蓝莓采后的转录组分析(Vaccinium corymbosum“Duke”)是对寒冷压力的反应

背景

蓝莓(Vaccinium spp。)是一种经济价值很高的小浆果。虽然冷藏可以使蓝莓的贮藏时间延长到60天以上，但会导致冷害(CI)表现为蒂孔;0°C-30 d为CI临界点。然而，对于蓝莓抗寒胁迫的机理和分子基础还没有明确的解释。为了全面揭示蓝莓在冷胁迫下的CI机制，我们采用高通量RNA Seq分析，研究了冷胁迫0d(对照)和30d蓝莓的基因调控网络。同时测定点蚀率、腐烂率、电解质渗漏(EL)、丙二醛(MDA)脯氨酸含量和谷胱甘肽(GSH)含量。

结果

分别构建了0d(对照)和30d冷却样品的两个cDNA文库并进行测序，共得到35,060个unigenes, N50长度为1348 bp。其中，1852个基因表达差异，1167个上调，685个下调。共鉴定出45个冷诱导转录因子(TF)家族，共1023个。deg指示应激反应等生物过程;细胞壁代谢;脱落酸、赤霉素、膜脂、能量代谢、细胞成分和分子功能对冷藏有显著响应。qRT-PCR检测了40个deg的转录水平。

结论

采后冷藏导致蓝莓CI严重，大大降低了品质、可贮存性和消费者接受度。在冷冻过程中，MDA含量、脯氨酸含量、EL含量升高，GSH含量降低。CI对应激反应、激素代谢等生物学过程有显著影响。综上所述，本研究的结果对于低温下预防CI具有重要意义，并有助于完善非模式植物遗传信息的缺失。

蓝莓的产量和消费量(Vaccinium spp。)近年来在世界范围内急剧增加，至少部分原因是它们已知的营养价值、经济价值和健康益处。但由于软化迅速，在室温(RT)下只能保存5-10天。因此，如何防止变质，延长贮藏期成为采后研究的重要课题。低温贮藏有利于防止软化，延长采后寿命;但冷藏会导致采后蓝莓果蒂凹陷、果皮和果肉粘连;同时伴有应激相关酶的异常变化，外细胞壁结构的破坏，纤维丝的减少[1，2］．这种CI的发展降低了消费者对水果的接受度，从而限制了它的储存寿命。冷胁迫加速蓝莓能量消耗和膜脂过氧化，影响蓝莓正常的活性氧代谢，已被证实。

冷害是影响园艺果蔬市场价值的主要问题之一;这也是主要的非生物胁迫之一。在零度以上低温(0-10°C)的冷胁迫和在零度以下温度的冻结胁迫导致细胞膜流动性下降，水势下降，渗透胁迫造成不可逆损伤。在之前的研究中，人们发现冷胁迫(4°C)会破坏辣椒的细胞结构(辣椒。) [3.，4，5];辣椒最典型的CI症状是水浸凹陷斑[6，7];在香蕉中，果皮在低温下会去核和变色。8];在桃中，CI症状包括缺乏多汁性[9]，味道差，肉也变成棕红色[10];芒果的CI症状包括烫伤、软化、内部褐变和电解质泄漏[11];荔枝冷藏过程中果实品质、膜透性、酶活性和能量的变化[12];梨在0℃下或长期贮藏后香气减弱，严重影响其品质[13，14，15];在收获的黄瓜中(黄瓜。)，当放置在7°C或以下时，会出现表面凹陷和黑色水渍的紊乱现象[16］．综上所述，在低温胁迫下，果实细胞结构发生变化，细胞膜被破坏，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量增加，活性氧(reactive oxygen, ROS)积累[17，18]，最终导致果实品质下降。尽管不同水果和蔬菜的CI症状不同，但其营养和经济价值会受到不利影响。而蓝莓的CI作用机制尚不清楚。因此，还需要进一步研究蓝莓果实冷藏机制，开发更有效的蓝莓果实贮藏和运输技术。此外，随着高通量测序技术的快速发展，对蓝莓果实冷藏反应机制的理解也取得了很大进展。

其中，rna测序(RNA-Seq)已成为一项强大的技术，可用于表征许多收获后水果的分子调节因子，如辣椒、番茄和“南国”梨[14，19］．此外，(Zhao et al. 2019) [20.]利用RNA-Seq技术鉴定了梨胁迫相关的四个PbBAM基因;(Lou et al. 2018) [21]结合等压相对和绝对定量标记(iTRAQ)和RNA-Seq，阐明了枇杷的耐寒机制。之前的研究也证实了一些关键基因和转录因子(TFs)的表达模式是对冷胁迫的响应。其中，bZIP、MYB、CBF和AP2/ERF是最知名的tf，被认为是植物冷反应基因的重要调控因子[22，23，24，25，26，27，28］．然而，对采后蓝莓的CI研究很少，对蓝莓点蚀调控机制的遗传特征研究也很少。

为了在分子水平上描述CI机制，丰富现有的转录组数据，识别果实对冷藏响应可能涉及的基因、重要途径和调控网络，本研究对冷藏0d(对照)和30d(去核)蓝莓进行了全面的转录组分析和生理实验。研究结果为防治蓝莓点蚀提供了理论和实践依据;这也为研究影响蓝莓果实点蚀的基因和转录因子的功能奠定了基础，并为今后涉及蓝莓果实的研究提供了参考转录组。

低温下表型和生理的变化

低温下蓝莓果实表型的变化

对对照蓝莓和30d冰鲜蓝莓的生理性能进行了研究。储存在20°C的蓝莓没有表现出CI症状(图。1a)，而在0°C下储存30天的水果表现出典型的CI症状，如蒂部凹陷(图。1b);这些症状在保质期内保持不变。

低温下点蚀率和衰变率的变化

在0℃不同贮藏时间下测定了蓝莓在货架期的点蚀率;我们发现直接在20°C下储存的蓝莓或在0°C下储存15天的蓝莓都没有观察到点蚀的迹象。2)．然而，蓝莓在0°C储存30天之前观察到点蚀迹象。0℃贮藏30 d时，点蚀率为5.2%，贮藏2d时，点蚀率迅速上升至21.9%，贮藏4d时，点蚀率为28.6%，贮藏6d时，点蚀率为35.8%，贮藏8d时，点蚀率为45.2%。蓝莓在0°C下贮藏45天和60天，从0°C中取出并保存8d时，果实的点蚀率分别提高到65.3和81%。衰变率也有类似的趋势;但长期低温贮藏蓝莓的腐烂率略高于短期低温贮藏蓝莓的腐烂率(图2)。2)．

低温下的生理变化

膜在水果中起着关键作用。膜脂过氧化常发生在心肌梗死过程中，MDA是膜脂过氧化的产物之一。如图(图;3.a)， MDA含量呈上升趋势，0℃贮藏30 d蓝莓果实MDA含量为9.2 mmol kg⁻¹)高于20℃贮藏的果实(6.5 mmol kg⁻¹)．同时，细胞膜的通透性可以反映细胞膜的稳定性和损伤程度;其中可以通过细胞膜的相对电导率反映出来。这可以从(图。3.B)随着贮藏时间的延长，蓝莓果实细胞膜的通透性不断增加。0℃保存30天后，膜结构、相变和渗透性发生变化;0℃贮藏30天蓝莓的相对电解泄漏量(42%)高于20℃贮藏蓝莓的相对电解泄漏量(36%)，达到81%。同时，随着果蒂点蚀的发生，果实细胞膜的相对电导率急剧升高。结果表明:0℃贮藏30 d的蓝莓果实中谷胱甘肽含量(89.2%)高于20℃贮藏的果实(75%);谷胱甘肽含量随着贮藏时间的延长而增加，特别是在贮藏20°C-6天的果实中(92.4%)。3.c). 0℃贮藏30天后，蓝莓果实GSH含量从89.2%迅速下降，随后保持低稳定状态(64.6%)。蓝莓果实在0°C储存30天的脯氨酸含量(2.25 g kg⁻¹)高于20℃贮藏时(0.6 g kg)⁻¹)(图。3.D)，果实出库后脯氨酸含量显著增加，达到3.95 g kg⁻¹保质期为8d。结果表明，在冷藏过程中，膜结构和膜功能受到严重破坏。

测序数据汇总

为了研究冷藏对收获后蓝莓的影响，对6个样品(对照和冷藏)的总rna进行了深度测序。为评价测序数据的质量，进行了mRNA片段饱和度随机化检验、插入片段长度检验和饱和度检验。这些测试确定获得的reads的数量足以覆盖大多数表达的基因。生成的干净数据总数为50.74Gb1)．平均清洁数据大于6.25Gb，获得Q30值的数据占93.93%以上;76.38 ~ 79.53%的干净reads成功映射到unigene数据库。同时，转录组数据检测具有较高的灵敏度，蛋白质编码基因表达水平FPKM (fragments per kilobase million，每千碱基百万个片段)的值跨越10⁻²到10⁻⁴六个数量级。样本基因表达水平分布的分散程度一般，不同样本的整体基因表达丰度较好(图。4a).根据PCA分析，将对照组和冷冻组的三个生物重复分别聚类在一起(图1)。4c)， Pearson相关系数大于0.94(图。4b)。

转录本表达分析的综合分析

deg数量

DEGs分析显示，FDR≤0.01时表达上调基因561个，下调基因158个;FDR < 0.05时表达上调基因1167个，下调基因685个。为了评估DEGs的多样性，我们构建了Venn图(图2)。5)．

所有deg的热图和显著变化的deg的选择

将鉴定出的deg进行层次聚类分析，将表达行为相同或相似的基因组织起来，显示不同实验条件下基因集的不同表达模式(图2)。6)．在20°C保存的蓝莓中，大多数基因显著下调;在0°C保存30天的蓝莓中，这些基因大多上调。我们根据这些基因的功能途径将它们分为15类。这些包括GABA受体活性、细胞外谷氨酸门控离子通道活性和g蛋白偶联受体信号通路。通过热图分析，每个簇中有30、27、37、92、14、351、217、193、315、1、161、409、2、1、2个基因，其中G4、G5、G6、G7、G8、G12簇中上调基因较多，而下调基因多为G1、G2、G3、G9、G10、G11、G13、G14、G15簇(图2)。6)．

同时，选择治疗组中变化最显著的10个deg来评估与CI相关的重要基因和途径(表2)2)．在这些deg中，c127608上调并参与了六种途径c120356并参与了0°C保存30天蓝莓的3条通路。

功能注释和分类

在我们的研究中，N50的长度为1348 bp，超过1Kb的unigenes有21649个。84,260个unigenes的组装完整性较高。以NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG、KOG、eggNOG数据库为基础的局部比对检索工具，对组装后的unigenes进行功能预测和分析:1142个(18.4%)unigenes标注在NR上;Swiss-Prot型834例(13.4%);GO中685 (11.2%);COG中unigenes 394个(6.4%);Pfam区922名(14.8%);KEGG组413例(6.7%);638人(10.4%)在KOG;1099份(17.7%)的蛋酒。

然后进行氧化石墨烯富集分析，获得上述DEGs的功能信息。显著丰富GO术语，基于修正进行识别P-value< 0.05，发现参与生物过程、细胞成分和分子功能的DEGs(图。7a).冷冻蓝莓中发现的DEGs主要富集在生物过程、代谢过程、细胞过程、单个生物过程、刺激反应、生物调节、定位、细胞成分、发育过程等12个不同的生物过程中。代谢过程、细胞过程和单生物过程类别中的DEGs在未去核的蓝莓中不表达。

为了进一步确定DEGs在低温胁迫下的响应功能，我们利用KEGG数据库对其进行了分类，并将其划分为相应的通路。通过比较样品，我们发现413个DEGs富集到50个通路中;这50条通路中有3条与细胞过程相关，2条通路属于环境信息处理，12条通路包含98个涉及遗传信息处理的deg, 32条通路包含174个涉及代谢的deg，剩余的通路与生物系统相关(图2)。7b). KEGG分析结果表明，冷胁迫下蓝莓中有26个DEGs参与植物激素信号转导通路，包括生长素(Aux)、细胞分裂素(CK)、赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、油菜素类固醇(BR)、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)信号通路，每个DEGs聚集数量不同。此外，参与ABA生物合成的类胡萝卜素生物合成由5个deg组成。这些结果表明，冷胁迫不仅激活了脂肪酸代谢，还激活了多种植物激素信号转导通路，导致蓝莓果实发生点蚀。根据富集结果，植物激素转导、类胡萝卜素生物合成、GSH代谢、淀粉和蔗糖代谢、内质网蛋白质加工和叶绿素代谢是响应冷胁迫变化最显著的6个途径(表1)3.)．

此外，在COG数据库中注释了394个deg(25个类)(图。7c).前三个COG术语分别为:general function prediction only (95DEGs);复制、重组和修复(50 DEGs)。能量的产生和转化、氨基酸的转运和碳水化合物的转运、无机离子的转运以及代谢生物合成的转运和分解代谢也很重要。

冷胁迫下deg的鉴定与分析

冷反应DEGs参与膜脂质和能量代谢

在本研究中，冷冻蓝莓中膜脂代谢129条高差异表达通路中的6条，包括甘油脂代谢(Ko00561)、甘油磷脂代谢(Ko00564)、醚脂代谢(Ko00565)、α-亚麻酸代谢(Ko00592)、鞘脂代谢(Ko00600)和磷脂酰肌醇信号系统(Ko04070)发生了显著变化。Ko00561中有1个下调的DEG;Ko00564;Ko00592、Ko00565、Ko00564、Ko00600和Ko04070分别由1个、1个、4个、2个和1个高度差异上调表达的结构基因组成。其中Ko00564和Ko00592在低温胁迫下诱导较强;c107765.graphc0（胆碱磷酸CytidylyltransferaseA)被调低;的c100748.graphc0（glycerol-3-phosphate dehydrogenase1)，c131228.graphc1（phospholipaseD1/2)，c125240.graphc0（N-myristoyltransferase)，c126471.graphc0（三酰甘油lipase4),c130733.graphc0（磷脂酰丝氨酸synthase2)在Ko00564中表达上调，而c130733.graphc0在Ko00592中上调。

冷胁迫下细胞膜脂质组成的变化与脂肪酸代谢密切相关。在冷冻蓝莓中发生显著变化的129条通路中，有6条与脂肪酸代谢有关，包括脂肪酸生物合成(Ko00061)、脂肪酸延伸(Ko00062)、脂肪酸降解(Ko00071)、亚油酸代谢(Ko00591)、不饱和脂肪酸生物合成(Ko01040)和脂肪酸代谢(Ko01212)。在Ko00061、Ko00071和Ko01040中分别下调了3个、1个和2个DEGs;在Ko00062、Ko00071、Ko00591、Ko01040和Ko01212中分别有1个、1个、5个、1个和2个DEGs上调。基因c126515.graphc0（fas相关蛋白与死亡结构域)，c109637.graphc0（脂肪酰基acp硫酯b)，c126471.graphc0（强力霉素)在Ko00061中下调(图;8一个)。

在Ko00230嘌呤代谢通路中，与能量代谢相关的DEGs受冷胁迫影响。基因c121781.graphc0，其上调参与磷酸戊糖通路。这涉及多种环境下微生物代谢的几种生物合成途径和碳代谢生物合成;c123543. graphc0在冰鲜蓝莓中表达，且表达量低于对照组。在Ko00280缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢通路中，c122233graphc0是差异;3-Hydroxyisobutyryl-CoA水解酶由两个基因共同调节c120356.graph而且c122037.graphc0，显著下调(折叠变化=−5.71)，并参与β -丙氨酸代谢和碳代谢途径。

参与脯氨酸、谷胱甘肽和类黄酮代谢的冷反应基因

此外，脱水应激常伴有渗透调节。植物需要积累或减少脯氨酸、谷胱甘肽、类黄酮等有机或无机物来维持细胞的保湿能力。根据途径富集分析，精氨酸和脯氨酸代谢被冷诱导脱水激活．在我们的研究中，c126860.graphc0（nadp特异性谷氨酸脱氢酶)还参与丙氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸代谢、d -谷氨酸代谢和碳代谢，均被上调;c123304. graphc0（聚胺oxidase2/3/4)在亚精胺合成过程中上调，它也参与β -丙氨酸代谢。在我们的验证实验中，我们发现的相对表达c126860.graphc0在冰镇蓝莓中显著上调。c的表达式123304. graphc0在冷冻蓝莓中也显著上调。

在本研究中，c123222.graphc0［异柠檬酸dehydrogenase1/2（IDH1/2)]在中间代谢和能量产生中起作用，可能与柠檬酸循环(TCA循环)中的丙酮酸脱氢酶复合物紧密结合或相互作用。一些与谷胱甘肽相关的基因也被鉴定出来。GPX和谷胱甘肽转移酶(GST)也是ROS的重要清除物，参与多种环境应激反应。谷胱甘肽过氧化物酶参与花生四烯酸代谢，并与c112252.graphc0［谷胱甘肽s-transferase（销售税)),c119253.graphc0（销售税)，c102135.graphc0（销售税)，c105671.graphc0（销售税）, c105671.graphc1（销售税)，c122443.graphc0（销售税)，c110117.graphc0,而且c120425.graphc0通过细胞色素P450协调异种生物的GST代谢。在我们的验证中，销售税而且IDH1与对照蓝莓相比，冰镇蓝莓中的钙含量降低了。的表达式GST1冰镇蓝莓的含量明显更高;的表达GST2而且GST3在冷冻蓝莓中显著降低(图;8b)。

的基因c116187.graphc0［Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate（HCT)]编码莽草酸o -羟基cinamoyltransferase (EC:2.3.1.133)，该酶参与代谢途径和次生代谢物生物合成;由白花色素还原酶(LAR)编码c119207.graphc1而且c110095.graphc0参与次生代谢产物的生物合成。我们的qRT-PCR结果显示HCT而且守护神（c110095.graphc0)和的守护神（c119207.graphc1)在冰镇蓝莓中表达上调。(无花果。8b)。

冷反应基因参与激素生物合成和信号转导

油菜素类固醇生物合成(Ko00905)、类胡萝卜素生物合成(Ko00906)和玉米素生物合成(Ko00908)。

在玉米素生物合成途径中，c111548.graphc0（细胞分裂素氧化酶/脱氢酶)在冷藏蓝莓中显著下调至−4.5;c126830. graphc0（tRNA isopentenyltransferase1)在产生尿苷磷酸化酶和顺式玉米素葡萄糖苷过程中表达上调。基因c112010.graphc0［细胞色素p450酶- 90 a1 -（CYP90A1)]和c115136. graphc0［细胞色素p450酶- 85 a2 -（CYP85A2)]参与次生代谢产物的生物合成和代谢途径，包括BR生物合成。这两种基因在冷冻蓝莓中有较高的表达(图2)。8c)。

在类胡萝卜素生物合成途径中，c99806.graphc0（β-胡萝卜素3 h-hydroxylase)， ABA合成前体显著下调，而该途径中ABA的合成代谢及相关基因则显著上调。这一发现与胁迫可以增加ABA的生物合成和积累这一事实相一致，这是植物防御反应的一部分。9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶[NCED;c126206.graphc0)是ABA合成中最关键的限速酶，在0℃贮藏后显著上调。黄嘌呤脱氢酶(c125901.graphc0)是ABA合成途径中的另一种限速酶，而基因c120652.graphc1而且c122315.graphc1共同调节ABA 8 ' -羟化酶。qRT-PCR结果显示-胡萝卜素3-羟化酶在冷冻蓝莓中表达上调。的ABA2冷冻蓝莓的基因显著上调。的表达细胞色素P450 707A（CYP707A)，其编码细胞色素P450，参与植物代谢中的萜类和多酮类ABA代谢途径，在冷藏蓝莓中显著上调，是对照蓝莓的25倍。由此可见，低温贮藏刺激了ABA合成酶相关酶基因的表达，并参与了ABA的合成，同时也促进了其向二羟基相酸的代谢。蓝莓在0℃贮藏30天后的点蚀可能受这些基因的影响;但具体机制有待进一步研究(图;8c)。

植物激素信号转导分析

转录组分析结果表明，大量的DEGs富集在植物激素信号转导通路中，尤其在IAA信号转导、ABA信号转导、SA信号转导和GA3信号转导中(图5)。9)．

我们的结果表明，应激反应途径通过转录与生长素调控相互作用辅助/ IAA，IAA5，IAA6,而且IAA19是耐应力所必需的;冷冻蓝莓生长素信号通路中有1个基因下调，2个基因上调。基因c113524.graphc0编码转运抑制剂反应1在冷冻蓝莓中下调。基因c128076.graphc0（国际宇航科学院)，c122133.graphc1（国际宇航科学院),c97770graphc0协调IAA(一种参与植物激素信号转导的生长素反应蛋白)的调控;c111137. graphc1的成员GH3基因家族在冰镇蓝莓中表达量较高。基因c102439. graphc0而且c113051.graphc0属于生长素上调的小RNA基因家族，受生长素和环境因子的调控;这些基因与国际宇航科学院而在冰镇蓝莓中，这一水平显著上调。PYL是一种ABA受体，PYL1，PYL4，PYL5，PYL6，PYL7，PYL10，PYL11，PYL13,PYL15被隔离和识别出来了吗拟南芥．在本研究中，的表达c121430.graphc0,一种参与丝裂原激活蛋白激酶信号传导的PYR/PYL家族的ABA受体，在冷冻蓝莓果实中显著升高。这两个基因的上调表明低温激活了ABA的生物合成和分解代谢。的ABA响应元素结合因子基因(c112990.graphc0)在我们的转录组结果中下调，而油菜素类固醇信号激酶（c122496.graphc0)在冷藏的蓝莓果实中表达上调，是对照蓝莓的8倍。

在SA途径中，植物-病原菌相互作用基因的表达c129050.graphc0（发病相关蛋白1),c126145.graphc0（矫正性大动脉转位)在冰镇蓝莓中的含量下降。两种基因的表达模式相似。此外，已知用GA3处理园艺作物和水果可在0°C处理后缓解CI症状[29］．在GA3通路中，蛋白的表达德拉作为GA3信号的负调控因子，0℃贮藏30天后，其表达上调。CK途径中有3个基因，一个CK受体和2组分反应调节因子ARR-B或ar - a上调。表达水平c107755.graphc0（ARR-B),c107605.graphc0（ARR-A)冷冻蓝莓中的基因表达显著上调，分别是对照蓝莓的18倍和59倍。因此，0°C低温贮藏对激素信号转导途径中的基因有显著影响，特别是CK和Aux调控和代谢的基因。

tf对冷应激的响应

30d冷冻蓝莓的不同基因表达模式表明，多种结构基因促成了蓝莓果实的点蚀。在本研究中，我们筛选了我们组装的转录本，并预测了来自45个家族的1023个tf，鉴定出738个蛋白激酶和327个转录调节因子(TRs);其中大部分在冰镇蓝莓果实中的表达发生了变化。1023个转录因子包括42类转录因子，包括92个C2H2, 87个MYB 68, 74个Ap2/erf-erf, 56个bHLH, 53个C2C2, 51个bZIP, 51个C3H, 45个FAR1, 43个wrky, 39个NAC。10)．

通过qRT-PCR验证RNA-Seq结果

为确保RNA-Seq数据的可靠性，采用qRT-PCR方法对40个随机DEGs的表达模式进行评估。(无花果。11而且12)．这些基因代表了不同的功能类别或途径，包括液体相关、防御系统、类黄酮代谢、油菜素类固醇生物合成、类胡萝卜素生物合成、玉米素生物合成和激素信号转导途径。线性回归结果表明，RNA-Seq和qRT-PCR的结果高度相关r= 0.8624)，尽管两种方法的绝对FC存在差异。结果表明，两种方法得到的表达模式一致，证实了转录组结果的可靠性。这些一致的表达模式进一步证实了本研究中报道的转录组数据是现有蓝莓基因组和转录组信息的宝贵补充。

虽然低温储存是防止大多数水果和蔬菜腐烂的主要方法，但它可能会引起CI症状，如收获的黄瓜表面有点蚀和黑色水渍[16]、香蕉的果皮凹陷[8]，梨的香气较少[13］．在我们目前的研究中，蓝莓在低温(0±0.5°C)下储存了15天、30天、45天和60天。该方法可保持果实品质，延长果实采后寿命。低温贮藏和冷胁迫导致椎弓根出现麻点;蓝莓储存的时间越长，核蚀就越严重。贮藏0°C-30 d为点蚀临界点。随着点蚀的发生，果实表型发生变化，细胞膜起皱，结构破坏[30.］．同时，EL、MDA、脯氨酸含量、GSH含量等反映植物冷胁迫生理状态的生理指标[31]，也是我们研究中确定的。果核蓝莓中EL、MDA和脯氨酸含量显著升高，GSH含量显著降低，表明膜脂代谢在冷胁迫响应中起重要作用。然而，这只是生理上的变化。

虽然冷应激反应和生理变化已被广泛研究[6，7，9，10]，但其分子和遗传机制在蓝莓中仍不清楚。为了在分子水平上探索冷胁迫下果实点蚀的直接原因和基因调控网，我们对冷胁迫后的蓝莓和对照蓝莓样品进行了深度转录组测序。RNA-Seq数据显示，3个独立的生物重复高度一致(0.9462 < R²< 0.9998)，说明RNA-Seq数据可靠。转录组序列被组装成35,060个转录本，其中73.7%的转录本被注释。这些注释为研究蓝莓的具体过程、功能和途径提供了有价值的资源。为了进一步验证，我们使用qRT-PCR，两种方法中40个显著变化的DEGs的表达模式相对应(Pearson 's r = 0.8624)。在冷胁迫下，许多参与不同细胞、分子和生物途径的DEGs被确定参与点蚀。根据富集结果，我们主要对脂质代谢、能量代谢、抗氧化防御系统、激素信号网络和tf相关基因进行了研究(表2)。4，5，6和无花果。8，9和S1)。这些结果表明，我们的转录组数据库是挖掘冷应激反应基因的丰富资源。这些转录组分析结果为在分子水平上解释核状蓝莓在低温胁迫下代谢变化的机制提供了重要依据。

冷应激下脂质代谢与能量代谢

当环境温度降低时，首先发生物相和细胞排列的变化;然后膜的通透性、脂类成分和含量开始降低。电解质渗漏是细胞膜通透性的重要指标，是评价植物组织在严重胁迫条件下损伤程度最常用的方法。EL的大幅增加通常是由膜结构和脂质组成的变化引起的，被认为是反映细胞膜功能和完整性的指标[32，33］．在我们目前的研究中，蓝莓的点蚀严重程度与相对较高的EL有关。在低温胁迫下的果实机制研究中，除漏电外，还评估了脂质过氧化[34］．由于MDA含量是脂质过氧化的直接衡量指标，因此可以通过评价MDA含量来评估细胞损伤程度[35］．在本研究中，我们观察到在冷藏期间，尤其是在0°C储存后的保质期内，MDA含量显著增加。这些结果表明，蓝莓膜脂过氧化在低温贮藏过程中发生，并在0℃贮藏后的保质期内加剧。

同时，脯氨酸的积累也与大多数植物的耐寒性有关[36］．脯氨酸已被证实在植物暴露于盐或低温胁迫时积累[37］．在本研究中，蓝莓冷藏30天后的脯氨酸含量显著高于其他蓝莓的8天保质期;此外，冷藏30天后蓝莓果实脯氨酸含量比另一组蓝莓高出2倍以上。显然，脯氨酸含量的增加为低温贮藏引起冷胁迫和蓝莓响应冷胁迫提供了有力证据。同时，我们还观察到冷藏组的GSH呈下降趋势，而冷藏组的GSH呈上升趋势。综上所述，膜脂代谢在蓝莓对冷胁迫的响应中起着重要作用，并可能与果实对冷胁迫的耐受性密切相关。这与其他水果的一些研究是一致的。李等(2012)[38证实相对EL在5°C的芒果果实中有显著的增加。Kong等人(2017)[4]的结果表明，低温(4°C)使辣椒的膜损伤严重，MGDG、PC、PE和PA在低温胁迫下发生变化。王等(2019)[30.]还发现低温储存后蓝莓的DGDG水平更高。此外，脂肪酸的变化也与膜脂代谢有关。而脂质的变化不仅发生在收获后的低温贮藏过程中，也发生在果蔬或植物的冷驯化过程中[39］．

此外，遗传和分子证据表明，点蚀是一种复杂的现象，涉及代谢的改变，包括特定代谢产物、脂质、能量和其他途径的合成。基因表达的变化是冷藏期间发生的一些生化和生理变化的基础。在本研究中，调节膜脂成分和脂肪酸的基因在冷胁迫下也发生了显著变化。冷冻蓝莓膜脂代谢的6个高差异表达途径，包括甘油脂代谢(Ko00561)、甘油磷脂代谢(Ko00564)、醚脂代谢(Ko00565)、α-亚麻酸代谢(Ko00592)、鞘脂代谢(Ko00600)和磷脂酰肌醇信号系统(Ko04070)发生了显著变化。此外，冷冻蓝莓中与脂肪酸代谢相关的6种高差异表达途径，包括脂肪酸生物合成(Ko00061)、脂肪酸延伸(Ko00062)、脂肪酸降解(Ko00071)、亚油酸代谢(Ko00591)、不饱和脂肪酸生物合成(Ko01040)和脂肪酸代谢(Ko01212)也发生了显著变化。在这些基因中，fadD，c109637.graph_c0编码棕榈酰酰基载体蛋白的基因是上调最明显的基因，其表达量是对照组的2.2倍;的FATB，c126515.graph_c0编码酰基辅酶a合成酶1的基因下调最为明显，其表达量比对照组低2.5倍。这些结果表明，膜脂相关通路对冷胁迫有较强的响应，这与枇杷的结果一致[21]，这两个基因可能是进一步研究膜脂代谢对果实核蚀响应调控的最理想基因。Die和Rowland的研究。2014 [40]也证实了与脂质代谢相关的途径，特别是与脂肪酸延伸、甘油磷脂代谢和-亚麻酸代谢有关的酶在冷应激下发生了显著变化。此外，Die和Rowland. 2014 [40]鉴定出编码磷脂酶、组氨酸激酶、5个脂质转移蛋白(LTP)基因和2个脂肪酸去饱和酶的基因，这些基因在改变蛋白质和脂质组成方面具有潜在作用。

事实上，CI的发生不仅是膜结构有害变化的结果，还与能量状态的变化有关[2，41］．其他水果发表的数据也表明细胞膜完整性调节与细胞能量状态密切相关。有研究认为细胞膜的损伤与能量状态的缺乏有关，ATP在脂肪酸的合成和细胞膜的修复中起着重要的作用[42］．近年来，许多证据表明，采后果实发生CI的部分原因是能量供应有限或能量产量低，而较高水平的ATP和能量电荷可以缓解CI [16，43］．此外，能量代谢对维持植物生命和植物对环境胁迫的抵抗力很重要[14，44，45］．在本研究中，有许多下调的deg参与能量代谢，这可能表明蓝莓中的可用能量状态和稳定的酶系统共同有助于提高蓝莓在0°C贮藏期间的耐寒性，减轻点蚀，保持蓝莓果实的品质[1］．能量代谢与三磷酸腺苷(ATP)的产生有关，是细胞功能和活力的主要决定因素，能量较高和生物膜结构维护较好的植物不易受CI影响[46，47］．相反，在0°C下长期储存会导致果实采后ATP水平下降，导致能量代谢中断[38］．特别是，已有研究表明，0℃贮藏后，木瓜的ATP含量和能量含量下降，表明CI与能量代谢密切相关[45］．与这些结果一致，我们的结果表明，能量代谢可能是造成蓝莓果实点蚀症状的主要原因，因此外源ATP处理可能减少蓝莓果实点蚀。研究证明，通过提高d -吡咯-5-羧化合成酶(P5CS)活性，进而降低CI，可以维持较高的ATP水平[44］．抑制活性氧[16]调节脯氨酸积累[48也可提高抗寒性。

冷应激下的激素信号

先前的研究表明，几种植物激素参与调节植物对环境变化的反应和适应[49］．作为次要信号，它们可以启动一系列信号事件(级联反应)，最终诱导应激反应基因。它们可能与低温胁迫下的胁迫反应高度相关，植物激素含量的变化也会影响果实品质。BRs可赋予植物对各种非生物和生物胁迫的抗性[50］．Br处理后的芒果果实通过调节脂质具有较高的耐寒性[44］．外源BL可显著降低芒果果实CI发生率。此外，其他植物激素，包括ABA、GA3、JA和乙烯[51，52]，也被牵连到调节非生物和生物压力。MeJA处理可有效抑制枇杷采后果实的CI [53，54]，并通过诱导与能量代谢相关的酶活性，维持高水平的ATP和能量电荷，在采后桃果中表现出更高的耐寒性[55］．近年来的研究表明，外源施用SA可显著缓解采收枇杷果实的寒气症状[56和芒果水果。以有效浓度的ETH或BR处理也可减轻番茄果实的CI [57，58］．ABA在植物抗胁迫过程中的作用也是必不可少的。ABA的含量在植物防御反应中增加，这种植物激素在植物对干旱和寒冷的胁迫反应中发挥多种作用[59］．ABA也参与了冷驯化的调节。aba不敏感5 (ABI5)蛋白是13种功能和结构相关的bZIP蛋白之一，这些蛋白在调节应激反应的变化中起着至关重要的作用[60］．因此，植物激素在果实采后低温耐受中具有重要作用。

在本研究中，我们发现许多植物激素相关基因对CI有反应。这些基因的数量和表达模式如图所示。9）;特别是BR、CK、Aux和SA通路相关基因上调，而ET和茉莉酸甲酯通路相关基因不受CI影响。但可能与Ding et al.， 2015不一致[51]，他们发现，在冷藏期间，冷藏水果的内源性GA3水平和关键GA代谢基因的表达水平低于室温贮藏的水果。可能由于物种不同，低温胁迫下激素含量的变化趋势也不同。此外，参与Aux和SA调控的基因同样影响CI，可能是因为受体基因表达减少，而PR1和GH3表达增加。总体而言，ABA、GA3、BRs和CK通过调控蓝莓大量下游基因的表达，在低温贮藏引起的点蚀中发挥重要作用。这些结果表明，激素信号通路在冷胁迫条件下可能发挥独特的作用，并可能在蓝莓中形成复杂的抗氧化防御系统。然而，ABA、GA3、BRs或CK介导的信号通路是否以及如何参与蓝莓的冷胁迫反应还有待进一步研究。

TFs参与了蓝莓对冷胁迫的点蚀反应

在许多生物过程中，防御反应也需要调控特定的tf，这是植物中复杂的调控网络之一[14］．tf可能通过特异性结合其启动子中的顺式作用元件来调控其靶基因，从而在应激反应中发挥重要作用。尽管tf家族在植物发育过程和环境反应中发挥着不同的作用，但大多数都与植物的抗寒性有关。例如，6BrbZIP基因被认为是冷胁迫反应的关键因素[23］．NAC基因也被报道被低温诱导拟南芥［61),菊花［62]，大米[63),甘蔗［64］．此外，NAC tf还可与CBF1相互作用，调节苹果的耐寒性[65]和香蕉[66］．bHLH家族，第二大家族[67]，也可以通过调节ROS清除相关基因和胁迫响应基因的表达来提高植物的耐寒性。同时，在冷胁迫下的甘薯中发现了第一个WRKY转录因子[68];在黄瓜中，CsWRKY46具有耐寒性，并正向调控aba依赖的冷信号通路[69］．

一些不太常见的转录因子，如c2h2 -锌指蛋白，在植物胁迫反应中也是必不可少的，尽管它们的转录调节机制在很大程度上尚不清楚[70］．总体而言，我们的结果显示，1023个tf包含42类tf，包括92个C2H2、87个MYB 68、74个Ap2/erf-erf、56个bHLH、53个C2C2、51个bZIP、51个C3H、45个FAR1、43个wrky、39个NAC;这与Die和Rowland(2014)有点相似[40];他们发现七个对冷胁迫反应最具代表性的TF家族是WRKY、ARF、C3H、AP2/ERF、bHLH、C2H2和NAC。根据我们目前的结果，bHLH家族在冰激蓝莓中显著上调，但Ap2、ZIP和WRKY家族在此条件下显著下调。此外，植物激素和转录因子也可能在低温胁迫下相互作用。例如，NAC tf已被证明在非生物应激反应中调节aba相关基因的表达[71］．乙烯被证明是负调控冷信号，至少部分是通过CBFs的直接转录控制[52］．由于我们目前的研究重点是进一步确认C2H2、MYB和NAC tf是否在LT应答中发挥重要作用，以及它们如何调节核痛蓝莓下游基因的表达。

总的来说，收获时长期冷藏会导致蓝莓严重的CI，这大大降低了质量、可储存性和消费者的接受度。我们的结果确定了点蚀的发生，并证明了30天的冷藏是点蚀的临界点。结果表明，30d冷冻浆果中MDA含量较高，脯氨酸含量较高，EL含量较高，GSH含量较低。此外，为了在分子水平上表征冷胁迫下蓝莓的CI机制，我们利用RNA-seq技术研究了冷胁迫下蓝莓的全面转录组谱。我们鉴定并总结了响应冷胁迫的基因:(1)转录因子;(2)膜脂与能量代谢;(3)防守;(4)激素生物合成与信号转导，包括膜脂、脯氨酸、谷胱甘肽、类黄酮、油菜素类固醇、类胡萝卜素、玉米素生物合成通路相关基因。这些DEGs以及与应激反应、脂质和激素代谢过程相关的生物过程几乎都在CI过程中积累和上调。并可能在蓝莓对寒冷胁迫的反应中发挥关键作用。 These results provides novel insights into a series of molecular mechanisms underlying physiological metabolism and defense. Further, the enormous amount of blueberry transcriptome data generated here will serve as the foundation in finding available effective way in alleviating CI and also help to perfect the lack of the genetic information of non-model plant species. In future work, we aim to focus on the function verification of special structural genes fadD (c109637.graph_c0) related to membrane lipid and fatty acid metabolism and 8′-hydroxylas (c122315.graph_c0) related to plant hormone and explore how they work in chilling process.

植物材料和温度处理

“公爵”蓝莓(鸡冠草。)于2016 - 2018年4 - 7月在中国辽宁省沈阳市(N41°39′55.82″，E123°05′12.46″)的蓝莓基地采摘商业成熟果实。蓝莓是人工采摘的，以防止任何机械损坏。在20℃预冷2小时后，将没有物理损伤、疾病或腐烂的蓝莓果实装入塑料盒中;然后在不同的储存温度(20°C和0°C)下储存。每箱装125克蓝莓，相对湿度保持在85%。收集肉质组织，快速冷冻在液氮中，并保存在−80°C [72］．将未去核的蓝莓样品(T01、T02和T03)定义为对照蓝莓，将在0°C下储存30天的去核蓝莓样品(T04、T05和T06)定义为30d冷藏蓝莓。它们被收集用于RNA-Seq, RNA-Seq由Biomarker Technologies (Beijing, China)完成。在此期间，我们研磨了每个样品(T01-06)的20个不同的蓝莓果实，并且在每个样品(T01-06)中，我们还进行了三次技术重复。

点蚀率、衰变率、电解质渗漏、丙二醛、脯氨酸测定

使用以下公式计算了在0°C下有或没有预先储存的水果在0、2、4、6和8天的货架期的点蚀和腐烂率:

在这些方程中，An是有核的蓝莓果实的数量，Ai是腐烂、多汁或霉变的蓝莓果实的数量，Am是蓝莓果实的总数。在每个时间点对150个重复样品进行三次独立测量。

73］．MDA含量测定方法参照Zhao et al. (2005) [74］．脯氨酸(Pro)含量和还原性谷胱甘肽(GSH)含量按照Zhao et al.(2009)的方法测定[75］．

总RNA分离，cDNA文库构建，测序

使用OminiPlant RNA试剂盒(CWBio, Beijing, China)分离所有样品的总RNA。根据Niu等人(2017)，使用1%琼脂糖凝胶监测完整性，使用NanoDrop分光光度计(赛默飞世尔科学公司)检查纯度[76］．使用NEBNext®Ultra™RNA文库准备试剂盒(Illumina®NEB, USA)生成测序文库，并将索引码添加到每个样品的属性序列中。采用安捷伦生物分析仪2100系统对文库质量进行评估。最后，cDNA文库在Illumina®HiSeq 2000平台(Illumina Inc.)上测序，并在北京生物标记技术公司(北京，中国)生成成对的末端reads [77］．所有下游分析均基于干净的高质量数据。本研究产生的所有测序数据均已存入NCBI，链接为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/578101临时提交号SUB643610，生物项目号PRJNA578101。

基因功能注释及差异表达分析

由于蓝莓缺乏精确的参考级基因组，因此从RNAseq数据和从国家生物技术信息中心(NCBI)下载的其他公开的蓝莓转录组数据中重新组装了一个转录组。基于NCBI非冗余(NR)对非冗余unigenes进行标注;蛋白质家族(Pfam);Swiss-Prot, Clusters of Orthologous Groups (KOG/COG/eggNOG);京都基因和基因组百科全书(KEGG)和基因本体论(GO)数据库根据Liu et al. (2015) [77］．

采用DESeq R包(1.10.1)对对照组和冷冻组的deg进行标准鉴别P-value< 0.05， |log2(折叠变化)|≥1。对DEGs进行氧化石墨烯富集和KEGG分析，以确定显著富集的DEGs生物学途径，并调整FDRP值< 0.05。

RNA-Seq数据验证及qRT-PCR表达分析

通过实时荧光定量PCR验证RNA-Seq数据中的表达模式。基因特异性引物采用Primer 5.0设计，由Genewiz生物技术合成实验室(江苏)(表S1qRT-PCR所用引物)。使用QuantStudio 6 Flex (Life Technologies)对2 × ULtraSYBR混合物(低ROX)试剂盒(ComWin Biotech，北京，中国)的程序和反应条件如制造商协议中所述。将模板cDNA稀释5倍，每20 μl PCR混合液中加入2 μl稀释后的cDNA。qRT-PCR法采用两步法。每个样品分别进行3个独立的生物重复和3个技术重复。相对表达量由比较2计算^−ΔΔCT方法使用的表达式从而作为内部控制。

统计分析

使用SPSS 20.0软件(BM Corp, Armonk, NY, USA)对所有数据进行单因素方差分析(ANOVA)和最小显著性差异(LSD)。每个实验独立重复3次，并考虑其代表意义P< 0.05。起源8.1 (https://www.originlab.com/)及R3.5.1 (https://www.r-project.org/)用来显示从实验中得到的数据。

本研究中产生和分析的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。本研究产生的所有测序数据均已存入NCBI，链接为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/578101临时提交号SUB643610，生物项目号PRJNA578101。

阿坝:

脱落酸

ATP:

三磷酸腺苷

辅助:

生长素

BR:

Brassinosteroid

bZIP:

基本leucine-zipper

CBF:

C-Repeat结合因子

置信区间:

冷害

CK:

细胞分裂素

度:

差异表达基因

埃尔:

电解液泄漏

等:

乙烯

罗斯福:

错误发现率

FPKM:

每千碱基100万个片段

遗传算法:

赤霉素

走:

基因本体论

谷胱甘肽:

谷胱甘肽

销售税:

谷胱甘肽s-transferase

HCT:

Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate

国际宇航科学院:

吲哚乙酸

是:

茉莉酸

政治:

白花色素还原酶

液态氧:

脂氧合酶

LT:

低的温度

MDA:

丙二醛

NR:

非冗余蛋白序列

朋友:

苯丙氨酸解氨酶

包含了:

蛋白家族

所有:

耐Pyrabactin 1-like

PYR:

Pyrabactin阻力

ROS:

活性氧

RT:

室温

山:

水杨酸

TF:

转录因子

TR:

转录监管机构

感谢沈阳农业大学食品系纪淑娟教授的指导。

本研究的材料收集、转录测序和数据分析得到了国家自然科学基金(31501534)的资助;基因验证和生理实验由第64届中国博士后科学基金(2018 M640260)资助。

从属关系

1. 辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号沈阳农业大学食品学院，邮编110866

   张帆，姬淑娟，魏保东，程顺昌，王亚娟，郝佳，王思尧，周倩

贡献

ZQ和JSJ设计了这个实验;WBD、CSC、ZF、WYJ、HJ、WSY等文献研究;ZF进行实验(RNA分离，qRT-PCR)，数据分析和手稿编辑;ZQ和JSJ对该稿件进行了修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到周钱．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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