是，考虑到GLM和MLM，12个和8个标记显示出与番泻浆的显着相关性^2.和粮食产量P. < 其中9个标记（RM248、RM17、RM440、RM85、RM556、RM23、RM340、OsNARMP1A、OsFER1）和4个标记（RM17、RM421、OsNARMP1A、OsFER1）和GLM以及MLM显示r^2. > 每米穗数为0.10^2.．在产量性状上，RM17、RM517、RM339和RM1132与r^2.用GLM和RM517两种模型的结果均显示r^2. > 0.10 (Table5.）.Q-Q图也证实了这些标记与水稻穗数/m2和产量的关联。7.）.

共同标记与不同性状相关。采用GLM和MLM模型分别观察了16个和4个常用标记物的铁和锌含量(附文件)5.:表S3和附加文件6.：表S4）。该数字减少至三（RM80、RM339、RM1132）当同时考虑这两个模型时，考虑到GLM模型，12个标记，即RM243、RM488、RM248、RM17、RM3392、RM440、RM201、RM421、RM585、RM34、RM339和RM1132，与所有性状，即籽粒铁和锌含量、每平方米穗数和产量显著相关。RM1132和RM339通常与籽粒铁、锌和钾相关考虑GLM和MLM模型的产量（表5.)OsFER1与除产量外的所有性状相关。

实时荧光定量PCR技术用于验证籽粒铁、锌含量相关标记/基因

利用qRT-PCR方法对标记性状关联分析中所鉴定的标记进行验证。分别选择OsZIP8和OsZIP6基因的两个显著相关标记OsZIP8B和OsZIP6A进行验证研究。基因的qRT-PCR结果与管家基因b微管蛋白归一化。在铁锌正常和缺铁条件下，研究了高粒铁锌基因型Kalanmak和低粒铁锌基因型Swarna的根和地上部表达情况。与对照相比，在缺铁缺锌条件下，这两个基因表达均上调。8.）.缺陷条件下，两种基因的表达倍数变化范围为1.69 ~ 6.22。在根中表达量较高。Swarna的根比Kalanamak的根有更多的上升。

现代高产品种缺乏水稻籽粒铁、锌等必需微量元素的含量[16,17]．精米的平均含量为2毫克公斤^{- 1}铁，而建议的人类膳食摄入量为10-15 镁 公斤^{- 1}．以前的种质研究报告的籽粒铁锌含量变异范围为6.3-24.4 mg kg^{- 1}Fe和13.5-28.4 mg kg^{- 1}对于水稻颗粒中的Zn强烈建议在水稻种质中存在遗传可变性的存在[6.,8.,9,25,52.,