QTL定位和转录组分析鉴定甜玉米果皮厚度调控候选基因gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

近年来，中国甜玉米种植面积迅速扩大。已经出现了一些产量高、适应性好的新品种。然而，通过培育果皮厚度较薄的品种来改善食用品质性状，迄今尚未实现。果皮厚度是一个复杂的性状，是决定甜玉米食用品质的关键因素。利用遗传作图与转录组分析相结合的方法，鉴定控制果皮厚度的候选基因。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

目的:鉴定甜玉米BC果皮厚度新的数量性状位点gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba利用M03(循环亲本)和M08(供体亲本)两个甜玉米系，建立了148个群体。此外，构建了包含3876个SLAF标签的高密度遗传连锁图谱，用于定位果皮厚度qtl。有趣的是，检测到14个与果皮厚度相关的QTL, 1个稳定的QTL (gydF4y2BaqPT10-5)gydF4y2Ba这解释了7.78-35.38%位于10号染色体上的表型变异(144,631,242-145,532,401)。在靶区发现42个候选基因gydF4y2BaqPT10-5gydF4y2Ba．此外，在这42个基因中，有5个基因(gydF4y2BaGRMZM2G143402gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRMZM2G143389gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRMZM2G143352gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRMZM6G287947gydF4y2Ba,gydF4y2BaAC234202.1_FG004gydF4y2Ba转录组分析显示，两个亲本之间存在差异表达。根据基因注释信息，三个基因可能被认为是果皮厚度的候选基因。gydF4y2BaGRMZM2G143352gydF4y2Ba和gydF4y2BaGRMZM2G143402gydF4y2Ba分别标注为AUX/IAA转录因子和ZIM转录因子，而gydF4y2BaGRMZM2G143389gydF4y2Ba已标注为脂肪酸出口2，叶绿体。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究确定了甜玉米薄果皮品种的主要QTL和候选基因，为该品种的图谱克隆和进一步的功能研究奠定了基础。gydF4y2Ba

甜玉米是一种玉米衍生的蔬菜作物，通过一个或几个隐性胚乳突变，减少淀粉的合成，增加糖或其他短链多糖的积累。中国甜玉米的种植面积迅速增加。近年来，出现了一些产量高、适应性好的新品种。然而，迄今为止，通过培育果皮厚度减小的品种来改善食用品质性状尚未实现。甜玉米的仁嫩度、脆度和残留率是评价甜玉米食用品质的重要指标。果皮的厚度和结构与这三个品质性状密切相关。薄果皮柔软度高，脆度高，残率低，口感好[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。玉米果皮由不易消化的纤维素组成，既没有营养也不易消化，果皮的厚度影响甜玉米的嫩度。因此，选择较薄的果皮在甜玉米品质育种计划中非常重要。降低果皮厚度已成为提高甜玉米食用品质的重要育种目标。gydF4y2Ba

玉米果皮厚度遗传特征具有较高的狭义遗传力(55 ~ 82%)，涉及加性效应、显性效应和显著上位效应[j]。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。8个杂交中与果皮厚度相关的有效基因数平均为3.3个，范围为1.4 ~ 5.9个[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。迄今为止，尚未发现具有主要影响(> 25%)的单一基因。Haddad研究表明，玉米杂交种的细胞层数与其母本相同，而果皮厚度的差异是由于杂交种细胞壁增厚所致，说明玉米果皮的厚度受到母基因和核基因的双重影响[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。Tracy和Schmidt分析了7种不同胚乳组成不同的甜玉米近等基因系的果皮厚度[gydF4y2Ba含糖的gydF4y2Ba（gydF4y2Ba苏)gydF4y2Ba，gydF4y2Ba无趣的gydF4y2Ba（gydF4y2Ba杜gydF4y2Ba），gydF4y2Ba蜡状gydF4y2Ba（gydF4y2Ba的天气gydF4y2Ba），gydF4y2Basugary-2gydF4y2Ba（gydF4y2Ba俗gydF4y2Ba),gydF4y2Bashrunken-2gydF4y2Ba（gydF4y2Bash2gydF4y2Ba)]用压力千分尺测定果皮厚度，发现胚型、胚乳型、近交互作胚乳、穗和测量位置对果皮厚度有显著影响[j]。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。Helm和Zuber的研究表明，果皮厚度的窄遗传力为0.80，果皮厚度受3 ~ 8个半显性、上位性和加性基因的控制[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。ITO和Brewbaker研究表明，果皮厚度受2-5个半显性基因控制[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。因此，利用分子方法可以更容易地鉴定和分析控制果皮厚度的基因位点及其遗传效应。gydF4y2Ba

据我们所知，关于玉米果皮厚度连锁图谱的研究很少。例如，利用限制性片段长度多态性(RFLP)标记在染色体片段替代系(CSSL)群体中鉴定了8个影响甜玉米果皮厚度的染色体片段[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。Wang和Brewbaker利用94个玉米重组自交系，鉴定出位于1、2和6号染色体上的三个果皮厚度qtl [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。利用100个SSR标记检测到41个与果皮厚度相关的qtl。主成分分析表明，由8个qtl组成的第一个主成分可解释87.60%的果皮厚度表型变异，可用于薄果皮玉米品种的选育[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。Choe和Rocheford TR还发现，在糯玉米作图面板上，一些控制果皮厚度的qtl与穗性状qtl存在重合，这可能是由于果皮厚度与穗性状高度相关所致[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。利用两种遗传模型检测到8个果皮厚度qtlgydF4y2Ba_1gydF4y2BaFgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba人口。利用复合区间作图(CIM)方法鉴定出3个果皮厚度qtl，分别解释了8.6、16.0%和7.2%的表型变异。基于混合模型的CIM (mixed model-based CIM, MCIM)方法，检测到果皮厚度的5个qtl [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。尽管进行了这些研究，但迄今为止还没有克隆出果皮厚度基因。这些遗传图谱通常具有低标记密度，这使得难以覆盖整个基因组，从而使QTL分析变得困难。下一代测序(NGS)技术使检测覆盖整个基因组的大量SNP标记成为可能。特定长度扩增片段测序(slf -seq)，最早由Sun等人开发。[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，已广泛用于高密度基因图谱的构建，如棉花[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，葡萄[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]和黄瓜[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。与传统分子标记相比，遗传作图中标记的分布密度影响作图的准确性，密度越高，作图越准确。此外，slf -seq还克服了传统标记费时费力的缺点。因此，slf -seq被认为是开发高稳定性和特异性分子标记的一种经济有效的技术。gydF4y2Ba

目前，品鉴是育种家对甜玉米品种进行综合评价的常用方法。该方法虽然直接实用，但其缺点是主观性强，表型不准确，给基因克隆带来困难。目前，随着基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白质组学、表观基因组学、基因组学等多组学技术的快速发展，为探索参与果皮厚度形成的基因提供了新的机遇。转录组学已被证明是大规模鉴定某些作物物种(包括水稻)中与特定性状相关的基因的有力工具[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，玉米[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，小麦[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，大麦[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]和棉花[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。迄今为止，还没有关于果皮厚度的RNA-seq研究的报道;因此，结合连锁分析和转录组分析，开发了一种更有效的鉴定果皮厚度相关基因的方法。目的鉴定控制甜玉米果皮厚度的基因，了解甜玉米果皮厚度发育的遗传基础。在本研究中，我们构建了一个BCgydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba群体使用两个不同果皮厚度的甜玉米自交系。因此，我们的目标是:1)通过连锁定位定位果皮厚度qtl; 2)基于互补转录组学分析提出这些qtl的候选基因。这些结果可为薄果皮甜玉米育种提供分子标记，并为甜玉米品质改良和产业化提供理论依据。gydF4y2Ba

表型分析gydF4y2Ba

公元前148年果皮厚度的表型资料gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba于2014年、2015年和2016年秋季采集人口及其父母二人。如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba果皮厚度在两亲本间存在显著差异。与‘M08’自交系相比，父本‘M03’自交系的果皮厚度较低。BC的果皮厚度gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba种群分布范围为30.63 ~ 104.21 μm，呈连续分布。偏度和峰度分别为0.78 ~ 1.23和1.17 ~ 2.29，广义遗传力(gydF4y2BahgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba3年和跨年的差异为0.66 ~ 0.73(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.BC的果皮厚度分布gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba结果表明，果皮厚度是一个典型的由多基因控制的数量性状，果皮厚度的分离近似于正态分布。在卑诗省表现出连续的分布和明显的海侵分离gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba种群，表明双亲对果皮厚度的等位基因均有贡献。gydF4y2Ba

在3年的评估中观察到性状之间的正相关(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表1)。3年的果皮厚度相关系数显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)，且在gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.756至0.915。说明不同环境下果皮厚度是稳定的。gydF4y2Ba

BC主要果皮厚度qtl的鉴定gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba人口gydF4y2Ba

公元前148年的DNAgydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba人群被送到生物标志物公司进行SLAF测序。共获得163961个SLAF标签，其中双亲的覆盖深度为42.15gydF4y2Ba×gydF4y2Ba，后代平均测序深度为5.47×。为了提高遗传图谱的质量，按照Zhu的方法对SLAFs进行筛选:1)亲本序列深度< 10×;2)完成度< 30%;3)部分分离显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01);双亲杂合[4]gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

对原始SLAF标签进行过滤后，共得到3876个snp。根据玉米自交系B73参考基因组(版本3)中SLAF标记在染色体上的位置，将其划分为10个连锁群(LGs)。gydF4y2Baftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-24/fasta/zea_mays/dna/gydF4y2Ba）.利用JoinMap4.1软件获得连锁群中标记的线性排列，并估计相邻标记之间的遗传距离。最后构建了总图谱距离为2413.25 cM的遗传图谱。地图上标记物的数量为3876个，标记物之间的平均地图距离为0.62 cM(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。gydF4y2Ba

基于构建的遗传连锁图谱，对BC果皮厚度的表型进行了分析gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba采用QTL作图分析2014年、2015年和2016年的种群数量及其3年的平均值。在BC中共定位了14个与果皮厚度有关的qtlgydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba人口跨越3年。qtl分布在玉米染色体1、5、6、7和10上。2014年，在1号和10号染色体上发现7个与果皮厚度相关的QTL，单个QTL解释的表型变异范围为3.36% ~ 7.78%。在5、6、10号染色体上鉴定出3个控制果皮厚度的qtl，占2015年表型变异的26.32%。两个qtl (gydF4y2BaqPT7gydF4y2Ba和gydF4y2BaqPT10-5gydF4y2Ba)分别位于7号和10号染色体上，对果皮厚度负责，解释了2016年表型变异的21.76%。基于3年平均果皮厚度检测到2个qtl，分别解释了3.22%和35.38%的表型变异。一个稳定的gydF4y2BaqPT10-5,gydF4y2Ba该基因位于901.2 kb (chr10: 145,172,996-145,532,401)区域，3年均有鉴定，3年平均，可解释7.78 ~ 35.38%的不同年间表型变异。这一发现表明gydF4y2BaqPT10-5gydF4y2Ba是控制甜玉米果皮厚度的稳定主位点区间(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;表格gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.根据参考基因组注释信息，该区域内有42个基因gydF4y2Baqpt10-5gydF4y2Ba被发现。gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Ba

目的:鉴定…的差异表达基因(DEGs)gydF4y2BaqPT10-5gydF4y2Ba以两亲本授粉后19天的果皮(DAP)进行转录组测序。对M03和M08系(每个样品5个重复)在第19个DAP时的果皮进行了扫描电镜(SEM)分析，M03和M08的平均果皮厚度分别为111.27±9.19 μm和176.90±13.86 μm(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.对M03和M08进行RNA测序，获得了43.98 Gb的总核苷酸数据。试验采用3个独立的生物重复。自交系M03共获得49,153,314 ~ 54,655,798个reads，其中67.77 ~ 69.94%定位于B73参考基因组(版本3)。自交系M08共获得51,359,308 ~ 54,932,698个reads, 70.06 ~ 70.46%定位于B73参考基因组(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba表S3)。显著的高相关性(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S4)在两个生物重复之间观察，揭示了重复样本之间稳定的表达谱。在本研究中，M03与M08共鉴定出4381个deg (|fold change|≥2,FDR < 0.01)。其中，在M03系中，2318个基因表达上调，2063个基因表达下调。gydF4y2Ba

基于基因本体的富集分析采用阈值(FDR < 0.01)来评估deg的主要生物学功能(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.将这些基因进一步分为生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)三大类。BP类别包含了GO注释的一半(18,418;50.96%)，其次是CC类别(12,965;35.87%)和MF类(4757;13.17%)。在生物过程类别中，以半胱氨酸生物合成过程、盐胁迫响应、镉离子响应、刺激响应、高尔基体组织响应、含氧化合物响应、缺水响应、缺氧响应、脱落酸响应和氧脂素生物合成过程为代表。在细胞成分类别中，细胞核、顺式高尔基网状膜、高尔基体、内质网、细胞外周、质膜锚定成分、细胞质膜结合囊泡、Smc5-Smc6复合物、细胞质溶胶和细胞壁代表了大多数亚类别。在分子功能方面，许多基因被划分为蛋白质结合、营养库活性、碳水化合物衍生物转运蛋白活性、香叶基反式转移酶活性、蛋白质同型二聚化活性、prunasin -葡萄糖苷酶活性、4-甲基伞形菊- β - d -葡萄糖苷-葡萄糖苷酶活性、esculin -葡萄糖苷酶活性和纤维素糖葡萄糖苷酶活性亚类。gydF4y2Ba

KEGG富集分析显示(FDR < 0.01)，这些基因主要位于植物激素信号转导、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解和脂肪酸降解途径中(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

候选基因预测gydF4y2Baqpt10-5gydF4y2Ba基于转录组分析gydF4y2Ba

42个候选基因gydF4y2Baqpt10-5gydF4y2Ba区域与转录组测序鉴定的deg进行比较。在42个基因中，有18个基因在转录组测序中被发现gydF4y2Ba6gydF4y2Ba表5)。只有五个基因，gydF4y2BaGRMZM6G287947gydF4y2Ba，gydF4y2BaAC234202.1_FG004gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRMZM2G143402gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRMZM2G143352gydF4y2Ba和gydF4y2BaGRMZM2G143389gydF4y2Ba，在M03和M08系之间差异表达(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.基因注释表明gydF4y2BaGRMZM2G143352gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRMZM2G143402gydF4y2Ba,gydF4y2BaGRMZM2G143389gydF4y2Ba可能是控制果皮厚度的候选基因。在这些基因中，gydF4y2BaGRMZM2G143352gydF4y2Ba和gydF4y2BaAC234202.1_FG004gydF4y2Ba在M08线上调，而gydF4y2BaGRMZM2G143389gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRMZM6G287947gydF4y2Ba,gydF4y2BaGRMZM2G143402gydF4y2Ba在M08系列中被下调为了确认转录组测序结果，选择这些基因进行qRT-PCR验证。正如预期的那样，通过qRT-PCR获得的5个选定基因的表达模式与转录组测序获得的表达模式相似(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.此外，对这3个基因在M03和M08系中的全长型进行了测序。gydF4y2BaGRMZM2G143352gydF4y2Ba与M03相比，M08在起始密码子和编码序列前缺失了一个CGCG和ACCTCG序列。虽然编码序列是一样的，gydF4y2BaGRMZM2G143402gydF4y2BaM08的启动子中插入了一个362 bp的序列，其中包含一个PIF-Harbinger转座子(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.gydF4y2BaGRMZM2G143389gydF4y2Ba与M03相比，M08系的启动子中有CCGCTCA的副本(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S2)。这三个基因的变异可能导致两个亲本之间果皮厚度的差异。这些结果可能有助于精细映射gydF4y2BaqPT10-5gydF4y2Ba基因座，需要进一步的实验来确定功能基因和确定果皮厚度差异的原因。gydF4y2Ba

slf -seq方法的特点gydF4y2Ba

与其他结合限制性内切酶酶切的测序技术(如基因型测序和限制性位点相关DNA测序)相比，SLAF-seq是通过对特定长度的扩增片段进行测序来测量的，具有更好的重复性。探索大量稳定可靠的分子标记是构建高密度遗传图谱的关键步骤。一旦基因组被限制性内切酶消化，选择正确的片段进行测序将更好地代表基因组。在本研究中，SLAF标记总数超过52万个，多态性标记数量为31582个。这是传统分子标记难以达到的结果。此外，所有的标记覆盖了整个基因组，这保证了最终定位的准确性。代表性差、完整性不足的标签和偏倚分离标签可以过滤掉。所有这些有益的特性简化了基因组测序，证明了该技术在遗传作图中的优越性。另一方面，由于标记数量多、群体复杂等因素，测序结果也增加了作图分析的难度和挑战。虽然连锁图谱的构建及其在普通玉米中的应用已经得到了广泛的应用[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，很少有关于甜玉米全基因组遗传图谱的研究发表。本研究为后续甜玉米遗传研究提供参考。gydF4y2Ba

果皮厚度QTL定位结果与其他研究的比较gydF4y2Ba

随着分子生物技术和生物信息学的迅速发展，植物基因定位取得了长足的进展。先前的研究表明，总共在公元前190年gydF4y2Ba_1gydF4y2BaFgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用不同果皮厚度的两个品种杂交的家系作为作图群体。8个qtl与果皮厚度相关，分别位于染色体1、2、3、5、6和8上[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。此外，264 F检测到33个qtlgydF4y2Ba_2:3gydF4y2Ba这些位点分别位于第1、2、3、4、8、9和10号染色体上[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。本研究在前人研究结论的基础上，以上腹部果皮厚度为代表，确定甜玉米果皮厚度。最后，在第10染色体上发现了一个主要的QTL位点，可以解释7.78 ~ 13.84%的不同年份表型变异。根据与检测QTL相同的数据估计QTL解释的表型方差，这可能导致RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba向上偏置的数值[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。在染色体中，有10条染色体具有最频繁的连锁标记。该结果与Yu等人的结果不同，但与Choe和Rocheford的结果相似[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。结果发现，定位在同一染色体上的基因座通常与其前身相邻。因此，染色体可能具有与前几代相同的主要基因位点。gydF4y2Ba

候选基因分析gydF4y2Ba

GRMZM2G143352gydF4y2Ba是AUX/IAA转录因子，gydF4y2BaGRMZM2G143402gydF4y2Ba是一个ZIM转录因子，而gydF4y2BaGRMZM2G143389gydF4y2Ba是叶绿体脂肪酸输出2蛋白。这两个gydF4y2BaGRMZM2G143352gydF4y2Ba和gydF4y2BaGRMZM2G143402gydF4y2Ba是否与植物激素信号转导有关gydF4y2BaGRMZM2G143389gydF4y2Ba与脂肪酸降解途径有关，这与KEGG富集分析的结果一致(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.此外，这三个基因的全长序列在M03和M08系之间存在差异。这三个基因的变异可能导致两个亲本之间果皮厚度的差异。gydF4y2Ba

GRMZM2G143352gydF4y2Ba是一种AUX/IAA转录因子，介导植物对生长素的许多方面反应[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。大多数Aux/IAAs的功能主要由功能获得突变等位基因定义gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。两种不同类型的转录因子参与生长素信号的调控，AUX/IAAs和生长素反应因子(ARFs)。ARFs通过其保守的dna结合域(DBD)直接结合生长素应答基因启动子区域的生长素应答元件。当生长素水平较低时，AUX/IAA蛋白与arf结合，阻止生长素应答基因的表达。高水平的生长素通过SCF促进AUX/IAAs的泛素化和降解gydF4y2Ba^{TIR1 /空军基地gydF4y2Ba}和26s蛋白酶体，导致生长素反应基因被ARFs激活[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。这些应答基因可能与果皮发育有关。gydF4y2Ba

我们知道生长素处理可以促进AUX/IAA基因的表达[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。我们发现gydF4y2BaGRMZM2G143352gydF4y2BaM08的生长素含量高于M03，说明M08的生长素含量可能高于M03。生长素是重要的细胞周期调节剂[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。生长素水平影响细胞生长，降低吲哚-3-乙酸(IAA)浓度，促进烟草BY-2细胞伸长，但对细胞分裂无影响。然而，较高的IAA浓度可加速细胞分裂，抑制细胞伸长[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。这些发现与我们的结果一致(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

GRMZM2G143402gydF4y2Ba是一种ZIM转录因子，是玉米中JA(茉莉酸)的抑制因子[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。JA信号调节植物的生长、发育和防御反应。JAZ(茉莉酸ZIM结构域)转录抑制因子直接结合到茉莉酸应答基因上。在没有JA ((3R,7S)-茉莉烯基- l-异亮氨酸)信号的情况下，JAZ通过抑制JA信号应答转录因子的转录活性来调节JA介导的应答[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。当JA信号出现时，JA受体特异性与JAZ结合，导致JAZ泛素化并被蛋白酶体降解，解除JAZ对JA转录调控的抑制，引起生理变化[j]。gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。JA通过调节气孔发育，提高植物应对各种外界胁迫的能力[j]。gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。JA信号通路的一些组分可以独立参与植物气孔发育调控[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。气孔的大小和开放状态可能是造成果皮厚度差异的原因之一。gydF4y2Ba

根据基因注释，gydF4y2BaGRMZM2G143389gydF4y2Ba脂肪酸出口量是2 (gydF4y2BaFAX2gydF4y2Ba)叶绿体蛋白。植物中的脂肪酸合成发生在质体中;因此，它需要输出到细胞质和内质网进行酰基编辑和脂质组装。然而，质体脂肪酸的转运机制尚未阐明。的功能gydF4y2Ba脂肪酸输出1gydF4y2Ba（gydF4y2Bafax1gydF4y2Ba)是生物量和男性生殖能力所必需的[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba),而gydF4y2BaFAX2gydF4y2Ba功能未知。因此，如果我们能证明该基因与甜玉米果皮厚度的关系，将是非常有趣的。因此，需要更多的证据来证明这些基因在甜玉米果皮厚度中的潜在作用。gydF4y2Ba

在我们的研究中，我们创建了一个BCgydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba利用SLAF方法构建了高密度遗传连锁图谱，相邻标记间平均遗传距离为0.62 cM。基于该高密度基因组图谱，共检测到14个果皮厚度QTL，其中1个稳定QTL (gydF4y2BaqPT10-5)gydF4y2Ba在多年间检测到，这解释了7.78-35.38%的表型变异位于10号染色体上。此外，靶区的5个基因gydF4y2BaqPT10-5gydF4y2Ba转录组分析显示，在两亲本之间存在差异表达。根据基因注释信息，三个基因可能被认为是果皮厚度的候选基因。本研究确定了一个主要QTL和候选基因，可加速甜玉米果皮薄厚品种的选育，为果皮薄厚品种的图谱克隆和进一步的功能研究奠定了基础。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

选择2个甜玉米自交系M03和M08作为亲本，培育一株BCgydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba人口的映射。两条线表示不同的果皮厚度;作为母星，M03的果皮厚度较薄;作为供体亲本，M08的果皮厚度线较粗。本研究中使用的所有植物材料均由李晓琴教授(华南农业大学农学院，中国广州)慷慨提供。定位群体由148个品系组成，背景恢复率评价显示，遗传背景恢复率小于90%的品系只有8个;其余品系的回收率均在90%以上，最高回收率为99.99%，平均背景回收率为95.91%。这些结果表明了BC的遗传背景gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba人口基本与受赠父母相同。gydF4y2Ba

2014年、2015年和2016年秋季在华南农业大学增城实验基地(东经约113°，北纬约23°)种植了2个亲本148个品系。2017年种植的两株亲本用于转录组测序。采用随机完全区组设计。每个系或亲本培养10株，2个重复。行长3 m，行距70 cm。株距25 cm，密度5.7万hmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．作物管理和病虫害防治是按照当地建议进行的。gydF4y2Ba

2017年，在田间采集了两亲本的3个自花授粉穗，并在授粉后19天立即放置在冰上。每穗中部采集10粒。果皮的上腹部部分在冰上剥离，保存在液氮中用于扫描电镜分析。gydF4y2Ba

表型数据收集gydF4y2Ba

冷冻切片法gydF4y2Ba

从每只耳朵上取下十个完整的果仁放在冰上。每个籽粒顶部用秃镊剪去约3mm，然后放入液氮中浸泡3 s。冷冻样品用于组织切片的制备。我们取了大约100 μm厚的背胚横切面。这个过程是在解冻之前完成的，以确保果皮不会脱落。然后迅速将切片放在载玻片上。解冻后，KI-IgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba加入试剂3 s，盖上盖盖后用水洗去染料。每粒果皮厚度用千分尺测量。将各基因型三穗果皮厚度的平均值作为果皮厚度的观测值，用于后续分析[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

表型数据分析gydF4y2Ba

表型数据采用SPSS version 19 (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)进行分析。利用线性混合模型估计各年份基因型和环境的方差成分:ygydF4y2Ba_{伊尔gydF4y2Ba}=gydF4y2BaμgydF4y2Ba+gydF4y2BargydF4y2Ba_lgydF4y2Ba+gydF4y2BafgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba+gydF4y2BaεgydF4y2Ba_{伊尔gydF4y2Ba}，利用混合模型估计基因型和环境在3年内的方差成分gydF4y2Ba_ijlgydF4y2Ba=gydF4y2BaμgydF4y2Ba+gydF4y2BaegydF4y2Ba_jgydF4y2Ba+gydF4y2BargydF4y2Ba_{lgydF4y2Ba（gydF4y2BajgydF4y2Ba）gydF4y2Ba}+gydF4y2BafgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba+ (gydF4y2Ba菲gydF4y2Ba）gydF4y2Ba_ijgydF4y2Ba+gydF4y2BaεgydF4y2Ba_ijlgydF4y2Ba,在那里gydF4y2BaμgydF4y2Ba是果皮厚度的均值，gydF4y2BafgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba是遗传的影响吗gydF4y2Ba我gydF4y2Ba线,gydF4y2BargydF4y2Ba_lgydF4y2Ba是复制的效果，gydF4y2BaεgydF4y2Ba_{伊尔gydF4y2Ba}为残差，gydF4y2BaegydF4y2Ba_jgydF4y2Ba是对环境的影响gydF4y2BajgydF4y2Ba环境，(gydF4y2Ba菲gydF4y2Ba）gydF4y2Ba_ijgydF4y2Ba是遗传和环境的相互作用，gydF4y2BargydF4y2Ba_{lgydF4y2Ba（gydF4y2BajgydF4y2Ba）gydF4y2Ba}环境中复制的影响是什么gydF4y2BaεgydF4y2Ba_ijlgydF4y2Ba为残差[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。SAS软件(Release 9.4;采用SAS Institute, Cary, NC)得到各果皮厚度性状的方差成分。gydF4y2Ba

广义遗传力(gydF4y2BahgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)，以下列公式计算:gydF4y2Ba\ ({h} ^ 2 ={\σ}_g ^ 2 / \离开({\σ}_g ^ 2 +{\σ}_z ^ 2 / r \) \)gydF4y2Ba，和gydF4y2Ba\({h}_b^2 \)gydF4y2Ba跨年的估算公式如下:gydF4y2Ba\ ({h} _b ^ 2 ={\σ}_g ^ 2 / \离开({\σ}_g ^ 2 +{\σ}_{通用电气}^ 2 / e +{\σ}_z ^ 2 / re \右),\)gydF4y2Ba在哪里gydF4y2BaσgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba是基因变异，gydF4y2BaσgydF4y2Ba_zgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba为残差，r为重复次数，gydF4y2BaσgydF4y2Ba_{通用电气gydF4y2Ba}^2gydF4y2Ba是基因型与环境的相互作用，gydF4y2BaegydF4y2Ba和gydF4y2BargydF4y2Ba表示每个环境中的环境数和复制数[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

文库建设和高通量测序gydF4y2Ba

从父母和BC中提取了基因组DNAgydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方案的种群[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。采用Illumina HiSeq™2500测序仪进行DNA测序。在对参考基因组的限制性内切酶位点进行分析后，选择Hpy166II内切酶来消化基因组DNA。slf -seq策略和图书馆建设的详情已在上文[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

序列数据的分组和基因分型gydF4y2Ba

特定长度扩增片段(SLAF)标记按照Sun等人描述的程序进行鉴定和基因分型。[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]， Zhang等。[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。过滤掉低质量的reads后，使用BWA软件将剩余的reads映射到参考基因组[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。相似度大于95%的序列被定义为相同的slf。所有与亲本和子代一致的多态SLAF标记进行基因分型。gydF4y2Ba

所有SLAF标记物经过四次过滤，并按照Sun等人的描述进行质量评估。[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。简而言之，snp小于3且平均测序深度大于3的标记被视为高质量的SLAF标记。利用这些标记构建高密度遗传图谱。gydF4y2Ba

联动图构建gydF4y2Ba

缺失基因型的归算采用基于双亲和BC的k近邻算法gydF4y2Ba_4gydF4y2BaFgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba人口(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。根据Zhang等人描述的程序构建了一个链接图。[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。详细地说，使用高图策略对连锁组中的SLAF标记进行排序[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]和SMOOTH策略[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。使用多点最大似然法将这些倾斜标记添加到连锁图中[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。利用kosambi作图函数估计相邻标记间的遗传距离[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

QTL分析gydF4y2Ba

采用QTLNetwork v2.1软件中的复合区间作图法对果皮厚度3年和平均3年进行QTL作图[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。采用1000个排列，映射步长为1.0 cM计算LOD阈值。默认情况下，10 cM窗口，背景标记设置为5，全基因组显著性水平为gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05 [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。LOD评分> 2.0的qtl被认为是暗示性qtl [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。此外，QTL的作用模式是根据Stuber等人提出的标准确定的。gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。QTL用q来命名，用性状来缩写。此外，QTL和同一染色体上的多个QTL的染色体编号用1、2、3等来表示。本文中QTL名称以斜体表示;例如,gydF4y2Baqpt1-3gydF4y2Ba为控制果皮厚度群体中1号染色体上的第三个QTL。gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Ba

使用Plant Total RNA纯化试剂盒(TR02-150, GeneMarkbio)从果皮(第19 DAP)中分离总RNA。提取的RNA在1%琼脂糖凝胶中运行，以评估RNA的完整性。简单地说，用poly- toligo附着的磁珠富集含有poly-A rna的mRNA并进行碎片化。用随机的六聚体引物合成第二链cDNA，然后纯化、末端修复、poly-A尾和连接接头。利用biomker Technologies(北京，中国)的Illumina HiSeq 2000系统对cDNA文库进行测序，读取长度为100 bp(配对端)。试验采用3个生物重复。gydF4y2Ba

定量逆转录酶PCRgydF4y2Ba

采用定量逆转录酶PCR (qRT-PCR)验证RNA-seq结果。从每个样品中提取总RNA，并根据制造商的协议使用FastQuant RT Kit (Takara)包括gDNase逆转录成单链cDNA。采用CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)进行qRT-PCR分析，检测基因表达。所有反应在20 μl体积中进行，体积为1 μl cDNA，每个基因特异性引物0.3 μl, SsoFast evgreen Supermix Kit (Bio-Rad)。qRT-PCR按以下程序进行:94°C 1 min，然后95°C 10 s, 55°C 10 s, 72°C 15 s的40个循环。相对转录水平用2gydF4y2Ba^{−gydF4y2Ba△gydF4y2Ba△gydF4y2BaCTgydF4y2Ba}方法(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba肌动蛋白是一种管家基因。具体引物采用NCBI引物BLAST (gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/gydF4y2Ba）.每个基因的引物序列在附加文件中列出gydF4y2Ba8gydF4y2Ba(表S6)。gydF4y2Ba

本研究的所有SLAF-seq原始数据已提交至NCBI序列读取档案(SRA)数据库，登录号为PRJNA574257 (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA574257gydF4y2Ba）.原始rna测序数据存储在NCBI SRA数据库中，登录号为PRJNA605850 (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA605850gydF4y2Ba）.下载玉米参考基因组B73 RefGen_V3序列及注释文件gydF4y2Baftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-24/fasta/zea_mays/dna/gydF4y2Ba和gydF4y2Baftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-24/gtf/zea_mays/gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

论坛:gydF4y2Ba

生长素反应因子gydF4y2Ba

CIM:gydF4y2Ba

复合区间映射法gydF4y2Ba

衣冠楚楚的:gydF4y2Ba

授粉后几天gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

不同的表达基因gydF4y2Ba

FAX1:gydF4y2Ba

脂肪酸出口1gydF4y2Ba

FAX2:gydF4y2Ba

脂肪酸输出2gydF4y2Ba

FS:gydF4y2Ba

冰冻切片gydF4y2Ba

国际宇航科学院:gydF4y2Ba

Indole-3-acetic酸gydF4y2Ba

JAZ:gydF4y2Ba

茉莉酸ZIM域gydF4y2Ba

LOD:gydF4y2Ba

以10为基数的对数似然比gydF4y2Ba

QTL:gydF4y2Ba

数量性状位点gydF4y2Ba

RFLP:gydF4y2Ba

限制性片段长度多态性gydF4y2Ba

扫描电镜:gydF4y2Ba

扫描电子显微镜gydF4y2Ba

SLAF:gydF4y2Ba

特定长度扩增片段gydF4y2Ba

SNP:gydF4y2Ba

单核苷酸多态性gydF4y2Ba

苏维埃社会主义共和国:gydF4y2Ba

简单序列重复gydF4y2Ba

我们感谢biomker Technologies Corporation (Beijing, China)对SLAF测序的支持。gydF4y2Ba

本工作得到国家重点研发计划项目(批准号:2018yfd0100106)、广东省重点研究与发明计划项目(2018B020202013)和华南农业大学博士创新人才培养计划项目(CX2019N056)的资助。作者声明，任何资助机构在研究设计、数据收集和分析以及稿件准备中都没有任何作用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广东广州510642gydF4y2Ba

   吴夏明，王波，谢富贵，张丽萍，龚杰，朱伟，李小琴，冯发强，黄军gydF4y2Ba

2. 华南农业大学农学院广东省植物分子育种重点实验室，广东广州510642gydF4y2Ba

   吴夏明，王波，谢富贵，张丽萍，龚杰，朱伟，李小琴，冯发强，黄军gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

WX进行实验，分析数据，撰写论文;WB、XF、GJ进行实验;FF和HJ分析数据;WX、XF、ZL和ZW进行田间试验;LX, FF, HJ设计实验，分析数据，撰写论文。所有作者都修改了原稿。所有作者已阅读并同意稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaFaqiang冯gydF4y2Ba或gydF4y2Ba小君黄gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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