代谢变化提供了一些见解Stylosanthes根系对缺磷的反应

背景

缺磷是制约植物生长的主要因素之一，特别是在酸性土壤中。Stylosanthes柱头(stylo)是热带豆科植物的先驱，对低磷胁迫具有良好的适应性，但其潜在机制尚不清楚。

结果

本研究研究了水稻茎柱对磷酸盐(Pi)饥饿的生理、分子和代谢变化。在低磷条件下，茎柱根的生长得到促进，这主要归因于棒曲霉素参与根生长的基因。代谢谱分析表明，茎柱根对磷缺乏的响应中，共有256种代谢物存在差异积累，主要包括黄酮类、糖类、核苷酸类、氨基酸类、苯丙素类和苯酰胺类。缺磷导致磷酸化代谢物(如含磷糖、核苷酸和胆碱)的积累显著减少，表明在低磷胁迫下柱茎根内部磷利用增强。然而，类黄酮代谢物，如山奈酚、大豆苷元及其糖苷衍生物，在缺磷的柱茎根中增加。此外，qRT-PCR分析显示，在柱头根部缺磷的情况下，一组与黄酮类化合物合成有关的基因被上调。此外，在缺磷条件下，茎柱根部酚酸和苯胺的丰度显著增加。茎柱根代谢产物黄酮类、酚酸类和苯胺类物质积累的增加可能促进了磷的溶解，并与根际有益微生物合作，从而促进了茎柱对磷的获取和利用。

结论

这些结果表明，柱头植物通过调节根系形态，从磷酸化代谢物中清除内部磷，增加黄酮类、酚酸和苯胺的积累来应对缺磷。本研究为柱头根部对缺磷的复杂反应和适应机制提供了有价值的见解。

磷(P)是植物生长必需的大量营养元素之一。它涉及光合作用、能量转换、信号转导和生物大分子生物合成[1]。可溶性无机磷酸盐(Pi)是植物从土壤中直接利用的磷的主要形式[2]。然而，磷很容易被土壤中的有机化合物，铁(Fe)或铝(Al)氧化物所固定[3.]。低Pi有效性是限制作物生长和产量的主要制约因素[4]。在现代农业中，为了缓解缺磷而过量施用磷肥[5]。过量施用磷肥不利于环境友好型农业[j]。6]。因此，为了保持农业的可持续发展，了解植物如何适应磷饥饿，这将有助于培育高磷效率的作物品种。7]。

在磷限制土壤中，植物进化出一系列的适应机制来提高磷获取效率(PAE)和磷利用效率(PUE)。8]。植物增加PAE的主要适应策略包括根构型和形态的改变[9]，有机酸从根向根际的渗出[10]，磷酸酶和核糖核酸酶的分泌[11]，增强Pi转运蛋白的表达[12]并与丛枝菌根(AM)或其他促进植物生长的根瘤菌(PGPR)共生[13]。主要的pue相关策略包括用半乳糖脂和亚脂替代膜磷脂[14]，从液泡P储存中重新激活Pi [15]，以及替代代谢旁路反应，例如无机焦磷酸盐(PPi)代替Pi [16]。这些复杂的反应可以通过精心设计的P信号网络的协调来实现[17，18]。在过去的几十年里，参与该网络的几个关键调节因子已经被功能表征，如PHR1(磷酸盐饥饿反应1)，SPX结构域含蛋白，PHO2(泛素偶联E2酶)和microRNA399 [19，20.，21]。

低圆周率诱导植物基因和蛋白表达的剧烈变化[22，23]。转录组学和蛋白质组学技术已广泛应用于多种植物的Pi饥饿反应(PSR)基因和蛋白质的研究拟南芥［24]，米饭(栽培稻) [25，26]，玉米(玉米) [27，28，29和马尾松(马尾松) [30.，31]。一组PSR基因和蛋白质与磷的摄取和再分配、含磷代谢产物的分解代谢、有机酸代谢、信号调节和细胞壁修饰有关[qh]32]。例如，扩展蛋白是一种超家族蛋白，可以修饰细胞壁松动，导致细胞延伸[33]。GmEXLB1通过转录组学分析在大豆(大豆)，其特征是通过调节根系生长参与磷的获取[34]。最近，通过液泡膜蛋白质组学鉴定的一对水稻液泡π外排转运蛋白(OsVPE1和OsVPE2)已被证明参与液泡π的再动员[35]。虽然一些PSR基因和蛋白的分子特性已经被证实，但许多PSR基因和蛋白的生物学功能还没有很好的文献记载。

除了基因和蛋白质丰度的变化外，在缺磷植物中还观察到代谢变化。气相或液相色谱-质谱(GC-MS或LC-MS)技术的代谢组学分析是研究植物对Pi饥饿的代谢机制反应的有用工具。36]。对几种植物对磷缺乏的反应进行了代谢物谱分析，如拟南芥[37]，大米[38]，玉米[39大麦(大麦芽) [40]，小麦(小麦) [41]，大豆[42和茶(茶树) [43]。此外，一组受Pi饥饿调节的代谢物在不同的植物中都是保守的。例如，在缺磷植物中通常观察到磷酸化糖水平的降低。然而，在不同的植物物种中，几种氨基酸丰度的变化有显著差异。此外，黄酮类化合物属于苯丙类代谢产物大家族，与植物生长发育和植物与环境的相互作用有关[44]。缺磷对黄酮类化合物水平的影响仅在包括拟南芥在内的少数植物物种中通过代谢组学分析进行了分析[37]，大豆[42和茶[43]。然而，在不同的植物物种中已经发现了数千种类黄酮[44]。不同黄酮类化合物对低磷胁迫的响应尚不清楚。

自来水笔(Stylosanthes豆科植物是一种重要的饲用豆科植物，广泛应用于酸性土壤分布广泛的热带和亚热带地区的农业系统中[45]。缺磷以及铝和锰(Mn)毒性被认为是酸性土壤中作物生长和生产的主要限制因素。46]。因此，我们有理由认为，柱花是热带豆科植物的先驱，对酸性土壤的非生物胁迫具有广泛的适应性，特别是对缺磷的适应性。最近，转录组和蛋白质组谱被用于分析花柱对Al和Mn毒性的反应[j]。47，48，49]。然而，茎柱根部对缺磷的代谢变化尚未报道。在本研究中，研究了柱头根在Pi饥饿下生长性能、PSR基因表达和代谢组谱的变化。

柱头对Pi饥饿的生理反应

为了评估富磷(+Pi)和缺磷(-Pi)条件下花柱的动态变化，进行了一段时间的水培试验。结果表明，在-Pi处理7 d后，地上部干重出现下降，随着处理时间的延长，-Pi与+Pi之间的差异显著增大(图2)。1)。虽然两种磷处理7 d后根系干重没有差异，但与+Pi处理相比，-Pi处理10 d和15 d后根系干重分别增加了40.3%和31.2%(图2)。1a、b;额外的文件1:图S1)。同样，在-Pi处理10和15 d后，总根长、根表面积和根体积均有所增加(图2)。1c, d, e)。P处理15 d时，总根长和根表面积增幅最大，分别为44.6%和56.1%1:图S2a, b)。

在Pi饥饿下，根冠比显著提高。此外，-Pi处理15 d时根冠比达到最大值，是+Pi处理的2.6倍(附加文件)1:图S3)。经-Pi处理15 d，虽然总磷含量下降，但根酸性磷酸酶(APase)和苯丙氨酸氨(PAL)活性分别提高了209.0和100.5%(另附文件)1:图S4a, b, c)。同样，与+Pi处理相比，-Pi处理也增加了根总酚，类黄酮和总抗氧化能力(T-AOC)(附加文件)1:图S4d, e, f)。此外，我们还发现，在-Pi处理下，茎柱根部内部苹果酸浓度降低了69.5%，但茎柱根部外部苹果酸渗出率提高了44.3%(另附文件)1:图s4, h)。这些结果表明，在Pi饥饿的反应下，花柱发生了一系列形态和生理变化。

描述的棒曲霉素在花柱根的基因家族

定位于细胞壁的扩展蛋白家族参与调节植物根系生长[j]50]。在本研究中，共有16例棒曲霉素在柱头(附加文件)中鉴定出基因2:表1)。系统发育分析显示有16个花柱棒曲霉素成员分为四个亚科，包括9个SgEXPA, 1SgEXLA3SgEXPB和3SgEXLB(附加文件1:图5)。在施磷15 d后，进一步分析了这些基因在花柱根部的表达模式。结果表明:SgEXPAs（SgEXPA1，2，4和8)，SgEXPB2和SgEXLB1是上调的，而SgEXLB3被Pi饥饿下调。剩余风格的表达棒曲霉素基因不受低磷处理的影响(图2)。2)。这些结果表明，一些风格棒曲霉素在低磷条件下，基因参与调控根系生长。

柱茎根代谢组学研究综述

为了评估代谢组对磷饥饿的反应，在两种磷处理下对茎柱根部进行了LC-MS/MS分析。在两个P水平下，茎柱根部共鉴定出708种代谢物(附加文件)3.表2)。主成分分析(PCA)表明，主成分1 (PC1)很好地定义了+Pi(三角形)和-Pi(圆形)风格材料之间的差异，约占差异的80.15%(附加文件)1:图S6a)。将-Pi/+Pi比值大于2或小于0.5，项目可变重要度(VIP)大于1.0的代谢物视为差异积累代谢物(DAMs)。在两种磷处理下，茎柱根部共鉴定出256个dam，包括136个低磷上调代谢物和120个低磷下调代谢物(图2)。3.a)，可以分别聚为上调簇(红色)和下调簇(蓝色)(附加文件1:图S6b)。根样本也聚类成+Pi和-Pi处理分支(附加文件1:图S6b)。鉴定出的256个dam可分为14类，包括类黄酮、苯丙素、苯胺及其衍生物、氨基酸和胆碱，这些dam的上调数量高于下调数量(图2)。3.b)。然而，上调的氨基酸衍生物和糖的数量少于下调的数量(图2)。3.b)。

柱头根部糖、胆碱、核苷酸及其衍生物对Pi饥饿反应的变化

根据代谢物中磷酸基团的存在，糖、胆碱、核苷酸及其衍生物可分为含磷代谢物和不含磷代谢物两类。对于13个糖相关的水坝，6个含p糖的水平随pi处理而下降。其中，2-脱氧核糖-1-磷酸、5-磷酸核酮糖、6-磷酸甘露糖和1-磷酸果糖在-Pi处理下比在+Pi处理下减少了10倍以上。然而，3种不含p的糖的水平显著升高，包括葡萄糖、肌醇和葡萄糖酸(图2)。4)。此外，4种不含磷胆碱的水平增加，但与+Pi处理相比，-Pi处理下含p胆碱的水平，如甘油-3-磷酸胆碱(GPC)和磷酸胆碱(PCho)的水平分别下降了58.43倍和20.96倍(图2)。4)。

另外，鉴定出28个dam为核苷酸及其衍生物。在低磷胁迫下，茎柱根部14种不含磷核苷酸中有10种水平升高，14种含磷核苷酸中有11种水平降低。烟酸单核苷酸、胞酸、尿苷5′-二磷酸-d -葡萄糖、尿苷5′-单磷酸、烟酸腺嘌呤二核苷酸和单磷酸腺苷在缺磷的茎柱根部下降了10倍以上(图2)。4)。

为检测参与含磷代谢物分解代谢的水解酶对低磷胁迫的响应，测定5茎柱紫色酸性磷酸酶(人民行动党)和3核糖核酸酶(RNS)基因进行实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分析。结果显示，5例中有4例的表达SgPAPs经pi处理后表达上调，尤其是SgPAP10/12/23，以及3 / 4的表达式SgRNSs在低Pi应力下增强(附加文件1:图S7)。

茎柱根部氨基酸及其衍生物对缺磷的响应

在鉴定的22种氨基酸中，有9种被认为是dam(附加文件)4(表S3)，在-Pi处理下，9个氨基酸相关的dam中有7个显著诱导，而在柱头根部，谷氨酸(Glu)和胱氨酸(Cys)因Pi饥饿而降低。瓜氨酸是含量最高的氨基酸(超过5倍)(图2)。5)。此外，本研究还鉴定了81个氨基酸衍生物。其中29个氨基酸衍生物为dam，其中上调9个，下调20个(另附文件)4:表S3;无花果。5)。

茎柱根部黄酮类化合物对缺磷的响应分析

黄酮类化合物54种，其中黄酮类23种，黄醇类16种，黄烷酮类6种，异黄酮类4种，黄烷醇类2种，花青素类2种，查尔酮类1种。在低磷胁迫下，茎柱根部黄酮类化合物的积累量增加(附加文件)1:图S8)。

对于差异积累的黄酮，23种黄酮中有19种黄酮的积累量显著增加，包括4种芹菜素的苷类衍生物和4种黄油醇的苷类衍生物，而其余黄酮的浓度经-Pi处理后呈下降趋势(图2)。6;无花果。7)。

在-Pi胁迫下，16种黄酮醇中有9种黄酮醇含量升高，其余7种黄酮醇含量降低。虽然山奈酚和槲皮素水平在缺磷条件下升高，但它们的苷类衍生物对低磷胁迫的反应不同。山奈酚的3种苷类衍生物在低磷胁迫下表达上调，槲皮素的5种苷类衍生物表达下调(图2)。6;无花果。7)。

对于差异积累的黄酮，除橙皮苷o -己苷外，低磷胁迫下柱头根中黄酮的丰度均增加。在缺磷条件下，排尿原素上调幅度最大，达4.97倍(图2)。6;无花果。7)。在-Pi胁迫下，4种异黄酮的浓度也明显升高。三种异黄酮的浓度，包括鱼藤酮、大豆黄素和大豆黄素7- o -葡萄糖苷，在低磷缺根中增加了5倍以上。6)。

随后，的表达式2-hydroxyisoflavanone脱水酶（SgHID),尿苷二磷酸糖基转移酶（SgUGT)分别参与大豆黄素和大豆黄素7- o -糖苷的合成。qRT-PCR分析显示，5个基因中有3个表达SgHIDs3个中的2个SgUGTs在低磷胁迫下，柱头根部表达上调(图2)。8)。的表达式类黄酮3 ' -羟化酶（SgF3'H)，黄酮醇合成酶（SgFLS),黄烷酮3-hydroxylase（SgF3H)，与黄酮类化合物合成相关。结果表明SgF3'H-1，SgFLS-1和SgF3H-1在缺磷条件下，柱根中表达上调(图2)。8)。

茎柱根部苯丙素、苯酰胺及其衍生物对缺磷的响应分析

除黄酮类化合物外，本研究还鉴定出其他差异积累的苯丙素，包括7种酚酸类和8种非酚酸类苯丙素。对于酚酸，5种dam的浓度显著增加，特别是对-Pi处理下的果酸浓度增加了10倍以上。对于非酚酸类苯丙素，低磷处理下5个坝的浓度升高，3个坝的浓度降低。在增加的坝中，缺磷茎根中芝麻素的相对含量增加了10倍以上。

此外，还鉴定了15种差异积累的苯胺及其衍生物，包括13种上调的dam和2种下调的dam(图2)。9)。低磷胁迫下，3种苯胺(n -苯甲酰色胺、n -阿魏酰尸胺和n -阿魏酰腐胺)在根系中的相对含量增加了5倍以上。如图所示。10与苯丙素代谢途径相关的许多代谢物因缺磷而上调。有趣的是，所有的ρ-香豆酸和4个相应的衍生物的浓度在柱头根响应Pi饥饿增加。

低磷有效度对柱头根部形态的影响

根系作为植物吸收磷的主要器官，对低磷有效度的发育响应具有很高的可塑性[j]。52]。累积研究表明，植物对缺磷的适应策略包括改变根构型和形态，如促进侧根生长、促进根毛发育和形成簇状根[4]。这种发展策略增加了根与土壤的接触面，从而有利于从土壤中开采Pi储量[9]。在本研究中，低磷处理10和15 d后，茎柱的根干重、根长、根表面积和根体积显著增加，表明茎柱通过改变根系生长来适应缺磷(图2)。1)。

细胞壁松动是根变性的重要过程之一，可由扩张蛋白基因调控[j]。33]。扩张蛋白包括α-扩张蛋白(EXPA)、扩张蛋白样A (EXLA)、β-扩张蛋白(EXPB)和扩张蛋白样B (EXLB)四个亚家族[53]。据资料显示，当植物遭受缺磷时，三个扩展蛋白成员参与调节根结构和形态，如TaEXPB23源自wheat [54]，GmEXPB2和GmEXLB1源自soybean [34，55]。在本研究中SgEXPB2和SgEXLB1的同构GmEXPB2和GmEXLB1，因缺磷而增加(图2)。2;额外的文件1:图5)。更进一步，4SgEXPAs在低磷胁迫下，柱头根部的叶绿素含量也有所增加(图2)。2;额外的文件1:图5)。这些结果表明棒曲霉素在缺磷条件下，基因参与柱茎根生长的调控。

缺磷茎柱根部葡萄糖的积累

由于缺磷，植物通常会改变碳水化合物的分配。大量的碳水化合物被分配到根系，刺激根系生长，导致根冠比增加[56]。本研究中，缺磷显著提高了茎柱的根冠比(图2)。1;额外的文件1:图S3)。代谢组学分析表明，在缺磷的茎柱根部，葡萄糖浓度增加了10倍以上。4)。同样，在茶叶和黑麦草(多年生黑麦草)在低Pi条件下[43，57]。葡萄糖是光合作用产生的碳水化合物之一，不仅参与植物的能量供应、碳代谢和细胞壁合成，而且作为重要的信号分子[58]。最近，葡萄糖信号已被证明通过与植物激素相互作用促进根的生长和发育[59]。在拟南芥中，已经证明葡萄糖串扰与生长素信号传导在促进细胞扩增和侧根形成方面具有积极作用[59]。这些结果表明葡萄糖在花柱对缺磷的适应中起重要作用。葡萄糖可能作为能量分子和信号分子调控根的生长。

缺磷时对含磷代谢物中磷的清除

含磷代谢物的再活化被认为是植物适应缺磷的重要策略[15]。在限磷条件下，植物细胞可清除核酸、磷脂和磷酸化糖等含磷代谢物，释放磷，维持磷稳态[qh]60]。研究表明，在拟南芥等多种植物中，磷酸化糖因缺磷而减少[37]，大麦[40]、白露苹(Lupinus白色) [61),杨树cathayana［62]。同样，在缺磷的茎柱根中，6种磷酸化糖的积累减少(图2)。4)。此外，Pi饥饿导致2 - p -胆碱和11 - p -核苷酸的浓度降低(图2)。4)。此外，一组基因(4SgPAPs和3SgRNSs)参与含磷代谢物降解的基因在柱根中因缺磷而上调(附加文件)1:图S7)。这些结果表明，茎柱根对缺磷的响应发生了多种含磷代谢物的变化。

缺磷可提高茎柱根部黄酮类化合物的含量

黄酮类化合物是植物重要的次生代谢产物之一，在植物中发挥着多种生物学作用，如生长素的运输、活性氧的调节、对紫外线b的保护以及与根际微生物的相互作用[j]。44]。迄今为止，在植物中已经发现了1万多种黄酮类化合物的结构变体。黄酮类化合物根据其基本结构可分为黄酮类、黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、黄烷醇类、花青素类和查尔酮类[63]。其中黄酮醇(如槲皮素、山奈酚、异鼠李素和山奈酚苷)已被发现在Pi饥饿期间在拟南芥中积累[37]。在本研究中，54种不同积累的黄酮类化合物中，有41种的丰度因Pi饥饿而上调(图2)。3.b;无花果。6)。低Pi条件下山奈酚及其黄酮醇苷类衍生物的浓度显著增强(图2)。6)。,年代gFLS-1参与山奈酚生物合成的最后一步，在柱根中因缺磷而表达上调(图2)。7，8)。据报道，植物根系可以分泌山奈酚，通过溶解土壤中的铁络合物来增加铁的有效性[44]。原儿茶酸是黄烷醇衍生物中的另一种黄酮类化合物，在缺铁条件下，原儿茶酸与山奈酚在水稻中的铁溶解作用相似[j]。64]。在本研究中，在低Pi条件下，茎柱根中原儿茶酸及其衍生物(原儿茶酸o -己糖)的浓度增加(图2)。6)。众所周知，铁和磷能在土壤中形成不溶性复合体。随着黄酮类化合物对铁的动员，铁可以被释放。因此，山奈酚和原儿茶酸在茎柱根部的积累可能有助于不溶性磷的动员。

据报道，在缺磷的普通豆中，异黄酮(如大豆苷元)的含量增加(菜豆) [65]。同样，在低Pi条件下，茎柱根中大豆苷元和大豆苷7- o -糖苷的积累增加了5倍以上(图2)。6)。此外，一组基因(SgUGTs和SgHIDs)，参与大豆苷元和大豆苷7- o -糖苷的生物合成，在柱茎根中被发现在Pi饥饿下上调(图2)。7，8)。研究表明，大豆苷元在与AM真菌的共生网络形成中起着重要作用，有助于大豆根系对Pi的吸收[63]。此外，花青素中的飞鸽苷3-葡萄糖苷和芍药苷3-葡萄糖苷含量因缺磷而显著升高。有研究认为，植物茎叶中积累的花青素可能具有光保护功能，但花青素在根系中的功能尚不清楚[42]。

缺磷茎柱根部酚酸和苯酰胺积累增加

除黄酮类次生代谢物外，缺乏磷的茎柱根部还增加了一组酚酸。例如，在Pi饥饿下，果酸的浓度提高了10倍以上(图2)。9)。据报道，从根部渗出的酚酸可以促进不溶性磷复合物(Fe-P和Al-P)的动员，从而增加磷的有效性[j]。66，67]。此外，据报道，焦糖酸可以促进AM真菌与植物的相互作用[68]。

苯胺，也被称为羟基肉桂酸酰胺(HCAA)或酚醛酰胺，是由酚酸衍生物和多胺合成的。据报道，苯胺在保护植物免受非生物和生物胁迫方面发挥着重要作用[69，70]。然而，苯酰胺对缺磷的反应尚不清楚。在本研究中，在暴露于低磷胁迫下的柱茎根中鉴定出15种不同积累的苯胺(图2)。9)。其中，缺磷茎根中13种苯胺的积累增加，如n -阿魏酰腐胺(图2)。9)。最近，n -阿魏酰腐胺已被证明参与水稻根系中与PGPR的相互作用[70]。因此，缺磷导致花柱中黄酮类、酚酸类和苯胺类物质的积累，这些物质可能有助于磷的再活化，并与有益微生物(如AM真菌和PGPR)合作。

本研究表明，缺磷对茎柱根生长有影响，包括广泛的生理、分子和代谢变化。在低Pi条件下，根系的生长和生长得到了促进棒曲霉素基因表达可能促进柱头的圆周率获得。含磷代谢物的减少表明，茎柱根部对磷缺乏的响应增强了内部对磷的利用。此外，在缺磷的茎柱根部，黄酮类化合物、酚酸和苯酰胺的积累增加，这可能与植物与环境的相互作用有关。综上所述，本研究提供了柱根对Pi饥饿的复杂反应的全面理解。

植物生长与处理

本研究使用的花柱基因型为“TF0291”，该基因型最初由哥伦比亚国际热带农业中心(CIAT)引入中国热带农业科学院(CATAS)。花柱种子由中国科学院热带作物遗传资源研究所热带牧草研究中心提供。

花柱种子在28°C的湿滤纸上预发芽。发芽3 d后，根据Famoso等人的方法，将均匀的幼苗移栽到装有改良Magnavaca营养液的蓝色塑料罐中。[71]。营养液含KCl (1 mmol L)⁻¹), CaCl₂(1mmol L)⁻¹Fe-EDTA (77 μmol L)⁻¹), MgSO₄(200 μmol L⁻¹)， Mg (NO_3.）₂(500 μmol L⁻¹), NH₄没有_3.(1.5 mmol L⁻¹), MnCl₂h·4₂O (11.8 μmol L⁻¹), ZnSO₄h·7₂O (3.06 μmol L⁻¹), CuSO₄h·5₂O (0.8 μmol L⁻¹), H_3.薄_3.(33 μmol L⁻¹),钠₂MoO₄·H₂O (1.07 μmol L⁻¹), MgCl₂h·6₂O (155 μmol L⁻¹), KH₂阿宝₄(250 μmol L⁻¹)。这些植物在中国海南大学温室(E121°54 '，N30°52 ')的自然昼夜循环和环境下生长。生长7 d后，将幼苗转移到添加(+Pi)或不添加(-Pi) 250 μmol/L KH的新鲜改性Magnavaca营养液中₂阿宝₄。在施磷处理0、7、10、15、20 d后，分别采收幼苗和根系，测定干重、全磷含量、总根长、根表面积和根体积。收获不同磷处理15 d的根，在- 80°C中保存，用于后续代谢物和qRT-PCR分析。

评价根系参数、全磷含量、APase活性等生化参数

为了确定根参数(如根长度、表面积和体积)，用扫描仪(爱普生，日本)以400 dpi扫描茎根。通过WinRHIZO程序(2009,Regent, Canada)对扫描图像进行进一步分析。测定干重后，采用钼酸磷-蓝色反应法测定茎和根中总磷含量[72]。采用标准曲线计算磷含量。根据Liu等的研究，测定了不同磷处理下柱头根部的APase活性。[73]。将约0.1 g根样品在1 mL萃取缓冲液中4℃磨成粉末，在4℃下12,000 g离心10 min，收集上清液，在含有1 mM ρ-硝基苯基磷酸的45 mM乙酸钠缓冲液中35℃孵育15 min，在吸光度405 nm处测定ρ-硝基苯酚的产率。

如前所述检测T-AOC和PAL的活性[74]，使用商用化学检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)。简单地说，约0.1 g根在0.9 mL萃取缓冲液中在4°C下磨成粉末。1.2万g离心10 min后，收集上清，在37℃的试剂盒反应液中孵育30 min，检测F的产率^2＋-TPTZ在520 nm吸光度处计算T-AOC活性。PAL活性方面，反应溶液在30℃下孵育30 min，在吸光度290 nm处分光光度法测定肉桂酸的产率。样品中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[75]。总酚和黄酮类化合物的含量采用商用化学检测试剂盒(中国南京建成生物工程研究所)进行检测。约0.1 g根样品在65%乙醇中研磨成匀浆，60℃超声提取2 h, 10000 g离心10 min，收集上清液。反应后，分别在760 nm和502 nm处检测吸光度，测定总酚和总黄酮的含量。此外，如前所述，检测柱头根的苹果酸浓度和渗出率[76]。简单地说，将经磷处理15 d的茎柱根转移到新鲜营养液中，分别收集根渗出液和根。收集的渗出液经真空冷冻干燥系统(Labconco)浓缩至1.2 mL，测定苹果酸盐渗出率。取约0.1 g茎柱根，用1.2 mL 0.25 M HCl研磨提取内部苹果酸盐，然后加热至80℃20 min，在12,000 g下离心15 min，收集上清分析。所有样品均采用高效液相色谱法进行分析。高效液相色谱法(1260 Infinity LC;采用Agilent 1100)和反相色谱柱(Kromasil C18, 250 mm × 4.6 mm,5 μm)。溶液(pH 2.8)为1.56 g NaH_3.阿宝₄， 800 mL水，16 mL甲醇为流动相。加入10 μL样品，流速0.8 mL/min，柱温25℃，时间30 min，紫外波长214 nm。

代谢物的分析

代谢组学分析由MetWare生物技术有限公司(中国武汉)进行。所有6个根样品(+Pi组和-Pi组3个生物重复)均被使用。通过非靶向LC-MS/MS技术评估代谢物。按照Chen等人的描述进行提取和代谢物分析。[77]。简单地说，根样品使用研磨机(MM 400, Retsch)研磨成粉末，100 mg样品在1.0 mL 70%水溶液甲醇中提取，在4°C下过夜。收集上清成分，用0.22 μm微孔过滤器(SCAA-104, ANPEL, Shanghai, China)过滤，10000 g离心10 min，然后进行LC-MS/MS分析。

将每种样品的2 μL注射到配备串联质谱(MS/MS, Applied Biosystems 6500 Q TRAP)的超高效液相色谱(UPLC, Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A)中。在UPLC中，样品采用Waters Acquity UPLC HSS T3 C18反相柱(1.8 μm, 2.1 mm × 100 mm)分离。流动相为洗脱液A(0.04%乙酸水溶液)和洗脱液B(0.04%乙酸乙腈溶液)。分离程序的梯度在0 min时为95:5 (A:B, v/v)，在11.0和12.0 min时为5:95 (A:B, v/v)，在12.1和15.0 min时为95:5 (A:B, v/v)。流速保持在0.4 ml/min，柱温保持在40℃。对于MS/MS，电喷雾电离(ESI)源操作参数设置如下:仪器采用正离子模式;离子源为涡轮喷雾;源温度设定为550℃;离子喷雾电压调整为5.5 kV;离子源气体I、气体II、幕气分别设定为每平方英寸55、60、25磅。 For triple quadrupole (QQQ) scans, each ion pair was scanned according to the optimized declustering potential and collision energy as multiple reaction monitoring (MRM) experiments.

代谢物的定性和定量分析参照前人的研究[78]。代谢物的二级光谱信息与自建的MetWare数据库(MWDB 3.2)和公共数据库(METLIN:https://metlin.scripps.eduPubChem:https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/mzCloud:https://www.mzcloud.org/)。通过QQQ质谱/质谱MRM分析代谢物的定量。此外，通过正交投影到潜在结构判别分析(OPLS-DA)，根据倍数变化(-Pi/+Pi)大于2或小于0.5，项目变量重要性(VIP)大于1.0的标准对大坝进行识别[79]。

实时定量PCR (qRT-PCR)分析

总RNA采用RNA-solve试剂(Omega Biotech, USA)提取。用M-MLV逆转录酶(Promega, Madison, WI, USA)从DNase i处理过的总RNA合成首链cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Japan)在Rotor-Gene 3000 qRT-PCR系统(Corbett Research, Australia)上进行qRT-PCR。基于NCBI数据库(PRJNA431518, SRX6928121)的核糖核酸测序(RNA-Seq)数据，检测了以下基因的表达，揭示了pi饥饿响应中与植物细胞壁修饰、含p代谢物分级以及可能的关键类黄酮代谢物合成相关的候选基因的相对水平:棒曲霉素的基因,SgPAP，SgRNS，SgF3'H，SgFLS，SgF3H，SgHID，SgUGT。管家基因，延伸系数1（SgEF-1α，加入号:JX164254)，作为内参基因规范基因表达。qRT-PCR分析基因的引物和基因的加入数在附加文件中列出2表S1。本研究共纳入4个生物重复，根据Liu等计算相对表达量。[80]。此外，还进行了花柱的多序列比对和系统发育树分析棒曲霉素分别用Clustal X和MEGA 5构建家族基因。

统计分析和可视化

采用Excel 2016软件(Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA)分析干重、全磷含量、根系参数、生理指标和基因表达的均值和标准误差。单因素方差分析(ANOVA)最小显著性差异(LSD)， Duncan和Student 'st采用SPSS (Version 19.0, IBM, Chicago, IL, USA)软件进行检验。主成分分析、火山图、聚类热图和圆形图在R (v 3.5.1)程序中进行。在分析之前，对原始数据进行Z分数转换，在热图中进行归一化。代谢类别图是用Microsoft Excel 2016创建的。根据京都基因与基因组百科全书(KEGG)代谢数据库(http://www.kegg.jp/)。为了确定代谢变化折叠，未转换的平均值(n= 3)计算-Pi/+Pi比率。

支持本文结论的数据集和附加文件也已获得，基因核酸序列已提交至NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)，并在附加文件中显示序列标识符2表S1，与本研究相关的38个基因的加入号如下:SgF3'H-1: MN165117;SgFLS-1: MN165118;SgF3H-1: MN165119;SgF3H-2: MN165120;SgHID-1: MN165121;SgHID-2: MN165122;SgHID-3: MN165123;SgHID-4: MN165124;SgHID-5: MN165125;SgUGT-1: MN165126;SgUGT-2: MN165127;SgUGT-3: MN165128;SgEXPA1: MN540933;SgEXPA2: MN540934;SgEXPA3: MN540935;SgEXPA4: MN540936;SgEXPA5: MN540937;SgEXPA6: MN540938;SgEXPA7: MN540939;SgEXPA8: MN540940;SgEXPA9: MN540941;SgEXLA1: MN540942;SgEXPB1: MN540943;SgEXPB2: MN540944;SgEXPB3: MN540945;SgEXLB1: MN540946;SgEXLB2: MN540947;SgEXLB3: MN540948;SgPAP1a: MN540949;SgPAP1b: MN540950;SgPAP10: KU315545;SgPAP12: MN064556;SgPAP23: MG492012;SgRSN1: MN540951;SgRSN2: MN540952;SgRSN3: MN540953;SgRSN4: MN540954;SgEF-1a: JX164254。

艾尔:

铝

问:

丛枝菌根

方差分析:

单因素方差分析

APase:

酸性磷酸酶

机票:

中国热带农业科学研究院

国际热带农业中心:

国际热带农业中心

半胱氨酸:

胱氨酸

大坝:

差异积累的代谢物

EF-1α:

延伸系数1

应急服务国际公司:

电喷雾电离

F3'H:

类黄酮3 ' -羟化酶

F3H:

黄烷酮3-hydroxylase

菲:

铁

读者:

黄酮醇合成酶

气相:

气相色谱质谱法

Glu:

谷氨酸

GPC:

Glycerol-3-phosphocholine

HCAA:

羟基肉桂酸酰胺

藏:

2-hydroxyisoflavanone脱水酶

KEGG:

京都基因与基因组百科全书

质:

液相色谱质谱法

迷幻药:

最小显著差异

米歇尔。内格罗蓬特:

锰

MRM:

多反应监测

MWDB:

MetWare数据库

OPLS-DA:

潜在结构判别分析的正交投影

病人:

磷

PAE股权:

磷获取效率

朋友:

苯丙氨酸氨

人民行动党:

紫色酸性磷酸酶

PC1:

主成分一

主成分分析:

主成分分析

PCho:

胆碱磷酸

PGPR:

促进植物生长的根瘤菌

PHO2:

泛素结合E2酶

PHR1:

磷酸盐饥饿反应1

Pi:

可溶性无机磷酸盐

PPi:

焦磷酸无机

PSR:

可溶性无机磷酸盐饥饿反应

PUE:

磷利用效率

调:

三重四极

存在:

定量实时聚合酶链反应

RNS:

核糖核酸酶

SPX:

SYG1 / PHO81 / XPR1

自来水笔:

Stylosanthes spp。

T-AOC:

总抗氧化能力

TPTZ:

Tripyridine triacridine

UGT:,

尿苷二磷酸糖基转移酶

UPLC:

超高效液相色谱法

贵宾:

项目中的可变重要性

汽相外延:

液泡Pi外排转运体

作者衷心感谢MetWare生物技术有限公司(中国武汉)帮助鉴定代谢物。

利益竞争

作者宣称他们没有竞争利益。

海南省自然科学基金项目(318QN265)、国家自然科学基金项目(31701492、31861143013、31672483)、现代农产技术研究体系项目(CARS-34、CARS-22-Z11)、中央公益性科研机构基础研究基金项目(1630032018004)资助。作者声明，没有任何资助机构在研究的设计或数据的收集、分析、解释和撰写手稿中发挥任何作用。

从属关系

1. 海南大学热带作物学院，中国热带农业科学院热带作物遗传资源研究所，海口570228

   罗佳佳，刘云喜，张慧凯，王金鹏，陈志坚，罗丽娟，刘国道，刘攀道

贡献

P.L.和l.l.构思并设计了这项研究。j.l.， Y.L.和J.W.进行了生理实验。J.L.和H.Z.进行了代谢和qRT-PCR分析。P.L.和J.W.分析了数据。J.L.写了草稿。p.l.， g.l.， L.L.和Z.C.对修改手稿提出了许多重要的建议。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Lijuan罗，Guodao刘或Pandao刘。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

出版商的注意

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