棉花是棉醇生物合成和积累的主要来源

背景

棉酚是一种特殊的次生代谢物Gossypium.物种。它不仅在棉花植物的开发和自我保护方面发挥着关键作用，也可用作重要的抗癌和男性避孕化合物。然而，由于人类的棉酚和单胃动物的毒性，棉籽的消费有限。迄今为止，关于棉花植物中的Gossypol代谢很少。

结果

在这项研究中，我们发现子叶是种子萌发阶段的胶质醇的主要来源。但此后，它主要来自发展根源。覆盖着玻璃和无柔性棉花以及向日葵砧木和棉田，揭示了棉醇主要在棉花植物根系中合成。既有腺体和无柔性棉状根都有棉糖生物合成的能力。但是茂物腺体的主要储存颜料腺体对糖kypol生物合成具有间接影响。根系和无根幼苗的体外培养证实了根系中的强烈糖ky型生物合成能力和幼苗其他器官中的相对较弱的糖型生物合成能力。携带型Gossypol生物合成途径中涉及的关键基因的表达分析也支持根系作为Gossypol生物合成的主要器官。

结论

本研究表明，无论是有腺棉还是无腺棉，根系都是棉酚的主要来源，而其他器官合成棉酚的能力相对较弱。棉酚的生物合成与色素腺的表达无关，但色素腺的存在对棉酚的积累至关重要。这些发现不仅可以阐明棉酚代谢的复杂调控网络，而且可以加速作物育种进程，具有更高的商业价值。

棉花（Gossypium.SPP。）是世界上最重要的经济作物之一。棉花不仅为纺织业生产天然纤维，还提供大量含有高质量蛋白质和油的棉籽[1］．据估计，每千克纤维产率加上1.65千克棉籽，其含有约21％的油和23％蛋白[2］．但是，由于棉酚存在，棉籽不能直接使用，对人类的有毒物质和单一动物[3.］．另一方面，Gossypol在棉花植物的自我保护中发挥着重要作用[4.那5.那6.］．

1938年，Adams等人通过一系列经典研究首次确定了Gossypol的特征[7.］．它是一种多酚醛，其构成20-40％的颜料腺体重量，占整个棉籽内核的0.4-1.7％。作为一种植物α素，Gossypol为害虫和病原体提供了组成型和诱导抗性[8.那9.那10.那11.那12.那13.］．此外，棉酚还可作为抗癌剂[14.那15.那16.]抗细菌[17.那18.]男性避孕试剂[19.那20.那21.］．Gossypol的两种不同的对映体，（+） - 甘蓝和（ - ） - 甘蓝型。基于先前的研究，（ - ） - 八曲面的生物活性强于（+） - gossypol [22.那23.那24.］．另外，当它们用作家禽饲料时，棉籽中的对映异构体的比例可能会影响家禽生产[25.］．

棉酚生物合成途径的几个关键基因已被鉴定和表征，如萜烯合成酶基因、GhTPS1和GhTPS2[26.),而HMG1.和HMG2.编码异戊二烯生物合成途径的限制酶[27.］．其他主要基因通常作为基因家族存在的Gossypol生物合成途径包括cad 1-一种那cad 1-C2.[28.]和CDN1.-C4[29.］．此外，gacyp706b1.为半糖酚生物合成的关键酶- cadinene-8-羟化酶[30.］．GaWRKY1，一种参与倍半萜生物合成调控的转录因子，影响倍半萜的表达CAD.-1，也被确定了[31.］．最近的一项研究表征了八曲薄膜生物合成途径下游的四个关键基因[32.］．在分子生物学的巨大进展中，基因转化，病毒诱导的基因沉默（Vigs）和Crispr / Cas9系统已被应用于研究棉花特征[2那33.那34.］．这些分子工具与其他遗传和生理的方法共同提供了一个很好的机会来剖析复杂的内在机制棉酚代谢。

在棉花植物中进行颜料腺和棉醇含量之间的明显关系非常重要。Punit等。发现不同的基因型对颜料腺体的分布产生了影响[35.］．棉花棉酒含量与颜料腺体的基因型密切相关。Singh和Weaver提出，与颜料腺体数量高度相关的Gossypol含量高度相关[36.]，除了Gossypium somalense huntch，种子中几乎没有棉酚，但有正常的色素腺[37.］．沉默CYP706B1，Gosypol生物合成途径的关键基因，MA等人。发现棉醇含量显着下降，但颜料腺体仍然形成为正常植物，并通过Vigs消除颜料腺体导致糖蛋白含量大大衰落[33.］．因此，棉酚与颜料腺之间的关系有关，但仍不清楚，需要更多的研究来澄清。

了解八曲面的新陈代谢对于用具有更广泛利用潜力的低棉酚种子开发棉花品种至关重要。然而，只有很少的研究才能阐明八脂醇的生物合成和运输。史密斯提出，基于体外根培养，以棉根培养合成棉毒药[38.]，但尚未报道其他组织是否也有合成棉酚的能力。明确棉花植物中参与棉酚合成和运输的组织器官，不仅对了解棉酚的合成机理具有重要意义，而且有助于通过遗传修饰选育出棉酚含量低的棉花新品种。

在目前的研究中，通过使用“棉花植物中的棉花棉植物的生物合成和运输棉花植物中的棉花和颜料腺体的关系，以及不同器官和无忧无虑的棉花的棉酚生物合成的能力植物嫁接，器官培养和基因表达分析方法，这可能会为科学家找到一些有用的信息，以操纵棉花植物中的Gossypol生物合成，并在棉籽中没有八脂醇在没有棉醇的情况下开发新的棉花品种。

Gossypol在腺体和无柔性棉幼苗的器官中改变

两对近等基因系(NILs)， CCRI17(腺系)与CCRI17W(无腺系)和Coker 312(腺系)与Coker 312 W(无腺系)，在温室中种植。对其幼苗不同时期根系、子叶和叶片中的棉酚含量进行分析(图2)。1)．

在子叶中，蜡烛棉中的棉醇含量总是高于各个阶段的无腺液中的含量。具体地，在种子萌发阶段，与其相应的Glandless Nils，CCRI17W（0.011 mg / g）和Coker 312 W（0.008 mg / g）。在随后的阶段，CCR117和Coker 312中的棉酚含量逐渐减少。在第三个真叶阶段，它们的高曲润含量分别降低至0.345和0.528 mg / g。然而，Gossypol含量随着CCRI17W（0.116mg / g）的第一个真叶阶段的峰值增加，并且在克洛伊克312w（0.177mg / g）中的第二真叶阶段。

同样，腺体叶片中的棉醇含量远远高于其无腺的尼尔。它随着植物开发而增加，并在两对二对的第二个真叶阶段达到峰值。然而，Glandless Nils叶片中的棉醇内容始终低。The peak contents were 0.007 and 0.004 mg/g for CCRI17W and Coker 312 W, respectively. While the peak contents were 0.130 and 0.102 mg/g for CCRI17 and Coker 312, respectively, which were 18 times higher than their glandless NILs.

一种t the seed germination stage, the gossypol contents in the roots of CCRI17 and Coker 312 were 0.986 and 0.768 mg/g, respectively, which were much higher as compared with their glandless NILs, CCRI17W (0.153 mg/g) and Coker 312 W (0.023 mg/g). With the growth of seedlings, the gossypol contents in roots were increased and reached the peak levels at the first true-leaf stage in all four genotypes. At the peak stage, the differences of gossypol contents between the glanded and glandless NILs were not significant, implying that the biosynthesis and accumulation of gossypol in glandless cotton roots were as strong as their glandled NILs. The general trends of root gossypol contents, for both the glanded and glandless genotypes, were significantly increased from seed germination to the first true-leaf stage and then remain unchanged or slightly decreased from the first true-leaf to the third true-leaf stage (Fig.1)．

植物嫁接

为了探讨根系系统对棉酚生物合成的影响，进行了不同组合的腺体（压盖棉或玻璃棉）和砧木（覆盖，无孔或向日葵）（附加档案1：图S1）。

所有带棉花和棉砧木的接枝组合都产生了棉籽的正常植物。然而，具有棉花区和向日葵砧木组合的接枝植物在2周后疲软并且除了来自棉花清晰度的再生根部之外的2周后死亡。

嫁接在腺体和无缘无卤棉花之间

测量叶片和种子中的颜料腺体的大​​小和密度，并在接枝和正常植物之间进行比较（附加文件2：表S1）。在正常压盖的植物中观察到颜料腺体尺寸和密度的显着差异，接枝的腺体间隙，带有腺体或无腺砧木。类似于正常的膀胱植物，在嫁接的膀胱间隙上没有观察到颜料腺体，含有腺体或腺体砧木。

棉籽中棉酚的含量在正常植株、自嫁接植株和不同色素腺砧木嫁接植株之间存在较大差异。自嫁接棉籽中棉酚的含量在4个基因型中均无显著差异。2），表明嫁接对棉醇含量没有影响。然而，对于使用优势无毛棉（CCRI17W）作为砧木的接枝组合，棉花糖棉花TM-1间隙中的棉毒含量明显低于自接枝和正常的TM-1棉籽中的棉毒含量。与正常的TM-1棉籽相比，（+） - 甘蓝型，（ - ） - 棉酚和（±） - 葡萄球菌的含量分别下降25.76,20.96和24.05％（图。2一种）。在从隐草型棉花（Coker 312 W）砧木和TM-1间隙的接枝组合中收获的棉籽中观察到类似的现象，（+） - 甘蓝型，（ - ） - 甘蓝和（±） - 葡萄球型下降的含量下降分别为16.18,10.97和15.34％（图。2b）与正常棉籽相比。相反，当玻璃棉花TM-1用作砧木时，来自接枝的腺体植物的棉籽具有显着高于其自嫁接和正常植物的棉籽含量高。与正常的棉籽相比，CCRI17W的棉籽中（+） - 棉酚，（ - ） - 棉酚和（ - ） - 棉酚和（±） - 葡萄糖和（±7.95％和10.45％（图。2c），虽然分别为31.39,58.46和43.16％，分别在Coker 312 W的棉籽中（图。2d)。

向日葵和棉花压盖之间的嫁接

为了进一步探讨棉根系合成棉酚的能力，我们在无法合成Gossypol的向日葵砧座上接枝着腺体棉花间（TM-1）。由于物种的分离，棉间隙仅在向日葵砧木上存活只有大约2周，除了那些具有再生根的平台（附加文件3.：图S2）。

分析了（±）胶囊中的动态变化叶片叶片。在移植当天，分别（+） - 棉酚，（ - ） - 棉酚和（±） - 谷物和（±） - 0.320和0.684mg / g的含量分别为0.364,0.320和0.684mg / g。接枝后四天，两间隙的（±） - 葡萄球型的含量显着降低，并且没有再生根部（图。3.），然后在没有再生根的情况下继续减少阴分。接枝后12天，与日期相比，在没有再生根部的阴分中的（+） - 甘蓝型，（ - ） - 棉酚和（±） - 吡哆醇和（±） - 吡啶醇的含量显着降低36.00,62.81和48.56％0（图。3.一种）。相比之下，从嫁接后的第4天至第12天从接枝后，增加（+） - 甘蓝醇，（ - ） - 甘蓝和（±） - 叶片在与再生根的叶片中的葡萄球菌和（±） - 达到达到的第0天的水平（图。3.B）。

在体外培养的器官的糖k醇变化

为了进一步研究根源在棉酚生物合成中的作用，我们将两对液体的牙芽幼苗分成了两部分：根和无根幼苗（包括子叶和幼杆子），分开培养它们（附加文件4.：图S3），并在培养后的0,2,4,8,12和16天中测量它们的胃蓬喉含量。

Glanged CCRON，CCRI17和Coker 312的根部中的初始糖型含量分别为0.986和0.768 mg / g。在开始（孵化后2天），它们的八曲面含量分别降低了46.06和32.22％，然后始终如一地增加。在16天的文化中，分别增加2.72和3.22折（图。4.一种）。然而，两个Glandless膳食的根中的初始棉花内容物，CCR111110和Coker 312 W分别仅为0.033和0.023mg / g。在整个培养期间对两种基因型观察到随后的增加。在16天的培养时，它们的糖型含量分别增加了133.47和100.42倍，几乎高于其腺体的NIL（图。4.B）。这些结果强烈提出了Gossypol生物合成在两个腺体和无缘无卤棉花中的能力。

一些离体培养的无根苗分别在有腺和无腺的NILs中培养4天和8天左右产生再生根。研究了两种类型(有再生根和没有再生根)幼苗棉酚含量的动态变化。5.)．无再生根系的棉花幼苗中棉酚含量比有再生根系的棉花幼苗中棉酚含量下降更显著(图2)。5.a和b)。相比之下,幼苗的棉子酚内容在4天后文化、棉子酚的内容与再生苗的根文化后16天(CCRI17)和58.06%下降到49.39%(312年Coker),虽然这non-regenerated根(CCRI17)和25.51%下降到23.67%(科克312)。无腺NILs的棉籽酚含量在整个培养过程中不断增加。两种类型幼苗的棉酚含量在再生前培养初期(8天)不存在差异。但此后(8-16 d)，有再生根的幼苗棉酚含量比无再生根的幼苗显著增加。最后，再生根系幼苗的棉酚含量约为未再生根系幼苗的两倍(图3)。5.C和D）。这些结果表明，棉状根部是Gossypol生物合成的主要位置，但其他器官也可能具有相对较弱的生产棉酚的能力。

我们进一步测量了在体外培养根和无根幼苗中的Gossypol异构体的变化（附加文件5.:表S2和附加文件6.：表S3）。在整个培养期内（+） - 酸葡萄球和（ - ） - 棉酚和（ - ） - 棉酚中的比例大约一个培养期6.一种）。然而，对于体外培养的无根幼苗，（+） - 甲脂醇和（ - ） - 幼苗中的棉酚的比例高于再生根的幼苗的比例高于再生根部（图。6.b).由此推断，根系产生的棉酚为外消旋型棉酚，而其他器官产生的棉酚为光学型棉酚。

Gossypol生物合成途径中关键基因的表达模式

量化CCRI17、CCRI17W、Coker 312、Coker 312 W和tm1中参与棉酚生物合成途径关键基因的表达水平(图1)。7.)．

在Gossypol生物合成途径的上游，HMGR被认为是最重要的酶之一[27.］．相应的编码基因，HMG1.和HMG2.，在五种基因型的根系系统和表达水平的根系中高度表达HMG2.在所有测试的组织中，在腺体上较高，而不是无腺植物。帧/秒法尼基焦磷酸生物合成基因在根中表达量最高，其次是真叶。的最高表达水平CAD1-A.也在所有基因型的根系中观察到。CAD1-A.种子根的表达量高于次生根。棉酚生物合成途径下游的一个关键基因CYP706B1[30.]那也显示出在根系统中表达量最高。相似HMG2.， 两个都CAD1-A.和CYP706B1在腺体中的表达水平更高，而不是每种组织中的无腺的含量。此外，WRKY1.，与Gossypol生物合成相关的转录因子[31.]，表现出在子叶和茎中的高表达水平，然后是根。这些结果表明，所有关键基因，除外WRKY1.在棉酚生物合成途径中，棉酚在根中表达量较高，在叶中表达量较低。因此，种子根可能是棉酚生物合成的主要器官，而叶片在棉酚生物合成中的作用非常有限。

我们的研究结果表明，与无气体的零相比，所有基因在腺体上确定了腺体中的更高表达水平，而主导和隐性的腺体脱离的基因表达略有不同。

Gossypol是棉花植物生长和发展中最重要的二级代谢产物之一[39.那40］．然而，在棉籽棉酚含量高限于棉籽，含有丰富的石油和蛋白质的广泛利用。因此，当务之急是要更好地了解棉酚代谢。通过对棉酚含量，植物嫁接，器官培养和表达谱动态分析，棉酚合成和积累，揭示本研究。

特定的次生代谢产物在相应的植物开发中发挥关键作用[41.］．据报道，八曲脂可以促进体细胞的分化，并且灵气植物从体细胞显示出更好的再生率[42.］．在我们的器官培养结果中，棉酚含量较高的无根腺苗产生不定根的时间明显早于无根腺苗产生不定根的时间，这表明棉酚在根系再生中发挥了一定的作用。

Gossypol生物合成的机制已明白很差。此前，史密斯表明棉酚生物合成基于在体外培养切除的根[38.]，但它并没有表现出其他植物器官是否也将在棉酚的生物合成的能力。在这项研究中，通过棉花嫁接和器官培养，发现棉酚主要是合成根系统，而其他器官有棉酚生物合成能力较弱，并且，无论是压盖和无腺体的根系统具有很强的能力，合成棉酚虽然该压盖棉花根系均高于低酚棉的能力更强。此外，棉花和向日葵之间嫁接证实，再生根能够合成棉酚是再运到树叶。参与根中棉酚合成比其他器官的关键基因的表达水平越高的大力支持棉酚主要产于压盖和低酚棉厂双方的根系。此外，表达谱结果还表明，在棉酚生物合成途径的所有关键基因表达的水平在叶相对较低，这表明叶可能有能力较弱合成棉酚。另外，在种子根更高的基因表达水平比在次生根可能表明，具有更强的生物合成棉酚比其他类型的根的能力的种子根。

棉花棉花棉酒的运输仍不清楚。以前的研究表明，涂曲醇被运输并储存在颜料腺体中[43.］．我们在子叶、根和叶3个组织中观察到的结果表明，腺状NILs根系中棉酚含量可能是由子叶原位生物合成、积累和/或运输的结果。而对于无腺的NILs，棉酚可能只在根中合成，然后转运到子叶、叶等器官。在种子萌发阶段，棉酚的主要来源是子叶。在子叶扁平化阶段，根系开始合成和积累棉酚。后期，棉酚主要在根中合成积累，并逐渐转移到其他器官。有腺和无腺的棉酚含量因色素腺的存在和缺失而有较大差异。有腺植物的棉酚含量远高于无腺植物，因为有腺植物的色素腺是棉酚的库。没有这样的库可能会减少棉酚从根部向其他器官的移动，或者可能会导致棉酚运输后的分解。基于我们目前的研究结果和之前发表的文章[38.]，这可能说明有腺植物中的棉酚主要在根中合成，然后运输到子叶等器官，最终储存在色素腺体中。而无腺棉花中的棉酚主要在根系中合成和积累，但由于色素腺体中储存不足，只能将部分棉酚运输到其他器官或分解。

我们的嫁接实验表明，主导和隐性的膀胱无百合的含量没有差异对糖葡萄球含量的影响很小。有人建议，Gosypol途径的生物合成和积累与显性和隐性膀胱基因无关。此外，向日葵砧木的嫁接实验进一步说明了棉麻在棉酚生物合成中的重要性。然而，根据Gossypol在无源幼苗中对根部再生的关键作用，Gossypol是否对促进根部再生过程中的反馈效果在棉花，向日葵仍不清楚。因此，棉醇在棉花增长和发展中的确切作用需要进一步调查。

棉酚和颜料腺之间的关系是独立的，有关的。根据基因沉默的证据，据报道，Gossypol生物合成和颜料腺体形成不能直接耦合[33.］．它们由不同的分子机制控制，但抑制颜料腺体的形成对八孔的生物合成和积累进行了反应作用。此外，使用关键基因的RNAi来破坏棉籽组织中的Gossypol生物合成，有人提出，Gossypol生物合成的降低对颜料腺体的表达有影响[2］．此外，来自澳大利亚的几种野生棉质物种的延迟腺体形态发生特征那在种子萌发后形成的颜料腺体，然后出现了八葡萄球[44.那45.］．结果表明，只有在颜料腺体形成后才能累积。我们的接枝实验表明，无曲润含量可能会发生变化，而不会改变颜料腺体的表达，表明八曲面生物合成和颜料腺体形成的途径彼此独立。我们还证明，两个腺体和腺体根系具有令人兴奋的Gossypol生物合成能力，这表明糖k型生物合成与颜料腺的表达没有紧密相关。但是，没有颜料腺体，无法储存八曲面。因此，适当的解释是甘蓝醇是要储存的材料，颜料腺是储存的组织。需要进一步调查以阐明甘白和颜料腺之间的复杂关系。

早期的研究表明，（ - ） - 甘蓝型生物活性比（+） - gossypol [22.那23.那24.]，只有（ - ） - 甘蓝型对动物有毒[11.那12.］．因此，通过降低（+） - 令人毛骨和（ - ） - 棉酚的比例而不改变Gossypol的总量，可以增加用作反刍动物或非反刍动物饲料的棉籽量。根据我们的器官文化的结果，我们发现没有再生根，（ - ） - 棉醇含量速度比（+） - 八曲面较快，同时用再生根，（ - ） - 棉醇含量几乎相同（+） - Gossypol。与器官培养的结果结合，根源产生相同量的（+） - gossypol和（ - ） - 八孔和无根幼苗产生更多（+） - gossypol而不是（ - ） - gossypol，据推测根源产生外消旋Gossypol和其他器官产生光学糖平型。这些发现可能有助于澄清用于光学活性棉酚的生物合成的主要器官，但需要进一步的研究来研究（+） - 酸葡萄球和（ - ） - 棉花植物中的特异性作用以及如何在遗传上改变它们的比例。

在目前的研究中，首先使用不同器官的嫁接和培养来研究八曲润的代谢，这可能适用于研究其他代谢物。根据先前报道的复合合成[46.那47.，同位素标记和跟踪技术可用于监测荷尼醇生物合成和运输的位置。此外，随着Gossypol的可能性是一种药物[19.那20.那21.[体外器官培养物可以为制药行业生产糖平醇提供一种新的方法。

我们的研究表明，棉酚主要在有腺和无腺的棉花根系中合成，而其他器官的棉酚生物合成能力也较弱。棉酚的生物合成与色素腺的表达没有直接关系，但色素腺的存在对棉酚的积累至关重要。棉根产生的棉酚主要是外消旋的，其他器官则合成具有光学活性的棉酚。这些发现不仅揭示了棉酚代谢的复杂调控网络，而且将加速棉花育种进程，提高其商业价值。

植物材料和抽样

两双有腺体和无柔性旱地棉花（陆地棉L.) near isogenic lines, CCRI17 vs CCRI17W and Coker 312 vs Coker 312 W, and the genetic standard upland cotton line, TM-1, were used in the experiments. CCRI17 was developed by Institute of Cotton Research of CAAS, and Coker 312 and TM-1 were given by USDA-ARS, College Station, Texas, USA, and they were all deposited in National Cotton Germplasm Medium Bank. CCRI17W and Coker 312 W were developed by our lab and deposited in Cotton Germplasm Bank of Zhejiang University. CCRI17 and Coker 312 were glanded cottons, while CCRI17W and Coker 312 W were glandless cottons. The glandless phenotypes of CCRI17W and Coker 312 W were controlled by dominant gene (2）和隐性基因（GL₂和GL_3.）， 分别。所有材料均受浙江大学的自我施肥。颜料腺体位于蜡烛棉的根，芽，叶和种子中。向日葵（Helianthus Annuus.L.）用作本研究中的砧木材料的品种Sandaomei（SDM）由吉林省农业科学院，并沉积在吉林省农业科学院的种质银行。

所有植株材料在浙江大学温室内，采用28±2℃、自然光照条件下的盆栽育苗(蛭石:营养土壤= 1:1)。每3天灌一次水。

植物嫁接

用两只真叶的幼苗用作区间和砧木。通过改进的树皮移植的方法接枝在Glandless棉砧木（CCRI17W和CCRI17W和CORTOK 312 W）和向日葵砧木（SDM）上嫁接了压盖棉。同样地，阴茎棉间隙，CCR117W和Coker 312W也嫁接在压盖棉砧木（TM-1）上。

在浇水土壤中嫁接后，用塑料袋覆盖，在28±2℃下生长。大约4天后，在覆盖幼苗的塑料袋上打了4个小洞，用于交换气体。两周后，将覆盖幼苗的塑料袋取出，幼苗恢复正常生长。

与向日葵砧木的植物棉花的真实叶子从第12天取样，并在收获阶段进行了成熟的棉籽（假期后45天）。将所有样品立即在液氮中冷冻并储存在-80℃，以测定古类含量。

体外器官文化

无菌水洗涤两次3分钟，然后用70％的醇（每次3分钟）消毒两次，然后在汞氯化物中灭菌10分钟，最后在无菌水中洗涤五次（每次2分钟）．核在MS培养基上发芽。当种子根达到2厘米的长度（附加文件4.：图S3A），从体外切割根（约1厘米），用于根培养的幼苗（附加文件4.:图S3D)，离体培养无根苗(附文件)4.：图S3B）。

在体外用于根培养的培养基含有宏观营养物和MS基本培养基，维生素和有机材料的1/2微量营养物，含有100mg / L肌醇，1mg / L的烟酸，10 mg / L.维生素B1，1 mg / L维生素B6,20 mg / L蔗糖和0.125mg / L的IBA。将大约0.8％的琼脂用作固体材料，将培养基的pH调节至6.4。根培养的生长条件为14/10小时夜间间隔，光强度为2000毫升，平均温度为28±2°C。

除了培养基中的微小变化之外，培养物中的无源幼苗培养物是类似的，其中使用MS基本培养基，维生素和有机物质，0.1mg / l in in和20mg / l蔗糖．

在第0天，将培养的根和无源幼苗在体外取样。将所有样品在液氮中立即冷冻并储存在-80℃，以测定棉酚含量。

棉酚确定

棉酚映异构体通过高效液相色谱法（HPLC）进行测定。Standard gossypol solution was prepared by dissolving 0.01 g of HPLC-grade (±)-gossypol in 10 mL of acetonitrile. And then 0.001, 0.002, 0.005, 0.050, 0.100, 0.200, 0.500, 0.800, 1.000, 2.000 and 3.000 mL standard (±)-gossypol solutions were added into 2 mL derivative reagents containing 2% D-alaninol, 10% acetic acid and 88% acetonitrile, which function to created separable gossypol stereoisomers on reverse column. Then they were water bathed at 75 °C for 45 min and adjusted to 10 mL using acetonitrile for 0.05, 0.10, 0.25, 2.50, 5.00, 10.00, 25.00, 40.00, 50.00, 100.00 and 150.00 mg/L serial standard (+)-gossypol and (−)-gossypol preparations. These preparations were performed on HPLC to create the calibration curves for (+)-gossypol and (−)-gossypol measurement.

所有样品在30°C下干燥至恒重，用研磨机研磨成粉末，并在−80°C下储存。每样取0.10 g悬浮于2ml衍生试剂中形成样品溶液。样品溶液用水在75°C下浸泡45分钟。样品悬浮液通过定量滤纸过滤，然后用0.45 μm注射器过滤器过滤(Agela，纽瓦克，美国)。沉淀物用乙腈洗三次。本程序完成后，用乙腈将提取物调至10 mL，用于待测样品的制备。

在Agilent 1100（Agilent，Santa Clara，USA）上进行了HPLC分析，配备了自动取样器和UV检测。A C18列（250毫米×4.6毫米，5μm，迪克马，里士满山，美国）被置于固定阶段。流动相由乙腈/ 0.2％H组成_3.宝_4.（75/25，v / v）。注射体积为10μL，流速为1.0ml / min。UV检测器设定为238nm，温度为25℃。在三种技术重复中测量了Gossypol准备。（+） - 甘蓝和（ - ） - 棉酚的保留时间分别为10分钟和13.75分钟。

图像分析

用数码相机通过Olympus解剖显微镜(德国LEICA MZ95)观察叶片色素腺体并拍照。用Image Pro Plus (V6.0)软件测量图像中色素腺体的密度和大小。

定量RT-PCR

真正的叶子，子叶，种子根，二次根和茎在第二个真叶阶段的棉花植物中取样，具有三个生物重复。将所有样品立即在液氮中冷冻并储存在-80℃。使用总RNA提取套件（中国AIDLAB，中国）提取每个样品的RNA。在制造商方案之后，使用转肌型单步GDNA去除和cDNA合成超混（Transgen Biotec Co. Ltd.）合成第一链cDNA。用底漆5.0软件设计QRT-PCR的引物。实验中使用的所有引物都列在附加文件中7.:表S4和棉花UBQ7用作内部控制。使用SYBR预混物EXAQ（Takara）用Limbrix 96系统（Roche）进行QRT-PCR的扩增反应，下列参数：30秒在95°C下初始化变性;然后在95℃下在54℃下的10 s变性的45个循环，10s在54℃下退火，20s在72℃下延伸。此外，选择了熔化曲线级的默认设置。通过2的方法计算相对表达水平^——ΔΔCt．用MEV 4.0软件生成用于表达配置文件的热线图。

统计分析

SPSS20.0进行（±） - 葡萄球含量和颜料腺体的统计分析。数据表示为平均值±站立偏差（SD）和值P. < 0.05 andP.< 0.01分别认为有统计学意义和极显著性。

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。

我们感谢张（浙江大学，中国）进行实验援助，穆罕默德Daud Khan博士（Kohat科技大学，巴基斯坦）进行手稿审查。

该研究工作由中国国家重点技术研发计划资助中国（2016年FD01404），中国农业研究系统（CARS-18-25），江苏省现代作物生产的协作创新中心，以及USDA-ARS 3091-21000-044-00d。

隶属关系

1. 浙江大学农学系，杭州，浙江310058

   天伦赵，钱文谢，巩li，程莉，雷梅，金虹陈＆水金朱

2. USDA-ARS，南部平原农业研究中心，大学站，TX，77845，美国

   John Z. Yu.

贡献

SZ，JC和JZY构思了研究计划，收集了棉花加入并监督并促进了写作;TZ设计并进行了大部分实验，分析了数据并起草了手稿。Col和QX在体外，植物嫁接和QRT-PCR中提供了在器官培养中的技术援助;CHL和LM有助于分析结果并修改稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

对应于Shuijin朱．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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