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异质三聚体G蛋白参与调控水稻的多种农艺性状和抗逆性gydF4y2Ba

BMC植物生物学gydF4y2Ba体积gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba文章编号:gydF4y2Ba90gydF4y2Ba（gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba）gydF4y2Ba引用这篇文章gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

由Gα、Gβ和Gγ亚基组成的异三聚体G蛋白复合物是真核生物中保守的信号转导机制。最近的分子研究表明，G蛋白信号通路参与了产量相关性状的调控。然而，G蛋白基因对产量组成和抗逆性的影响尚未得到很好的研究。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)基因编辑技术在水稻中生成了异三聚体G蛋白突变体。研究了异质三聚体G蛋白对产量组成和抗逆性的调节作用。突变体的gydF4y2Bags3gydF4y2Ba和gydF4y2Badep1gydF4y2Ba产生了较好的农艺性状与野生型相比，而突变体gydF4y2Barga1gydF4y2Ba表现出极端矮化表型，导致粮食产量急剧下降。突变体的抗逆性提高，特别是在盐胁迫下。我们发现了4个推测的超大G蛋白(PXLG) 1-4，它们也参与了产量成分和耐受性的调节。酵母双杂交结果表明，RGB1可能与PXLG2互作，而与PXLG1、PXLG3和PXLG4不互作。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些发现不仅有助于我们对水稻中异质三聚体G蛋白的理解，而且有助于异质三聚体G蛋白在水稻育种中的应用。gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

关于异质三聚体G蛋白的许多开创性工作是在过去40年完成的，因此，难怪这条途径是世界上了解最多的。异质三聚体G蛋白，包括α， β和γ亚基，通过细胞表面受体感知细胞外刺激，然后将信号传递给效应体，启动大量的细胞行为[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．这些包括对激素、干旱和病原体的反应，以及发育事件，如侧根形成、下胚轴伸长、钩子张开、叶片扩张和角果发育[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．哺乳动物基因组中存在一个大型的异质三聚体G蛋白家族，例如，人类基因组编码23g α、5g β和12g γ [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，而植物中的异质三聚体G蛋白库要比动物中的简单得多[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．在水稻基因组中，有正则Gα (gydF4y2BaRGA1gydF4y2Ba)及Gβ (gydF4y2BaRGB1gydF4y2Ba)子单元gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]和两个正则Gγ亚基(gydF4y2BaRGG1gydF4y2Ba和gydF4y2BaRGG2gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．最近的分子研究发现，在基因组中有三种不同寻常的大蛋白，其序列与Gα亚基相似gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，这些被命名为超大gtp结合蛋白，或xlg [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．的gydF4y2BaXLGsgydF4y2Ba与标准的Gα相比，n端有一个长且富含半胱氨酸的结构域gydF4y2BaXLGsgydF4y2Ba显示gtp结合和gtp酶活性[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．类似地，有三个非正则g - γ亚基，gydF4y2BaGS3gydF4y2Ba，gydF4y2BaDEP1gydF4y2Ba,gydF4y2BaGGC2gydF4y2Ba在水稻基因组中[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．非典型的g - γ亚基在c端也有一个长且富含半胱氨酸的结构域gydF4y2BaRGG1gydF4y2Ba和gydF4y2BaRGG2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．有趣的是，富胱氨酸区域的变异有助于重要农艺性状的改良。品种各异gydF4y2BaGS3gydF4y2Ba等位基因产生了颗粒大小的多样性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba的富cys域删除gydF4y2Badep1-1gydF4y2Ba等位基因导致穗部密集而直立，每穗粒数显著增加[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．综上所述，异质三聚体XLG蛋白和动物异质三聚体G蛋白库中不存在的非标准Gγ亚基可能识别额外的信号转导途径，扩大异质三聚体G蛋白库。gydF4y2Ba

CRISPR/Cas9系统已经成功地作为高效的基因组编辑工具应用于许多植物物种[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]．CRISPR/Cas9基因编辑技术已被用于验证重要的产量相关基因的功能，如gydF4y2BaDEP1gydF4y2Ba，gydF4y2BaGS3gydF4y2Ba，gydF4y2BaIPA1gydF4y2Ba,gydF4y2BaGn1agydF4y2Ba［gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术生成了1个Gα突变体、1个Gβ突变体、5个Gγ突变体和4个超大Gα突变体。我们评估了突变体的产量构成和胁迫耐受性，揭示了异质三聚体G蛋白突变体对产量构成和胁迫耐受性的显著不同影响。本研究旨在深入了解水稻基因组中的异质三聚体G蛋白，为水稻育种提供更好的信息和种质资源。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

异三聚体G蛋白编码基因转化的研究gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba本研究以Sasanishiki水稻品种作为野生型进行转化。Sasanishiki是一个典型的日本人gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba20世纪80年代以前在中国东北广泛种植的品种。然后Sasanishiki成为主要的骨干亲本，中国东北的许多水稻品种共享Sasanishiki的基因组片段。因此，Sasanishiki是一种理想的转化材料，不仅可以用于水稻异质三聚体G蛋白编码基因的功能论证，也可以用于东北地区的分子育种遗传改良。因此，我们首先评估了Sasanishiki的异质三聚体G蛋白编码基因。对Sasanishiki的Gα、Gβ和5个Gγ基因进行了研究gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.结果表明，Sasanishiki与Nipponbare共享G蛋白基因。在Nipponbare和Sasanishiki之间没有检测到帧移动。因此，我们假设Sasanishiki的所有7个G蛋白基因都是功能性的。gydF4y2Ba

表1本研究中修饰的靶基因详细信息gydF4y2Ba
全尺寸表gydF4y2Ba

利用CRISPR/Cas9生成异质三聚体G蛋白突变体gydF4y2Ba

为了评价异质性三聚体G蛋白编码基因对水稻农艺性状的影响，我们利用CRISPR/Cas9特异诱导G蛋白的突变。我们对每个突变体的20个植株进行了测序，以检测突变效率gydF4y2Ba0gydF4y2Ba的一代。结果表明，64.29%的植物发生了突变，10.71%的测序植物推定为纯合子突变(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.7 TgydF4y2Ba1gydF4y2Ba进一步分析采用纯合子突变系和WT。每个外源三聚体G蛋白编码基因均获得至少2个独立的转基因株系gydF4y2Bargg2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.40 TgydF4y2Ba1gydF4y2Ba2018年4月23日，在沈阳农业大学试验田(N41°，E123°)播种各突变体和WT的植株。我们记录了第一穗从穗鞘中露出时的抽穗期。结果表明gydF4y2Bargb1gydF4y2Ba，gydF4y2Bargg1gydF4y2Ba，gydF4y2Bargg2gydF4y2Ba，gydF4y2Bags3,gydF4y2Ba和gydF4y2Badep1gydF4y2Ba突变体成穗期明显早于野生型gydF4y2Barga1gydF4y2Ba和gydF4y2Baggc2gydF4y2Ba突变体表现出与WT相似的开花时间(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

异质三聚体G蛋白的示意图和CRISPR/Cas9基因编辑产生的突变体的序列。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba水稻中异质三聚体Gα和Gβ蛋白的结构示意图。功能域用不同的颜色表示。黑色箭头表示sgRNA所在的位置。数字表示氨基酸序列。gydF4y2BabgydF4y2Ba水稻中异质三聚体g - γ蛋白的蛋白质示意图。功能域用不同的颜色表示。黑色箭头表示sgRNA所在的位置。数字表示氨基酸序列。gydF4y2BacgydF4y2BaCRISPR/Cas9基因编辑生成的异质三聚体G蛋白突变体序列gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba
表2目的基因突变的T0植株百分比gydF4y2Ba
全尺寸表gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba
figure2gydF4y2Ba

异质三聚体G蛋白对植株结构、穗粒大小、粒级和产量构成的遗传效应gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba整个植物的异质三聚体G蛋白突变体。Bar = 10cm (gydF4y2BabgydF4y2Ba)异三聚体G蛋白突变体的穗部。条形= 1厘米(gydF4y2BacgydF4y2Ba)异质三聚体G蛋白突变体的颗粒。条形= 1厘米(gydF4y2BadgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)异质三聚体G蛋白突变体的株高、抽穗次数、穗数、每穗粒数、千粒重和结实率。*表示在5%水平显著gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

异质三聚体G蛋白突变体的产量构成gydF4y2Ba

异质三聚体G蛋白参与多个农艺性状的调控，包括粒级和穗型结构。因此，我们比较了7个G蛋白突变体和WT的产量组成(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.结果表明，独立突变系的表型变化相似。的gydF4y2Barga1gydF4y2Ba表现出显著的矮化表型，穗长、粒长、千粒重和结实率均显著低于野生型gydF4y2Bargb1gydF4y2Ba突变体表现为半矮化表型，穗数小于WT。Sun等和Gao等报道gydF4y2BaRGB1gydF4y2BaCRISPR/Cas9基因编辑技术产生的基因是致命的[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．但是，三个碱基和六个碱基的缺失gydF4y2Bargb1-1gydF4y2Ba和gydF4y2Bargb1-2gydF4y2Ba没有造成帧移，哪一个可能是存活的原因gydF4y2Bargb1-1gydF4y2Ba和gydF4y2Bargb1-2gydF4y2Ba．在g - γ亚基中gydF4y2Bargg1gydF4y2Ba突变体的穗长而穗少，穗长而穗少gydF4y2Bargg2gydF4y2Ba突变体的株高较野生型降低gydF4y2Baggc2gydF4y2Ba和gydF4y2Badep1gydF4y2Ba突变体株高呈下降趋势gydF4y2Badep1gydF4y2Ba与野生型相比，突变体籽粒短，穗粒数大gydF4y2Bags3gydF4y2Ba突变体单株穗数较高，粒长较长，千粒重较野生型增加。gydF4y2Ba

异质三聚体G蛋白突变体的耐受性gydF4y2Ba

然后，我们检测了异质三聚体G蛋白突变体的耐旱、耐寒和耐盐性(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.由于独立突变株系表型变化相似，我们仅对每个异质三聚体G蛋白使用1号转基因株系进行耐受性调查。在耐旱调查中gydF4y2Barga1gydF4y2Ba和gydF4y2Badep1gydF4y2Ba与野生型相比，突变体表现出更强的抗旱性gydF4y2Bargb1gydF4y2Ba，gydF4y2Bargg1gydF4y2Ba，gydF4y2Bargg2gydF4y2Ba，gydF4y2Bags3gydF4y2Ba,gydF4y2Baggc2gydF4y2Ba突变体由于干旱也表现出类似的缺陷。在冷冻处理试验中gydF4y2Bargb1gydF4y2Ba和gydF4y2Baggc2gydF4y2Ba突变体比野生型更敏感gydF4y2Barga1gydF4y2Ba和gydF4y2Badep1gydF4y2Ba在盐度处理下，所有异三聚体突变体的耐盐性均比野生型增强，其中异三聚体突变体表现出更强的耐盐性gydF4y2Bags3gydF4y2Ba和gydF4y2Badep1gydF4y2Ba突变体。综上所述，异质三聚体G蛋白可能参与多种应激反应机制。gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

异质三聚体G蛋白突变体的耐受性。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaWT和异质三聚体G蛋白突变体的非处理控制。gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba这些植物在干旱、寒冷和盐胁迫下的照片。gydF4y2BaegydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba干旱、寒冷和盐度处理后的存活率。条形= 10cm， *表示在5%水平显著gydF4y2Ba

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大米中的超大Gα蛋白gydF4y2Ba

生物信息学分析表明，推测有4种超大Gα蛋白(gydF4y2Bapxlg1-4gydF4y2Ba)编码水稻基因组中的基因(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.然后我们产生了四种突变体gydF4y2BapxlggydF4y2Ba基因(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.这四个gydF4y2BapxlggydF4y2Ba与野生型相比，突变体表现出较早的开花表型(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.的gydF4y2Baplxg1gydF4y2Ba突变体的穗数较野生型短，粒数较野生型长gydF4y2Bapxlg1gydF4y2Ba与WT相比显著增加。gydF4y2Bapxlg2gydF4y2Ba和gydF4y2Bapxlg3gydF4y2Ba与WT相比，gydF4y2Bapxlg1gydF4y2Ba籽粒长比WT长，千粒重增加。两个独立的转基因系gydF4y2Bapxlg2gydF4y2Ba千粒重差异不大gydF4y2Bapxlg2-1gydF4y2Ba千粒重显著降低，而千粒重则显著降低gydF4y2Bapxlg2-2gydF4y2Ba与野生型相比，有相似的1000粒重gydF4y2BapxlggydF4y2Ba突变体(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.在干旱处理中，gydF4y2Bapxlg4gydF4y2Ba与野生型和其他三种相比，表现出更强的抗旱性gydF4y2BapxlgsgydF4y2Ba．在冷冻处理中，gydF4y2Bapxlg4gydF4y2Ba与野生型相比，在盐度处理下表现出更好的耐冷性gydF4y2BapxlgsgydF4y2Ba表现出更强的耐盐性，尤其是gydF4y2Bapxlg3gydF4y2Ba和gydF4y2Bapxlg4,gydF4y2Ba具有比WT更大的耐冷性，gydF4y2Bapxlg1,gydF4y2Ba和gydF4y2Bapxlg2gydF4y2Ba．随后，我们利用酵母双杂交分析方法调查了pxlg是否与水稻中的RGB1相互作用。结果表明，RGB1与PXLG2相互作用，而与PXLG1、PXLG3和PXLG4不相互作用(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

表3目的基因突变的T0植株百分比gydF4y2Ba
全尺寸表gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba
装具gydF4y2Ba

大米中的特大型Gα蛋白。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba大肠杆菌特大型G蛋白的系统发育分析gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba而在大米中，相同且保存完好的残留物用不同的颜色表示。gydF4y2BabgydF4y2Ba推测的超大Gα蛋白在水稻中的示意图表示。黑色箭头表示sgRNA所在的位置。gydF4y2BacgydF4y2BaCRISPR/Cas9基因编辑产生的超大Gα蛋白突变体的序列gydF4y2Ba

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图5gydF4y2Ba
figure5gydF4y2Ba

推测的特大型Gα蛋白对植株结构、穗大小、粒大小和产量构成的遗传效应。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba推测的特大型Gα蛋白突变体的整个植物。条= 10厘米。gydF4y2BabgydF4y2Ba推测的超大Gα蛋白突变体的圆锥花序。条形= 1厘米。gydF4y2BacgydF4y2Ba推测的超大Gα蛋白突变体的颗粒。条形= 1厘米。gydF4y2BadgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba推测的特大型Gα蛋白突变体的株高、抽穗次数、穗数、每穗粒数、千粒重和结实率。*表示在5%水平显著gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba
figure6gydF4y2Ba

推测的特大型Gα蛋白突变体的耐受性。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaWT和推测的超大Gα蛋白突变体的非处理控制。gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba经过干旱、寒冷和盐胁迫处理的植物的照片。gydF4y2BaegydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba干旱、寒冷和盐胁迫后的存活率。条= 10厘米。*表示在5%水平显著gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba
图7gydF4y2Ba
figure7gydF4y2Ba

RGB1与pxlg的相互作用。在酵母双杂交试验中，RGB1被用作猎物(AD)， pxlg被用作诱饵(BD) (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)在自激活试验和酵母双杂交试验中的相应位置。gydF4y2BabgydF4y2Ba结果采用自激活试验和酵母双杂交试验。将两个含有AD或BD结构的质粒导入酵母菌株中，在缺乏Leu和Trp的选择培养基上培养转化子。pGBKT7-p53 + pGADT7-T为阳性对照，pGBKT7-p53 + pGADT7-LaminA为阴性对照gydF4y2Ba

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讨论gydF4y2Ba

异质三聚体G蛋白参与了许多生物学过程。以往的研究表明，异三聚体G蛋白突变体表现出多种表型变化。的空突变体gydF4y2BaRGA1gydF4y2Ba基因在水稻中表现出严重的矮化表型[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，而表达的下调gydF4y2BaRGA1gydF4y2Ba基因导致半矮化表型[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．微阵列分析gydF4y2BaRGA1gydF4y2Ba显示,gydF4y2BaRGA1gydF4y2Ba可能参与多种非生物胁迫的调控，如干旱、盐度、耐热和耐寒性[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．在干旱期间,gydF4y2Barga1gydF4y2Ba突变体植株的气孔导度高于野生型，但两种基因型单位叶面积蒸腾失水率相同[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．最近的一项研究表明gydF4y2BaRGA1gydF4y2Ba可以调节水稻的光保护和光回避[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．的gydF4y2BaCOLD1gydF4y2Ba基因调控水稻抗寒性研究进展[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]．我们的研究证实了gydF4y2BaRGA1gydF4y2Ba表现出严重的矮化表型，在干旱、低温和盐胁迫下表现出耐受性。的抑制gydF4y2BaRGB1gydF4y2Ba导致节间和层间关节区矮化和褐变[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba的零突变体gydF4y2BaRGB1gydF4y2Ba在ZH11的遗传背景下是致命的[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．我们的研究还表明gydF4y2Bargb1gydF4y2Ba导致植株结构矮化，穗长短于野生型gydF4y2Bargb1-1gydF4y2Ba和gydF4y2Bargb1-2gydF4y2Ba具有温和的等位基因gydF4y2BaRGB1gydF4y2Ba因为3-bp和6-bp的缺失没有引起帧移位。过度的gydF4y2BaRGG2gydF4y2BaCRISPR/Cas9突变体在珍山97背景下的生长增强，节间延长，千粒重和植株生物量增加，单株产量增加[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]．然而,gydF4y2Bargg2gydF4y2Ba在Sasanishiki基因背景下，CRISPR/Cas9基因编辑的植物表现出与WT相似的表型(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.有趣的是，突变体gydF4y2Bargg1gydF4y2Ba表现为生长增强，与gydF4y2Bargg2gydF4y2Ba珍汕97突变体的遗传背景(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这些结果证明了两者gydF4y2BaRGG1gydF4y2Ba和gydF4y2BaRGG2gydF4y2Ba可能是水稻植物生长的调节者。最近的分子研究发现了两个非典型的Gγ亚基gydF4y2BaDEP1gydF4y2Ba和gydF4y2BaGS3gydF4y2Ba为主要数量性状位点(qtl) [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．一些研究发现gydF4y2BaGS3gydF4y2Ba作为粒长、粒宽、粒重的主要QTLgydF4y2BaDEP1gydF4y2Ba与密集直立的穗和增加的粒数相对应的[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]．我们的研究表明gydF4y2Bags3gydF4y2Ba能显著增加籽粒长度，而gydF4y2Badep1gydF4y2Ba籽粒长度显著降低。的gydF4y2Badep1gydF4y2Ba突变体的穗短于野生型，但每穗粒数显著增加。另一个非典型Gγ蛋白基因的突变，gydF4y2BaGGC2gydF4y2Ba，并没有表现出在gydF4y2Bags3gydF4y2Ba和gydF4y2Badep1gydF4y2Ba突变体。穗粒大小和结实率均受到影响gydF4y2Baggc2gydF4y2Ba突变体。我们的研究还表明gydF4y2Bargb1gydF4y2Ba，gydF4y2Bargg1gydF4y2Ba，gydF4y2Bargg2gydF4y2Ba，gydF4y2Bags3gydF4y2Ba和gydF4y2Badep1gydF4y2Ba突变体的头部发育明显早于WT，这一结果在以前的研究中没有报道。本研究观察到的早期抽穗期表型表明，G蛋白信号可能参与了植物抽穗期的控制网络。gydF4y2Ba

近年来，人们建立了一个“自抑制”模型来解释功能突变体的增益gydF4y2Badep1gydF4y2Ba和gydF4y2Bags3gydF4y2Ba．假设c端结构域抑制了非标准g - γ蛋白的n端结构域[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．虽然c端和n端区域都被认为参与了蛋白质相互作用，但观察到的自抑制的分子机制gydF4y2BaGS3gydF4y2Ba和gydF4y2BaDEP1gydF4y2Ba仍然难以捉摸(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．作为gydF4y2BaDEP1gydF4y2Ba在水稻G蛋白的研究和水稻育种中起着至关重要的作用，已经进行了大量利用CRISPR/Cas9技术的研究来验证其功能gydF4y2BaDEP1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]．的gydF4y2BaDEP1gydF4y2BaCRISPR / Cas9 gene-edited植物以消除c端展示每穗粒数的增加,降低株高、穗长、长度和谷物,和一个直立穗架构,而植物失去了Gγ和cys-rich域显示减少凝固速度和每穗粒数。此外，我们注意到被截断的部分gydF4y2Badep1gydF4y2Ba在遗传背景下，农垦57和武运粳8号的每穗粒数也有所下降[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]．这些结果暗示了被截断的部分gydF4y2Badep1gydF4y2Ba在不同的遗传背景下，等位基因对每穗粒数有相反的影响。本研究表明，剔除g - γ结构域和富胱氨酸结构域的突变体每穗粒数增加。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.Li等生成了在c端截断长度不同的3个株系gydF4y2BaDEP1gydF4y2Ba采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，3个品系表现出相似的粒级表型变化[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．综上所述，我们假设这两种类型gydF4y2BaDEP1gydF4y2Ba等位基因(消除G - γ和富半胱氨酸结构域的等位基因和只消除富半胱氨酸结构域的等位基因)可以增加每穗粒数，但由于遗传背景的不同，可能会产生相反的效果，水稻异质三聚体G蛋白信号转导可能存在复杂的遗传网络。gydF4y2Ba

大粒Gα蛋白的研究gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba已经证明异三聚体XLG-Gβγ蛋白在植物异三聚体G蛋白信号转导中具有额外的信号转导机制[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]．然而，的功能gydF4y2BaXLGsgydF4y2Ba在水稻基因组中还不清楚。生物信息学分析表明，推测有4个超大Gα蛋白编码基因(gydF4y2BaPXLG1-4gydF4y2Ba)在水稻基因组中。我们制造了四种突变体gydF4y2Bapxlg1-4gydF4y2Ba使用CRISPR / Cas9突变体。所有的四个gydF4y2BapxlggydF4y2Ba突变体的抽穗期明显早于野生型，在产量构成和耐受性等方面均有不同的表型变化。由于酵母双杂交分析表明RGB1只能与PXLG2互作，我们预期突变体gydF4y2Bapxlg2gydF4y2Ba与其他突变体相比，能产生明显的农艺变化gydF4y2BaPXLGsgydF4y2Ba．然而，突变体gydF4y2Bapxlg2gydF4y2Ba在4个突变体中表现出一般的表型变化gydF4y2BapxlgsgydF4y2Ba的突变体gydF4y2Bapxlg1gydF4y2Ba穗长和粒数变化较大，突变体gydF4y2Bapxlg4gydF4y2Ba表现出较其他突变体更强的耐受性gydF4y2BaPXLGsgydF4y2Ba．这些结果表明，PXLG2可能通过与RGB1的直接互作，参与了产量组分和耐胁迫性的调控。然而，四种pxlg之间的相互作用还需要进一步研究。gydF4y2Ba

Yield是植物中由异三聚体G信号调节的一系列关键性状中最新的一项[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．通过组合不同的G蛋白变异，粒长可减少35%或增加19%，粒重可减少40%以上或增加28% [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]．本研究在相同遗传背景下构建了异质三聚体G蛋白突变体。研究了异质三聚体G蛋白对产量组成和抗逆性的调控作用。我们发现gydF4y2Bags3gydF4y2Ba和gydF4y2Badep1gydF4y2Ba突变体在产量构成和耐受性方面均表现出理想的表型。的gydF4y2Bapxlg4gydF4y2Ba与野生型相比，突变体表现出相似的产量构成，但耐受性增强，单株籽粒产量为17.38±0.99 ggydF4y2Bapxlg1-1gydF4y2Ba和gydF4y2Bapxlg1-2gydF4y2Ba分别为29.96±1.59 g和28.88±0.95 g。因此,gydF4y2Bapxlg1gydF4y2Ba在本试验条件下，PXLG1的单株产量可提高69%，表明PXLG1在水稻高产育种中具有潜在的应用价值。综上所述，G蛋白信号调控的结果可能会提高水稻和其他作物的产量和抗逆性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术生成了1个Gα、1个Gβ和5个Gγ突变体。生物信息学分析表明，推测有4个超大Gα蛋白编码基因(gydF4y2BaPXLG1-4gydF4y2Ba)在水稻基因组中。考察了产量组成和应力耐受性。结果表明，异质三聚体G蛋白参与了产量组成和耐受性的调节。酵母双杂交实验表明PXLG2可能与RGB1互作。这些发现不仅提高了我们对水稻异质三聚体G蛋白库的认识，而且有助于异质三聚体G蛋白在水稻育种中的应用。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

CRISPR/Cas9载体构建与植物转化gydF4y2Ba

该实验是在日本广告的基因背景下进行的gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba品种Sasanishiki。Sasanishiki的种子(JP编号:5354)是从NARO (Tsukuba, Japan)的Genebank项目订购的。根据Genebank的标准物质转移协议，Genebank的种子可以用于科学研究和教育。为了进行CRISPR/Cas9基因编辑，我们进行了之前研究中描述的载体构建[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]．我们按照前面描述的方法进行了水稻转化[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]．从突变体植株中提取基因组DNA，利用设计靶点侧翼的引物对进行PCR扩增。200-500 bp的PCR产物采用简并序列译码法直接测序[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]．本研究使用的引物在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

田间试验gydF4y2Ba

2018年在沈阳农业大学试验场(N41°，E123°)进行了田间试验。除外，每个异质三聚体G蛋白制备了两个独立的转基因品系gydF4y2Bargg2gydF4y2Ba它只有一个转基因品系。4月24日播种突变体和WT种子，5月23日移栽(每山一苗)。本研究采用3个重复的随机区组设计。地块长5.4米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba120株，间隔30厘米× 15厘米。栽培方法和田间管理如前所述[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]．在成熟期(抽穗期后35天)，每个转基因株系采24株地上部。根据上述数据计算每穗粒数和籽粒灌浆率。gydF4y2Ba

压力承受力调查gydF4y2Ba

将填充充分、均匀的WT和突变体水稻种子用70% (v/v)乙醇洗涤30 s，然后用无菌水洗涤3次。播种后3周进行胁迫处理。为了测试耐冷性，每个基因型27株幼苗在2-4℃下处理72 h。随后，他们被转移到一个温控温室(30°C白天/22°C晚上)进行恢复。在干旱处理中，每个基因型的27株幼苗在温室(30°C昼/22°C夜)脱水胁迫下持续10 d，直到观察到胁迫反应的变化。然后我们添加了水用于恢复。我们在温室中比较了WT和纯合子突变体植株的耐盐性，将3周龄植株分别用新鲜地下水和0.75% NaCl溶液(pH = 7)处理。处理2周后，用新鲜地下水处理植株进行回收。恢复2周后测定生存率。每一行复制三次。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

使用SPSS 13.0进行统计分析(SPSS, Chicago, IL, USA)，并使用Student 's进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba检验和双向方差分析(ANOVA)。数值为3次重复的平均值±标准差(SD)，图中以星号或不同字母表示0.05水平上的显著差异。gydF4y2Ba

酵母2台混合动力分析gydF4y2Ba

利用媒质双杂交系统(Clontech)进行酵母双杂交实验。RGB1和4个pxlg的编码序列用引物进行扩增gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．将获得的片段分别克隆到PGADT7和PGBKT7中。酵母双杂交试验的细节已在其他地方描述[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通信作者在合理的要求。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

CRISPR:gydF4y2Ba

成簇的有规律的间隔短回文重复gydF4y2Ba

PXLG:gydF4y2Ba

推测为超大G蛋白gydF4y2Ba

QTL:gydF4y2Ba

数量性状位点gydF4y2Ba

SD:gydF4y2Ba

标准偏差gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

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    中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba

  42. 42.gydF4y2Ba

    关键词:粳稻，qPE9-1等位基因，穗直度，渐渗，单株产量中国基因工程杂志。2011;38(5):217-23。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba

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    关键词:水稻，穗直度，qPE9-1，数量性状，株型，驯化遗传学。2009;183(1):315 - 24。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba

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    Chakravorty D, Gookin TE, Milner MJ, Yu Y, Assmann SM。特大型G蛋白扩展了拟南芥异三聚体G蛋白信号转导的亚基库。植物杂志。2015;169(1):512 - 29。gydF4y2Ba

    PubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba中科院gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba

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    关键词:水稻，抽穗期，CRISPR/Cas9，繁殖过渡，产量构成acta photonica sinica, 2019;132(6): 1887-96。gydF4y2Ba

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    农杆菌介导水稻转化的研究进展。Nat Protoc。2006;1(6):2796。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba

下载参考gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(no . 2017YFD0100500)资助。创始机构在研究的设计、收集、分析和数据的解释以及手稿的撰写中没有作用。gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

  1. 崔悦和南江对这项工作贡献相当。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

  1. 沈阳农业大学水稻研究所，辽宁沈阳110866gydF4y2Ba

    崔悦，徐正进，徐全gydF4y2Ba

  2. 沈阳市现代农业研发服务中心，沈阳110866gydF4y2Ba

    南姜gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba
  1. 悦崔gydF4y2Ba
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  2. 南姜gydF4y2Ba
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  3. Zhengjin徐gydF4y2Ba
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  4. 关丽珍徐gydF4y2Ba
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贡献gydF4y2Ba

Q.X.和Z.X.设计了本研究，并对项目的原始概念做出了贡献;Y.C.和N.J.进行了大部分实验;Q.X.写了这篇论文。所有作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba关丽珍徐gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

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额外的文件1。gydF4y2Ba

本研究中使用的引物gydF4y2Ba

权利和权限gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

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崔勇，姜楠，徐志强。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba异质三聚体G蛋白参与调控水稻的多种农艺性状和抗逆性。gydF4y2BaBMC植物杂志gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba90(2020)。https://doi.org/10.1186/s12870-020-2289-6gydF4y2Ba

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关键字gydF4y2Ba

  • 大米gydF4y2Ba
  • Heterotrimeric G蛋白质gydF4y2Ba
  • CRISPR / Cas9gydF4y2Ba
  • 产量构成gydF4y2Ba
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