基于itraq的叶绿体蛋白质组学分析gydF4y2Ba小麦gydF4y2Ba干旱胁迫和5-氨基乙酰丙酸缓解的L.叶片揭示了几种参与光合作用保护的蛋白质gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

叶绿体蛋白的扰动是干旱胁迫下光合作用受到抑制的主要原因。外源施用5-氨基乙酰丙酸(ALA)可减轻干旱胁迫对植物的伤害，保护植物生长发育，但其调控机制尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

采用干旱处理小麦幼苗，利用基于itraq的蛋白质组学方法研究外源ALA对叶绿体蛋白质含量的影响。共鉴定出9499个多肽，可分为2442个蛋白群，FDR≤0.01。此外，干旱胁迫处理与无干旱对照相比，改变了87个叶绿体蛋白质含量，而外源ALA处理与干旱胁迫处理相比，改变了469个叶绿体蛋白质含量。基因本体论(GO)注释和京都基因与基因组百科(KEGG)分析结果表明，ALA预处理调节了一些生物通路，如代谢通路和参与光合作用的通路和核糖体通路，增强了叶绿体的抗旱性。此外，干旱促进HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba累积和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba外源ALA预处理降低了叶绿体的产量，过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性上调，这与叶绿体蛋白质组学数据一致。我们认为，ALA通过调节酶的过程促进叶绿体中活性氧(ROS)的清除。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们从叶绿体蛋白质组学的结果扩展了对外源ALA在小麦抵御干旱胁迫中的作用机制的理解。gydF4y2Ba

小麦(gydF4y2Ba小麦gydF4y2BaL.)是全球最重要的作物之一。然而，小麦植株往往在整个生长阶段遭受干旱胁迫，造成严重的生理生化损伤，从而导致产量下降[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．植物叶绿体是对干旱胁迫最敏感的组成部分之一。干旱导致叶绿体内亚单位的结构退化，如类囊体和粒粒[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，从而破坏叶绿体的光合功能。在干旱条件下，除非光合功能得到充分保护，否则小麦植株无法维持正常性能，为植株提供充足的光合产物[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

干旱胁迫下维持植物叶绿体光合功能需要叶绿体蛋白质的调节。在过去几十年的报道中，一些在干旱胁迫下维持植物叶绿体光合功能的蛋白质已经被鉴定出来。例如，在干旱胁迫下，抗氧化酶的含量和活性显著增加，其目的是清除产生的活性氧[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．替代氧化酶已被证明参与呼吸电子传递链途径，这对干旱胁迫下维持光合性能至关重要[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．有限的报道表明，叶绿体蛋白的翻译、磷酸化和易位在干旱条件下的光合功能维持中起着重要作用。gydF4y2Ba

然而，用半自主的分析方法，叶绿体蛋白的功能调节是无法解释的。在植物叶绿体中的2000-3000种蛋白质中，只有大约100种是在叶绿体中组装的，其他的都是由核基因编码的。然后它们在细胞质中被翻译，最后被运送到叶绿体[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．因此，基于全叶的研究在揭示叶绿体蛋白功能方面存在一定的局限性。叶绿体分离后的蛋白质组学分析为阐明叶绿体定位的蛋白质调控及其与抗逆性的关系提供了一种有前途的方法[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．到目前为止，叶绿体蛋白质组学策略已被用于研究多种植物在生物或非生物胁迫下可能的分子调控途径，如植物的褪绿机制gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba病毒感染诱导的叶片[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，番茄的反应机制(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Bal)对干旱胁迫和恢复的影响[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，以及与耐盐性相关的途径gydF4y2BaKandelia candelgydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．然而，据我们所知，很少有研究报道小麦叶绿体蛋白质组学对干旱胁迫的响应，特别是当施用外源调控时。gydF4y2Ba

生长调节物质长期以来一直被认为有希望提高植物对环境胁迫的抵抗力[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．5-氨基乙酰丙酸(ALA)是植物叶绿体中卟啉的前体[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．近几十年来，外源施用低浓度的ALA对植物生长发育有保护作用，以应对各种胁迫，如NaCl [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]、重金属[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]、内涝[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，光动力[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，以及令人心寒的[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)压力。在干旱胁迫下，外源施用ALA已被证明可以减轻损害，这在肯塔基州蓝草的报告中得到了证明[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，紫花苜蓿(gydF4y2BaMedicago杂文集gydF4y2Ba马丁。)gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),gydF4y2Ba羊草gydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]、油菜籽(gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Bal .) [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]和小麦[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．对于小麦，使用ALA更有吸引力，因为据报道这种物质可以促进生长，减轻干旱条件造成的产量损失[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

尽管有大量关于作物对干旱反应的报道，但目前关于植物ala诱导的缓解机制的信息很少。由于ALA对环境胁迫的主要保护作用，其作用机制越来越受到人们的关注。现有证据表明，外源施用ALA提高了叶绿素含量，激活了抗氧化酶，降低了膜的脂质过氧化[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，促进光合作用[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，增强了四吡咯生物合成途径和脯氨酸积累[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，促进多胺的代谢[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，调节氮的代谢、营养离子的吸收、聚集和分布[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，通过增加类囊体的完整比例来抑制叶绿体的微观结构损伤[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]，并调节基因的表达[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．我们前期研究表明，ALA预处理增强了干旱胁迫下小麦幼苗的光合能力[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，但这种效应背后的调控机制仍然未知。gydF4y2Ba

在本研究中，我们利用iTRAQ技术鉴定了外源ALA预处理的干旱胁迫下小麦幼苗叶绿体中差异丰度的蛋白质。本研究的目的是探讨在干旱胁迫下叶绿体调节的主要蛋白质和酶。为了解植物在干旱胁迫下外源ALA的调控途径提供了理论依据。gydF4y2Ba

外源ALA对干旱胁迫下小麦生理反应的影响gydF4y2Ba

本研究通过测定小麦生理性状，评价外源ALA对小麦干旱响应的缓解作用。如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，干旱胁迫显著提高了叶片渗透势，但降低了RWC和叶绿素含量(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。而外源ALA预处理小麦叶片的渗透势较单独干旱胁迫降低21%，RWC和叶绿素含量分别提高24%和25%。这三个指标构成了生理反应分析的基础，提出外源ALA可以缓解干旱胁迫的反应。因此，我们使用不同处理下的叶片样本进行蛋白质组学分析，假设不同处理下的叶片样本具有不同的叶绿体蛋白质组。gydF4y2Ba

初步数据分析和蛋白质鉴定gydF4y2Ba

对4种处理下小麦幼苗叶片的3个生物三拷贝进行了叶绿体蛋白质组学分析。经LC-MS测定和生物信息学分析，共鉴定出9499个肽，FDR≤0.01gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，可分为2442个蛋白群(补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．主成分分析(PCA)显示了CK(正常浇水)、干旱(不补水)、ALA(正常浇水加外源ALA)、D + A(不补水加外源ALA)样品的异同(补充图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．4个样品的蛋白质总方差分别为44.4% (PC1)和20% (PC2)， 4个不同的聚类显示出可接受的分离。D + A处理较ALA处理和干旱处理离CK最远。这表明，与干旱或单独处理ALA相比，干旱胁迫下外源施用ALA会导致最严重的蛋白质组学变化。gydF4y2Ba

通过对ALA处理与CK处理叶绿体蛋白质差异丰度(DACPs)的分析，探讨ALA预处理对正常浇水条件下叶绿体蛋白质积累的影响。为了解干旱胁迫对叶绿体蛋白质积累的影响，测定了干旱处理与对照处理之间的DACPs。通过ALA加干旱处理与单独干旱处理的比较，旨在了解外源ALA对干旱损伤的可能缓解机制。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba2gydF4y2BaALA + CK、干旱+ CK、ALA +干旱+干旱分别鉴定出52、87和469个DACPs。其中，上调的有41、35、244个，下调的有11、52、225个。与对照处理相比，ALA、单独干旱处理和ALA +干旱处理鉴定出的蛋白质显著不同(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．对这些鉴定出的蛋白质进行筛选，以验证蛋白质丰度的变化是否显著。这是基于折叠变化≥1.5或≤0.667和gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.05。结果表明，干旱胁迫下ALA预处理对叶绿体蛋白质积累的影响大于ALA和干旱单独处理。gydF4y2Ba

采用qRT-PCR方法验证6个随机选择的DACPs的基因表达模式。对于每个DACP，分别在ALA、干旱和D + A处理下评估基因转录，以CK为参考样本。对18个转录的子集进行了测试，以确认蛋白质组学结果。详见补充图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，两者之间有很强的正相关(gydF4y2BaRgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.78)，证实了本研究蛋白质组学数据的有效性。gydF4y2Ba

dacp的功能分类gydF4y2Ba

为了了解ALA预处理和干旱胁迫下DACPs的相关蛋白功能，采用BLAST2GO软件进行GO分析。GO功能分类从ala预处理的小麦幼苗和CK之间的52个DACPs中生成了327个注释(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).在该研究中，116、39和172个注释分别可以归类为生物过程、分子功能和细胞成分的一级分类。在生物过程分类中，细胞过程(GO:0009987)和代谢过程(GO:0008152)分类的DACPs分别为24个和21个。在细胞成分分类中，主要分为细胞部分(GO:0044464)和细胞(GO:0005623)。在分子功能分类中，最常见的分类是结合(GO:0005488)。gydF4y2Ba

GO功能分类从仅经过干旱处理的幼苗和CK之间的87个DACPs中生成了603个注释(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).在该研究中，分别有246、282和75个注释可以归类为生物过程、细胞成分和分子功能的一级分类。在生物过程分类中，将52和49个DACPs分为代谢过程(GO:0008152)和细胞过程(GO:0009987)。在细胞成分分类中，56个DACPs被分为细胞部分(GO:0044464)和细胞(GO:0005623)两类。在分子功能分类中，结合(GO:0005488)和催化活性(GO:0003824)两类DACPs分别有33个和29个。gydF4y2Ba

仅在D + A和干旱条件下，对DACPs进行氧化石墨烯富集，从469个DACPs中产生了3366个注释(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).生物过程分类中丰富的前5个GO术语分别是代谢过程(GO:0008152)、细胞过程(GO:0009987)、单生物过程(GO:0044699)、细胞成分组织(GO:0071840)和生物调控(GO:0065007)。在细胞成分分类中，富集最多的5个GO术语分别是细胞(GO:0005623)、细胞部分(GO:0044464)、细胞器(GO:0043226)、细胞器部分(GO:0044422)、膜(GO:0016020)。分子功能分类中最丰富的术语是结合(GO:0005488)和催化活性(GO:0003824)。gydF4y2Ba

DACPs的KEGG通路分析gydF4y2Ba

通过KEGG通路注释方法进一步分析不同处理间DACPs的功能(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．将D + A与干旱处理幼苗间的469个DACPs分为84个KEGG分类。“代谢途径”是最具代表性的途径，其次是“次生代谢产物生物合成”、“碳代谢”、“核糖体”和“光合作用”(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).“代谢途径”也是ALA与CK以及干旱与CK中最具代表性的途径(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在ALA和CK中，由52个DACPs分类的4个最具代表性的途径是代谢途径、光合作用-天线蛋白、光合作用和核糖体。干旱与对照的87个DACPs中最具代表性的4种途径是代谢途径、次生代谢产物的生物合成、碳代谢和光合作用。KEGG途径分析结果表明，干旱胁迫和外源ALA的施用主要影响代谢产物和光合作用的途径。gydF4y2Ba

DACPs的蛋白-蛋白相互作用gydF4y2Ba

使用STRING在线搜索工具分析DACPs，并使用Cytoscape软件构建交互网络，使用得分高于0.7的ppi。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，仅D + A与干旱的PPI网络就包含519条边，高于预期的423条边。过多的边数表明，与从基因组中提取的大小相似的随机蛋白质组相比，这些蛋白质具有更多的PPIs。结果表明，DACPs作为一个群体至少部分地具有生物学上的联系。gydF4y2Ba

在干旱条件下，叶绿体对维持植物的光合功能至关重要，这可以归因于叶绿体对蛋白质含量的调节。详细了解叶绿体蛋白质在干旱响应中的变化对理解胁迫适应机制至关重要。在本研究中，我们重点研究了有或没有ALA预处理的叶绿体对干旱胁迫的响应，并评估了其对光合作用抗旱性的可能贡献。gydF4y2Ba

根据蛋白质组学数据，在干旱胁迫下，ALA预处理导致细胞色素P450 71a9样蛋白(A0A1D5YKA1)上调。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，细胞色素P450介导油菜素内酯生物合成中蓖麻酮的Baeyer-Villiger氧化合成油菜素内酯[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．油菜素类固醇是一种多羟基甾体植物激素，在调节多种植物生长发育过程中起着关键作用。许多研究已经声称，油菜素内酯可以在包括干旱在内的各种胁迫条件下改善农业系统的生长和产量[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．本研究中细胞色素P450积累的新颖之处在于，ALA预处理可以通过促进油菜素内酯的生物合成来增强抗旱性，可能有助于小麦在干旱胁迫下的产量维持[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

当植物遭受干旱胁迫时，由于CO的作用，碳氮比通常会发生改变，并诱导养分动员gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba限制。在干旱胁迫下ala预处理的幼苗中，苹果酸脱氢酶(MDH) (A0A1D5YPG2)比单独干旱胁迫下的幼苗增加了1.7倍。MDH通过参与克雷布斯循环在碳氮比调控中发挥关键作用。当有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在环境胁迫下，MDH同化受到限制，MDH在叶绿体中的积累伴随着电子受体NADP的再生gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba［gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，有利于基质NADPH氧化还原阶段的短期调整[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．观察到ALA预处理对氨基酸相关蛋白生物合成的下调，这表明在需要保留现有能量的情况下，可以刺激替代分解代谢途径来产生能量[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

已知大多数C3植物至少存在两种光合循环电子传递途径:NAD(P) H脱氢酶(NDH)依赖途径和质子梯度调节(PGR5) (H9C8A5)依赖途径[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．在本研究中，在干旱胁迫下，ALA预处理小麦幼苗NAD(P) H脱氢酶显著下调。然而，铁氧还原蛋白依赖性CET途径中的关键蛋白质子梯度调节5 (PGR5)在干旱胁迫下下调。有趣的是，PGR5随着ALA预处理显著积累。此外，ala预处理小麦幼苗中二磷酸核酮糖羧化酶(小链和大链)下调，但二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶激活酶增加了1.9倍。在这两个gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba衣藻reinhardtiigydF4y2Ba结果表明，PGR5/PGRL1-Fd CEF的功能与ATP/氧化还原控制模型一致[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba过表达PGR5的植物在强光和干旱胁迫下比野生型植物表现出更好的生存能力[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．因此，目前的蛋白质组学数据表明，外源ALA通过激活pgr5依赖通路来保护干旱胁迫下的小麦幼苗。gydF4y2Ba

丝氨酸羧基肽酶样蛋白家族位于细胞膜上，已被证明在植物生长发育和应激反应中发挥关键作用[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．苯并噻二唑、水杨酸、茉莉酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸等处理后，水稻叶片中这些蛋白质显著积累。过量的植物还表现出对氧化应激的耐受性增强，氧化应激相关基因表达上调[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．目前的蛋白质组学数据表明，在干旱胁迫下，丝氨酸羧肽酶(A0A1D6ANR8)在单独的干旱胁迫下下调，而在干旱胁迫前应用ALA时，其累积量为2.1倍。在无干旱条件下，外源ALA的上调作用不显著。结果表明，丝氨酸羧基肽酶可能参与了外源ALA的调控，从而对干旱胁迫产生保护作用。gydF4y2Ba

许多隐性耐药基因已被证明编码真核生物翻译起始因子(EIFs)。一组核心的EIFs被保存，以促进mRNA起始密码子上具有翻译能力的核糖体的组装[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．越来越多的研究表明，植物的EIFs在抗逆境中发挥作用，如gydF4y2BaeiF (iso) 4 egydF4y2Ba在gydF4y2Bab·拉伯gydF4y2Ba［gydF4y2Ba39gydF4y2Ba),gydF4y2Baeif2B-betagydF4y2Ba在gydF4y2Bab . junceagydF4y2Ba［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，以回应TuMV。在本研究中，外源ALA预处理的干旱胁迫小麦幼苗中，2个EIF亚型(6和3 L)在干旱胁迫下下调，而5个EIF亚型(5A、6、3B、3C和3 L)在干旱胁迫下累积。真核生物翻译起始是基因翻译的一个高度调控和复杂的阶段，至少需要13个核心起始因子和5个辅助因子的作用[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．在EIFs中，eif5a是一种在所有真核生物中高度保守的蛋白gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba已经证明，它通过影响Cd的吸收、积累和解毒来影响Cd的敏感性[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．这些小麦EIFs在干旱胁迫下的积累为外源施用ALA的保护策略提供了新的靶点和机制。众所周知，氧化应激通常是干旱胁迫的结果。如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa和b, HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba在干旱胁迫下，小麦叶绿体的产量均显著增加(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)。ALA预处理可减轻活性氧(ROS)对叶绿体的损伤，表现为HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba产量明显下降，但仍高于无干旱苗。近几十年来，研究表明活性氧(ROS)的化学性质表明，它们不仅对植物细胞有潜在的危害，而且还在响应环境胁迫的信号转导中充当第二信使[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．根据现有的叶绿体蛋白质组学数据，ALA预处理后，磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) (A0A1D5U2X7)和过氧化物酶(POD) (A0A1D6BMX2)分别比单独干旱处理上调了1.7倍和2.2倍。蛋白质组学数据与小麦叶绿体中GPX和POD的酶解分析结果一致(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac和d)，但超氧化物歧化酶Cu/Zn isoform (Cu/Zn- sod) (C3VQ50)下调0.5倍，过氧化氢酶(CAT) (A0A0A7MA13)没有明显变化(gydF4y2BaPgydF4y2Ba单干旱处理和ALA +干旱处理均< 0.05)。这可能是由于Cu/Zn-SOD主要在细胞质中起清除ROS的作用，而在叶绿体中只起到少量清除ROS的作用[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．GPX催化H的还原gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，有机过氧化氢和脂质过氧化物，使用谷胱甘肽(GSH)，硫氧还蛋白(TRX)和/或其他还原剂，通常被认为是对抗氧化膜损伤的酶促防御的主线[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．GPX已被证明在脱落酸和干旱胁迫响应中作为氧化还原换能器和活性氧清除剂gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．转基因烟草叶绿体中GPX的过度积累可以去除细胞膜在应激条件下产生的不饱和脂肪酸氢过氧化物，从而维持细胞膜的完整性，增强对各种应激条件引起的氧化应激的耐受性[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．pod主要定位于细胞壁和液泡[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]，但最近一份报告显示，pod也存在于叶绿体中[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．POD通过将过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)到HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO，而底物被氧化，因此在抗旱性中发挥重要作用[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．磷酸肌醇磷酸酶SAC8也参与减少ROS的积累[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．在我们的研究中，蛋白质组学数据显示，外源ALA预处理提高了小麦叶绿体中磷酸肌苷磷酸酶SAC8亚型SAC1 (A0A1D5SX72)的水平，这与NaHS预处理干旱胁迫小麦幼苗的结果相似[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．在本研究中，外源ala触发的GPX、POD和磷脂酰肌醇磷酸酶SAC1的积累表明，在干旱胁迫下，小麦植株是ROS清除剂。gydF4y2Ba

在高等植物叶片中，存在三种甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gap)，它们通过催化关键的能量步骤和减少细胞的能量分配来参与环境胁迫反应;GapA和GapB在叶绿体中，而GapC在细胞质中[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．蛋白质组学数据显示，在单独干旱胁迫下，小麦幼苗GapB (A0A1D5XJY0, A0A1D5YL67)积累，而在外源ALA预处理下，GapA (A0A1D5T798, A0A1D5TTT4)、GapB和GapC (A0A1D6C9L9)均显著下调。Gap的积累有利于ROS过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)信号对干旱胁迫的响应，敲除Gap降低了气孔对ABA的敏感性，使植物对水分亏缺的反应低于野生型[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．当ALA预处理小麦幼苗时，gap的下调与H含量的降低是协调的gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在先前的报告中[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，这很可能与ROS清除剂GPX和POD的积累有关。gydF4y2Ba

还有一些参与ROS清除的非酶性分子抗氧化剂，包括抗坏血酸、α-生育酚、类胡萝卜素和谷胱甘肽[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．在应激反应中，番茄红素环化酶通过β支特异性途径负调控类胡萝卜素的合成[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．在干旱胁迫下，番茄红素环化酶(C1IP74)表达下降，有助于将类胡萝卜素含量维持在一定水平，以清除叶绿体中的ROS [gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．外源ALA预处理使干旱胁迫下的小麦叶绿体中累积了番茄红素环化酶，这表明与干旱胁迫下的小麦幼苗相比，外源ALA预处理降低了ROS产量，提高了叶绿素含量，因此并不需要较高的类胡萝卜素含量。zeta -胡萝卜素去饱和酶(A0A1D5U7A6)是另一种对类胡萝卜素生物合成至关重要的叶绿体蛋白。与干旱胁迫下的小麦幼苗相比，ala预处理的小麦幼苗中该基因表达上调。此外，-胡萝卜素去饱和酶的积累在叶绿素生物合成、着色、叶绿体生物发生和PSII能力中起着重要作用[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．结果表明，ALA预处理通过调节类胡萝卜素生物合成相关蛋白参与了非酶促抗氧化过程。gydF4y2Ba

在鉴定的DACPs中，鉴定出一些非叶绿体蛋白，在处理后发生了显著变化。例如，在干旱胁迫下，外源施用ALA均下调了组蛋白H2A、H2B、H3和H4，这与水稻在冷胁迫下的研究结果一致[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．非叶绿体蛋白质污染应归因于基于percoll的叶绿体净化方案，该方案不能完全排除来自其他质体和细胞区室的交叉污染，即使它已经得到了很好的确立[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．组蛋白容易发生可逆的翻译后修饰，如磷酸化、泛素化、乙酰化、甲基化和糖基化，使蛋白质能够灵活地对刺激做出反应[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．它们是类核或核形的dna结合蛋白，也可能被翻译后修饰并在叶绿体中发挥作用[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

综上所述，采用基于itraq的蛋白质组学方法，研究了干旱胁迫下外源ALA对小麦叶片叶绿体蛋白质含量的影响。FDR≤0.01的肽共有9499个，可分为2442个蛋白群。在干旱胁迫下，87个叶绿体蛋白质含量在干旱胁迫下发生变化，469个蛋白质含量在外源ALA胁迫下发生变化。结果表明，ALA预处理改变了叶绿体的一些生物学途径，如代谢途径和参与光合作用和核糖体的途径，从而增强了叶绿体的抗旱性。此外，ALA通过调节酶的过程促进ROS的清除。我们从叶绿体蛋白质组学的结果扩展了对外源ALA在小麦抵御干旱胁迫中的作用机制的理解。gydF4y2Ba

植物材料及处理gydF4y2Ba

选择大小均匀的小麦品种爱康58种子，5% H表面消毒gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba3分钟。爱康58是由河南新农种业股份有限公司商业收购的。选择小麦品种作为材料，是因为它是在中国北方大面积种植的耐旱品种。在自来水中浸泡12小时后，在双层潮湿滤纸上进行48小时的预发芽。然后将相同且发芽的种子转移到长6.8厘米，宽6.8厘米，高7.1厘米的塑料花盆中，并添加90克营养土壤。人工控制生长室，光周期为14 h/10 h，光周期为300 μmol mgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}的光合光子通量密度(PPFD)。光照时段为每天早上7点至晚上9点。环境温度和相对湿度分别控制在25°C/22°C(昼夜)和75~85%。每2 d用400 mL水浇灌小麦幼苗，直到两片叶子完全展开，100 mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}根据我们之前的评估结果，在叶片上应用ALA [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．ALA处理3天后，停止浇水对幼苗进行干旱胁迫，对照组正常浇水。处理组合设置如下:(1)CK, 0 mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}ALA +蒸馏水;(2) ALA, 100 mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}ALA +蒸馏水;(3)干旱，0 mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}ALA +不含蒸馏水;(4) D + A, 100 mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}ALA +不含蒸馏水。栽培土壤为有机营养土壤与蛭石比例为3:1 (v/v)的混合土壤，不补充水分，每天失水率约为10.5%。处理6 d后，收集第二片叶子(紧挨着旗叶的叶子)进行叶绿体分离和蛋白质组学分析。在这个时间点，正常浇水条件下土壤含水量在70 ~ 75%之间，而干旱条件下土壤含水量在30 ~ 35%之间。为尽量减小相同处理下不同平行样品之间的偏差，样品分别取自小麦幼苗独立的3个样地。工作流程如图所示。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

生理测量gydF4y2Ba

利用土壤水势评价了小麦幼苗所受的胁迫参数。研究了叶片渗透势、相对含水量和叶绿素含量等生理性状。每个处理取3个重复的新鲜幼苗叶片。RWC计算公式为:RWC (%) = (FW - DW) / (TW - DW) × 100 [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．采用分光光度法，参照Porra等方法测定叶绿素含量[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．使用水势分析仪(WP4C, Decagon Devices Inc.， USA)测量叶片渗透势。gydF4y2Ba

叶绿体隔离gydF4y2Ba

根据Tamburino等人的修改，从10 g新鲜叶片中分离出纯净完整的小麦叶绿体[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．所有步骤都在4°C下进行。新鲜叶片在含有330 mM d -山梨醇、50 mM Hepes-KOH、2 mM MgCl的100 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.6)中彻底均质gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 2mm EDTA-NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 5 mM抗坏血酸。用4层滤纸过滤匀浆，并清洗至无绿色液体溢出。滤液以300倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba上清液1000×再次离心1 mingydF4y2BaggydF4y2Ba2分钟。球团在含有330 mM d -山梨醇、50 mM Hepes-KOH和1 mM DTT的磷酸盐缓冲液(pH 7.6)中重新悬浮。将悬浮液小心地加载到连续的Percoll梯度上(Sigma-Aldrich，美国)，并以10500倍的离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。完整的叶绿体被小心地回收并重新悬浮在含有20 mM Tricine-KOH (pH 7.6)， 5 mM MgCl的5倍体积的缓冲液中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 2.5 mM EDTA和0.3 M山梨醇。通过荧光显微镜监测细胞器纯度和完整性(补充图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．离心2100×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟后，回收颗粒，在液氮中快速冷冻，然后在−80°C保存，直到使用。每个处理条件设3个生物重复。gydF4y2Ba

叶绿体蛋白提取和消化gydF4y2Ba

叶绿体蛋白提取程序遵循从叶片中分离完整叶绿体的Sigma试剂盒(Sigma, CPISO-1KT)的说明。完整的叶绿体在1/10体积的SDT缓冲液(4% SDS, 100 mM DTT, 150 mM Tris-HCl, pH 8.0)中溶解。在沸水中孵育3 min后，超声处理(80 w，每次10 s超声，每15 s一次，10次)，100℃孵育3 min。粗提物经13000 ×离心澄清gydF4y2BaggydF4y2Ba在25°C下放置10分钟[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．以BCA为标准，Bradford法定量测定叶绿体蛋白含量，取20 μg样品进行SDS-PAGE质量验证。上清液保存在−80°C直到使用。gydF4y2Ba

蛋白质消化根据Wisniewski等人描述的过滤辅助样品制备(FASP)程序进行。[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．每种提取的蛋白质200微克加入含有8 M尿素和150 mM Tris-HCl的200 μL UA缓冲液(pH 8.0)中。将混合物转移到10 kDa超滤离心管中，14000 ×离心2次gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟。用100 μL的50 mM IAA (UA缓冲液配制)溶解沉淀物，以600 rpm的速度摇晃1 min。室温暗箱孵育30 min后，14000 ×离心溶解gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。再用100 μL UA缓冲液洗涤两次，然后用100 μL溶解缓冲液(50 mM碳酸氢铵，pH 8.5)在14000 ×下离心洗涤两次gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。然后用40 μL胰蛋白酶缓冲液消化蛋白，40 μL溶出液中含有2 μg胰蛋白酶。叶绿体蛋白质的消化在37°C下摇晃18 h。在14000 ×离心下收集消化肽gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟后，沉淀物被丢弃。gydF4y2Ba

iTRAQ标记和SCX分离gydF4y2Ba

根据制造商的协议，使用iTRAQ Reagent-4Plex Multiplex Kit (AB SCIEX)对80微克多肽进行标记。CK、ALA、干旱和D + A 4个处理分别用iTRAQ标签114、115、116和117标记。用SCX分离itraq标记的多肽是在AKTA Purifier 100 (GE Healthcare)上进行的。将上述制备的itraq标记肽混合，加入10×体积缓冲液A (10 mM KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba加入PO4, 25% v/v ACN，用磷酸调整pH值至3.0)，然后将样品加载到含有5 μm颗粒的聚磺乙基4.6 × 100 mm SCX 200 Å色谱柱上(PolyLC公司，美国马里兰州)。在流速为1 ml/min的条件下，以100%缓冲液a的梯度洗脱肽段25和25.01 min, 90%缓冲液a和10%缓冲液B (10 mM KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2BapH 3.0, 500 mM KCl, 25% CAN)分别为32和32.01 min, 80%缓冲液A和20%缓冲液B分别为42和42.01 min, 55%缓冲液A和45%缓冲液B分别为47和47.01 min, 100%缓冲液B分别为52和60 min, 100%缓冲液A分别为60.01和75 min。然后，共33个馏分经CgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba在液相色谱-质谱(LC-MS)分析之前。gydF4y2Ba

质分析gydF4y2Ba

采用EASY-nLC1000高效液相色谱系统(Thermo Scientific, USA)，流速为250 nL/min，分离各组分的多肽(10 μL自注射)。注样柱为5 μm C18颗粒填充的EASY-column C18 (2 cm × 100 μm, Thermo Scientific, Waltham, USA)，分离柱为3 μm C18颗粒填充的EASY-column C18 (75 μm × 100 mm, Thermo Scientific, USA)。用95%溶剂A(水，0.1% v/v甲酸)和5%溶剂B(水，0.1% v/v甲酸，84%乙腈)预平衡色谱柱。多肽通过线性梯度流动相的应用进行洗脱:在55分钟内从0%溶剂B到35%溶剂B，然后在3分钟内从35%溶剂B到100%溶剂B，保持2分钟。gydF4y2Ba

采用Q-Exactive系统(Thermo Finnigan, USA)对毛细管高效液相色谱分离的组分进行质谱分析。数据采集在正ESI模式下，自动MS/MS范围为m/z 300-1800。第一级MS参数为:分辨率为m/z 200时的70000,AGC靶值为3e6，最大IT值为10 MS，动态排除时间为40 s。第二级MS参数为:隔离窗口为2 m/z，分辨率为m/z 200时为17500，最大IT值为60 MS，归一化碰撞能为30 eV，底填充比为0.1%，激活类型为HCD。gydF4y2Ba

生物信息学分析gydF4y2Ba

MS分析的原始数据文件提交到Mascot 2.2服务器(Matrix Science, Boston, USA)，使用Proteome Discoverer软件(version 1.4;美国热)。用于MS/MS数据检索的数据库为UniProtgydF4y2Ba小麦gydF4y2Ba蛋白质数据库，包括2017年7月17日发布的145635条序列。计算假发现率(FDR)，以FDR≤0.01为标准对有效肽进行筛选。软件中检测到的蛋白阈值设置为95%置信度。叶绿体蛋白质组学分析是用生物三拷贝进行的，学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba-test在。水平上评价各治疗间DACPs的意义gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。选择不同处理间iTRAQ比值大于1.5和小于0.667的蛋白分别为上调蛋白和下调蛋白。利用在线可视化聚类软件ClustVis (gydF4y2Bahttps://biit.cs.ut.ee/clustvis/gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

根据BLAST2GO软件的基因本体(GO)注释对DACPs进行功能分类(gydF4y2Bahttps://www.blast2go.com/gydF4y2Ba)．利用京都基因与基因组百科全书(KEGG) (gydF4y2Bahttp://www.kegg.jp/kegg/gydF4y2Ba)．使用cluster 3.0软件对DACPs进行聚类分析(gydF4y2Bahttp://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htmgydF4y2Ba)．蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)由检索相互作用基因/蛋白质(STRING)数据库(Version 11.0)的搜索工具预测[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]，相互作用网络由Cytoscape软件绘制[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．交互得分高于0.7(高信度)的PPIs进一步进行交互网络分析。gydF4y2Ba

RNA提取和实时PCR分析gydF4y2Ba

从第二叶中提取总RNA，反转录为cDNA。如前所述，cDNA被用于定量实时PCR分析[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．我们随机选择了6个差异积累蛋白的基因来研究它们的相对转录水平。qRT-PCR分析的引物对使用Primer 5软件(PREMIER Biosoft International, USA)从目标蛋白的相应基因组序列设计。β-的放大gydF4y2Ba肌动蛋白gydF4y2Ba用作内部控制[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．引物组均列于补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．特异性基因的相对表达量用2gydF4y2Ba^{——ΔΔCTgydF4y2Ba}方法(gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

H的测定gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容,gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba叶绿体中过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，内容，OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba按照Li等的方法测定叶绿体中POD (EC 1.11.1.7)和GPX (EC 1.11.1.9)活性。[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]在叶绿体被分离出来后。HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过监测过氧化钛配合物在410 nm处的吸光度来测定叶绿体中的含量gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba在530 nm的吸光度下测量。通过记录愈创木酚氧化4min时在470 nm处的变化来确定POD活性，每分钟1单位吸光度的变化定义为1个酶单位。GPX活性是通过监测470 nm处愈创木酚氧化引起的吸光度的增加来测定的。gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

每项测量进行三次独立重复，结果以均数±标准差(SD)表示。采用GraphPad Prism 7.0软件(GraphPad software Inc.， California, USA)进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Tukey多元比较检验(multiple comparison test)在水平上比较各处理间均数的显著性差异gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01。gydF4y2Ba

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。本文的质谱蛋白质组数据已通过iProX(集成蛋白质组资源)合作伙伴存储库保存到ProteomeXchange Consortium，数据集标识符为PXD017528。gydF4y2Ba

阿拉巴马州:gydF4y2Ba

5-Aminolevulinic酸gydF4y2Ba

CK:gydF4y2Ba

控制gydF4y2Ba

DACPs:gydF4y2Ba

叶绿体蛋白质差异丰富gydF4y2Ba

FASP:gydF4y2Ba

过滤辅助样品制备gydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

GPX:gydF4y2Ba

谷胱甘肽过氧化物酶gydF4y2Ba

质:gydF4y2Ba

液相色谱质谱仪gydF4y2Ba

圆荚体:gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

质子泵抑制剂:gydF4y2Ba

蛋白质相互作用gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

我们感谢Hoogen-bio有限公司在iTRAQ LC-MS/MS分析方面提供的技术援助。gydF4y2Ba

YW感谢中国国家自然科学基金(批准号:)中国国家留学基金委(201708410311)、河南农业大学科技创新基金(批准号:U1704103);KJCX2016A06)，用于支持研究。资助机构在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有发挥任何作用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 河南省郑州市农业路63号河南农业大学生命科学学院(450002gydF4y2Ba

   王月霞，李晓燕，魏世梅，王佳楠gydF4y2Ba

2. 中国农业大学理学院，北京100193gydF4y2Ba

   娜娜刘gydF4y2Ba

3. 弗吉尼亚大学病理学系，弗吉尼亚州夏洛茨维尔，22908，美国gydF4y2Ba

   秦总gydF4y2Ba

4. 河南省郑州市农业路63号河南农业大学食品科技学院，河南省郑州市450002gydF4y2Ba

   锁表gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

YW和BS对这篇手稿的实验设计和写作做出了贡献。YW, XL, SW和JW对实验性能有贡献。BS、NL和FQ对数据分析有贡献。所有作者均已阅读并批准稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaYuexia王gydF4y2Ba或gydF4y2Ba锁表gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba