磷酸盐转运蛋白，pnpht1; 1和pnpht1; 2来自田七增强磷酸盐和砷植物

背景

田七是一种药用重要的中草药，具有悠久的培养和临床应用。种植区主要分布在文山县，质量和安全三七一直受到来自土壤的高浓度砷的威胁。在该物种中，磷酸(Pi)转运体参与Pi获取和砷酸盐(AsV)耐受的作用尚不清楚。

结果

在本研究中，两个开放阅读框架(orf)PnPht1; 1和PnPht1; 2分开三七基于RNA-SEQ克隆，分别编码527和541个氨基酸。相对表达水平的结果表明，两种基因对PI缺乏或暴露进行了反应，并且高度上调。不同的表达酿酒酵母MB192揭示了这一点PnPht1; 1和PnPht1; 2在补充酵母pi运输缺陷时最佳地进行，特别是在PnPht1; 2．细胞表达PnPht1; 2对AsV的耐受性比PnPht1; 1-表达细胞，高pi浓度下细胞中As积累较少。与血浆膜定位的结果相结合，这些数据证实转运蛋白PNPHT1; 1和PNPHT1; 2占用高亲和力H⁺/小时₂宝_4.^-介导Pi和AsV的摄取。

结论

PnPht1; 1和PnPht1; 2编码有功能的质膜定位转运蛋白，介导假定的高亲和力Pi/H⁺Symport活动。表达式PnPht1; 1或PnPht1; 2在突变体菌株中可以增强pi和asv的摄取，这可能对根部的积累负责三七．

田七（Burk.) F.H. Chen is a rare and well-known perennial herb, of which the main medicinal part is radix, and has been used for 600 years in clinical treatment with clearly medicinal actions of dissipating blood stasis, arresting bleeding, blood-activating, and inflammation-diminished, thereby promoting the elimination of swelling and relieving pain [1那2那3.]．云南省文山自治州以种植紫荆花而闻名三七，背景土壤中砷(As)的浓度非常高，部分原因是采矿活动和使用含砷农药[2那4.]．前期研究发现，文山地区近一半耕地出现As过量危机，共分析了21块耕地[1]．因此，作为积累三七有土壤中的背景值闭合链接。调查表明，随着偶数的含量，茎和花中的含量超过阈值（2.0mg / kg，作为中国的中国绿色贸易标准的标准，中国）。31个样本中的过度标准率高达56％[5.那6.那7.]．

作为一种剧毒材料，砷对人体健康非常危险，其中毒性效应将通过生物浓缩来放大[8.]．磷(P)是一种必需的宏量营养素，在膜、磷脂和核酸的生物合成、能量传递反应和信号转导中发挥重要作用[9.]．磷酸盐（PI），例如H.₂宝_4.^-磷是土壤中无机磷的主要形式，通过磷转运体被植物吸收，而磷转运体通常是由产生的质子梯度驱动的，即质膜H⁺-AtPases [10那11那12]．

由于类似的P和AsV的电化学特性,研究发现,π转运蛋白不仅用来调解π吸收和易位在植物而且AsV的载体,这是一个初级plant-available形式的土壤(12那13]．大量的Pi转运体参与了Pi和As的摄取，如PvPht1;3 inPteris Vittata.[13]，pht1; 9 in拟南芥[9.8、OsPT1、OsPT2、OsPT4、OsPT8奥雅萨苜蓿[14那15那16那17), HvPht1; 8大麦芽[18]，pht1; 3，pht1; 4和pht1; 12柳树spp。19]．Pi转运体有三个亚家族，分别是Pht1、Pht2和PHO，其中Pht1通常由微摩尔Km值诱导，属于高亲和力的Pi转运体，Pht2以微摩尔Km组成表达，被称为低亲和力的Pi转运体[20.那21那22那23]．由于AsV和Pi之间的竞争摄取，通过补充足够的Pi来抑制AsV摄取是一种常见的机制[13那24]．有证据表明，Pi浓度的增加抑制了AsV的摄取，这主要是由于Pht1的作用下降[25那26]．但是，减轻ASV摄取可能会受到某些上调表达的影响PHT1.基因[18那27那28]，带有对ASV的低亲和力的转运仪[13那29]．

目前，关于PI运输扣的角色知之甚少三七在PI缺乏或暴露的应力下的PI和ASV的摄取。在这项研究中，我们专注于鉴定两种PI转运蛋白编码基因及其作用，以提高PI和ASV采集，这两者PnPht1; 1和PnPht1; 2与纤维根分开P. notoginseng，并对PI缺乏或暴露的应力肯定响应。在本文中，一种揭示PNPHT1和PNPHT1的PI / ASV吸收机制的理想方法.2是采用突变酵母，可显着改变这种摄取的PI-ASV相互作用。表达式PnPht1; 1和PnPht1; 2当Pi添加量足够时，突变体细胞对As的吸收和积累降低。此外，亚细胞定位的结果将有助于阐明PnPht1;1和PnPht1;2在Pi/AsV摄取中的作用。我们的研究结果将有助于实现抑制As积累三七并降低与之相关的健康风险。

PnPht1; 1和PnPht1; 2编码两个Pht1 Pi转运体

的ORF长度PnPht1; 1和PnPht1; 2cDNA分别为1581 bp和1623 bp。预测翻译产物为527和541个氨基酸PnPht1; 1和PnPht1; 2计算的分子质量和等电点分别为57.53 kDa/9.08和59.43 kDa/9.43。PnPht1;1和PnPht1;2 Pi转运体相似，由11个跨膜结构域和一个Pht1特征序列(GGDYPLSATIxSE)组成[30.]在红线框中，如图2所示。1．PnPht1;1、PnPht1;2与已知植物Pht1蛋白具有较高的同源性，与LsPht1 (GenBank登录号KY305670.1)具有76.2和79.3%的同源性，与OsPht1 (AY332471.1)具有69.0和68.8%的同源性，与SoPht1 (XM_022007438.1)具有69.7和70.3%的同源性(图2)。1）.系统发育分析证实两者都是PnPht1; 1和PnPht1; 2属Pht1亚家族，与Pht1亚家族亲缘关系非常密切n benthamiana和P.Vittata.同源物NTPHT1; 1和PVPHT1; 1，特别是与前者（图。2）.另外，瞬态表达PnPht1; 1和PnPht1; 2在n benthamiana叶片清楚地表明，它们都定位于质膜(图。3.)，类似于其他Pht1基因，如:PvPht1; 2和PvPht1; 3在P.Vittata.[13]．

PnPht1; 1和PnPht1; 2根系中的基因表达三七磷缺乏症和砷暴露

发现了一个明显的现象:两者都有PnPht1; 1和PnPht1; 2积极应对PI缺乏或作为暴露，并且高度上调（图。4.）.实际上，上调的PnPht1; 1和PnPht1; 2在pi缺乏的压力下较高，而不是暴露，呈现出显着差异PnPht1; 2在具有或不具有或不用的低PI处理下，PnPht1; 1: lPnAs增加28.4倍，lPhAs增加25.6倍，mPhAs增加8.5倍，hPhAs增加10.8倍;PnPht1; 2: lPnAs增加105.6倍，lPhAs增加67.2倍，mPhAs增加5.4倍，hPhAs增加11.8倍。注意，补充AsV可以降低lP组(lPnAs和lPhAs)的表达水平，例如:PnPht1; 1：2随着LPNA的8.4倍增加，LPNAs增加25.6倍;PnPht1; 2:增加105.6倍，增加67.2倍。有趣的是，与低磷酸(lP)处理相比，其表达水平PnPht1; 1和PnPht1; 2在补充质量下急剧下降（0.7 mm和1.4毫米）。

酵母MB192的补体试验

不同的表达PnPht1; 1和PnPht1; 2在突变酵母MB192中，通过增强PI吸收使高亲和力PI转运蛋白中的缺陷互补，使酵母能够以低浓度的PI（0.002mm和0.02mm）存活（图。5.）.od.₆₀₀菌株MB192 -PnPht1; 1和MB192 -PnPht1; 2显着高于MB192和MB192-YEPLAC112的高度，并且在WT型附近（图。5.a).细胞表达的两个对数期PnPht1; 1或PnPht1; 2第10 ~ 25 h。5.a).可见，培养MB192-的培养基颜色PnPht1; 1或mb192-PnPht1; 2在0.002 mM、0.02 mM和0.06 mM Pi浓度下，呈黄色，与WT相近，而MB192和MB192- yeplac112呈紫色或淡黄色。5.b).颜色随pH变化，与酸性磷酸酶活性(ACP)密切相关。如图1所示。5.C，MB192的ACP-PnPht1; 1和MB192 -PnPht1; 2高于MB192-YEPLAC112和MB192的差异显着差异。酵母生长的最佳pH值为6，然后是5（图。5.d).另外，OD值₆₀₀MB192-PnPht1; 1和MB192 -PnPht1; 2由呼吸抑制剂，氰化物的补充剂清晰抑制m- 氯苯基肼（CCCP），或2,4-二硝苯酚（2,4-DNP）（图。4.e）。因此，这些结果证实了PI转运蛋白，PNPHT1; 1和PNPHT1; 2的结论是推定的高亲和力H.⁺/小时₂宝_4.^-举例者，介导PI吸收。

此外，通过基于对数生长阶段的指数回归评估生长速率系数。代表性测定如图2所示。6.a-c，以及独立获得的每个转运体的若干生长速率系数的平均值(N= 4)如图所示。6.d.在低Pi浓度(20 μM)下，MB192-YEplac112的生长速率系数相对较低(0.0984)，而细胞滞留PnPht1; 1或PnPht1; 2具有较高的系数（0.1594,0.163）。这些结果表明，PNPHT1; 1和PNPHT1; 2个PI转运蛋白在补充酵母PI转移缺陷时最佳地进行，特别是在PNPHT1; 2。

酵母细胞表达PnPht1; 1和PnPht1; 2改善是宽容

目前的证据表明，磷酸转运系统是AsV吸收的主要途径。然而，充足的Pi会竞争性地抑制AsV摄取[28]．如图1所示。7.在50 μM Pi培养基中，转基因酵母与突变菌株的生长趋势相似，表明转运体PnPht1;1和PnPht1;2对Pi和AsV具有相同的吸收特性。表达细胞的生长速率系数PnPht1; 1或PnPht1; 2在50μmpi下方高于上一节中描述的低PI（25μm）培养基中测定的值。在80μm的ASV处理下，MB192-YEPLAC112的生长速率系数，MB192-PnPht1; 1和mb192-PnPht1; 2，分别为0.0562,0.0892和0.1036（图。7.A，B，C）。通过在不存在的情况下，通过计算作为暴露的生长的生长百分比来评估每种转基因系的耐受性。结果表明，MB192的耐受性PnPht1; 2比MB192显着强烈PnPht1; 1和MB192-yeplac112。尽管作为MB192的宽容PnPht1; 1也大于MB192-YEplac112，差异不明显(图2)。7.d）。

如图1所示。8.a，od₆₀₀WT，MB192-PnPht1; 1和MB192 -PnPht1; 2随着磷浓度从20 μM增加到100 μM，磷含量显著增加，说明高磷浓度减轻了AsV的胁迫。然而，OD的变化₆₀₀突变株的变化不明显。此外,OD₆₀₀的PnPht1; 2-表达细胞略大于MB192-PnPht1; 1在含有80μmAsv的相同处理下没有显着差异。该现象显示PI添加可以提高概率，PI转运蛋白在ASV的竞争下吸收PI。在高水平的pi浓度下，pnpht1; 1和pnpht1; 2优选组合pi。该发现由WT，MB192的细胞中的积累加强PnPht1; 1和MB192 -PnPht1; 2，随着添加高pi浓度而降低（图。8.b). MB192-的下降AsPnPht1; 2从20μm至100μmpi浓度以及wt呈现出显着差异。作为MB192的浓度PnPht1; 1或mb192-PnPht1; 2在20或100μm的pi浓度下显着小于20或100μm的pi浓度，但显着高于Mb192和Mb192-yeplace112的突变菌株在20μmpi以下（图。8.b).值得一提的是，MB192-的As浓度之间仍然存在显著差异PnPht1; 1和100μmpi以下的突变菌株。对于MB192-PnPht1; 1和MB192 -PnPht1; 2，在100 μM Pi浓度下差异显著。MB192 -PnPht1; 1砷的积累是表达细胞的2.3倍PnPht1; 2，提示PnPht1;1较PnPht1更可能合并AsV;结合图中As公差的结果。7.D，得出结论，转运仪PNPHT1; 1和PNPHT1; 2具有不同的同化能力和诸如PnPht1; 2-表达细胞具有较强的As耐受性。此外，高浓度的Pi可以缓解As胁迫。

三七是一个重要的中药植物，其中根茎是含有活性物质的主要药用部分，例如，NOTOGINSENOSIDE。但是，质量三七已经受到主要生产领域的高浓度威胁[1]．栽培的结果表明，作为含量的含量三七升高的ASV浓度升高，但在高度治疗下，高水平的PI浓度显着降低（图S1）.在此过程中，PI运输商在摄取和易位中发挥着至关重要的作用[31那32]．

在此，我们鉴定了两个Pi转运体编码基因，PnPht1; 1和PnPht1; 2的纤维根三七在PI缺乏和ASV暴露的治疗下。根据生物信息学和系统发育树，PNPHT1; 1和PNPHT1; 2属于具有签名序列“GGDDYPLSATIXSE”和11个跨膜结构域的亚家族pHT1（图。1和2），这是PI吸收和易位的主要途径[13]．进一步的证据表明，PI转运蛋白不仅对PI吸收负责，而且还负责P，例如P.，例如[16那27]．这一发现表明PI和ASV之间的基材的竞争关系[17那33那34]．然而，Pi或As与Pi转运体的亲和性取决于Pi转运体的特性、Pi和As的浓度、持续时间或化学形态以及植物的组织[19那26那35那36那37]．在本研究中，qPCR结果显示PnPht1; 1和PnPht1; 2通过PI缺乏或ASV暴露诱导表达。相比之下，回应PnPht1; 1和PnPht1; 2PnPht1;1和PnPht1;2可能是高亲和力的Pi转运体。有趣的是，AsV浓度的增加降低了PnPht1; 1和PnPht1; 2在低PI治疗组（LPNA和LPHA）中，尤其是PnPht1; 2(无花果。4.）.越来越多的证据表明，许多Pht1基因可以显著响应钙离子缺乏或砷暴露的诱导，如上调OSPT1.那OSPT2.那OSPT4.和OSPT8.在o .漂白亚麻纤维卷那CMPT1在菊花莫瑞菊,PvPht1; 3在P.Vittata.在缺磷或砷照射下[13那38那39]，下调PvPht1; 1在P.Vittata.在暴露下[13]．偶尔，Pi转运体几乎没有转运AsV的能力，例如:PvPht1; 2在P.Vittata.[40]．因此，需要进一步的研究来阐明可能调控的特性PnPht1; 1和PnPht1; 2．

随后，在酵母突变体MB192敲除高亲和Pi转运蛋白编码基因后，通过互补分析PnPht1;1和PnPht1;2的特性。酵母细胞表达PnPht1; 1和PnPht1; 2可以弥补高亲和Pi转运体缺失的缺陷，在低Pi浓度(2和20 μM Pi)下生长良好(图2)。5.）.pH依赖性和ACP活性测定的结果表明，pnpht1; 1和pnpht1; 2是h⁺依赖型Pi转运体，由H⁺浓度梯度。酵母细胞表达PnPht1; 1或PnPht1; 2在添加CCCP或2,4- dnp(典型的原核载体)的培养基中明显抑制，导致对阴离子的吸收受到抑制[41]．这一发现与之前的报道通常是许多pht1蛋白质通常是h⁺/小时₂宝_4.^-在质膜上参与能量依赖的转运，介导Pi的摄取[9.那12那39那42那43]．这证实了我们对PnPht1;1和PnPht1;2的定位分析。3.）.然而，H⁺/小时₂宝_4.^-膜中的Symport尚未确定，可能是由于质子和甘油-3-磷酸酶Symperate的机制大肠杆菌[39那44那45]．

如上所述，AsV和Pi的摄取和转运之间存在复杂的关系。细胞质中的AsV与Pi竞争，形成不稳定的ADP-AsV复合物，从而扰乱能量流动[46那47]．因此，对后处理植物的高水平PI供应可以通过降低氧化损伤来降低膜损伤[48]．在种植园实验中，研究发现PI供应可能抑制植物的摄取[26那49那50那51，这与图中所示的结果一致S1．此外，我们的结果表明酵母细胞表达PnPht1; 1和PnPht1; 2由于容忍，特别是在PnPht1; 2通过比较与MB192-载体的差异有显着差异，由生长速率系数和作为容差指数表示（图。7.）.此外，细胞也有藏身之处PnPht1; 2有一个强大的耐受性宽度，而且PnPht1; 1- 扩张细胞累积更多砷（图。8.b）。判断PNPHT1; 1优选与PNPHT1相比结合ASV的假设; 2。此外，表明一种有趣的现象表明，作为转化体患者的浓度PnPht1; 1或PnPht1; 2显著低于野生型。这可能与PHO84敲掉突变体和两个靶基因。PHO84-overexpressing酿酒酵母明显增强了AsV的吸收[52]．总之，作为互补突变菌株，MB192的能力PnPht1; 1和MB192 -PnPht1; 2与野生型相比，Pi或AsV的吸收能力相对较弱。这些观察结果与以往的研究一致，共同表明高亲和力的Pi转运体对AsV的吸收具有相似的特异性，并在增强AsV的吸收和耐受中发挥重要作用，如PvPht1;3 inP.Vittata.[13]和OSPT1 INo .漂白亚麻纤维卷[15]．作为高亲和力pi转运蛋白，pht1; 1-3答:芥显示ASV摄取的慢速，最终使突变体能够积聚在野生型植物中的砷[35]，而AtPht1;5或AtPht1;7也更倾向于Pi而不是AsV [13]．相反，虽然发现OSPT8对PI和ASV具有高亲和力，但是Wu等人。认为PI运输器仅略微贡献为摄取[14]．占用PNPHT1; 1和PNPHT1; 2响应PI缺乏或暴露的应力，并改善了ASV的耐受性，特别是在高水平的PI浓度下。需要许多努力来研究使用PHT基因的可能性三七提高对缺磷或砷胁迫的适应性，如构建稳定pnpht1; 1-或PnPht1; 2超表达系统P. notoginseng。

在本研究中，我们揭示了PnPht1;1和PnPht1;2的作用三七在pi和asv的摄取。QPCR的结果表明PnPht1; 1和PnPht1; 2对磷缺乏症或砷暴露有反应，且高表达。然而，表达水平PnPht1; 1或PnPht1; 2在补充足够的磷酸盐时减少。不同的表达酿酒酵母MB192揭示了这一点PnPht1; 1和PnPht1; 2在补充酵母pi运输缺陷时最佳地进行，特别是在PnPht1; 2．细胞表达PnPht1; 2对AsV的耐受性比PnPht1; 1-表达细胞，高pi浓度下细胞中As积累较少。此外，磷供应还能抑制根内砷的积累P. notoginseng。一起服用，我们确认了这一点PnPht1; 1和PnPht1; 2编码有功能的质膜定位转运蛋白，介导假定的高亲和力Pi/H⁺Symport活动。表达式PnPht1; 1或PnPht1; 2在突变体菌株中可以增强PI和ASV的摄取，这可能负责作为积累三七．

三七材料和实验设置

全部三七本研究中使用的幼苗是从文山苗翔三桥科技有限公司购买的，并由荣华教授识别，专业从事中国草药的鉴定，培养和加工。

一岁的三七状况良好，在标准种植园中栽培被移植到园林盆中。这些幼苗的体重，高度或叶子数量没有显着差异。栽培培养基是含有20％轻质聚集体，40％膨胀的蛭石，30％粘土和10％淤泥，根据Mandal等人进行修饰。[53]．经1% NaHCO二次冲洗后，土壤中溶解磷浓度降至0.07 mM_3.．通过添加kh将Pi浓度调节至0.07mm，0.7mm和1.4mm（干重）₂宝_4.，这是最小的限制，增长促进和过度浓度三七．将3个浓度处理称为低磷酸盐（LP），中磷酸盐（MP）和高磷酸盐（HP）。在种植之前，砷酸钠（NA_3.aso._4.)掺量为0.2 mM(干重)的混合土。As浓度与云南文山自治州主产区土壤背景值相当[4.]．在实验中，总共设定了5种处理，如下：LPNA，LPHA，MPHA，HPNA和HPHA。同时，MPNA被视为对照检查（CK）。由于混合土壤中没有矿物营养，50毫升1/4的Hoagland的溶液缺乏磷的溶液每3天滋养植物，其中kh₂宝_4.被kno所取代_3.．三七在25°C，相对湿度85％的相对湿度下增长，避免直射阳光和温室积累。5个月后，收获新鲜的纤维状根，用去离子水冲洗，冷冻在液氮中，并储存在-80℃。每种治疗都有八个生物重复和每次重复的四种植物。

根茎中总量的分析三七

根茎中的总浓度三七被确定为Wu等人所述。[14]和徐等人。[54]．植物样品被磨成细粉，用HNO消化_3.: H₂O.₂(85:15, v / v)。然后，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS) (Agilent 7500c，美国)测定消解液。

克隆的PnPht1; 1和PnPht1; 2

开放阅读框(ORF)的碱基对信息PnPht1; 1和PnPht1; 2是从成绩单中获得的三七如上所述处理的根。底漆PnPht1; 1和PnPht1; 2对于ORF克隆列在表中1．将第一链cDNA用作ORF PCR扩增的模板，其用Primescript II第1链CDNA合成试剂盒（Takara，Japan）的总RNA与总RNA相反转录。用小纤维植物RNA提取试剂盒（Takara，Japan）从纤维根中提取总RNA。PCR程序包含初始变性步骤（94℃/ 5分钟），然后进行35个94℃/ 1分钟，58℃/ 30 s，72℃/ 1分钟，并在4℃下保持。该序列已提交给NCBI，其中GenBank登录号PnPht1; 1和PnPht1; 2是MN420501和MN420502。

QPCR.

按上述方法提取5个处理组(lPnAs、lPhAs、mPhAs、hPnAs、hPhAs)和control check (mPnAs)的须根总rna。以cDNA为模板，用Primescript RT试剂试剂盒和gDNA擦除器(TaKaRa, Japan)进行逆转录。所有qpcr均用TB Green进行预混料Taq交货（TLI RNASEH PLUS），ROX PLUS（Takara，Japan）与特异性特异性引物（表1）根据制造商的指示。每种20μl反应系统含有10μLTB绿色混合物，100ng cDNA和每种引物的0.2μm。26S-2作为内参基因，用于RT-qPCR数据的归一化[55]．引物对如表所示1．最后，利用2^-ΔΔct方法 [56]．

生物信息学分析

利用在线软件鉴定了cDNA全长的ORFhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/．疏水、等电点、蛋白质分子量和假定的跨膜结构域的位置是通过安装在http://expasy.org/tools/protscale.html．使用DNAMAN（DNAMAN V6.0，Lynnon Biosoft，USA）进行多种肽取向。系统发育分析使用了Mega V4.0软件。

酵母突变菌株的互补缺陷PI吸收

酿酒酵母MB192（马塔pho3-1 pho84::HIS3 ade2 leu2-3, 112 HIS3 - 532, trp1-289 ura3-1, 2 can1)高亲和力Pi转运基因缺陷PHO84通过插入HIS3 DNA片段作为异源表达酵母，用于摄取PI和作为[11那57]．orfsPnPht1; 1和PnPht1; 2放大使用Transustart Fastpfu.DNA聚合酶（Transgen Biotech，中国）含有含有限制酶切割部位的底漆对（表1）.用相应的酶消化所得的扩增子BAM你好/kpn.我和Xba我/xma.然后，在制造商的协议之后，使用T4 DNA连接酶（NEB，USA）引入表达载体yeplac112与它们各自的识别位点。通过限制酶消化和DNA测序定义所得重组质粒的结构大肠杆菌（DH5α）。使用Bio-rad电穿孔设备（Bio-Rad Laboratories，Richmond，USA）通过电动变换将两种重组质粒和空载体YePlac112转化到MB192细胞中[58]．总共3种转化体，包括MB192-PnPht1; 1MB192 -PnPht1; 2屈服于MB-YEPLAC112。野生型（wt）酿酒酵母被用作阳性控制。通过SD-TRP挑选阳性转化体^-选择性培养基。将单克隆细胞转移到补充有4.5μmPI的酵母氮气基培养基中，通过质粒提取和测序验证重组质粒。

对于PI浓度的影响，将鉴定的酵母重新培养到对数阶段（OD₆₀₀ = 0.6) in the YNB liquid medium. Then, 100 μL of suspension liquid was diluted to 5 mL and cultured at 200 rpm and 30 °C for an additional 16 h, in which the medium was adjusted with a range of Pi concentrations (0.002, 0.02, 0.06, and 0.1 mM) and an initial pH of 6.8 [38]．使用溴甲酚紫色来表示pH的变化，这使得从黄色转移到紫色。在液体培养基的酸化期间，随着酵母细胞的生长和酸性磷酸酶活性（ACP）的生长，变化良好地相关[59]．pH依赖的磷吸收实验中，培养基pH值在4.0 ~ 8.0之间。将单克隆细胞转移到含80 μM Pi的YNB液体培养基中，在30℃、200 rpm条件下培养24 h。对于生长测定，OD值₆₀₀在5ml SD-Trp中每3或5 h检测一次^-含有20μmPI和2％葡萄糖的培养基，在200℃下，将pH调节至6和OD的初始浓度₆₀₀至0.03，细胞悬液为对数期[13]．因此，通过指数回归计算对数增长的增长率系数。

呼吸抑制剂对磷吸收的影响

当OD₆₀₀酵母悬浮液窝养PnPht1; 1或PnPht1; 2高达0.6，将100μl酵母悬浮液接种到5ml SD-TRP中^-含有80μmkH的培养基₂宝_4.2%葡萄糖，调节pH至6.0，含或不含羰基氰化物m-氯苯腙(CCCP)(10或50 μM)和2,4-二硝基苯酚(2,4- dnp)(100或200 μM) [39那60]．最初溶解在乙醇中并加入到培养基中至最终乙醇浓度为0.01％（v / v）[61]．光密度(OD₆₀₀）在培养后在振动200rpm 20小时和30℃下测量。

受Pi浓度影响的ASV摄取

用于测定生长速率和As耐受性，细胞表达PnPht1; 1那PnPht1; 2或YEplac112用10ml SD-Trp洗涤两次^-含有50μmPI和2％葡萄糖的培养基，其初始浓度为0.03（OD₆₀₀）.将AsV加入最终浓度为80 μM的培养基中，200 rpm, 30℃培养30 h。od.₆₀₀每3或5 h检测一次，以揭示对数期的生长速率系数和AsV耐受性[13]．通过测定OD值，研究了Pi浓度对其吸收的影响₆₀₀以及As在细胞中的积累浓度。首先，1ml OD₆₀₀= 0.6个转化体和WT悬浮液转移到50 mL SD-Trp中^-含有2％葡萄糖，不同的Pi浓度（20或100μm）和80μm的ASV的培养基，将pH调节至6.0。od.₆₀₀在用200rpm培养30 h和30℃的培养后测量酵母悬浮液。然后，将酵母细胞收集为5000rpm 5分钟，用25ml 10mM EDTA洗涤粒料两次[62]．经上述消化后，用ICP-MS(美国安捷伦7500c)测定总as。收集的数据进行4个生物重复，每个生物重复独立进行3个技术重复。

亚细胞定位PnPht1; 1和PnPht1; 2

PnPht1; 1和PnPht1; 2被克隆到PCOMBIA 1301 GFP二元载体（武汉·斯塔岛，中国），含有35s启动子，GFP和KAN⁺抗性基因使用BAMH /萨尔我认可网站。与此同时，这是n .烟草将质膜蛋白UPF0057基因(XM_016579128.1)作为膜特异性定位基因，通过克隆到上述修饰的二元载体(其中仅用RFP替代GFP)中BAMH /萨尔我的网站。将上述3个重组质粒转化为DH5α大肠杆菌感受态细胞(CD101，转基因生物技术，中国)。然后选取阳性克隆，测序并进行验证。重组质粒转移到农杆菌肿瘤术通过冻融方法EHA105 [63]．A. Tumefaciens.携带重组质粒的EHA105渗透到四周龄的叶片中n benthamiana通过下表皮注射1 mL菌悬液。用10 μM β-雌二醇(Sigma)浸润6-12小时后4-6天最终诱导细胞，并按Dong等人的描述进行瞬时表达分析[64]．使用Ultraview Vox激光双纺盘共聚焦实时成像分析显微镜（USA）获得图像。通过640,488和561nm激光激发自高荧光，GFP和RFP。

统计分析

在统计上处理并分析所有数据，使用Microsoft Excel 2010，SPSS 17.0和Sigmaplot 12.0 for Windows。在所有统计测试之前测试了差异的正常性和均匀性的假设。所有随后用单向分析（ANOVA）的单向分析进行显着差异，然后在0.05水平下进行Tukey HSD测试（包括相对表达水平）（图。4.)、ACP活性(图。5.c），OD₆₀₀（图。5.D和8.a），浓度（图。8.B，图S1)和生长速率系数(图。6.d）。此外，还用于0.05或0.01水平的独立样品T检验来分析差异，例如OD₆₀₀各处理(CCCP或2,4- dnp)与CK之间的差异(图2)。5.e），OD₆₀₀或As浓度在20 μM和100 μM Pi之间(图1)。8.）.所有图表数据均以均数±标准差(SD，N ≥ 3).

本研究产生或分析的数据包括在这篇发表的文章及其补充信息文件。的GenBank登录号PnPht1; 1和PnPht1; 2是MN420501和MN420502。

2,4-DNP：

2, 4-dinitrophenol

ACP：

酸性磷酸酶活性

ADP：

二磷酸腺苷

方差分析:

方差分析

作为：

砷

AsV:

砷酸

CCCP：

羰基氰化物法研究

CK：

控制检查

有限公司：

有限公司

EDTA：

乙二胺四乙酸

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

生命值：

高磷酸盐

HPHA：

高磷酸盐和高砷酸盐

hPnAs:

高磷酸盐和非砷酸盐

摘要:

电感耦合等离子体质谱法

lP:

低磷

lPhAs:

低磷酸盐和高砷酸盐

LPNAS：

低磷酸盐和非砷酸盐

议员:

中磷酸

mphas：

中磷酸和高砷酸盐

MPNAS：

中间磷酸盐和非砷酸盐

OD:

光密度

子:

开放阅读框

P：

磷

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

Pi:

磷酸

QPCR：

实时定量聚合酶链反应

招标书:

红色荧光蛋白

SD：

标准偏差

SD-Trp^-：

合成色氨酸漏出培养基

WT:

野生型

YNB：

酵母氮基

我们感谢Zhi-Wei Zhao（云南大学云南省云南省生物资源卫生利用国家重点实验室，为酿酒酵母MB192。

本研究得到了中国天然科学基金（2019FB122），云南基础研究项目（2019FB122），云南省（2017KF006）的国家重点实验室，云南省科技部（2017KF006），云南省科技部- 云南中医药大学应用基础研究联合专用资金（2017九十六（ - 019）; 2017FF117（ - 014））。本研究还由云南应用基础研究项目（2017FD109），国家重点研发计划（2017年FFC1700704），南方医学协同创新研究中心（30272100800），主要支出增加和中央级别的减少项目（2060302）。资金代理商在实验设计，数据收集和分析或准备中没有作用。

隶属关系

1. 中医学院，云南中医药大学，云南昆明

   曹冠华，李泽东，王希福，张雪，赵荣华，顾文，陈迪，余杰，何森

2. 云南大学云南省钻探保护与利用国家重点实验室，云南昆明，云南

   关 - 华曹

贡献

SH, JY和GC构思并设计了实验。DL、GC、XZ、XW、DC、WG等进行了实验、数据分析等。RZ帮助准备材料。本手稿由GC, SH和JY共同撰写。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到杰玉或森他．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

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