转录组共表达网络分析确定了成熟猕猴桃酯生物合成的关键基因和调控因子

背景

果香是水果重要的感官品质，对消费者的偏好有很大的影响。猕猴桃酯在果实成熟过程中经历快速和实质性的变化，有助于风味的形成。部分酶及其编码基因已被认为是合成风味相关酯类的潜在候选酶。但目前对酯类生物合成途径的研究还存在明显的空白，调控酯类生物合成的机制尚不清楚。

结果

采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对乙烯(ETH, 100 μl/l, 24 h, 20°C)和1-甲基环丙烯(1- mcp, 1 μl/l, 24 h, 20°C)作用下猕猴桃挥发性化合物进行定量分析。结果表明，乙烯对酯类的影响最大，而1-MCP对酯类的影响最大。利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)构建的RNA-seq结果与酯类浓度的相关性表明，3个结构基因(脂肪酸去饱和酶，adfad1.；醛脱氢酶,adaldh2.；醇酰基转移酶,ADAT17）具有类似的表达模式，可分离酯含量的变化，以及adfad1.转录本表现出最高的相关性。为了寻找潜在的酯类生物合成调控因子，我们将14个乙烯响应转录因子(TFs)与酯类及其生物合成基因进行相关性分析。采用双荧光素酶检测，研究了转录因子对酯类生物合成基因启动子的体内调控活性，结果表明AdNAC5和AdDof4 (DNA结合一指)反式激活和反式抑制酯类生物合成基因启动子adfad1.启动子。

结论

本研究通过对3个猕猴桃成熟相关酯合成基因的鉴定，进一步阐明了猕猴桃成熟相关酯合成的分子基础adfad1.那adaldh2.和ADAT17通过转录组分析，并通过反式激活研究突出了两个tf的功能。

奇异果(Actinidia Deliciosa.)是一种最近开发和经济上重要的水果作物，原产于中国，现在有全球商业分布[1]．由于它们的营养化合物的风味和高价值（例如维生素C），猕猴桃是广泛的优选的消费者（例如，维生素C）[2]．香气，与甜酸混合，产生奇异果的独特风味。芳香挥发物的生产强烈依赖乙烯[3.]．在乙烯 - 抑制的猕猴桃中，果实软化显着延迟，并且芳香挥发性产生显着降低，可以通过施加外源乙烯来重新启动[4.]．Kiwifruit的香气由各种挥发性化合物的混合物产生，包括醇，醛，酮和酯[5.]，这使得Kiwifruit是理解不同挥发性化合物的生物合成和调节的良好模型。

猕猴桃长期以来一直被用作挥发性研究的材料。Young等人早期对猕猴桃挥发性化合物的研究发现，通过同时蒸馏法提取挥发性物质，发现丁酸乙酯、(E)-2-己烯醛、(E)-2-己烯醇、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯是猕猴桃香气的主要成分[6.]．从那时起，人们对猕猴桃挥发物进行了广泛的研究，到目前为止已鉴定出80至90种化合物[7.那8.]．一般来说，未成熟的绿色果实中醛类物质更丰富，而成熟果实中带有果香味的酯类物质则更多，正己醛、(E)-2-己醛和丁酸乙酯已被鉴定为奇异果的特定挥发物[8.]．到目前为止，人们已经开发和使用了许多不同的方法来分析猕猴桃中的香气化合物，如气相色谱-质谱联用(GC-MS)，这进一步扩大了猕猴桃中已知挥发性化合物的种类[9.那10]．

酯是负责果味香气的主要芳香成分，随着猕猴桃成熟的巨大增加，这增加了巨大增加[8.那9.]．脂氧合酶(LOX)的活性与此有关，随着果实发育到更年期，LOX的活性显著增加，乙烯处理对某些LOX基因的调控尤为明显AdLox1和AdLox5[11那12]．Günther等人指出，乙烯调节了中酯的生产A. Chinensis.通过诱导AAT基因表达与aat底物前体形成[13]．基于这一点猕猴桃在EST数据库中，鉴定出30种酰基转移酶(ATs)，系统发育分析表明12种ATs是口味相关酯类合成的潜在候选酶[14]．然而，在猕猴桃酯生产过程中，脂肪酸去饱和酶(FAD)、过氧化氢裂解酶(HPL)、醛脱氢酶(ALDH)等关键酶及其编码基因尚未被研究。例如，对猕猴桃的一些基因进行了分析AdADH1和AdADH2(醇脱氢酶)在渍水后被激活[15，这与果酯的生产无关。尽管酯类化合物对猕猴桃风味具有重要的作用，但在其生物合成途径和调控机制方面仍存在明显的空白。

此外，尚未报告猕猴桃中酯合成的转录调节，以及大多数其他果实。目前，水果芳香产量转录调节机制的研究主要集中在包括柑橘的萜烯上CITAP2.10（+） - 瓦伦烯和citerf71.为E.香叶醇,猕猴桃AaNAC2/3/4用于单萜生物合成[16那17那18]．在柿子果中ERF.可以调节抗利尿激素柿子去涩味的促进剂和可能的关键成分[19]．在猕猴桃，AcNAC5对丙烯的响应显著增加，并与芳香挥发物的生产模式相关，表明其在调控芳香挥发物中的潜在作用AcAAT以及成熟过程中挥发性的生物合成[3.];然而，这些发现仅提示了转录因子在酯相关通路调控中的潜力，而这些erf和其他转录因子在酯生物合成中的作用尚不清楚。在我们之前的研究中，我们分析了猕猴桃的三个主要成熟性状，包括质地、乙烯生产和淀粉降解，并确定了一系列乙烯响应的转录因子[20.]．只有AddOf3，AddOF4（与一种手指的DNA结合）和ADNAC5被鉴定为与Kiwifruit成熟和软化有关的靶向基因[20.，并且推测剩余的TFs可能还参与其他调控其他成熟相关性状，如香气。

本研究基于猕猴桃酯生物合成研究的学术背景，确定了猕猴桃酯生物合成的关键基因及其转录调控机制。采用GC-MS、乙烯处理、1-MCP处理和对照果实对挥发物进行定量分析。利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)，通过转录组学结果预测了三个关键结构基因。此外，AdNAC5和AdDof4被初步鉴定为活性于adfad1.启动子。因此，这些结果不仅填补了猕猴桃酯生物合成途径的一些空白，而且还确定了参与香气产生调节机制的转录因子。

猕猴桃成熟过程中挥发性成分分析

在用乙烯，1-MCP或对照处理的Postharctip Kiwifruit中分析了醇，萜烯，醛，酮和酯。在总醇中，萜烯，醛，酮和酯类中，酯是在成熟阶段存在的最多的化合物，其值在0d的236.23μg/ kg中增加，并且达到eth的47,373.07μg/ kg的峰（10 d）在1-MCP处理样品（18d）中的对照（18d）和499.82μg/ kg中的23,232.26和499.82μg/ kg（图。1一种）。主要挥发性化合物的浓度可以在附加文件中找到1．（E.-2-己烯醛在大多数未成熟的水果中含量都很高，被认为是猕猴桃散发出绿色香味的主要原因[21]．此外，成熟果实中丁酸甲酯、苯甲酸甲酯、丁酸乙酯和苯甲酸乙酯含量最高2：图S1）。在储存期间，这四种酯显示出类似的变化：由乙烯诱导并抑制1-MCP。酯类的生产在对照（17d，18d）和Eth果汁（8d，10d）中急剧增加，同时伴随内源性更年期乙烯生产，而它们在1-mcp处理的果实中储存的整个储存量仍保持在基础级别（无花果。1b).与这四种酯相比，其他挥发物对芳香谱的贡献要小得多(图4)。1C）。PCA分析表明，位于与乙烯最近的酯类化合物，暗示它们之间的强烈相关性和与猕猴桃成熟相关的酯的可能性（附加文件2:图S2)。

RNA-seq数据的WGCNA

进行WGCNA以研究共表达网络，其中所有共表达基因彼此相互连接，不同的相关强度。基因被分成二十二个共表达模块（图。2a).酯类含量与基因表达量在‘蓝色’模块中呈正相关，在‘品红’模块中呈负相关，相关系数为0.82 (P. = 4 × 10⁻⁵）和 - 0.78（P.= 1 × 10⁻⁴),分别(无花果。2b).与其他四种挥发性化合物的模组系数均小于0.7(图4)。2b).基于相关性(R. > 0.7) between genes in the two modules and ester content, a total of 1896 genes were identified.

利用1896年的基因，GO进行了注释。GO注释分析显示，基因可以概括为细胞成分、分子功能和生物过程三大类功能。60%以上的基因主要分为细胞组、细胞部分组、细胞过程组、代谢过程组和细胞器组。3.）.

猕猴桃成熟过程中酯合成基因的鉴定与表达

基于WGCNA从RNA-SEQ缩小差异表达基因（DEGS）的范围，并重点关注酯的生物合成途径，两种醛脱氢酶（Adaldh1.那adaldh2.)、两种脂肪酸去饱和酶(adfad1.那adfad2.)，一乙醇脱氢酶(AdADH3）和一个醇酰基转移酶（ADAT17)[22被确定。使用TBTools软件，通过热图显示基因转录本丰度(图2)。4.a).在基因中，ADAT17那adaldh2.和adfad1.表现出类似的模式，明显由外源乙烯诱导而1-MCP抑制AdADH3那Adaldh1.和adfad2.对两种治疗的反应较小（图。4.a).转录本的丰度增加ADAT17那adaldh2.和adfad1.通过Postharvest'Hayward'Kiwifruit的实时PCR确认。结果表明ADAT17那adaldh2.和adfad1.响应于外源乙烯在1d中，也与Eth和对照果汁中的内源乙烯平行积聚（图。4.b）。1-MCP治疗保持表达ADAT17和adaldh2.在基础水平，虽然它仅延迟了表达的增加adfad1.(无花果。4.b).观察到的最显著差异为ADAT17在ETH中，其相对表达量在8 d时达到最大值(186.53)，而CK和1-MCP在8 d时的相对表达量分别为0.93和0.05(图2)。4.）.

转录因子对两种主要酯生物合成基因的调节作用（adfad1.和ADAT17）

与酯含量相关分析，3个候选基因(adfad1.那ADAT17和adaldh2.)可能参与酯生物合成，与14个已确定的成熟相关的TFs [20.，用美国Cytoscape (v3.7.1, USA)进行可视化分析。如图所示。5.，三种酯生物合成基因均与酯含量呈正相关adfad1.显示出最高的正相关性。14个TFs的转录组在AdBEE1那AdERF10那AdNAC6那ADGT1.那addof3.和AdNAC5与酯含量正相关，而addof4.那ADHB1和adbzip1.显示出负相关(图。5.）.酯生物合成基因与转录因子之间的正相关性最高AdBEE1和ADAT17， 其次是AdBEE1和adfad1.，负相关系数最高的是addof4.和adfad1.(无花果。5.）.

为了超出TFS，结构基因和酯含量与TFS之间的关系的数字分析，TFS对两种主要候选目标两种启动子的体内调节作用（ADAT17和adfad1.)，采用双荧光素酶检测。不幸的是，失败的放大adaldh2.启动子排除了它在本分析中的包含。结果表明，AdNAC5能显著反式激活adfad1.启动子，有2倍以上的诱导(图。6.A)，反之adfad1.促进剂，与基部活性设定为1的基础活性相比，Addof4作用为阻遏物，将转录活性降低至0.67（图。6.a).没有一个被检测的TFs显示出显著的调节效应(既不激活也不抑制)ADAT17子,(无花果。6.b）。

乙烯和1-MCP对酯积累的调节作用

了解香气的形成对猕猴桃的质量和市场销售至关重要，特别是酯类的生产，这是猕猴桃成熟香气的主要成分(图。1a).在猕猴桃成熟的过程中，味道从“草”和“绿”到“果味”，这表现为酯类增加，醛类减少[21]．有人建议，在成熟过程中酯的积累可能由乙烯驱动[8.那12]．酯的生产，特别是丁酸乙酯和丁酸甲酯的生产，似乎强烈地依赖于乙烯信号[3.]．另外，在乙烯 - 抑制的转基因系Kiwifruit中，酯显着降低，而在乙烯 - 未挤压果实中产生的主要挥发物是丁醇酸乙酯，甲酸甲酯和乙酸乙酯[4.]．本研究还发现，乙烯处理比对照果实更能促进酯的积累，而1-MCP处理则对酯的产生产生相反的影响。结果表明，四种酯类化合物(丁酸甲酯、苯甲酸甲酯、丁酸乙酯和苯甲酸乙酯)是海沃德猕猴桃成熟过程中总酯的主要组成部分。1C)与之前的发现相似。8.那9.]．在0°C的“Hayward”贮藏期间，主要由丁酸甲酯和丁酸乙酯组成的总酯在贮藏9周后增加，但在贮藏21周后下降，苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯表现出类似的趋势[8.]．丁酸盐是“海沃德”和“Hort16a”水果中的主要果味酯，在成熟和过度成熟的水果中显着增加。Butanoates在'Hayward'水果中贡献的百姓少于40％，但在'Hort16a'中大于60％[9.]．Zhang等人报道了乙基和丁酸甲酯水平在“布鲁诺”的成熟过程后期增加[12]．在'Hort16a'kiwifruit中，乙烯处理（100ppm，24 h）可以通过冷储存（1.5°C）恢复有关香气相关酯的显着减少2或4个月[23]．此外，乙烯和/或1-MCP对酯类的影响在其他水果中也被广泛报道。在梨果实中，1-MCP处理的果实中总挥发物和酯的浓度均低于对照[24]．在苹果果实中，乙烯调控对挥发物的产生有主要影响，AAT酶是乙烯调控下酯的产生的重要调控点[25]．此外，乙烯对甜瓜和番茄中一些挥发性相关基因的表达也很重要[26那27]．

乙烯对乙酸酯生产在更年期水果中的影响是很好的。因此，在生理学水平，我们在整个储存和成熟期间记录了芳香化合物的变化。本研究结果证实了与果实软化重合的“Hayward”酯含量的爆炸性增加，其通过乙烯处理加速并被乙烯作用抑制剂1-MCP延迟。这些结果直接符合乙烯对酯生物合成调控的重要影响。

酯生物合成候选靶基因

除了生理方面的研究，酯生物合成的分子方面也得到了广泛的研究。Yahyaoui等人发现AAT参与了甜瓜成熟过程中香气挥发性酯的生成[26]．转基因苹果植株减少MpAAT1表达显示大多数关键酯水平降低[22]．mdaat2.与‘Golden Delicious’中AAT酶活性和酯产量正相关[28]．Qian等人证明了AAT基因主要测定浆果挥发性酯的含量[29]．Balbontin等人指出木瓜果实vpaat1.编码具有高AAT活性的官能酶，有助于形成苄酸苄酯，其表达依赖于乙烯[30.]．Cumplido-Laso等人观察到草莓果托的酯产量显著下降Faaat2.表达瞬时下调[31]．除了AAT之外，还有多种其他酶及其编码基因参与酯制备，例如脂肪酸去饱和酶（FAD），醇脱氢酶（ADH），脂氧合酶（LOX）。在桃树水果中，HA（热空气）和UV-C治疗有效地促进了酯的排放，这与上述规定一致PpAAT那PpFAD和PPACX1 / 2.表达式[32]．在梨果实,Puloxs.和PuAAT在1-MCP中急剧抑制，抑制Puloxs.和PuAAT基因可以归因于较低含量的总挥发物和酯的原因[24]．而且，过表达时尚（FAD3和FAD7)促进了番茄果实中亚麻酸含量的增加，促进了挥发物的积累[33]．在番茄中，LOXC已被证明直接参与香气挥发物的生产[27]．在猕猴桃中，酶及其编码基因主要集中在脂氧合酶（LOX）和醇酰基转移酶（AAT）上。Lox酶的活性趋于果实成熟增加，并通过乙烯处理上调[11那12，尽管在番茄中乙烯刺激一些转录本的积累液态氧基因，包括TomLoxc参与风味挥发性生产，并抑制其他液态氧基因(27]．AAT酶的活性是专用于产生乙烯的猕猴桃，酯的生产取决于亚乙烯调节的AAT酶水平[13]．至于编码基因，有6个液态氧基因(AdLox1-6)和12aat（ADAT1./2/6./17/22那AeAT9那ACAT15/16/20./23/24那AAAT18)，并且AdLox1那AdLox5和12aat被认为是与味道相关的酯类合成的潜在候选物质[11那12那14]．Günther等。确认积累AAT1那AAT2.那AAT15那AAT16那AAT17和AAT18转录本依赖于乙烯诱导的成熟[13]．AcAAT表达表现出丙烯处理的Kiwifruit急剧增加[3.]．目前基于转录组的分析和WGCNA分析显示了3个关键基因(adaldh2.那adfad1.和ADAT17）对Kiwifruit酯产生批判密性重要，并突出了这些基因在猕猴桃中了解酯代谢的重要性。系统发育分析表明ADAT17聚集有关的风味aat从其他植物物种，包括Faaat2.那vpaat1.那CMAAT1-3和苹果AAT1-4.（附加文件2：图S3），而且adfad1.集群最亲密的与ATFAD2.（附加文件2:图S4)，它与ER 18:1去饱和酶活性共同作用于脂肪酸[34]．

水果酯生物合成的转录机制

除生物合成途径外，涉及酯代谢转录控制的转录因子的信息很少，最近的研究主要集中在萜类生物合成方面。例如,猕猴桃AaNAC2/3/4参与的转录调控TPS基因(AATPS1.)及单萜生产[18];柑橘CitAP2.10和CitERF71相应调控TPS基因(CsTPS1和CITTPS16)，并对(+)-瓦伦辛和E.-香叶醇代谢，分别[16那17]．此外，在草莓中发现ERF-MYB转录复合物调控呋喃醇的生物合成FAQR.启动子(35]．然而，据报道，很少有TFS对酯类生物合成具有调节作用。目前的发现表明，其中一个关键的生物合成基因（adfad1.)被AdNAC5激活，被AdDof4抑制(图。6.)，为酯类代谢的转录调节模块提供了一个基本的例子。NAC转录因子(AaNAC2/3/4)参与猕猴桃萜的生物合成[18，然而，系统发育树与AdNAC5与报告的顺序NACS.在A. Chinensis.和A. Arguta.和AdNAC5对萜烯生物合成的Kiwifruit NAC没有高同源性和更密切相关的基因（AT5G61430.1，AT5G07680.1和AT3G18400.1）拟南芥都是功能上没有特征的(附加文件2：图S5）。

在植物中，Dof转录因子被广泛报道参与许多生物过程，如甘薯SRF1，玉米Zmdof3和猕猴桃addof3.参与调节碳水化合物和淀粉代谢[20.那36那37]．香蕉MaDof23与MaERF9互作调控果实成熟[38然而，DOF转录因子在香气生产中的作用很少被研究。因此，NAC和DOF对Kiwifruit酯相关基因的调节作用不仅提供了有关水果香气（特别是酯生物合成）调节的新信息，而且还提出了可能有助于挥发性代谢的新型转录因子。

总之，使用GC-MS本研究表明，在成熟的“Hayward”的猕猴桃中，使用四个主要酯（甲基丁酸甲酯，甲基苯甲酸甲酯，甲苯甲酸甲酯，苯甲酸乙酯和乙酯）的作用。进一步研究基于RNA-SEQ和WGCNA，提出了三个关键结构基因（adfad1.那ADAT17和adaldh2.)用于酯生产。此外，测试转录因子在转录调控中的作用，将AdNAC5作为转录激活因子，AdDof4作为转录抑制因子adfad1.启动子。总的来说，这些发现为猕猴桃成熟过程中挥发物的产生以及特定结构基因和转录因子在酯代谢中的作用提供了新的见解。

植物材料和治疗

成熟的猕猴桃(Actinidia Deliciosa.[一种。chev。] c.f.梁等人。弗格森·瓦尔。熟食店简历。海沃德在2015年赛季收获了一座商业果园（中国山西），其平均可溶性固体（TSS）为6.19％。Kiwifruit'Hayward'是最初来自新西兰的繁殖植物材料，在中国科学院武汉植物园提供。我们宣布，本研究中的Kiwifruit材料符合机构，国家和国际收集和培养任何植物材料的准则。没有可见缺陷的均匀尺寸的果实分为三个批次。用c处理一批₂H_4.(ETH, 100 μl l .⁻¹1 μl l . mcp处理⁻¹第三批密封在空气中作为对照(空气，24 h, 20°C)，均置于20°C。每个处理包含三个大约200个果实的生物复制。在每个采样点，每批采集3个重复，共4个果实。每隔一段时间取样，材料(小块剥去皮或种子的外果皮)用液氮冷冻，在−80℃保存。处理和样品采集，以及成熟相关指标(硬度、细胞壁材料、淀粉、TSS、乙烯)按Zhang等[20.]．

挥发性分析采用GC-MS

根据Zhang et al.和Wu et al. [12那39]．将冷冻肉组织在液氮中研磨，总共2g肉转移到含有3ml饱和氯化钠溶液的10ml小瓶中。每个样本点有三个重复。在密封小瓶之前，加入10μl2-辛醇（0.8mg / ml）作为内标。在剧烈涡旋后，样品在45℃下平衡30分钟，用固相微萃取（SPME）纤维收集的挥发物涂有65μm的聚二甲基硅氧烷和二乙烯基苯（PDMS-DVB）（SupeLco Inc.，Bellefonte，Pa，美国）。使用Agilent 7890N气相色谱仪鉴定挥发性化合物，其与Agilent 5975C质量分光光度计（Agilent，Palo Alto，Ca，USA）偶联。Agilent 5975C质谱仪配备有DB-WAX柱（30米，0.32mm，0.25μm，J＆W科学，Folsom，CA，USA）。烤箱温度程序在40℃下开始，并以3°C min的速率增加至100°C⁻¹，然后以5°C min的速率升降至245°C⁻¹．以1.0mL min的流速用作载气的氦气⁻¹．MS的源温度为230℃，并且通过70eV的电子能量在250℃下通过电子能量电离柱流出物。质量扫描在35-350 m / z的范围内完成。通过将它们的电子电离质谱与NIST / EPA / NIH质谱库（NIST-08）与真实标准的保留时间进行比较，进一步验证挥发性化合物的鉴定。

RNA提取和cDNA合成

按照Yin等人所描述的方法从冷冻猕猴桃果肉中分离出总RNA [40]．从每个样品中，使用PrimeScript 1st Strand cDNA合成试剂盒(TaKaRa, Dalian, China)，按照制造商的协议，逆转录1 μg总RNA在20 μL溶液中。在每个采样点进行RNA提取和cDNA合成，共3个生物重复。

RNA-seq, WGCNA和基因网络可视化

RNA-seq的细节由Zhang等人描述[20.]．SRA接入号为SRR6885590-SRR6885601、SRR7630964-SRR7630969。

使用r中的wgcna（v1.29）包创建了共表达网络[41]．WGCNA共表达网络分析的数据为存储过程中产生的5类香气成分(萜类、醇类、醛类、酮类、酯类)和剔除无可检测基因后的所有RNA-seq基因(FPKM = 0)。共使用26111个基因作为已签署的WGCNA网络构建的输入。采用自动网络构建功能块来构建模块。在标准WGCNA网络中，软实力设置为6，最小模块大小为30,merge Cut Height值为0.25。最初的聚类是根据特征基因合并的。计算每个模块的特征基因值，用于搜索与风味化合物的缔合关系。WGCNA使用软阈值来保持数据集的连续性，并消除设置任意相关得分截止值的需要。“蓝色”和“品红”的候选中心基因以0.7的阈值进行挑选。通过Cytoscape (v3.7.1, USA)软件对酯含量、转录因子和候选靶基因的网络进行可视化分析。

实时PCR分析

使用LightCycler®480仪器（Roche）用Lighcycler®480SYBRGreen I Master（Roche）套件进行实时PCR。有关结构基因的信息列于附加文件中3.S1:表。采用引物3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3)，并在附加文件中列出3.S2:表。Yin等通过熔化曲线和PCR产物重测序双重检查引物的特异性[40]．用Kiwifruit actin监测丰富的cDNA模板，其稳定地表达了kiwifruit成熟阶段[11]．分析了三种生物学重复进行实时PCR。PCR程序在95℃下用5分钟的初步步骤引发，然后在95℃下进行45个循环，10s，60℃，10 s，72℃。用2分析数据^——∆Ct方法通过转录本丰度计算基因的相对表达量。

基因分离及启动子克隆

基于RNA-SEQ结果，用基因特异性引物分离和验证与酯生物合成相关的差异表达基因（DEGS），并通过PCR验证基因特异性引物（附加文件3.：表S2）使用CDNA从CV。'海沃德'。转录因子来自我们之前的报告[20.]．

利用RNA-Seq结果和猕猴桃基因组数据库作参考[42，扩增启动子序列(附加文件3.:表S3)。来自“海沃德”的基因组DNA (gDNA)作为扩增的模板ADAT17和adfad1.启动子。引物列于附加文件中3.:表S4。

Dual-luciferase化验

11转录因子的全长序列被整合到PGREEN II 0029 62-SK载体（SK）中20.的推广者ADAT17和adfad1.插入PGREEN II 0800-LUC载体（LUC）。

重组SK和LUC载体转染农杆菌肿瘤术GV3101，用甘油在−80℃下保存。注射前，在新的LB板上加入50 μg ml激活甘油储备⁻¹卡那霉素25 μg ml⁻¹庆大霉素。然后是农杆菌将重组载体悬浮在渗透缓冲液中（10mM MgCl₂，10 mm mes，150 mm acetosyringone，pH 5.6）至最佳密度（OD₆₀₀~ 0.75)。之后，100 μl农杆菌含启动子与1ml的农杆菌将含有转录因子的培养物注入烟草(烟草）叶使用无针注射器。空SK向量被注入控制。渗透后三天，使用双荧光素酶测定试剂（Promega）以在制造商的指示之后测量LUC和REN荧光强度。用三种生物重复进行双荧光素酶测定。

统计分析

结果采用DPS7.05(浙江大学，杭州，中国)进行分析，比较显著性差异，使用最低显著性差异(LSD)在5%水平。用TBtools软件绘制热图。图用Origin 8.0 (Microcal Software Inc.， Northampton, MA, USA)绘制。统计学意义用学生的计算T.以及(*P.< 0.05, * *P.< 0.01和***P.< 0.001)。

原始资料已提交[20.]．SRA接入号为SRR6885590-SRR6885601、SRR7630964-SRR7630969。

1-MCP：

1-methylcyclopropene

AAT:

乙酰转移酶

抗利尿激素:

醇脱氢酶

ALDH:

醛脱氢酶

:

酰基转移酶

d:

一天

景深:

用一根手指结合DNA

eth：

乙烯

时尚:

脂肪酸去饱和酶

气相:

气相色谱分析-质谱法

HPL：

氢过氧化物裂解酶

液态氧:

Lipoxygenas

TFs:

转录因素

WGCNA:

加权基因共表达网络分析

感谢英国诺丁汉大学Don Grierson教授对手稿的大量修改，感谢浙江大学农业实验站荣静小姐对植物的栽培。

国家重点研发计划项目(no . 2018YFD1000200);国家自然科学基金项目(no . 31722042, no . 31901737);霍英东教育基金项目(no . 161028)。资助方没有参与材料的创作、研究的设计、数据的分析和手稿的撰写。

隶属关系

1. 鲁东大学食品工程学院，山东烟台264025

   张爱迪，龚汉生，范新广，杨延庆

2. 鲁东大学生物纳米技术研究所，山东烟台264025

   张爱迪，龚汉生

3. 浙江大学紫金港校区农业与生物技术学院，杭州，310058

   张秋云，刘晓芬，尹学仁

4. 湖东大学农业学院，山东烟台，中华人民共和国264025

   剑招李

贡献

YXR和Zad设计了这项研究。Zad，LJZ，ZQY和LXF进行了实验。ZQY，FXG，GHS和YYQ分析了数据;YXR和ZAD写了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应到爱张或当地阴．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

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