生理和比较蛋白质组学分析为玉米(gydF4y2Ba玉米gydF4y2Bal .)gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

荫蔽胁迫是一种普遍存在的非生物胁迫，严重地抑制了植物的生长和生产。然而，对荫胁迫下的蛋白质调控网络知之甚少。为了更好地表征遮荫胁迫下玉米叶片蛋白质组学的变化，设计了抽雄期至生理成熟期60%遮荫(S)和阴天光照(L)，以环境光照处理(CK)为对照。采用等压标记相对绝对定量(iTRAQ)技术测定叶片蛋白质组谱。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

遮荫显著降低SPAD值、净光合速率和籽粒产量。2个试验年，S处理的产量分别比CK降低48%和47%，L处理的产量分别比CK提高6%和11%。通过iTRAQ共鉴定出3958个蛋白，并对2745个蛋白进行了定量分析，其中349个蛋白在处理与对照之间表达水平变化至少为1.2倍。利用Web Gene Ontology Annotation Plot在线工具将差异表达蛋白分类为光合作用、胁迫防御、能量产生、信号转导以及蛋白质和氨基酸代谢。此外，这些蛋白在叶绿体(58%)和细胞质(21%)中富集，用于亚细胞定位。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

60%的遮荫诱导了光合电子传递链(尤其是光收集复合体)和胁迫/防御/解毒相关蛋白的表达。然而，与卡尔文循环、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解、TCA循环以及核糖体和蛋白质合成相关的蛋白质显著降低。本研究结果可为蛋白质功能分析提供有价值的资源，并阐明玉米荫蔽胁迫下的蛋白质组学和生理机制。gydF4y2Ba

玉米(gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba(l)作为食物、饲料和生物燃料，是世界上最重要的作物之一[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。由于C4循环使CO富集，玉米的光合速率相对较高gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba然后提高RuBP的羧化活性[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。光合作用受薄壁组织分化和发育的影响，而薄壁组织对遮光极为敏感[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。近年来，研究人员越来越关注C4植物的荫蔽胁迫[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在这些条件下(如潮湿的天气、植物密度和海拔)，玉米经常遭受弱光胁迫或自遮荫，特别是在华北平原的生长后期，日照时数和太阳辐射的减少严重限制了玉米的生产[j]。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。叶绿体是进行光合作用的场所，对外部环境非常敏感，其结构直接影响光合作用[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。荫蔽胁迫破坏叶绿体超微结构，降低叶绿素合成、二氧化碳固定和光合能力[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。此外，阴影胁迫诱导了更多的超氧化物，HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba植物中的羟基自由基gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。植物改变形态和营养分布以适应光照不足，例如通过合成更多的叶绿素来适应弱光环境，作为光收集复合体的一部分[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。增加光照导致类囊体层结构更致密，并显著增强光系统I和II (PSI和PSII)活性[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。植物对环境胁迫有复杂的生理生化反应[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。因此，了解荫胁迫引起的蛋白质组学变化具有重要意义。gydF4y2Ba

蛋白质作为直接参与者参与生长、发育、繁殖、代谢等过程，反映了环境刺激下各种生理功能的反应[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。差异蛋白质组学侧重于筛选和鉴定不同物种或状态之间蛋白质组的差异和变化，揭示和验证蛋白质组学的变化[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。相对和绝对定量等压标签(iTRAQ)结合串联质谱和多维液相色谱提供了良好的准确性和可重复性，特别是对于低水平的蛋白质[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

以往对遮荫条件下玉米光合作用的研究多局限于表观生理水平，比较蛋白质组学研究较少。为了系统深入地了解玉米叶片对不同光强的响应，了解其蛋白质组学的变化，我们测定了不同光照条件下玉米叶片中丰富蛋白的差异。总之，我们的研究可能有助于阐明阴影胁迫的机制及其对玉米叶片光合作用的影响。gydF4y2Ba

粮食产量及产量构成gydF4y2Ba

遮荫后的籽粒产量与对照(CK)相比显著下降(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。2015年和2016年，遮荫(S)处理籽粒产量分别降低48%和47%，补光(L)处理籽粒产量分别提高6%和11%。抽雄后不同光照条件对产量成分有影响。S处理导致单穗粒数、穗数和千粒重较CK降低，造成产量损失。gydF4y2Ba

叶片光合性能gydF4y2Ba

功能叶片气体交换参数gydF4y2Ba

光合速率(gydF4y2BaPgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba)、蒸腾速率(gydF4y2BaTgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba)、气孔导度(gydF4y2BaggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba})在相应的生育阶段均低于对照(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。的gydF4y2BaPgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba，gydF4y2BaTgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}VT20(抽雄后20 d)和VT40(抽雄后40 d)分别降低了53、67和68%和67、59和67%。的gydF4y2BaPgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba，gydF4y2BaTgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}与对照相比，L处理分别提高了3、5和15%，VT20和VT40处理分别提高了8、15和19%。细胞间COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度(gydF4y2BaCgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)，在VT20和VT40时，S处理分别增加11%和10%;L处理在VT20和VT40分别降低了13%和4%。gydF4y2Ba

叶绿素土壤植物分析发育(SPAD)值gydF4y2Ba

抽雄后不同光照强度对叶绿素SPAD值的影响不同(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).在VT20和VT40, S处理的SPAD分别比CK降低了17%和23%，而L处理同期的SPAD分别比CK提高了3%和6%。gydF4y2Ba

功能叶丙二醛(MDA)含量gydF4y2Ba

与对照相比，S处理在VT20和VT40的MDA含量分别提高了29%和17%;L处理降低了9%和6%。抽雄后不同光照强度对玉米衰老特性的影响不同(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

玉米叶片中差异丰度蛋白(DAPS)的iTRAQ分析gydF4y2Ba

从玉米叶片中鉴定出3958个蛋白，其中2745个蛋白具有相对定量信息(另附文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。根据dap的识别标准(倍数变化率> 1.2和gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)，抽雄后20 d S处理鉴定出105个dap;其中63种蛋白升高，42种蛋白降低。L处理在抽雄20 d后鉴定出17个DAPs，其中6个蛋白增加，11个蛋白减少。不同时间点的dap数量不同。加工后期，在S处理中鉴定出223个DAPs，其中125个蛋白增加，98个蛋白减少;从L处理中获得98个DAPs，其中65个蛋白增加，33个蛋白减少(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

抽雄20 d后，98个蛋白(61个增加，37个减少)和10个蛋白(4个增加，6个减少)只对S或L处理有反应，7个蛋白在S和L处理中都有差异表达。7个蛋白中，2个蛋白在S和L处理下升高，5个蛋白在两种处理下均降低。抽雄后40 d，分别有182个(95个增加，87个减少)和57个(37个增加，20个减少)蛋白只对S或L处理有反应，而41个蛋白在S和L处理中都有差异表达。在这41个蛋白中，28个蛋白在S和L处理下均增加，11个蛋白在S和L处理下均减少。两种蛋白在S处理下增加，在L处理下减少(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

DAPs的功能分类及定位预测gydF4y2Ba

根据UniProt (gydF4y2Bahttp://www.uniprot.org/gydF4y2Ba)及GO网站(gydF4y2Bahttp://www.geneontology.org/gydF4y2Ba)， 349个蛋白被划分为7个功能类别(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa和附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。这些类别参与光合作用(25%);压力、防御或排毒(20%);能源生产(19%);蛋白质和氨基酸代谢(12%);信号转导(4%);其他蛋白质功能(17%);未知的蛋白质功能(3%)。gydF4y2Ba

接下来，WoLF PSORT软件(gydF4y2Bahttp://www.genscript.com/wolf-psort.htmlgydF4y2Ba)用于预测亚细胞定位。349个特征蛋白的亚细胞定位显示，202个蛋白(58%)位于叶绿体中，74个蛋白(21%)位于细胞质中，18个(5%)位于细胞核中，17个(5%)位于线粒体中，13个(4%)位于细胞外间隙，8个(2%)位于液泡膜中，8个(2%)位于质膜中，5个(1%)位于细胞骨架中，3个(1%)位于内质网中，3个(1%)位于过氧化物酶体中(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).这些结果表明，玉米叶绿体中有许多蛋白质与光反应有关。gydF4y2Ba

DAPs的GO富集和KEGG注释分析gydF4y2Ba

DAPs氧化石墨烯富集分析gydF4y2Ba

为了进一步了解鉴定和定量的蛋白质的性质(折叠变化率> 1.2和gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)，我们用GO注释了它们的功能和特征。dap被分为三个层次结构的GO术语:生物过程(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个和gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)细胞成分(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Bab和gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)，分子功能(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac和gydF4y2Ba6gydF4y2Bac). Go聚类分析表明，增加的DAPs (VT20L vs. VT20CK)在大分子生物合成和蛋白质代谢过程中高度富集，主要位于细胞膜，对核糖体的结构成分和结构分子活性起作用。增加的DAPs (VT20S vs. VT20CK)主要参与光合作用、对氧化应激和损伤的响应以及蛋白质修饰过程，主要位于光系统，其分子功能为叶绿素结合。减少的DAPs (VT20S vs. VT20CK)主要参与氧化还原反应、碳水化合物代谢和其他代谢过程(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。这一结果表明，增加的DAPs (VT20S)主要位于光合系统和类囊体结构，参与光合作用和蛋白质修饰等生物过程，主要以“结合”和“信号转导”为主。而DAPs (VT20L和VT20CK)主要参与蛋白质代谢过程(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

与对照(VT40Ck)相比，增加的DAPs (VT40S)在细胞形态发生、氧化应激反应和应激防御中高度富集，且主要位于光系统和液泡中，S处理的DAPs在酶调节活性和氧化还原酶活性方面表现出较强的富集。减少的DAPs (VT20S vs. VT20CK)主要位于质体和叶绿体中，参与蛋白质复合物组装、胁迫防御和多糖代谢过程。光照处理40 d时，增加的DAPs主要参与细胞分解代谢、低聚糖代谢和生物碳水化合物代谢过程。减少的DAPs主要参与光合作用、能量代谢和蛋白质合成过程(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

DAPs的KEGG富集分析gydF4y2Ba

使用KEGG数据库识别富集途径，使用双尾Fisher精确测试来测试DAPs对所有鉴定蛋白质的富集程度。有一个修正的路径gydF4y2BapgydF4y2Ba-value < 0.05为显著性。根据KEGG通路网站(gydF4y2Bahttp://www.genome.jp/kegg/pathway.htmlgydF4y2Ba)。抽雄20 d后，KEGG聚类分析显示，L处理的DAPs在蛋白质合成和剪切功能上高度富集，S处理的DAPs在光合作用和氨基酸合成上高度富集(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad).抽雄后40 d, KEGG聚类分析显示，L处理的DAPs在光合作用和酪氨酸代谢中富集，S处理的DAPs在氮代谢、谷胱甘肽、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢、亚油酸代谢、n糖链合成中表达(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)转录表达分析gydF4y2Ba

gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。相反，叶绿素a-b结合蛋白2在VT20L表现出相反的趋势。gydF4y2Ba

近年来，玉米生育期后期多雨天气频发，影响了玉米授粉，导致产量下降[j]。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。转录组学研究表明，荫蔽极大地诱导了许多途径，如DNA合成/染色质结构、光信号、光反应和RNA转录调控[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。然而，mRNA表达水平并不能完全预测转录后修饰和翻译调控导致的相应蛋白质丰度[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。蛋白质组学研究有助于揭示阴胁迫下玉米叶片的复杂变化，为玉米田间对阴胁迫的响应提供新的信息。我们成功鉴定了3958个蛋白(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，这比基于二维电泳的蛋白质组学发现的要多。gydF4y2Ba

光强对籽粒产量和光合特性的影响gydF4y2Ba

除光照强度定期监测外，各处理间小气候指标无显著差异(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，而杜[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。MDA含量往往反映了体内脂质过氧化的程度，间接反映了细胞损伤和叶片衰老的程度，并影响光合作用[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。我们的研究结果表明，抽雄后遮荫增加了丙二醛浓度，加速了叶片衰老，而补光通过提高保护酶活性和增加活性氧清除能力延缓了叶片衰老，前期研究报道[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。抽雄后遮荫降低了叶绿素含量、光合速率和籽粒产量，这是由于膜系统中自由基的损伤造成的[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]，而补充光照则提高了光合能力和产量。gydF4y2Ba

光强对光合作用相关蛋白的影响gydF4y2Ba

在本研究中，我们确定了87个在遮荫和补充光照后参与光合作用的DAPs(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).包括光反应和固碳反应在内的光合作用决定了植物的生产力和能量效率，并且对非生物胁迫非常敏感[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。VT20S处理可提高叶绿素a/b结合蛋白(A0A096RF43)的表达，提高光合电子传递链操作速率，为暗反应提供足够的恢复力和三磷酸腺苷(ATP) [j]。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。L诱导光系统II反应中心Psb28蛋白(K7V1V6, B6TYC5)的表达，促进水光解。铁氧化还蛋白(K7U9U9, B6SP61, A0A096QD90)是光合电子传递链的末端氧化酶，而细胞色素P450 (A0A096QBU9, A0A096PQR7, A0A096SY33, C0P4G2)作为末端氧化酶接受NADPH电子，共同参与电子传递[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。我们的研究结果表明，S增加了铁氧还蛋白、细胞色素P450和PSI反应中心亚基(B4FUT9、P62596、B6TR16、B6U534、B4G1K9)的丰度，而VT40L降低了铁氧还蛋白的丰度，这可能意味着植物改善了光合电子传递以适应遮荫胁迫，从而产生了弱光胁迫应急响应，需要调整碳代谢产物等一些基础代谢产物在非生物胁迫下建立新的平衡。gydF4y2Ba

果糖二磷酸醛缩酶(FBPase)、淀粉合成酶和异黄酮还原酶与蔗糖的合成和光合产物的形成密切相关[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。在我们的研究中，S降低了FBPase (B4FR47, A0A096RD67)、淀粉合成酶(B8A2L4)和异黄酮还原酶(B4FD74)的丰度(图4)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)，可能影响叶片光合效率，降低ATP和NADPH含量。同样，对叶片超微结构的研究表明，遮荫破坏了叶绿体超微结构，而补充光照增加了籽粒和片层的数量[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。我们推测灌浆前期遮荫主要抑制PSI和暗反应，而PSII通过增加电子传递相关蛋白的丰度，降低遮荫对生长发育的不利影响，提高光能利用效率。psii相关DAP增高，CO增高gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生长后期固结和淀粉合成受到抑制。光合机制受到破坏，反映在气体交换参数和相对蛋白质丰度上，导致生物量和籽粒产量下降。光合作用相关蛋白在VT20L中较少，而在VT40L中较多。这可能是灌浆初期降雨较少，灌浆后期降雨较多的结果。补光促进了光合电子传递，提高了光合效率，促进了淀粉合成过程。这可以解释为什么玉米的光合速率和干物质积累增加(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

不同光照条件对能量生产相关蛋白的影响gydF4y2Ba

植物通过呼吸代谢将复杂有机物分解为简单化合物，并释放能量维持植物中间代谢物和能量需求[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。蛋白质组学分析表明，多糖降解相关蛋白(1,4- β - d -葡聚糖酶(B4FTK9, B4FPA0)，水二激酶(A0A096TN87)， 1,3- α -葡糖苷酶(K7TGE1, K7VP34))在S中减少，表明叶片被各种多糖降解削弱。与这些结果相似，遮荫胁迫也抑制糖酵解相关酶的表达，而补充光照则有相反的趋势，说明遮荫胁迫抑制糖酵解，加速植物衰老。液泡atp酶亚基(B4FPE4)在衰老叶片中不断增加，说明叶片在衰老过程中需要通过蔗糖合成来运输叶片输出的糖或将其暂时储存在细胞质中。线粒体呼吸链第一复合体中nadp依赖的醌氧化还原酶样蛋白(A0A096S7Z2, A0A096U487)也受到阴影的强烈诱导。它们的增加可能意味着植物可以通过增强呼吸链中的电子传递和ATP合成来弥补能量供应的不足。-半乳糖苷酶(A0A096R2T2)是产生能量和碳的重要来源[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。醇脱氢酶超家族蛋白(K7UAQ8、A0A096SZS3、A0A096TTS5)、β -半乳糖苷酶(A0A096R2T2)、附子水合酶(C0HER4)、β -淀粉酶(A0A0B4J3H2)等参与糖酵解和三羧酸循环的蛋白均被阴影显著抑制。因此，遮荫破坏了糖酵解、三羧酸循环和其他能量代谢途径，这可能会降低能量供应和粮食产量。能量代谢的灵活性可能有助于提高玉米对遮荫胁迫的抗性。gydF4y2Ba

光照强度对胁迫/防御/解毒相关蛋白的影响gydF4y2Ba

植物在逆境中往往会积累大量活性氧(ROS)和自由基，严重影响植物体内平衡，加速植物衰老[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。在进化过程中，植物也形成了防御系统来清除许多自由基和活性氧[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。过氧化物酶(Prx、A0A0B4J3G7、A0A0B4J3A8、B4FVT1、A0A096T686、A0A096SIT0、A0A096RME9)、过氧化氢酶(K7UGM3、A0A0B4J352)和半胱氨酸蛋白酶(Cpr、B4FS65、B4FZ79、A0A096S518)在遮荫诱导下参与防御和解毒过程[j]。gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。Prx比其他过氧化物酶(如SOD、POD、CAT和APX)具有更强的活性氧清除能力[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]，提高了遮荫胁迫下玉米叶片的抗氧化能力。Cpr作为一种蛋白水解酶，参与受损蛋白的降解，从而降低可溶性蛋白含量，增强渗透调节[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。荫蔽胁迫通过提高活性氧的清除能力来增强玉米叶片的荫蔽适应性或抗性，热胁迫后的葡萄叶片也发现了类似的结果[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。热休克蛋白70 (Hsp70, A0A096R6Z8, C0P732)是一种重要的应激诱导蛋白和分子伴侣蛋白，在光抑制下保护和修复PSII [qh]gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。谷胱甘肽s -转移酶(GSTs)参与代谢、清除自由基和减轻氧化损伤[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]，它还可以通过与还原型谷胱甘肽结合来解毒膜脂过氧化物和氧化的DNA降解产物[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。因此，GST活性的增加可能有助于玉米在荫蔽胁迫下的抗性。gydF4y2Ba

光照强度对蛋白质和氨基酸代谢相关蛋白的影响gydF4y2Ba

蛋白质代谢一般包括蛋白质的生物合成、蛋白质折叠、修饰和降解[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。iTRAQ分析鉴定出18个与转录翻译相关的蛋白，包括3个核酸结合蛋白60S、40S(核蛋白合成)、30S和50S(质体和线粒体蛋白合成)核糖核蛋白(A0A0B4J3C6、C0P9S2)和延伸因子(A0A096PU69、A0A096QDW6、B6TWN7)。遮荫降低了伸长因子，表明遮荫胁迫抑制了转录翻译相关蛋白的表达，影响了蛋白的合成[j]。gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。我们还鉴定了20种与蛋白质折叠、修饰和降解相关的蛋白质。荫蔽通过抑制硫氧还蛋白的表达抑制转录后蛋白修饰、二硫交换调控和重要的酶活性调控[j]gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。遮荫诱导蛋白结合蛋白(C4J5Y0)的表达，C4J5Y0是一种普遍存在的辅酶和酶调节剂[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。在此背景下，抽雄后不同的光照强度可以影响蛋白质的折叠、修饰和降解，从而调节植物的各种生理生化代谢过程。gydF4y2Ba

根据我们的研究结果和前人的研究，我们可以采取一些策略来减少遮荫对玉米的危害。首先，有可能通过弱光运动增强光合作用相关蛋白的表达，提高光合电子传递链开动率和抗逆性。其次，外源激素调控可能是减少弱光对玉米不利影响的便捷途径。最后，选择高抗性品种，调整播期，避免生育后期阴雨天气，保证适宜的光照条件，使玉米高效光合作用。本研究结果为进一步了解荫蔽胁迫下玉米叶片蛋白质表达机制提供了理论依据，并有助于通过遗传改良和农艺管理措施提高玉米的光合作用和产量。gydF4y2Ba

基于iTRAQ蛋白质组学分析，在玉米叶片中鉴定出3958个蛋白，其中349个重要的dap与光合作用、防御、能量代谢、蛋白质合成、信号转导等生物过程有关。与对照相比，遮荫诱导了光合电子传递链相关蛋白(尤其是光收集复合物)和胁迫/防御/解毒相关蛋白的表达，但与卡尔文循环、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解、TCA循环以及核糖体和蛋白质合成相关蛋白的表达显著降低。研究结果为揭示玉米在荫蔽胁迫下的蛋白质组学水平和生理反应机制提供了新的思路。gydF4y2Ba

植物材料与胁迫处理gydF4y2Ba

试验在山东农业大学实验农场(36°09′n, 117°09′e, 158 m)进行gydF4y2Baa.s.l。gydF4y2Ba)和作物生物学国家重点实验室(2015年和2016年)。根据《濒危野生动植物种贸易公约》，本研究由山东农业大学批准。研究区属温带大陆性季风气候，研究期间的积温、降雨量、人工照明时间见表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．关于该地区土壤的更多信息可参见Gao等人(2017a)。本研究种植玉米杂交种郑单958 (ZD958，郑58/长7 - 2)(67500株/公顷)，2001年获得中国国家作物品种审定委员会批准。材料购自泰安登海五岳泰山种业有限公司。三种处理(S: 60%遮荫;L:阴天辅助照明;CK:环境光照)布置于田间。每个试验田为5行60厘米宽、9米长的玉米。在抽雄阶段进行遮荫和补充照明，一直持续到收获。遮阳帐篷采用市售遮阳布(中国寿光宏达遮阳布公司)搭建，遮阳布高出作物约2 m，阴天光照强度L最大为1600 ~ 1800 μmol mgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．每次处理都能很好地控制病虫害。玉米萌发前施用莠去津和乙草胺防治杂草，硫辛硫磷防治螟虫。gydF4y2Ba

田间小气候gydF4y2Ba

辐照度、冠层CO的测量方法gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度、相对湿度、冠层空气温度、风速、土壤温度在我们以前的研究中都有报道[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

功能叶片气体交换参数gydF4y2Ba

光合速率(gydF4y2BaPgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba)、蒸腾速率(gydF4y2BaTgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba)、气孔导度(gydF4y2BaggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba})和细胞间COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度(gydF4y2BaCgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba)根据Gao et al. (2017) [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

叶绿素SPAD值gydF4y2Ba

使用便携式叶绿素计(SPAD-502，美能达相机公司，大阪，日本)在VT, VT20和VT40处测量SPAD值。每个处理随机选择10株进行测量。gydF4y2Ba

功能叶MDA含量gydF4y2Ba

在VT、VT20和VT40取样，每个处理3个重复。对于每个植物样本，收集穗叶并在分析前保存在- 40°C。采用硫代巴比妥酸法测定功能叶MDA含量[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]，单位为μmol ggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}弗兰克-威廉姆斯。gydF4y2Ba

粮食产量及产量构成gydF4y2Ba

采用连续取样法，于R6收割每地块中间三行30穗，测定产量及产量构成。标准含水率为14%。gydF4y2Ba

iTRAQ蛋白质组分析gydF4y2Ba

根据前人的研究，我们选择了VT20和VT40期作为灌浆前期和后期蛋白表达变化的两个不同时期。我们在VT20和VT40取样了每个地块中心的五株植物的五片穗叶。收集叶片的中间部分，在液氮中冷冻，并在- 80°C保存，然后进行分析。每个处理有3个生物重复(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。用研钵和杵将样品在液氮中磨成细粉，然后提取蛋白质。提取的蛋白溶液经胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化后，对肽进行脱盐、真空干燥和iTRAQ标记。样品经高ph反相高效液相色谱分离，进行液相色谱-串联质谱分析。蛋白质组学的具体分析方法由Jingjie PTM BioLabs, Inc.提供。在附加文件中描述了更详细的方法gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

得到的质谱/质谱数据使用Mascot搜索引擎(v.2.3.0, Matrix Science, London, UK)进行处理。串联质谱与gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba数据库。搜索执行指定胰蛋白酶/P作为切割酶，允许多达两个缺失的切割。前体离子的质量误差为10 ppm，碎片离子的质量误差为0.02 Da。Cys上的氨基甲酰被指定为固定修饰，Met上的氧化被指定为可变修饰。在Mascot中选择iTRAQ-8-plex进行蛋白定量。假发现率调整为< 1%，肽离子评分设置为≥20。我们使用同一时期的CK样本作为参考，所有其他样本都与CK进行比较。为了确保定量结果的准确性，在进一步分析之前，我们至少从两个生物重复中获得了定量蛋白质信息。以3次生物重复的平均值作为最终蛋白质丰度，在不同阶段平均蛋白质丰度变化大于1.2倍的蛋白质(gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.05)定义为DAPs。gydF4y2Ba

使用GO对DAPs物种进行功能注释。基于这些注释，将蛋白质分为三类:生物过程、细胞成分和分子功能。然后我们使用WoLF PSORT软件预测亚细胞定位。我们利用KEGG数据库预测了主要代谢途径和DAPS生化信号转导途径。统计学分析采用SPSS 20.0的方差分析(ANOVA)。我们在0.05的概率水平上使用最小显著性差异(LSD)检验来评估处理之间的差异。gydF4y2Ba

RNA提取和实时定量PCRgydF4y2Ba

我们选择了6个鉴定的蛋白，通过qRT-PCR分析了相应基因的表达水平。用TRIzol试剂(Aidlab，北京，中国)从叶片中提取总RNA。用DNaseI处理总RNA以去除基因组DNA污染。目标基因的特异引物(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)采用Primer 3.0软件设计。采用Bestar SYBR Premix Ex Tag KIT(德国)进行qRT-PCR。qRT-PCR在20 μl体积中进行，体积中含有10 μl 2X SYBR Green qPCR主混合物、2 μl cDNA、各基因特异性引物0.5 μl和7 μl ddHgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO. PCR条件为:95°C 2 min, 95°C 10 s 40个循环，60°C 30 s和72°C 30 s，熔体曲线为65°C至95°C。在CFX96 Real-time PCR检测系统(Bio-Rad)上进行反应。使用CFX Manager软件(Bio-Rad)分析所有数据。gydF4y2Ba

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。gydF4y2Ba

雨:gydF4y2Ba

AcetonitrilgydF4y2Ba

方差分析:gydF4y2Ba

方差分析gydF4y2Ba

ATP:gydF4y2Ba

三磷酸腺苷gydF4y2Ba

CgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

细胞间有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度gydF4y2Ba

CK:gydF4y2Ba

野外环境阳光gydF4y2Ba

心肺复苏:gydF4y2Ba

半胱氨酸蛋白酶gydF4y2Ba

衣冠楚楚的:gydF4y2Ba

差异丰富蛋白gydF4y2Ba

DH605:gydF4y2Ba

登海605gydF4y2Ba

费尔南多-阿隆索:gydF4y2Ba

甲酸gydF4y2Ba

FBPase:gydF4y2Ba

Fructose-bisphosphate醛缩酶gydF4y2Ba

ggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}：gydF4y2Ba

气孔导度gydF4y2Ba

消费税:gydF4y2Ba

谷胱甘肽S-transferasegydF4y2Ba

Hsp:gydF4y2Ba

热休克蛋白gydF4y2Ba

iTRAQ:gydF4y2Ba

等压标记用于相对和绝对定量gydF4y2Ba

李:gydF4y2Ba

在多云的日光下补充照明gydF4y2Ba

迷幻药:gydF4y2Ba

最小显著差异gydF4y2Ba

MDA:gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

女士:gydF4y2Ba

质谱分析gydF4y2Ba

票面价值:gydF4y2Ba

光合有效辐射gydF4y2Ba

PgydF4y2Ba_ngydF4y2Ba：gydF4y2Ba

光合速率gydF4y2Ba

插件可以:gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

PSI:gydF4y2Ba

光系统IgydF4y2Ba

PSII:gydF4y2Ba

光系统IIgydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

R6:gydF4y2Ba

成熟阶段gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

史:gydF4y2Ba

60%的阴影gydF4y2Ba

SPAD:gydF4y2Ba

叶绿素土壤-植物分析进展gydF4y2Ba

TgydF4y2Ba_rgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

蒸腾速率gydF4y2Ba

VT:gydF4y2Ba

抽雄期gydF4y2Ba

VT20:gydF4y2Ba

抽雄后20天gydF4y2Ba

VT40:gydF4y2Ba

抽雄后40 dgydF4y2Ba

作者感谢审稿人和编辑对本文提出的建设性意见和建议。我们感谢PTM Biolabs, Inc.在生物信息学方面的建议。gydF4y2Ba

本研究由国家自然科学基金(31671629)、国家现代农业技术与产业系统(CARS-02-18)、国家重点研发项目(2017YFD0300304-02)资助。资助机构不参与设计研究、测量、数据分析和起草稿件，而只是提供资金支持。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 山东农业大学作物生物学与农学院国家重点实验室，山东泰安271018gydF4y2Ba

   高佳，刘铮，赵斌，刘鹏，张继旺gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

JZ和JG发起并设计了这项研究。JG进行了测量，数据分析，并起草了手稿。ZL, BZ, PL, JZ在构思和实验设计方面做出了很大的贡献，并对稿件进行了严格的修改。所有作者已阅读并同意稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaJi-Wang张gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供到知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了修改。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba