油菜素内酯信号可能调控宿根稻腋芽的萌发gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

水稻再生化历来是中国水稻种植制度的重要组成部分。但与第一季水稻相比，对再生稻产量影响因素的研究较少。由于再生稻是一种利用腋芽在稻桩上发芽、第一茬收获后产生穗的一季水稻，其产量主要受腋芽生长的影响。本研究旨在探讨腋芽的发芽机制，以提高再生稻产量。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

首先，我们观察了汕优63不同节段腋芽的分化和生长动态，发现腋芽在母茎抽穗前从下至上分化，发育非常缓慢。在头部后，它们从上到下分化，顶部的节点，尤其是顶部的第2节点，发展速度比其他节点快得多。腋芽的平均长度和干重在黄熟期显著大于其他节段，并在黄熟期6 d后分化为雌蕊和雄蕊。汕优63再生分蘖的营养器官形态也表明，再生稻上芽发育较好，受激素调节。此外，还建立了水稻腋芽黄熟期前后顶部2节的蛋白质组综合图谱，其中一些与类固醇生物合成有关的蛋白质显著增加。其中4种参与了油菜素内酯(brassinosteroids, BR)的生物合成。因此，BR信号可能在宿根稻腋芽萌发过程中起一定作用。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究结果为进一步研究内源BRs在宿根稻腋芽萌发中的生物学功能提供了线索。gydF4y2Ba

大米(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2BaL.)是世界上一种重要的粮食作物，收获后可产生结穗的二次分蘖(即宿根苗)[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在一个种植季节生产第二种水稻被称为再生苗。宿根作物是通过在第一次季稻收获后留下的茬的节芽再生水稻分蘖而发展起来的[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．在主季后有充足水源的地区，可以采用再生稻作为两熟作物的替代[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．它比主要作物需要更少的投入，如化肥，并且在主要作物几乎无法收回投入成本时，通常可以为种植者提供净利润。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．在中国，宿根稻可以追溯到1700年前[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．20世纪30 ~ 40年代开始对再生稻分蘖形态发育的研究，20世纪60 ~ 70年代在中国培育了一批再生稻品种[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．20世纪80年代以来，随着一批高产杂交水稻新品种的选育，再生稻已成为中国南方大面积推广的一种新型种植制度。1997年，再生稻种植面积扩大到7.5 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba嗯gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在中国(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．1998 - 2002年，中国福建省三明市尤溪县建立了再生稻超高产示范区，累计种植面积1097.73 hmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在5年。平均产量10664 kg/hmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba第一季为6537 kg/hmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba再生期，年总产量为17201 kg/hmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．有1.07 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba嗯gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba单作水田面积3.3 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba嗯gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba适合种植再生稻。再生稻产量17201 kg/hmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba，该面积可生产5.68 × 10gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba每年1公斤大米。这对于以世界7%的耕地养活世界22%人口的中国粮食生产和战略发展具有重要意义。gydF4y2Ba

再生稻是一种利用稻秆节芽再生的水稻分蘖器。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．新分蘖是由第一季收获的第一种作物或主要作物再生而来的[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．主根作物与宿根作物的生理参数不同。再生稻的穗发育和抽穗较主稻少。宿根作物的低产量通常取决于有效分蘖数的减少和生育期短[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．水稻主要作物开花后，叶片和秆中积累的糖和淀粉转运到籽粒中。这可能是在主要作物成熟后，碳水化合物在茎中再次积累，为宿根的生长发育做准备。因此，有效实施再生稻专用农艺措施将为再生稻的增产提供巨大的潜力[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

影响宿根稻生长发育的因素包括发育品种、水肥管理、茬高、植保措施以及影响宿根稻产量的温度、光照等外部环境因素[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．在这些因素中，最重要的是品种发育。以往的研究主要集中在种植日期、水肥管理等外部因素对宿根作物生产的影响。虽然研究了品种和茬高对再生稻产量的影响，但它们的潜力和影响有限[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．因此，充分了解腋芽的发芽机理，提高再生稻的再生能力是提高再生稻产量的最有效途径。腋芽的萌发对再生稻的稳产栽培非常重要，但其机理尚不清楚[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．因此，进一步研究宿根稻腋芽的发芽机理，以优化宿根稻芽蘖促进栽培技术。gydF4y2Ba

腋芽的萌发受顶端优势的影响[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，由激素调节[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．油菜素内酯(Brassinosteroids, BRs)是一类植物专用的类固醇激素，其特征是多羟基甾醇结构，具有显著的促生长活性，对植物的正常生长发育至关重要[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．它们参与调节植物的许多重要生理过程，如伸长、萌发、光形态建成、免疫和生殖器官发育[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．其中一种活性最强的BRs能显著增加水稻胚轴长度，减少根系长度[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．BRs在幼苗和幼嫩植物的茎部具有特别强的促生长作用，主要是通过促进与细胞伸长和细胞壁伸长有关的基因表达[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．尽管近年来BR相关基因的分离和功能鉴定极大地扩展了我们的知识，但对BR信号在水稻腋芽发育中的作用知之甚少。由于植物体内BR维持体内稳态的机制复杂，通过对BR生物合成和信号通路的微调来实现对水稻腋芽发育的基因改造还需要进一步的研究。因此，我们建立了水稻腋芽黄熟前后的蛋白质组图谱，以确定参与BR信号转导的蛋白质。此外，我们还研究了BRs在宿根稻腋芽萌发中的可能作用。gydF4y2Ba

腋芽萌发是一个复杂的生理生化反应过程，包括信号转导、代谢再激活和氧化还原稳态调节等。这些生物学过程受到多种蛋白质的催化和调控，因此构建芽萌发过程的比较蛋白质组谱是有价值的。此外，通过将蛋白质组学数据整合到调控通路网络中，可以评估单个蛋白质的作用[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．目前，二维凝胶电泳和多维蛋白鉴定技术是对蛋白质进行识别和定量的常用方法，但这些方法并不适用于包括低丰度蛋白在内的所有类型的蛋白质。它只在特定条件下或特定器官中获得蛋白质。然而，肽标记与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的结合为植物蛋白质的动力学和功能方面提供了新的见解[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．本试验对汕优63(明辉63与珍汕97B杂交)腋芽生长规律进行了详细观察。随后，利用等压标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)构建了再生能力强的明恢63、再生能力弱的珍汕97B和汕优63的定量芽蛋白表达谱。我们的工作获得了芽蛋白组定量配给的全面信息，并确定了与芽萌发有关的差异表达蛋白。同时，我们确定了可能在芽萌发过程中起重要作用的代谢途径。这将为了解水稻腋芽的发芽机制提供更多的信息。gydF4y2Ba

腋芽的分化gydF4y2Ba

再生稻有两次收成。第一茬在齐穗期收获，第二茬在黄熟期收获。一般来说，用于再生稻的晚熟杂交水稻品种地上部分有5个茎叶和6个节间。除顶部第1节外，其他节的腋芽在适宜条件下均可从叶腋发育并萌发形成再生分蘖。通过对汕优63腋芽的显微镜观察，腋芽在第一季黄熟期前12 d仍处于苞片分化阶段(图63)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf、表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．从黄熟期前9 d开始，腋芽分化从上至下开始幼穗分化的新阶段(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag,表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．黄熟期前9 d，顶部第2、3节腋芽分化为初生枝(图3)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag,表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，在黄熟期前3 d转入二次枝(图3)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bah,表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，在黄熟期后3 d转化为小穗(图3)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba我,j,表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，顶部2节部分腋芽在黄熟期后6 d分化为雌蕊和雄蕊(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bak, l,表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．腋芽顶部第4、5节穗分化滞后。顶部4节腋芽在第一季黄熟期才进入初级分枝分化，在黄熟期后6 d才进入次级分枝分化。只有顶部5节的部分腋芽在黄熟期进入初级分支分化，在黄熟期后6 d进入次级分支分化(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．观察不同节位的腋芽，发现它们在母茎抽头前就开始自下而上分化，但发育非常缓慢。母茎抽头后，从上到下分化，顶端的腋芽发育速度明显快于其他芽(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．因此，宿根稻上芽生长较好。gydF4y2Ba

腋芽的生长动态gydF4y2Ba

汕优63观察到，腋芽在茎上的潜伏期较长，在母茎抽穗前仅生长2mm。这是由于顶端优势的控制。黄熟前12 ~ 6 d，腋芽长度仅为6.2 ~ 12.6 mm，黄熟前3 d，顶部第2、3节大部分腋芽开始伸长，顶部第4、5节部分腋芽也开始伸长(表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．黄熟时，第2节顶部腋芽平均长度和干重分别为80.1 mm和55.67 mg，第3节顶部腋芽平均长度和干重分别为68.4 mm和48.23 mg，第4节顶部和第5节顶部腋芽平均长度和干重分别为34.8 ~ 4.63 mm和16.68 ~ 18.07 mggydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．通过对不同节段腋芽长度和干重的比较发现，在黄熟期之前，腋芽长度和干重差异不显著，且均生长缓慢。但在黄熟期前3 d，所有腋芽都开始显著生长，顶部第2和第3个腋芽的生长趋势最大gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

再生分蘖的形态发展gydF4y2Ba

通过对分蘖再生营养器官形态的观察，发现分蘖顶端第2节和第3节的叶片总数一般为3个，顶端第4节和第5节的叶片总数一般为4个。测量各淋巴结器官长度(见表1)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．大部分初叶呈萎蔫状，长度仅为1-3 cm，且长时间内仍被叶鞘包裹，在幼穗发育初期难以确定叶龄(表)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．因此，同时测定了营养器官的伸长动态。最后，以胚乳长度和胚乳年龄为指标，分析了幼穗在1 ~ 5期的发育过程。以顶部两叶的枕叶距、针叶距、小穗长和顶部两节间长为指标，确定了幼穗在第6 ~ 8期的发育过程gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1，表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

腋芽生长动态的蛋白质组学分析gydF4y2Ba

不同再生力水稻品种腋芽发芽率不同，同一水稻品种不同节点腋芽发芽率也不同。其中，再生量高的品种腋芽顶部第2节的再生率最高。根据我们之前的研究，所有的腋芽在黄熟期都有显著的生长gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．为了将我们的大规模腋芽蛋白质组分析与黄熟期调控蛋白的定量信息相结合，我们采用串联质量标记(TMT)方法[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．采用一维凝胶电泳(1-DE)和液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)对水稻明恢63、珍汕97B和汕优63上2节段腋芽蛋白质提取物进行分析。将100 μg左右的蛋白装入1-DE，可视化切片用胰蛋白酶消化。采用LC-MS/MS分析鉴定所有蛋白。具有fold changes (FC)大于1.3和gydF4y2BapgydF4y2Ba-值小于0.05为差异丰度蛋白。本研究共鉴定出差异丰富蛋白9846个，其中5268个(53.5%)增加，4578个(46.5%)减少(图4)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。在黄熟后第3 d，差异丰富度显著增加，表明腋芽萌发时刺激表达了很多基因或蛋白(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。同时，通过比较不同组合的差异丰富蛋白，发现再生能力强的品种汕优63和再生能力弱的品种珍汕97B在黄熟后3 d差异丰富蛋白数量最多。因此，我们重点分析了这些差异丰富的蛋白质，并筛选了参与腋芽萌发的蛋白质。gydF4y2Ba

基因本体(GO)注释和亚细胞分类差异丰富的蛋白质gydF4y2Ba

GO注释将蛋白质分为三类:生物过程、细胞间隔和分子功能。基于生物过程本体论，将蛋白质分为代谢过程(30%)、细胞过程(25%)、单一生物过程(19%)、刺激反应(7%)、生物调节(6%)、定位(4%)、细胞成分组织或生物发生(3%)、发育过程(2%)、多细胞生物过程(1%)、信号传导(1%)、繁殖(1%)和其他(1%)4个功能类别(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).基于细胞成分本体论，将蛋白质分为细胞(36%)、膜(24%)、细胞器(23%)、大分子复合物(7%)、细胞外区(6%)、细胞连接(1%)、共质体(1%)、膜包腔(1%)和其他(1%)功能类别(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).根据分子功能本体，将蛋白分为结合(46%)、催化活性(45%)、转运蛋白活性(2%)、抗氧化活性(2%)、分子功能调节(1%)、结构分子活性(1%)和其他(3%)四类(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac). GO注释显示，这些蛋白主要位于细胞、膜和细胞器中，在代谢过程中发挥作用，并具有结合和催化活性(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

真核生物的细胞被精心地细分为功能不同的膜结合区。因此，我们也使用Wolfsport软件来预测差异丰富蛋白的亚细胞结构(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2)，包括叶绿体(34%)、细胞质(24%)、细胞核(21%)、细胞外(7%)、质膜(6%)、线粒体(4%)、液泡膜(2%)、细胞骨架(1%)和内质网(1%)(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2)。这些结果反映了水稻腋芽在萌发过程中代谢活性的逐渐增加。gydF4y2Ba

BRs可能介导腋芽的萌发gydF4y2Ba

为了确定差异丰度蛋白在特定功能类型中是否具有显著富集趋势，我们进行了GO、京都基因和基因组百科全书(KEGG)和结构域富集分析(图4)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。最丰富的蛋白是具有水解酶、蛋白质异二聚体、氧化还原酶、半乳糖苷酶、蔗糖合酶和udp -葡萄糖6-脱氢酶活性的蛋白，这些蛋白参与了碳水化合物、一元羧酸、细胞碳水化合物和脂质代谢过程，以及脂质和脂肪酸的生物合成过程(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．KEGG富集分析结果显示，检测到的酶参与了光合生物的氨基糖和核苷酸糖代谢、不饱和脂肪酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、丙酮酸代谢、类固醇生物合成、果糖和甘露糖代谢以及碳固定(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在腋芽萌发过程中，会发生一系列的生理生化反应，并进行必要的代谢过程。此外，种子萌发也受到激素的调控。汕优63与珍汕97B之间存在差异丰富的参与类固醇生物合成的蛋白gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4)。BRs是调节植物生长发育的植物甾体激素。在类固醇生物合成途径中，BR生物合成是一个分支。根据KEGG富集分析，有4个BR生物合成相关蛋白显著增加(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4)。因此，BR信号可能在宿根稻腋芽萌发过程中起一定作用。这些蛋白的鉴定将有助于确定BR信号在水稻腋芽萌发过程中的作用。因此，这些蛋白质被选择用于未来的研究。gydF4y2Ba

通过实时定量逆转录PCR (qRT-PCR)分析评估蛋白表达gydF4y2Ba

为了确认蛋白质组学分析结果的准确性和重复性，8个差异丰富的蛋白质调控类固醇生物合成、脂肪酸生物合成和酪氨酸代谢(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)进行qRT-PCR验证。以明恢63、珍汕97B和汕优63的腋芽RNA为模板。8个基因在3个品种黄熟期后表达量均下降，且黄熟期强再生期均高于弱再生期，除BGIOSGA006239(谷胱甘肽s转移酶zeta 1)外(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．其中，环artenol合成酶BGIOSGA007157 (cycloartenol synthase)参与甾体合成，BGIOSGA035444(长链酰基辅酶a合成酶2)参与脂肪酸合成，BGIOSGA011034(甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶)、BGIOSGA017490(葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶)、BGIOSGA008810(双功能dtdp -4-脱氢鼠樱糖苷3,5-表二聚酶/ dtdp -4-脱氢鼠樱糖苷还原酶)和BGIOSGA026375 (udp -葡萄糖醛酸脱羧酶2)参与氨基糖和核苷酸糖代谢。BGIOSGA017637(金合欢基焦磷酸合成酶1)参与萜类主链生物合成，BGIOSGA006239(谷胱甘肽s -转移酶zeta 1)参与酪氨酸代谢。因此，我们发现了一些显著丰富的蛋白参与类固醇生物合成，如BGIOSGA007157((萜烯环化酶))，它们可能在调节腋芽萌发过程中参与BR信号转导。gydF4y2Ba

在中国南方，水稻再生法一直是水稻种植制度的重要组成部分。在这个地区，生产季节不够长，不能再种植第二种水稻，但水稻再生法为可能的第二次收获提供了机会，也增加了土壤中的生物量。再生稻比主要作物需要更少的投入，比如肥料，而且当主要作物几乎没有收回投入成本时，再生稻通常可以为种植者提供净利润。然而，与第一次收获相比，目前对影响再生稻产量的因素的研究还很有限。由于再生稻是一种利用腋芽在稻穗上发芽并在第一茬收获后形成穗的一季水稻，其产量受多种因素的影响[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．其中，品种是最重要的影响因素。品种主要决定最佳产量潜力，而高分蘖潜力和分蘖活力对最大限度地提高再植潜力至关重要。gydF4y2Ba

根据我们之前的研究，腋芽前三叶原基的分化与母茎的生长密切相关。通过对几个再生稻品种的观察，在常见栽培条件下，第2芽发芽率为70-80%，第3芽发芽率为60-70%，第4芽发芽率为20-40%，第5芽发芽率为10-15%。每穗粒数仅为母茎的1 / 3，其中第3粒略大，第2和第4粒次之，第5粒略小。结实率和千粒重随节位下降而下降。因此，2、3分蘖约占总产量的80%。gydF4y2Ba

为提高再生稻产量，对汕优63不同节段辅助芽的分化和生长、花粉粒发育特征及茎器官形态进行了研究。在母茎抽穗前，茎辅助芽的分化从下至上开始，而抽穗后，顶端的腋芽比其他芽发育得快得多，初生枝和次生枝的分化从上至下发生(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．母茎处于黄熟期时，顶部第2节和第3节的腋芽大部分进入二次分支分化，顶部第4节和第5节的腋芽进入一次分支分化(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．对汕优63再生分蘖植株营养器官形态的观察也表明，再生稻上芽发育较好gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1，表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，这是由激素调节的。gydF4y2Ba

BRs在植物的生长发育中起着重要的作用，包括地上部生长、根系发育、育性、种子萌发等。它们也在细胞水平上调节细胞分裂，伸长和分化[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．通过建立水稻腋芽黄熟前后的蛋白质组学综合图谱，我们鉴定出一些与类固醇生物合成有关的蛋白质显著增加。其中4个参与了BR生物合成(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4)。因此，BR信号可能在宿根稻腋芽萌发过程中起一定作用。因此，本研究揭示了BR信号转导的分子机制，为进一步探讨内源BRs在宿根稻腋芽萌发中的生物学功能提供了可能。gydF4y2Ba

宿根稻是一种第一季收获后利用稻桩上的腋芽和穗进行发芽栽培的一季稻。具有一次种植，两次收获，节省人工和成本的优点。然而，与第一次相比，很少有研究探讨影响再生稻产量的因素。由于再生稻第一季收获后在稻桩上从腋芽萌发，因此我们对腋芽的萌发机理进行了研究。腋芽在母茎抽穗前就开始自下而上分化，发育非常缓慢。抽穗后从上到下分化，顶部的发育速度明显快于其他节点，尤其是顶部的第2节，其中腋芽平均长度和干重在黄熟期显著高于其他节点。黄熟后6 d，雌蕊和雄蕊开始分化。通过建立水稻腋芽黄熟前后顶部2节的综合蛋白质组图，我们发现一些参与类固醇生物合成的蛋白质显著增加。其中4个参与油菜素内酯的生物合成。因此，BRs信号可能在宿根稻腋芽萌发过程中起一定作用。 Together, our novel data shed light on the molecular mechanisms underlying BRs signalling, and may allow researchers to explore further the biological functions of endogenous BRs in the germination of axillary buds in ratoon rice.

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

本研究所用植物材料“汕优63”、“珍汕97”、“明恢63”保存在福建省农业科学院水稻研究所。汕优63是中国特级杂交水稻[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．是晚熟杂交稻品种，再生能力强，可作为再生稻栽培。它是不育系珍汕97A(再生力弱)与不育系珍汕97A杂交而成gydF4y2Ba籼稻gydF4y2Ba恢复系明恢63(再生能力强)[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．这三个品种在中国福建省友溪县三明市的水田种植，并用于整个试验。现场管理按照当地标准方法进行。8月采收第一季，10月采收再生季。取明恢63、珍汕97B和汕优63 3个重复顶部2、3节腋芽，−20℃保存，进行蛋白质组学分析。gydF4y2Ba

腋芽发育动态gydF4y2Ba

第一季从拔节期至抽穗期10 d，每周挖出10个分蘖苗，利用光学显微镜观察不同节段腋芽分化过程。在黄熟前12、9、6、3 d，黄熟中，黄熟后3、6 d，每次挖掘30个分蘖。对不同节位的腋芽进行分解，利用显微镜观察10个不同节位的腋芽对幼穗的分化过程。采用3个重复，测定20个不同节段腋芽的长度和干重。gydF4y2Ba

我们重点观察和比较了不同节点腋芽的分化和生长动态，并确定了与其生长相关的趋势。通过对这些变化趋势的总结，可以研究其腋芽的发芽机理，进而阐明促进再生稻高产的机理。为了确定腋芽的发芽机制，我们鉴定了与腋芽发芽相关的基因，并探讨了它们的具体调控机制。本研究结果为积极调控腋芽生长的技术开发提供了依据。gydF4y2Ba

花粉粒形态观察gydF4y2Ba

从再生期旗叶延伸至全穗期，每3 d从不同节点取汕优63分蘖穗5个，在FAA溶液中固定24 h，然后用70%酒精保存。镜检前，将稻穗分别用50%酒精浸泡30 min、30%酒精浸泡30 min、10%酒精浸泡30 min，再用蒸馏水浸泡。将圆锥花序上部、中部和下部的1-2个小穗的花药置于玻片上。花粉母细胞期、减数分裂期和花粉充注初期的花药采用乙酸品红染色，花粉成熟初期的花药采用I染色gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba吻。压碎花药释放花粉粒，静置10分钟。然后把它们放在有盖的玻璃下，在显微镜下拍照。gydF4y2Ba

蛋白质的提取gydF4y2Ba

将明恢63、珍汕97B和汕优63顶部第2、3节的腋芽在液氮中磨成粉末，然后转移到5 ml离心管中。根据Saravanan和Rose提取总蛋白，并进行了一些修改[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在细胞粉末中加入4体积的裂解缓冲液(8 mol/L尿素、1% Triton-100、10 m mol/L二硫苏糖醇和1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒)，然后使用高强度超声处理器(Scientz)在冰上超声三次。4°C, 20000 g离心10分钟，去除剩余碎片。蛋白质经20%三氯乙酸沉淀处理后，冷丙酮洗涤3次。最后，将蛋白质溶解在8 mol/L尿素中，按照制造商的说明使用bicinchoninic acid (BCA)蛋白测定试剂盒进行测定。gydF4y2Ba

胰蛋白酶消化gydF4y2Ba

在56℃下，用二硫苏糖醇(5 mmol/L)还原蛋白溶液30分钟。在室温黑暗中，用碘乙酰胺(11 mmol/L)对样品进行烷基化。然后用100 mM的小苏打三乙基铵(TEAB)和小于2 mol/L的尿素的混合物来稀释蛋白质。样品以1:50(胰蛋白酶:蛋白质)质量比胰酶消化过夜，以1:100质量比胰酶消化4 h。gydF4y2Ba

TMT标签gydF4y2Ba

胰酶消化，固相萃取柱脱盐。真空干燥后，肽在TEAB中进行了重组。然后按照TMT套件(Thermo)的制造商说明进行处理。gydF4y2Ba

高效液相色谱分离gydF4y2Ba

采用Agilent 300 Extend C18柱(5-μm颗粒，4.6 mm直径，250 mm长度)的高pH反相高效液相色谱分离胰蛋白酶肽。简单地说，在60分钟内，使用8 - 32%的乙腈(pH 9.0)梯度将多肽分离为60个组分。然后，将肽组合成9个馏分，通过真空离心干燥。gydF4y2Ba

LC-串联质谱(MS/MS)分析gydF4y2Ba

将胰蛋白酶肽溶解在含0.1%甲酸的A溶剂中。然后，样品被装入反相分析柱(15 cm长，75 μm径)。流动相为溶剂B(0.1%甲酸，98%乙腈)梯度洗脱，流速为400 nL/min;采用超高效液相色谱(UPLC)联用三重四极杆串联质谱(MS-MS)进行分析。电喷雾电压为2.0 kV。的gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba扫描范围为350 - 1800，完整的多肽在70000分辨率下被检测。然后用NCE 28选择肽段进行质谱/质谱分析，片段的分辨率为17500。采用1次MS扫描和20次MS/MS扫描交替进行，数据依赖过程，动态排除时间为15 s。自动增益控制(AGC)设置在5E4。固定初质量设为100 m/z。gydF4y2Ba

数据库搜索gydF4y2Ba

采用Maxquant搜索引擎(v.1.5.2.8)对MS/MS结果数据进行分析。UniProt数据库(gydF4y2Bahttps://www.uniprot.org/gydF4y2Ba)与反向诱饵数据库连接，搜索串联质谱。胰蛋白酶(Parenzyme)被指定为卵裂酶，它允许缺失两个卵裂。在第一次搜索和主搜索中，前驱体离子的质量公差分别设定为20 ppm和5 ppm。同时，设定片段离子的质量容限为0.02 Da。半胱氨酸上的氨基甲基(Cys)被认为是一种固定修饰，而蛋氨酸上的氧化(Met)被认为是一种可变修饰。肽的最低评分设置为> 40，错误发现率(FDR)调整为< 1%。gydF4y2Ba

生物信息学方法gydF4y2Ba

GO是一项重要的生物信息学倡议，旨在统一所有物种的基因表征和基因产品属性[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．Go标注使用UniProt-GOA数据库。将蛋白质id转换为UniProt id后映射为GO id。Wolfpsort是真核生物序列预测的PSORT/PSORT II的更新版本，作为亚细胞定位预测软件。利用KEGG数据库注释蛋白质通路[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．首先，利用KEGG在线服务工具KAAS对蛋白质KEGG数据库描述进行标注。然后使用KEGG在线服务工具KEGG mapper将标注结果映射到KEGG路径数据库上。gydF4y2Ba

通过功能富集途径分析(包括GO富集分析)和蛋白结构域分析，确定差异丰度蛋白在特定功能类型中是否存在显著富集趋势。GO注释将这些蛋白分为生物过程、细胞间隔和分子功能三大类。通过双尾Fisher精确检验和校正后的GO项来确定差异表达蛋白对所有鉴定蛋白的富集水平gydF4y2BapgydF4y2Ba-value < 0.05为显著项。利用KEGG数据库确定富集途径。富集水平由双尾Fisher精确检验确定，修正后的p值< 0.05的途径被认为是显著途径。利用InterPro数据库(gydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/interpro/gydF4y2Ba)．富集水平由双尾Fisher精确测试和蛋白质结构域确定gydF4y2BapgydF4y2Ba-值< 0.05被认为显著富集。gydF4y2Ba

RNA分离及qRT-PCR分析gydF4y2Ba

用TRI-zol试剂从明恢63、珍汕97B和汕优63的腋芽中提取总RNA [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ABI, Foster City, CA, USA)，从2 μg总RNA中按照说明书合成第一链cDNA。我们所关注的基因的核苷酸序列是从gydF4y2Bahttp://plants.ensembl.org/info/website/ftp/index.htmlgydF4y2Ba．设计用于qRT-PCR分析的引物，进行解离曲线分析，验证无非特异性扩增。引物列在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2BaS1:表。使用Thermo Lifetech ABI QuantStudio 6 Flex序列检测系统和SYBR Green实时PCR混合(Roche, Shanghai，中国)进行qRT-PCR分析。基因表达的相对定量采用gydF4y2Ba肌动蛋白gydF4y2Ba基因表达作为参考。数据使用Thermo Lifetech ABI QuantStudio 6 Flex SDS软件进行分析。gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

1-DE:gydF4y2Ba

一维电泳gydF4y2Ba

BR:gydF4y2Ba

BrassinosteroidgydF4y2Ba

br:gydF4y2Ba

BrassinosteroidsgydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书数据库gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

实时定量逆转录PCRgydF4y2Ba

TEAB:gydF4y2Ba

Triethylamonium bicarbonatgydF4y2Ba

台湾海陆运输公司:gydF4y2Ba

串联质量标签gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

本研究由国家重点研发计划基金(2016YFD0300508, 2017YFD0301602-01)和福建省公益性科研院所专项基金(2016R1020-4)资助。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 徐慧斌、连玲和王福祥对这项工作做出了同等的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 福建省农业科学院水稻研究所，福建福州350019gydF4y2Ba

   徐慧斌，连玲，王福祥，蒋家欢，林强，谢红光，罗曦，朱永生，王金兰，谢华安，蒋兆伟，张建福gydF4y2Ba

2. 农业农村部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室，福建福州350003gydF4y2Ba

   徐慧斌，连玲，王福祥，蒋家欢，林强，谢红光，罗曦，朱永生，王金兰，谢华安，张建福gydF4y2Ba

3. 福建省和科技部种质资源创新与分子育种国家重点实验室孵化器，福建福州350003gydF4y2Ba

   徐慧斌，连玲，王福祥，蒋家欢，林强，谢红光，罗曦，朱永生，王金兰，谢华安，张建福gydF4y2Ba

4. 全国水稻改良中心福州分中心，福建福州350003gydF4y2Ba

   徐慧斌，连玲，王福祥，蒋家欢，林强，谢红光，罗曦，朱永生，王金兰，谢华安，张建福gydF4y2Ba

5. 福建省作物分子育种工程实验室，福建福州350003gydF4y2Ba

   徐慧斌，连玲，王福祥，蒋家欢，林强，谢红光，罗曦，朱永生，王金兰，谢华安，张建福gydF4y2Ba

6. 福建省水稻分子育种重点实验室，福建福州350003gydF4y2Ba

   徐慧斌，连玲，王福祥，蒋家欢，林强，谢红光，罗曦，朱永生，王金兰，谢华安，张建福gydF4y2Ba

7. 杂交水稻国家重点实验室华南基地，福建福州350003gydF4y2Ba

   徐慧斌，连玲，王福祥，蒋家欢，林强，谢红光，罗曦，朱永生，王金兰，谢华安，张建福gydF4y2Ba

8. 油溪县农业农村局，福建三明350108gydF4y2Ba

   Chuanying卓gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

JZ, ZJ设计了实验。JZ、ZJ和HX3构思了这项研究。HX1、LL、FW、JJ和QL完成了大部分的实验，包括腋芽的采集、观察和测量，花粉粒形态观察和蛋白质组学分析。HX2、XL、YZ、CZ为腋芽采集和测量工具。FW和JW分别进行qRT-PCR分析和生物信息学分析。HX1、LL、FW、ZJ、JZ准备稿件。所有作者阅读并通过了稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaHuaan谢gydF4y2Ba，gydF4y2BaZhaowei江gydF4y2Ba或gydF4y2BaJianfu张gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理认可和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》对出版的地图和机构附属关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许不受限制地在任何媒体上使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供创作共用许可的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域转让豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba