梨、桃和草莓果实发育的比较转录组分析为单一乙状体模式提供了新的见解

背景

梨果在开发期间表现出单一的丝状样式，而桃和草莓水果表现出双齿轮图案。然而，关于这两种模式之间的差异很少。

结果

在该研究中，测量水果重量，并由石蜡切片由果实成熟的梨，桃和草莓样品制成。结果表明，单一和双乙状样品图案都是由细胞膨胀而导致的，但不是细胞分裂。在五个水果增大阶段，在梨，桃和草莓水果中进行了比较转录组分析。比较涉及这些间隔的基因在桃和草莓中，发现836个基因与梨中的所有三个水果增大阶段相关（模型I）。在这些基因中，25位位于与水果重量相关的定量性状基因座（QTL）区域内，90种参与细胞发育。此外，649个基因与中部扩大阶段相关，但在梨（II模型II）中没有早期或晚期扩大。另外，22个基因位于与果实重量相关的QTL区域内，并且参与细胞发育63。最后，双荧光素酶测定显示出筛选的bHLH转录因子诱导细胞膨胀相关基因的表达，表明这两种模型解释了单个六端模式。

结论

单乙状结肠模式是由模型I和模型II协调调控的，因此提出了一个潜在的单乙状结肠模式的基因调控网络。这些结果加强了我们对果实大小的分子调控的理解蔷薇科。

在这内蔷薇科，不同的肉质水果类型显示出两种不同的果实生长模式。由于细胞增大梨果，例如苹果和梨表现出在其中水果期间立即受精后的最初几周内进行广泛的细胞分裂单个S形图案，之后，几乎所有的生长[1那2那3.那4.]．诸如晚熟桃子等石材水果表现出双齿轮图案，其中两个快速生长阶段被缓慢生长阶段分离[2那5.那6.]．有趣的是，草莓果实在不同品种中表现出单个或双齿轮模式[7.那8.那9.那10.那11.那12.]．这些结果表明，水果的生长模式是由其他因素而不是由水果类型决定的。

单个和双六端模式之间的区别是在水果扩大过程中发生缓慢生长期。先前的研究报告说，水果肿胀的速度和持续时间之间的合作决定了果实尺寸[13.]，由单元格数目和大小决定[14.那15.那16.]．目前，关于控制果实尺寸的基因几乎熟知，除了涉及细胞周期，细胞壁代谢，细胞色素和泛素的基因外，[13.那17.那18.]．具体来说，周三那RNA聚合酶II转录， 和丝裂原活化蛋白激酶激酶都与细胞周期有关[19.那20.那21]，xyloglucan半乳糖基转移酶那糖基转移酶那纤维素合成酶那β牛乳糖， 和microtubule-associated蛋白质与细胞壁代谢相关[22那23那24那25]，和转录因子，包括基本区域/亮色拉链图案（Bzip.）[26]，NAM / ATAF1 / 2 / CUC2（南汽）[27]，V-myb禽成髓细胞病病毒致癌基因同源物（MYB）[28]，基本/螺旋 - 环 - 螺旋（bHLH）[29]， 和怀疑[30.]是果实尺寸调节网络的组件。

转录组测序和QTL的组合是筛选特异性特征的候选基因的有效方法，并且已用于植物，包括桃子，梨和西红柿[27那28那31那32]．目前，已知果实大小由28 QTL锚定，在西红柿中分布于11条染色体[33那34]．在POME，果子重量，高度和宽度分别在5颗染色体上分别单独锚定14,3和4 QTLS和梨中的9个支架[35那36那37]以及分别在苹果中的7个染色体上分别锚定10,7和10 QTL [38]．在Drupe中，果子重量，高度和宽度分别在桃子中的所有8条染色体上单独锚定7,6和12 QTL [39那40那41]，分别被6个、2个和2个qtl锚定在甜樱桃的4条染色体上[42那43]．此外，果子重量在草莓中的CHR2上锚定3 QTL [44那45]．这些报道的QTL区域为筛选农艺性状的候选基因提供了良好的参考。

单乙状结肠和双乙状结肠在上个世纪已被报道蔷薇科水果种[2，但这些模式之间的差异直到现在还没有在分子水平上探索。在蔷薇科，梨是一个沼泽的水果，被选中用于研究单齿片图案，而桃是露珠果实，呈现双齿片图案，被选中作为对照。此外，草莓是含有六种或双层图案的骨料果实，并选择另一种控制。选择这三种物种中的果实并对转录组测序进行，以探索单个和双层模式之间的差异。首先，收集开发和成熟的水果，用于测量果子重量和计算细胞数，以澄清桃子和草莓中快速扩大和间隔的时间。基于梨，桃和草莓的完成基因组项目[46那47那48[将转录组测序进行转录物测序，用于筛选与三个有关的差异表达的基因（DEG）。蔷薇科物种。根据已报道的qtl对候选基因进行验证[35那39那44[还执行功能注释。此外，在筛选的转录因子和细胞膨胀相关基因之间进行双荧光素酶测定。最后，讨论了单个六端模式的分子调节。这是第一研究报告分子水平单六型模式之间的差异。这些结果将增强我们对水果大小的分子调节的理解蔷薇科。

梨，桃和草莓水果生长曲线调查

为了研究梨、桃和草莓果实的生长曲线，测量了每个品种从小果期到成熟期的果实重量。结果显示，梨果实呈单一的s型生长曲线(图。1一个;数字S1），但桃子和草莓水果中的双重模式（图。1一种）。进一步分析石蜡部分的进一步分析表明，在盛开（DAFB）分别在42,21和19天之前，每种果实的细胞数量主要增加，然后保持稳定直至果实成熟（图。1b）。相比之下，细胞尺寸分别在42,21和19dAFB之前变化，然后发生细胞扩展（图。2）.结果表明，梨、桃和草莓果实分别在42、21和19 DAFB之前进行了广泛的细胞分裂，然后细胞扩大。此外，单和双s型曲线都是在这些天之后出现的，我们的结论是，单和双s型曲线都是细胞扩张的结果，而不是细胞分裂的结果[1那2那3.那4.]．

转录组测序和差异表达分析

要揭示单个和双齿片模式之间的差异，果实在果实上的果实，第一次放大，间隔，第二次放大和成熟（表S1）选择桃和草莓被选择用于转录组测序。将这五个阶段样品被指定为pp1至pp5（桃）（碧桃）和草莓中的Fa5（Fragaria×ananassa.)(表S1),分别。梨(Pyrus Bretschneideri.）时，幼果（28 DAFB），早期扩大（98 DAFB），中间放大（126 DAFB），晚期放大（140 DAFB），和成熟（168 DAFB）选择并指定为PB1阶段水果至PB5分别。总共1.41，1.56，和1.44千兆原始的读取从梨，桃，草莓水果分别产生。After removing low-quality reads, an average of 91.47, 100.01, and 92.3 Mb clean reads were used for mapping to the reference genome in pear, peach, and strawberry fruits, respectively. The average percentages of total mapped reads were 73.99, 88.64, and 72.27% in pear, peach, and strawberry fruits, respectively. A total of 31,910 genes were detected in pear fruits. Of these genes, 25,633 were commonly expressed in all tested fruits, while 1303, 231, 162, 214, and 254 were specifically expressed from PB1 to PB5, respectively (FigureS2）.在桃果实中共检测到27747个基因。其中22480个基因在所有试验果实中普遍表达，而从PP1到PP5分别有652、189、149、113和291个基因特异表达(图)S2）.在草莓果实中共检测到35502个基因。其中，共有27,023个基因在所有被试果实中普遍表达，而分别有1156、303、265、702和325个基因在FA1 - FA5中特异表达(图)S2）.

为了分离与果实放大相关的基因，进行差异表达分析以在快速增大和生品或成熟阶段进行比较果实。与PB1和PB5相比，在梨中，4096（PB2-DEG），2478（PB3-DEG）和3831个（PB4-DEG）和3831（PB4-DEG）基因差异表示为PB2，PB3和PB4（图。3.）.在桃子中，与PP1和PP5相比，PP2和PP4中5656 (PP2- deg)和4536 (PP4- deg)基因在PP2和PP4中有差异表达(图5)。3.）.在草莓中，与FA1和Fa5相比，在Fa2和Fa4中，3210（Fa2-eg）和2238（Fa4-Deg）基因在Fa2和Fa4中差异表达（图。3.）.这些分离的基因可能与相应物种的果实膨大有关。在桃中，有3799个(PP3- deg)基因在PP3和PP2/PP4之间差异表达，有2863个(FA3- deg)基因在FA3和FA2/FA4之间差异表达(图2)。3.）.这些基因的差异表达可以是参与果实膨大的间隔。

与QTL区域重叠与果实尺寸有关的QTL区域

果实大小包括果实重量、高度、宽度和深度，在梨、桃和草莓果实中得到了广泛的研究。在梨中，果实大小被21个QTL区域锚定，覆盖1279个基因[35那36那37]，其中PB2-、PB3-和PB4-DEGs中分别检测到123、72和117个基因(见表)S2）.在桃子中，果实尺寸由36个QTL区域锚定，覆盖7100基因[39那40那41[分别在pp2和pp4-degs中检测到，其中1198和1001基因（表S2）.在草莓中，果实大小由三个QTL区域锚定，覆盖在150 kB范围内的192个基因[44那45[其中，在Fa2-deg中检测到哪些基因（表S2）.这些结果表明，与果实尺寸相关的QTL重叠的DEGS与果实尺寸相关的次数重叠，表明对于果实增大候选基因的筛选是可靠的，基于这三个的转录组分析蔷薇科物种。

水果扩大的概念蔷薇科

梨，桃和草莓水果是蔷薇科遗传背景相对相近的物种。梨类水果呈单一的s型，桃类和草莓类水果呈双s型。1一种）。这些生长模式是梨（PB3）中的中部扩大阶段与桃子和草莓中的间隔之间的差异的结果（PP3 / FA3）。在桃子中，通过PP2和PP4-℃介导的两个水果放大阶段，而与PP2和PP4-℃相比，通过表现出PP3-DEG的相反趋势的基因来控制间隔。在草莓水果中也观察到该结论。因此，据推测，参与间隔阶段的基因必须具有相关的表达谱，其桃子和草莓的果实生长模式具有相关的表达曲线。在梨中，涉及中部扩大阶段的基因与果实生长模式的表达谱相关，或者与早期和晚期扩大阶段中涉及的基因无关。

通过对桃、草莓双乙状体形态的比较，对梨的单乙状体形态进行了解释。在第一个模型(模型I)中，桃子和草莓的果实膨大间隔被第一个和第二个膨大阶段所取代，形成单一的s型，这是由与梨三个膨大阶段相关的基因介导的。在第二个模型(模型II)中，桃和草莓果实膨大间隔独立于其他果实膨大阶段，形成单一的s型，这是由膨大中期相关基因介导的，而梨膨大早期和晚期相关基因介导的。

模型I中细胞发育基因的鉴定

为了检查模型I的可能性，在三个中鉴定了与两种果实生长模式相关的相关表达谱的基因蔷薇科物种。在桃子中，在pp2和pp4-℃下上调90个基因，但在pp3-deg中下调;该基因组被指定为PPP。同时，在PP2和PP4-DEG中下调162个基因，但在PP3-DE中升级;该基因组被指定为PPN。在草莓中，在Fa2和Fa4-Degs中，43种基因上调，但在Fa3-Deg中下调;该基因集被指定为FAP。此外，在Fa 2和Fa4-Degs中下调26个基因，但在Fa3-Deg中上调;该基因集被指定为风扇。在梨中，上调592个基因，下调335个，其重叠在Pb2，Pb3和Pb4-edg中（图。4.a，b），与梨中的单个六样图案相关联。上调和下调的基因集分别被指定为PBPC和PBNC。在这927个基因中，155名参与细胞发育，包括细胞壁生物发生，细胞生长和细胞分裂（图S3A).但是，PBPC、PPP、FAP的基因比较分析中，没有发现三者之间的同源基因蔷薇科对PBNC、PPN和FAN基因的比较分析也没有发现。这些结果与模型I不一致，因此，与梨三个果实膨大阶段相关的基因与与桃子和草莓膨大间隔相关的基因是不同的。

尽管PBPC中的基因与PPP和FAP中的基因不同，但是目前尚不清楚PBPC中的所有基因是否与果实放大相关，因为桃和草莓水果中的正交基因可以包含在PPN /风扇中。对PBNC中的基因进行了类似的推断。为了验证这些簇，对PBPC，PPN和风扇中的基因进行了比较分析。结果表明，PBPC中的44个基因对PPN或风扇中的基因进行了直观，表明这些基因与单六样图案无关;剩余的548个基因在梨中可能涉及水果放大（图。4.一种）。类似地，PBNC中的47个基因与PPP或FAP中的基因直观，表明这些基因与单个六样物图案无关;梨中剩余的288个基因可能参与水果肿大（图。4.b）。在这些836℃的梨中，90次参与细胞发育，包括细胞周期和细胞壁代谢（表S3）.值得注意的是，这些基因，25位于果子重量QTL区域内（表1）.显然，几个这些基因被特异地与果实肥大梨相关联，并且所述单和双S形模式之间的差异可以由这些基因产生的。

在II型细胞增大基因鉴定

为了检查模型II的可能性，在梨中分离出介导中间扩大阶段但未早期或晚扩大的基因。结果，在PB3-DEG中检测到512上调和204个下调基因;这些基因集分别被指定为PBPO和PBNO（图。4.C，d）。在这些基因706，有22个参与细胞壁生物发生，泛素，和生长素（图S3b）。然而，PBPO，PPP和FAP中基因的比较分析检测到这三个中没有完全基因蔷薇科物种，也不是PBNO，PPN和风扇中基因的比较分析。这些结果与模型II不一致，因此，参与梨中梨中增大阶段的基因不同于桃子和草莓间隔的基因。

虽然PBPO中的基因与PPP和FAP中的基因不同，但目前尚不清楚PBPO中的所有基因是否与果实增大相关，因为桃子和草莓水果中的正交基因可以包括在PPN /风扇中。对PBNO中的基因进行了类似的推断。为了验证这些簇，在PBPO，PPN和风扇中的基因中进行比较分析。结果表明，PBPO中的47个基因在PPN或风扇中的基因上垂直，表明这些基因与单个六样物图案无关。梨中剩余的465个基因可能参与水果肿大（图。4.c).同样，PBNO中有20个基因与PPP或FAP中的基因同源，表明这些基因与单一的s型无关。梨中剩下的184个基因可能与果实增大有关。4.d)。在梨的649个DEGs中，63个参与细胞发育，包括细胞壁生物发生、细胞生长和细胞代谢(TableS4）.值得注意的是，这些基因中有22个位于果实质量QTL区域内1）.显然，这些基因中的一些与梨的水果增大有关。因此，单个和双矩形图案之间的差异可能是模型II的结果。集体，在梨果水果模型I和II模型中检测到的基因可以调节单个乙状图案。

果实膨大候选基因的表达谱

为了验证转录组分析，从模型I和模型II中选择了与细胞壁、细胞周期、泛素化、植物激素、细胞色素、锚蛋白、转录因子和富亮氨酸重复序列(LRR)相关的12个候选基因，对梨、桃子和草莓果实进行实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分析。结果显示，这些基因的表达谱与转录组分析结果相似，表明这些结果是可靠的(图S4）.此外，为了测试候选基因是否在不同梨品种中表现出类似的表达曲线，在相同的五个水果增大阶段研究了“housui”，'cuiguan'和'xueqing'品种，并通过qrt-pcr分析（图S1）.结果表明，三个品种中，三种上述基因的表达谱几乎与“DangShansuli”品种相同（图。5.），这表明从“砀山”确定了这些候选基因也参与了其它梨品种的中间膨大阶段。因此，这些候选基因可以与梨果实单个S形图案相关联。

的监管bHLHs在细胞扩张相关基因中

在以前的一项研究中，bHLH被定义为桃子中的上游因子调节细胞扩增相关基因[13.]．在这项研究中，四个bHLH基因，Bhlh3.(Pbr009044.1),BHLH30.(Pbr016145.1),BHLH106（PBR013890.1），和BHLH144（PR039557.1）被检测到与单六端模式相关的基因中，以及细胞扩增相关基因，包括纤维素合成酶（消费电子产品展），糖基转移酶（GT），microtubule-associated蛋白质（地图），UDP-glycosyltransferase（ugt.），COP9 Signalosome复杂亚基（CSN.），eNOCYST复杂的组成部分（exoc.），expans（exp.），xyloglucan半乳糖基转移酶（XG Galt.),Xyloglucan糖基转移酶（XG肠道）.探讨这四人的作用bHLH转录因子（TFS）表达细胞膨胀相关基因，四个全长序列bHLH将基因扩增并插入PSAK277作为效果。另外，将细胞膨胀相关基因的启动子〜2000bp序列插入PCREEN 0800-LUC中作为记者（图。6.一种）。双荧光素酶检测结果显示，Bhlh3.那BHLH30.， 和BHLH106增强了由14个基因中11个启动子驱动的萤火虫荧光素酶(LUC)的活性BHLH144增强了LUC的活性，并由14个选定基因中10的促进剂驱动（图。6.b）。值得注意的是，LUC由纤维素合酶，糖基转移酶-1，糖基转移酶-2，UDP-糖基转移酶-2，扩张素，木糖葡聚糖吡咯烷基转移酶-1和木糖葡聚糖转移酶的启动子驱动，并在过表达任何烟草叶中表现出更高的烟草活性bHLH与空载体转化的烟草叶片相比的基因。这些结果表明，四bHLHtf与大多数细胞扩张相关基因的启动子相互作用并驱动它们的表达。

梨单六端模式的潜在基因调控网络

单乙状结肠和双乙状结肠在上个世纪被报道过蔷薇科水果种[2，然而，这些模式之间的差异直到现在还没有在分子水平上探索。在研究梨果实膨大的生理表型基础上，提出了梨果实膨大的两种模型。通过对三个果实的转录组比较分析蔷薇科果实物种，几种与细胞周期相关的基因[19.那20.那21]、多糖及细胞发育[22那23那24那49那50那51那52那53那54那55那56]在模型I和II中检测到（表S3和S4）.因此，模型I和模型II在单个s型模式的生成中起着重要的作用。

除了上述基因外，还在模型I和II模型中检测到几种转录因子（表1;桌子S3和S4）， 包含锌指蛋白（ZFPS.），植物有机组织期间的控制细胞尺寸[57]， 和bHLHs，通过转换助线信号传导来调节细胞延伸[27]．Bzip.通过影响胃纤维素和菌丝的生物合成和信号转导来介导细胞膨胀[24那58]，而Ankyrin重复蛋白质通过促进毒素生物合成Bzip.[59]．怀疑和南汽参与细胞发展[30.那60那61]，以及植物生物合成[62那63]， 尽管增殖细胞因子（TCP.） 和MYB只与生长素生物合成相关[64那65]．可见，生长素信号转导可能参与了梨果实中期膨大期的发育。

在该研究中，在模型I和II中检测到疾病诱导的因子，包括生长素响应因子，肿瘤诱导的蛋白质和生长素响应蛋白，其与细胞扩张相关[66那67]．此外，检测到的细胞色素P450蛋白通过增加细胞尺寸来刺激植物器官生长[17.]．四种物质的转录激活bHLHs在14个候选基因中，通过双荧光素酶分析也证实了这两种模型的单一s型模式。这些结果表明，14个基因的启动子被激活bHLHs(无花果。6.）.基于这些结果，提出了诸如梨单六端图案的潜在基因调控网络（图。7.）.该网络表明植物激素植物植物症被调节MYB那怀疑那TCP.那南汽和ankyrin介导的Bzip.，这由此触发的表达bHLH和生长素引起的因素。同时，Bzip.触发的嗜酸性胃泌素转导，以激活胃肠杆菌素响应蛋白。养阴诱导的因素bHLH那ZFP.那细胞色素p450.， 和胃肠杆菌素响应蛋白促进的表达β-半乳糖苷酶那纤维素合成酶那GDSL酯酶/脂肪酶那糖基转移酶那microtubule-associated蛋白质那COP9 Signalosome复杂亚基那eNOCYST复杂组件SEC15A那expans， 和xyloglucan半乳糖基转移酶促进细胞扩张，导致梨果实中膨大。

梨和桃果实膨大基因均存在正向选择

植物驯化是一个长期的，以人为基础的植物相互作用，有利于基因的等位基因，控制某些特性的频率增加[68]．在肉质果实，果实膨大果实是发展和成熟过程中观察到的一个典型的表型。在先前的研究，番茄果实呈现出果实生长期间的单个S形图案[2)，果实质量也被驯化了，从它们祖先的小果实到现代西红柿的大果实[55那69]．在梨中也发现了类似的对果实大小的驯化[70]， 桃子 [71那72]， 苹果 [73甜蜜的樱桃[43]．

在这项研究中，测量了显影和成熟梨，桃和草莓水果的动态重量。结果证实，梨果果实在果实生长期间表现出单一的乙状样式，而桃和草莓水果表现出双重凝集图案。但是，目前尚不清楚这三种的果实生长模式蔷薇科物种经历正向选择。此前，在桃和梨的果实中分离出了果实大小的选择性扫区[70那72那74]．在桃子中，707和507个基因分别与第一和第二扩大阶段相关，并且位于选择性扫描区域内。此外，395个基因与第一和第二扩大阶段相关[71那72]．这些结果表明，与第一和第二放大级中这些物种进化（表中驯化S5）.类似地，在梨，66,32和74个基因中，分别与早期，中部和后扩大阶段相关，并且位于选择性扫描区域内。此外，21个基因与三个水果扩大阶段相关（表S5）.这些结果表明，在这些物种的演变过程中驯化了三个水果扩大阶段。集体，这些发现表明，梨和桃子果实中驯化了每个水果增大阶段。

在先前的研究中，两个假设解释了桃子果实的双齿轮模式：种子和果皮之间的吸收竞争，以及种子果皮增长的激素控制[6.]．在这项研究中，这些假设可以共存在三个肉质水果中。首先，草莓果实发展依赖于种子受精诱导的激素[75.]，表明素荷是水果扩大所必需的。理论上，不应中断激素控制的水果扩大。然而，当草莓水果颜色的漂流器时（图S5），荷尔蒙和同化含量用于花青素生物合成或水果肿大，导致果实增长缓慢。同样，当桃子果实表现出石头硬化（图S5），为Endocarp Higrification或水果扩大提供了激素和同化，诱导果实增长缓慢。相比之下，由于在梨果发育过程中观察到缺乏显着变化（图。1A)，激素和同化物都被用于果实膨大，导致单一的乙状结肠模式。

在这项研究中，梨果果实表现出单个六样形图案，而桃和草莓水果表现出双六端图案。这些模式由细胞扩展产生，而不是细胞分裂。通过梨，桃和草莓水果中的比较转录组分析，发现836个基因与梨果水果（模型I）中的所有三个水果增大阶段相关，而649个基因与中部扩大阶段相关，而不是早期或晚期扩大（二号二世）。因此，梨单六样图案似乎由这些提出的模型协调。有趣的是，这些模型中的大多数基因被注释并与细胞发育相关。此外，47个基因位于与果重的QTL区域内。基于先前的报告和双荧光素酶测定，在本研究中起草了单六端模式的潜在基因网络（图。7.）.

植物材料

该“砀山酥梨”（P. Bretschneideri.甜茶），“翠冠”（P. Pyrifolia Nakai.），'xueqing'（P. Bretschneideri.Rehd.)和《Housui》(p . serotina梨品种在南京农业大学江浦果园进行了栽培。从14 DAFB至成熟，每14 d采集一次梨果实。晚熟的‘良缘’桃品种(P. Persica）在中国杭州杭州内镇江农业学院维持。从14天DAFB到成熟，每7天收集桃子果实。“宏岩”草莓品种（F.×ananassa.）在中国镇江农业学院的温室里成长。共有300个鲜花，并在初始开花阶段标记;从三个DAFB到成熟时每4天收集源自这些花的果实。使用每个果实物种的每个时期的15个果实测量果子重量。

将‘丹山苏里’、‘良源’、‘红岩’果实切片，用固定液(50%乙醇90 mL、甲酚5 mL、冰醋酸5 mL) >处理24 h。样品经梯度酒精脱水和石蜡包埋后，使用RM2016 LEICA切片机(LEICA, Wetzlar, germany)切片。使用尼康ECLIPSE E100系统(10 × 10)(尼康，东京，日本)对石蜡切片进行可视化。使用imageJ 1.47v(美国国立卫生研究院，Bethesda, USA)记录细胞数量。

此外，为了分析梨，桃和草莓果实的果实肿胀过程中整个预测基因的表达谱，每个收集至少有三个独立的重复。将收集的梨和桃子果实在液氮中冷冻并研磨成细粉末。类似地，在从草莓水果表面除去种子后，将剩余的组织在液氮中捣碎并储存在-80℃下进行进一步的分析。

库的准备和排序

使用RNAPREP纯植物套件（天根Biotech，中国）提取总RNA。在1％琼脂糖凝胶上监测RNA降解和污染。使用Nanophotometer®分光光度计（Upplen，CA，USA）检查RNA纯度。使用Qubit®20鳞片计（Life Technologies，USA）中的Qubit®RNA测定试剂盒测量RNA浓度。使用在生物分析仪2100系统（Agilent Technologies，CA，USA）上的RNA纳米6000测定试剂盒评估RNA完整性。梨，桃和草莓水果的RNA完整性数（rin）> 8.8，符合建筑图书馆的要求。在总RNA的定性和定量检测之后，使用Epicenter Ribo-Zero TM rRNA去除试剂盒（epicenter，Wi，USA）耗尽核糖体RNA（RRNA）。使用RRNA缺失的RNA片段化在Nebnext第一链合成反应缓冲液（5×）中用随机六聚体引物合成第一和第二cDNA链。然后，将NEBNext适配器加入到腺苷酸化DNA片段中，然后纯化和筛选CDNA片段，其长度为150-200bp。使用Truseq PP Cluster Kit V3-CBOT-HS（Illumina，CA，USA）来执行群集。 Then, the libraries for ‘Danshansuli’, ‘Liangyuan’, and ‘Hongyan’ were sequenced on an Illumina Hiseq 4000 platform (Illumina, CA, USA) with three replicates.

质量控制和转录组装

根据先前描述的方法进行FASTQ格式的原始数据（原始读取）的质量控制[76.]．去除不合格的原始reads后，使用Bowtie2 v2.2.8和HISAT2 v2.0.4将干净reads映射到参考基因组[77.]．梨，桃和草莓水果的参考基因组包括Pyrus.基因组v1.1 (http://peargenome.njau.edu.cn.），李古鲁乌斯_斯威察_v2.0.a1（https://www.ncbi.nlm.nih.gov） 和Fragaria_vesca_v2.0.a.1（http://ftp.bioinfo.wsu.edu),分别。干净的读取映射到参考基因组，并使用StringTie v1.3.1按照基于参考的方法进行组装[78.]．STRINGTIE用于其新颖的网络流算法和可选的DE Novo装配步骤，用于组装和量化为每个基因座的多个剪接变体代表多长度转录物。

差异表达分析

基于每百万片段映射（FPKM）读数的外显子（FPKM）读数的每千碱基的片段计算基因表达水平。79.]．在Python脚本中过滤不可靠的数据（https://github.com/peims/batch-screening-unqualified-data.）.使用利马包进行差异表达分析（https://biocumon.org/packages/limma/）.区分显着基因差异的标准是P. < 0.05 [80那81.]．

基因函数注释

使用PlantRegMap实施了对DEGS的基因本体（GO）富集分析（http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/）.筛查标准的显着丰富的术语是P. < 0.05. KOBAS v3.0 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）软件用于计算Kegg Pathway Deg的丰富。基因功能注释是使用对NCBI NR数据库的当地BLAST 2.2.29+进行的。

DEGs的染色体定位及同源分析

根据mRNA信息检索DEGs的位置。位于报告的QTL区域内的deg在python脚本中进行统计分析(https://github.com/peims/calculate-the-distance-between-the-gene-and-the-marker.）.使用orthofinder v2.3.3进行局部基因分析[82.]．

QRT-PCR.

使用Plant Total RNA Isolation kit plus (Gore Gene，中国成都)提取总RNA。cDNA第一链用FastKing gDNA diselling RT SuperMix试剂盒(天根生物技术，北京，中国)合成，随后作为qRT-PCR的模板。使用LightCycler 480 SYBR Green I Master mix (Roche, Basel, Sweden)在Lightcycle-480系统上进行qRT-PCR。反应混合物按先前报道的方法进行[74]．提供本研究中使用的基因特异性引物（表S6）.使用三种独立的生物样品进行所有PCR实验，其中包括三种技术复制。梨塞夫， 桃t,和草莓DBP.基因用作癌症。使用独立的样品T检验来分析每个样品之​​间的QRT-PCR结果。转录组和QRT-PCR结果之间的相关分析在Python脚本中进行（https://github.com/peims/calculate-the-pearsoner.）.

载体构建和双荧光素酶测定

检测四个的转录激活bHLHs与模型I和II的单一乙状体模式相关的14个候选基因，4个基因的全长序列bHLHs使用特异性引物扩增（表S7）.将Phanta®Max超保真DNA聚合酶(P505, Vazyme Biotech Co.， Ltd, China)引入到pSAK277载体中构建效应器(图。6.一种）。将14个基因的〜2000bp启动子序列插入PGREEN 0800-LUC载体中以构建记者。然后，将正确的重组质粒转化到农杆菌属菌株GV3101，利用pSoup对pGreen 0800-LUC载体进行转化。GV3101菌株包含一个效应株和报告株，共渗入烟草叶片[83.]．空的PSAK277瞬时表达载体用作阴性对照。对于每个启动子-TF比较，使用相同的至少六个渗透叶农杆菌属在双荧光素酶测定中使用培养物。使用Dual-Luciferase®报告系统（Promega，Wi，USA）在制造商的说明之后测定Luc和Renillia Luciferase（ren）活性。相对LUC活性计算为每个比较的LUC / REN的比率，并在每个实验中归一化。使用SPSS V17.0软件（SPSS Inc.，Chi，USA）进行统计分析。学生们T.- 表演，以确定显着差异（P. < 0.05).

Illumina测序数据保存在NCBI SRA数据库中，登录号为SRP238133, bioProject登录号为PRJNA596556。本研究过程中产生或分析的数据包括在本文及其补充信息文件中。

DAFB：

盛开后的几天

度:

差异表达基因

F A：

草莓

扇子：

草莓FA2-和fa4 - deg基因表达下调，而FA3-DEG基因表达上调

FAP：

Fa2-和Fa4-Degs的基因上调，但在草莓中的Fa3-Deg中下调

铅:

梨

PBPC (PBNC):

重叠之间PB2-，PB3-下调，上调的基因，并在梨PB4-度的视角

页:

桃子

PPN：

在pp2和pp4-egs中下调的基因，但在桃子中以pp3-deg升级

PPP：

PP2-和pp4 - deg基因表达上调，PP3-DEG基因表达下调

存在:

定量实时聚合酶链反应

QTL：

定量特质基因座

我们感谢镇江农业科学院（杭州，中国）提供的实验材料。我们感谢LetPub语言编辑公司为这个手稿的excellant语言的编辑工作。

这项工作得到了中国国家重点研究和发展方案资助了中国（2018年）的国家自然科学基金（31830081），中国农业研究体系（CARS-28）和江苏省科技专用基金（31830081）支持计划（BE2018389）。资金机构在研究设计，数据分析和解释以及稿件写作中没有作用，但只提供财政支持。

隶属关系

1. 南京农业大学作物遗传学和种质增强国家重点实验室梨工程技术研究中心，南京，210095

   裴茂松，曹素浩，吴磊，王国明，谢志华，顾超，张少玲

贡献

SLZ和CG构思并设计了实验。MSP进行石蜡切片、数据分析、qRT-PCR验证、撰写原稿等工作。SLZ和CG进行了数据分析和原稿修改的指导。SHC、LW、GMW和ZHX进行样品采集和果实重量测定。所有作者都已阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应于超国或者绍张玲。

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

开放获取本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。Creative Commons公共领域奉献豁免（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。

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