低拷贝核基因AGT1.作为Bromeliaceae的新型DNA条形码标志物

背景

凤梨科被子植物有超过3500种，具有极高的形态和生态多样性，但遗传变异非常低。在许多属中，植物的营养非常相似，这使得很难确定不开花凤梨科植物。这对于活的植物来说尤其成问题，因为这些植物通常被种植了几十年而没有开花。因此，DNA条形码技术是一种非常有前途的方法，为物种测定提供可靠和方便的辅助。然而，在凤梨属中所观察到的标准条形码标记的低遗传变异导致了问题。

结果

在这项研究中，低拷贝核基因AGT1.被鉴定为适用于密切相关的溴尿液的分子鉴定的新型DNA条形码标志物。将与相邻的遗传高度可变的内含子组合相对慢慢地发展的外显子序列，正确匹配的基于Megablast基物种鉴定率为迄今为止使用其他条形码标记的溴脲报道的最高速率约为两倍。

结论

在目前的工作中，我们描述AGT1.作为一种新的植物DNA条形码标记，用于用于溴脲的条形尺寸，遗传变异低的植物组。此外，我们提供了一个全面的标记序列数据集，用于进一步用于Bromeliad研究界。

迅速辐射的单子叶植物凤梨科目前被认为包括3597种和76属[1]主要分布主要限制在新生儿[2，3.]．Bromeliadds是一个形态学上高度独特的植物组，对于大多数属于哪一个最新的专着。因此，确定需要良好的专业知识，这是一些有问题的群体可能只能被少数专家自信地识别的那一点。此外，测定通常依赖于生成人物，而开花很少发生在许多溴洲，特别是当在北半球的植物园中栽培时。因此，测定的辅助方法，例如DNA条形码，对Bromeliad研究界具有高兴趣。这特别适用于植物园背景，因为菠萝蛋白酶通常包括主要部分，因为他们作为观赏植物的普及以及他们的科学价值，例如他们的科学价值。作为一种型号组，用于快速辐射和凸轮光合作用的演变[3.，4，5]．

在倡议的范围内，以改善德国植物园植物园生物植物植物和溴 - 群岛（Evoboga）的植物园植物植物收集和可用性[6]，我们旨在开发一种易于处理和经济高效的DNA条形码协议，并为Bromeliad提供全面的条形码数据库。

DNA条形码方法广泛用于识别动物物种，并在寿命国际条码（Ibol）项目的范围内，可以使用遗传标记成功确定大量的动物物种[7]．对于动物条形码，线粒体基因组的细胞色素C氧化酶I（COI）座位在植物中普遍使用，同样的轨迹不是信息性的，因此需要替代方案[8，9]．塑性标记如matK和rbcl.以及植物条形码提出了核标记，如ITS1 / ITS2及其组合，但适用性并不普遍，因此不同的组需要不同的条形码标记[10.，11.，12.，13.]．

近年来，已经进行了一些努力，以测试溴脲的一套规范植物条形码标志物。但是，证明了这一点rbcl.，trnh-psba.和matK是不足以决定物种的，因为遗传变异较低[14.]．因此，开发凤梨特有的条形码程序需要评估新的潜在的DNA条形码标记，并最终考虑新的条形码方法。

在本研究中，我们研究了低拷贝核基因（LCNG）的潜力AGT1.作为Bromeliaceae DNA条形码的标志物。AGT1.编码参与光素途径的拟甲酰胺氨基转移酶拟南芥［15.，16.，17.]轨迹被建议作为低分类学水平的系统发育研究的标志物[18.]．自那以后AGT1.已成功用于许多系统发育研究，涵盖了各种Angiosperm植物组[19.，20.，21.，22.，23.，24.，25.]．在最近两项旨在修订“隐齿状体复合体”的研究中[23.]和属菠萝，包括其最亲近的亲属[25.]，AGT1.被证明对溴脲基西/亚类水平的重建具有很大的价值，从而促进进一步调查其对条形码的潜在适用性。

基于这些目标，我们选择了来自主要溴脲亚属的良好和系统大学分类的代表并产生了AGT1.序列以：（1）检查遗传多样性，并评估存在“条形码 - 间隙”的内部变化;（2）阐明系统发育相关性和限制AGT1.序列信息;（3）评估基于Megablast的物种确定率并将其与matK;（4）评估以下物种水平的分辨率，用于人口研究和潜在援助AGT1.追踪溴皂甙症的杂交起源。

AGT1.PCR扩增和测序成功率

的AGT1.本研究使用的标记区域最初如既往研究所述进行放大[18.，23.]．由于双条带出现频率较高，我们设计了凤梨属特异性引物，其退火温度较高，以获得更高的特异性，并阻止非特异性条带的出现。由此，我们可以得到300-700碱基对(bp)长AGT1.通过凝胶电泳和荧光定量验证了足够的DNA质量的415个案例（89.2％）的PCR片段。

此外，使用时，Sanger测序成功率相当低AGT1.特定的引物也用于测序。因此，我们在每个寡核苷酸上添加了通用测序引物位点(M13, SP6)。考虑到只有那些成功的情况下，测序工作的两个引物，从而导致一个全长一致序列比对，AGT1.排序成功率为370中的287人（77.5％）。我们一起获得，我们获得了579AGT1.Bromeliaceae Barcodes为本研究，覆盖236 Tillandsioideae，3 Hechtioideae，3 Navioideae，38 pitcairnioideae，10 puyoideae，1 brocchinioideae和288溴脲素分类，其中一些在早期的研究中已经发表[23.，25.]．

在51例（约15％）中，我们无法成功序列AGT1.Intron IV部分作为电泳图显示双峰，可能是由于内含子内的等位基因变化。为了更详细地调查这一点，我们也克隆了AGT1.所选中的等位基因，并发现由于Intron IV中的插入/删除而发生的等位基因差异在所有检查的情况下（附加文件4：S4）。这些等位基因差异被限制在外显子IV序列部分内，我们无法检测到显着的序列变异。

AGT1.序列特性和序列聚类

部分AGT1.基因体扩增包括大约四分之三的外显子IV（264bp），整个内含子IV以及外显子v（14bp）的非常短的部分，如图2所示。1．与之相反AGT1.ortholog of.拟南芥蒂利亚纳凤梨属的基因体长约3025 bp，包含5个外显子而不是4个外显子(附加文件)7：S7）。溴脲AGT1.内含子IV区被证明是高度可变的AGT1.序列在我们的数据库，从大约100碱基对(bp)到大约400 bp。当试图比对所有的插入子IV时，我们发现插入/缺失的频率很高，不仅在远亲类群中，而且在同一亚科的物种中。因此，我们无法对整个凤梨科进行比对，也无法对凤梨科的亚科进行比对。

与之前的研究一样，表明序列分歧AGT1.Intron IV在Genera / Clade水平上相当低，因此保持良好[23.，25.，我们评估了AGT1.这两项研究中报道的进化支之间的序列相似性，发现值≥97%的序列一致性。鉴于此，我们的目标是在所有样本中找到序列一致性高于98%的簇AGT1.我们的数据库中存在的序列，使用DNA序列聚类软件CD-HIT-EST [28.]．

如表所示1，我们发现52个序列一致性≥98%的簇AGT1.凤梨亚科、Tillandsioideae和Pitcairnioideae分别有34个和8个簇。

系统发育有效性AGT1.序列簇

支持系统发育相关性AGT1.凤梨亚科植物的序列聚类研究Portea./Gravisia复杂的(29.]．对应的序列出现在AGT1.数据集集群，具有高于98％的标识值且没有非“Portea./Gravisia该集群中存在复杂的“成员”。另外六个集群代表最近被分配到“隐齿象复合体”的群体[23.]，五是“nidularioid综合体”的成员[30.，31.[一个仅包括最近学习的属的分类群菠萝［25.]．在剩下的溴脲中AGT1.序列我们发现了七个集群，这些集群仅包括以下任一属的成员：Wittmackia，Billbergia，Araeococcus，Hohenbergia.，Lymania要么Neoregelia.．所有这些属性当前被认为是单噬细胞[29.，30.，31.，32.，33.，34.，35.，36.，37.，38.]．

虽然我们得到了31种序列簇我们得到了系统发育载体，但检测到的溴脲簇中的9个具有不按照电流分类的物种组合物。十二个溴脲AGT1.集群由同一物种的成员组成。

如果是34AGT1.我们在Tillandsioideae成员中检测到的序列簇，我们参考了最近发表的两个研究，基于多基因座DNA序列和形态学数据[1，39.，40]．如表所示1，我们发现有21个簇有文献支持，10个簇包含不同分支的分类群，与文献相矛盾(补充文件)2:表S2)。此外，在所有的类群中，我们发现了尚未被纳入任何系统发育研究的分类群。

的AGT1.我们从皮特证尼省成员获得的序列全部与同一属的成员聚集[1，41.]．据此，我们发现5个簇只包含单系属中的任何一种Pitcairnia.，抚养名和德国ocohnia.(附加文件2:表S2)。

属级别遗传多样性和“条形码差距”评估

以评估其遗传多样性AGT1.EXON IV / Intron IV序列，我们产生了群集的对齐，序列相似度高于98％，并使用Kimura 2参数（K2P）模型计算遗传多样性（附加文件5：S5）。如图所示。2(最右边窗格)，不同物种(种间)的K2P值在005至0015之间，离群值和中位数约为0.01。

为了评估K2P值在物种间和物种内部(种内)是否存在差异，我们还计算了同一物种的遗传多样性。由于实际原因，本分析仅限于Tillandsioideae亚科的11种，平均每种5种。如图所示。2（右上窗格），K2P值重叠，因此我们找不到“条形码间隙”。

家族水平遗传多样性及其比较matK

由于高的遗传变异AGT1.Intron IV部分和产生的对准产生的困难，我们分离出外显子IV / Intron IV序列并从外显子v移除了14bp部分以进一步分析。根据注释确定外显子/内含子边界ananas comosus agt1基因模型和肽序列[26.]．

评估所获得的序列数据表明AGT1.外显子IV地区具有31％的可变地点的一部分，并且定义信息场所的速率约为23％（表2和额外的文件5：S5）。对于此评估，我们使用K80替代模型，因为它据报道是最准确的AGT1.Bromeliad的标记[23.]．

作为matK是最有前途的凤梨科DNA条形码标记[14.，我们也包括在内matK在这个研究中。因此，我们下载了440matK覆盖来自Genbank的这项研究的溴脲属金属覆盖的序列并完全按照我们的作用评估遗传变异AGT1.(附加文件6: S6)。如表所示2，可变位点的比率(24%)和吝啬信息位点的比率(14.5%)matK是相当低的情况下AGT1.．

我们接下来比较了遗传多样性AGT1.和matK基于K2P替代模型的序列。的AGT1.比较了不同亚科分类群(家族间)、亚科内种群(属间)和各亚科内种群(同属)间的外显子IV序列比对。如图所示。2相比,matK，AGT1.显示所有分类水平之间的遗传距离值相对高。平均间隙的距离AGT1.但是远高于内部距离，但值是重叠的，表明在许多情况下，序列分歧AGT1.种内标记区域不低于种间标记区域。

AGT1.使用megablast介导的物种识别

为了评估适用性AGT1.作为DNA条形码标记，并将其性能与其进行比较matK，我们生成了一个包含所有IV外显子/ IV内含子的序列数据库AGT1.序列。执行Megablast搜索此溴脲AGT1.数据库中，我们使用了来自多个不同种源的序列。数据库共包含567个不同物种，共检索到41/42个物种，包括Bromeliaceae亚科brochinioideae、Bromelioideae、Hechtioideae、Navioideae、Pitcairnioideae、Puyoideae和Tillandsioideae。如表所示3.和额外的文件2：表S2，正确的物种识别使用AGT1.Exon IV / Intron IV在41个测试病例中可能是可能的。

我们还测试了物种识别率matK使用42种作为对A的查询matK数据库共包含440个序列。如表所示3.和额外的文件2:表S2，在42个案例中有10个被识别成功，因此明显低于AGT1.．

接下来，我们将正确的分配测试到物种组，因为它们被定义为Subfamilies Bromelioideae和Tillandsioideae [23.，39.]．在42例中的32个中，AGT1.具有最高比特分数的序列被分配给相同物种或物种组中考虑的物种（表3.和额外的文件2:表S2)。

DNA条形码超出物种鉴定的应用

初步研究表明AGT1.序列多样性也适用于解决人口水平多样性，最终有助于调查杂交[23.，25.]， 我们获得了AGT1.推定的杂种物种以及潜在父母的序列。

我们选择了蒂尔西亚subg。隔音瘤成员Tillandsia Marconae.为此目的，因为它已被描述为推定的杂种种类Tillandsia Paleacea和Tillandsia紫竹［42.]．首先，我们克隆了AGT1.来自潜在父级物种的序列Tillandsia紫竹，T. Virescens.，t . recurvata和T. Landbeckii.这是在秘鲁南部沙漠的共现点收集的。随着AGT1.最大似然树如图所示。3.描述了,T. Virescens.，t . recurvata和T. Landbeckii.已被分配到蒂尔西亚subg。隔音瘤在以前的研究中[39.，40，43.，可以清楚地与Tillandsia紫竹复杂的成员T. purpurea.和T. Marconae.．不同的T. Marconae Agt1.等位基因明确分配给T. Landbeckii.或者是T. purpurea.GenePool（相同的等位基因和/或高引导支持）。Tillandsia Marconae.由此，携带两种父母种类的Genopools的等位基因，其也与智利北部介于秘鲁的北部北部的局部流行病T. purpurea.而且很大程度上是智利T. Landbeckii.．因此，我们解释T．Marconae.作为推定的杂交T. purpurea.和T. Landbeckii.从subg。隔音瘤作为早些时候提出的父母[42.，43.]．

遗传多样性和系统发育有效性AGT1.序列

我们获得了579.AGT1.外显子IV + Intron IV序列覆盖各种溴脲亚特征Bromelioideae，Tillandsioideae，Pitcairnioideae，Puyoideae，Brocchinioideae和Hechtioideae。由于较高的变化AGT1.内含子IV序列部分，由于仅对包含的物种系统发育信息的子集可用，我们无法生成全球和家族范围的比对。相反，我们使用CD-HIT-EST软件进行序列聚类分析，获得序列一致性值≥98%的组。我们选择98%的门槛是因为AGT1.以往研究中所报道的进化支之间的序列相似性约为98%以上[23.，25.]．与发表的文学的群集进行比较时，我们发现在大多数情况下，群集代表目前接受的分类群（表1）.这些群体要么由相同物种的个体组成，属于来自相同属的物种或物种，其中在文献中分配给子属或物种组。

因此，遗传多样性AGT1.序列对当前接受的多基因座来发育相当良好，并且似乎非常适合在整个溴脲中用作DNA条形码标记。然而，由于一些获得的簇包含不适合各组的物种，并且另外，如在非群集内，我们发现我们预期的所有物种 - 虽然存在于数据库中 - 但是使用的很明显AGT1.由于DNA条形码标记需要预防措施，因此不适用于所有物种的安全确定。

在内异性和间隙遗传变异（“条形码间隙”）之间具有清晰分离的大小被认为是良好DNA条形码标记的关键要求[44.，尽管这个问题引起了激烈的讨论[45.]．我们评估了AGT1.外显子IVAGT1.外显子IV +内含子IV Kimura 2参数(K2P)值在物种之间和不同的登录之间。如图所示。2（最右侧窗格），我们发现在测试的情况下的内特异性K2P值之间的重叠，因此我们不能辨别不同的“条形码间隙”。然而，由于可以预期这种差距的发生是最真实的，因为它是现实的，或者是否可能只有采样不足的人工制品[46.，我们不认为缺乏“条码间隙”是反对使用的普遍理由AGT1.DNA条码技术。

主要是，我们认为由于基因流动，根据密切相关的物种的进化分歧，我们将不得不应对不足的问题AGT1.序列差异，在某些情况下，DNA条形码通常是具有挑战性的。例如，在基于MegaBLAST的物种鉴定试验中，我们发现41个测试案例中有4个存在歧义(见表)3.）.在这些实例中，我们发现一个或多种显示与查询物种相同的比特分数。鉴于这些试验的物种数量相对有限，我们还必须假设将来会将更多的物种添加到数据库中，我们将越多，我们将不得不应对由于有限的有限而削弱此类歧义AGT1.序列分歧。

物种歧视使用AGT1.相对matK

对我们的Bromeliad的梅格瑙搜索所选分类群的绩效AGT1.序列数据库使我们能够正确识别41个被测物种中的22个(53%)。因此,使用AGT1.与先前的研究相比，我们可以增加溴脲对溴脲的DNA条形码的歧视性成功，其标记区域约为两倍，该研究报告了27.6％的识别成功matK，19％的人rbcl.和26％的人trnh-psba.［14.]．当三个标记时，同一位作者最多报告了最多44.4％的识别成功rbcl.+matK+trnh-psba.的总和，仍然大大低于AGT1.［14.]．

与旨在区分异质且不紧密相关的群体的研究相比，鉴定成功率约为53％，旨在歧视异质且不相关的群体，例如雨林补丁的医疗植物或物种，这成功鉴定了90％的物种[10.，47.]．然而，最近发表的一些研究表明，在所有报道的研究中，对近缘物种的DNA条形码比对异质性更强的群体的效率要低得多。例如，使用ITS2可以正确识别76.4%的调查菊科物种[48.]．在一项研究中，旨在将其用作属于属的条形码标志物Corydalis.(Papaveraceae)的鉴定成功率为65.2% [49.]．另外两项研究调查了核标记ITS2的使用，用于密切相关的条形码姜黄物种（Zingiberaceae），发现46.7％分别确定了73％的物种[50.，51.]．

因此，我们的正确物种鉴定率约为53％，在据报道的其他Agiosperm组的范围内，我们得出结论，由于上述原因，通常难以获得更高的分数，特别是在具有众所周知的低遗传变异的基团中如溴eliad [14.]．

DNA条形码在Bromaliaceae使用中的适用性AGT1.

鉴于PCR成功率为89％，排序成功率为77％，同时考虑到我们能够恢复全长的事实AGT1.从凤梨科8个亚科中的7个亚科的序列中，我们认为条形码在整个科中普遍可用。在许多其他研究中，报道了标记物的放大效率，如matK和its2 /2在相同的范围内，甚至更低[52.，53.]．

Intron IV部分的等位基因变异在大约15％的情况下涉及测序和所需克隆的事实是部分地与我们发现标记的先决条件，使我们能够开发廉价且易于处理的条形码程序。然而，它还有机会扩大其适用性，以扩展到植物收藏中的探讨以及有助于人口研究或检测潜在的F1或早期发电杂种。

为了检验高遗传变异的可能性AGT1.可能足以调查溴脲种类的网状物种的网状演化，我们进行了一个案例研究蒂尔西亚subg。隔音瘤成员Tillandsia Marconae.，因为它被描述为一种潜在的杂种物种Tillandsia Paleacea和Tillandsia紫竹［42.]．从我们的结果中（图。3.）我们有良好的迹象表明Tillandsia Marconae.可能是一个混合Tillandsia紫竹和另一个子。隔音瘤成员，作为克隆物种的一种等位基因最接近各个家长的最大似然分析中的等位基因Genepool（图。3.）.鉴于包括在内的分类群中的事实Tillandsia Landbeckii.共享栖息地Tillandsia Marconae.和Tillandsia紫竹［54.]，我们认为很可能Tillandsia Marconae.通过杂交出现Tillandsia Landbeckii.和Tillandsia紫竹．这些调查结果支持早期的研究，使用其他低核标记来解决同一问题[43.]．虽然这些假设需要通过其他分类相关数据和更全面的数据集进一步强调，但我们认为值得注意的是AGT1.序列分辨率足够高，也可以用于研究人口水平，以重建网状进化过程。

一起携带，我们证明了这一点AGT1.允许评分约53％（41例中的22例中的22种）的溴脲基物种测定率，其对应于使用单个标记的先前报告的速率增加，其最高为27.6％和44.4％的精心制备组合三个标记[14.]．通过在未来将数据集扩展到基因组规模，可以进一步使用其他规范标记来进一步增加正确的物种识别率。

我们打算开发一种易于处理的协议，可以使用低成本的努力和基本提供的实验室设施在植物园背景下应用，我们考虑使用AGT1.一个可能的解决方案，以协助凤梨属物种的测定，并可能也与其他低遗传变异的植物组。参考文献资料的相应知识数据库系统正在开发中。

植物材料的采集和采样策略

植物材料收集自德国和奥地利的3个植物园(德国海德堡植物园;Alter Botanischer Garten Göttingen，德国;德国柏林植物博物馆;以及来自巴西(Refúgio dos Gravatás, Teresópolis，里约热内卢de Janeiro, Brazil)一位合著者(EMCL)的私人收藏。这些活标本是按照《生物多样性公约》(1993年)第9条所建议的迁地保护准则种植的。我们对取样材料进行充分分类的标准是由至少一位著名凤梨科专家进行可验证的评估和物种收集历史的完整文件(例如“Werner Rauh遗产项目”[55.]）。植物材料的出处，确定植物材料的人的名称和关于凭证标本的可用性的信息列于附加文件1S1:表。

我们试图涵盖在最近修订的孕妇亚家族的最近修订中所代表的所有曲线[39.]以及在最近对溴脲的研究中恢复的所有曲线[23.，25.，32.，34.，35.，36.，56.]．在亚科伯基替硝基菌，Hechtioideae，Navioideae，Pitcairnioideae和Puyoideae，我们添加了许多不同的物种，因为我们可以从上述任何收藏品中获得。这最终导致477种（3597）和目前接受的76属的51种[1]．

我们另外从推定的杂交物种中获得植物材料Tillandsia Marconae.W. Till＆Vitek以及许多潜在的家长物种（T. Paleacea.C. PRESL，T. purpurea.Ruiz＆Pav。，T. Virescens.（Ruiz＆Pav。）L. B. SM。，t . recurvata（L.）L.和T. Landbeckii.菲尔。）从秘鲁沙漠南部的遗址收集[42.]．

DNA提取、PCR扩增、DNA测序、质粒克隆

根据制造商的说明，使用Qiagen (Venlo, NL) DNeasy Plant Mini Kit从新鲜或干燥的叶子材料中提取DNA。PCR扩增AGT1.marker region was performed using MyTaq DNA-polymerase (Bioline, London, UK) using 10–20 ng DNA template, 5x MyTaq reaction buffer (5 mM dNTPs and 15 mM MgCl), 10 pmol of each primer (AGT1_SP6_Fw: 5‘-ATTTAGGTGACACTATAGATTGATGTCGCATTAACCGGC-3‘ and AGT1_M13_Rev: 5’-AACAGCTATGACCATGGCAGTTCTTCAGTCCCCATG-3’). The cycling conditions were the following: 95 °C 3 min. [30 cycles: 95 °C 30 s.; 56 °C 20 s.; 72 °C 20 s.] 72 °C 5 min. Before designing bromeliad specific primers, we also used the canonicalAGT1.之前研究中使用的引物[18.，23.]．PCR扩增和测序matK引物组合MatK 5F: 5 ' -ATACCCTGTTCTGACCATATTG-3 '和trnK2r 5 ' -AACTAGTCGGATGGAGTAG-3 '。内部排序matK使用底漆Tomatk 480f 5'-catctkgaaatttggtc-3'完成了[57.]．

在测序之前，根据供应商的建议，用外切核酸酶I (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)和虾碱性磷酸酶(Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)联合处理PCR反应。

使用标准测序引物（SP6_FW 5'-）使用标准测序引物（SP6_FW 5'-）使用ABI 3730平台（Senckenberg生物多样性和气候研究中心）的ABI 3730平台（Applied Biosystems，CA，USA）设备进行了Sanger测序（Senckenberg生物多样性和气候研究中心）进行atttaggtgacactatag-3'和m13_rev 5'-aacagctatgaccatg-3'）。

AGT1.根据供应商的建议，使用CloneJET PCR克隆试剂盒(Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)进行PCR片段克隆。然后在Eurofins Genomics (Eurofins Scientific, Luxemburg, LU)使用通用质粒测序引物M13正向和SP6反向对每个克隆试验进行4到5个质粒测序。

收购matK来自Genbank的序列

482.matK从Genbank下载序列。将所有序列对齐并修剪至782bp的长度。可以在附加文件中找到包含所有物种的GenBank登录号的列表1S1:表。

数据分析

对序列数据进行编辑和分析诅咒软件（BioMatters，奥克兰，NZ，版本11.0.5）[58.]．序列比对采用诅咒实施的Mafft.序列对齐工具（版本7.388）[59.]．序列比对进一步分析Mega7.软件包(60]．利用Kimura 2参数距离(K2P)分析外显子IV序列比对Mega7.，采用Wilcoxon秩和检验。

AGT1.使用CD-HIT-EST软件进行序列数据库聚类分析[28.，61]．最终序列标识截止设置为0.98，所有其他参数都设置为默认值（附加文件2:表S2)。

使用爆炸介导的物种鉴定使用诅咒实现自定义BLAST函数[59.]．所有快餐序列AGT1.外显子IV被修剪至264 bp，内含子IV部分在外显子V边界被截断。使用MegaBLAST算法进行两两比较，使用以下设置进行数据库搜索:评分(Match Mismatch): 1-2;缺口成本(Open Extend):线性;最大价值:10;文字大小:28。输出是通过增加每一次命中的Bit-Score来排序的。我们认为，只有当最高位分对应于与查询相同的物种，而所有其他物种确实具有完全不同的较低位分时，识别才会成功(附加文件)2:表S2)。

使用Paup生成最大似然树* [62]．对线总长度为492 bp，“间隙”和缺失数据未计算在内(图2)。3.和额外的文件3.：S3）。提供了从1000复制的引导支持值（> 50％）。

本研究使用的数据集包括在手稿和补充材料中。本研究获得的所有DNA序列均提交至GenBank，登录号列于附加文件1S1:表。

• 2020年12月30日

  对本文的修订已发布，并可通过原始文章访问。

BP：

底对

Ibol：

国际条码生命

K2P：

Kimura 2-参数

LCNG:

low-copy核基因

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

subg：

亚属

感谢Andreas Franzke和Simone Elfner（德国Heidelberg大学），Barbara Knickmann（Botanischer Garten derUniversitätWien，奥地利）以及Michael Schwerdtfeger和Leonard Georg（德国Göttingen大学植物园）用于植物抽样帮助;Heike Kappes（Grunelius-Möllgaard实验室，法兰克福，德国）和弗兰克拉佩（歌德大学，德国法兰克福，德国）为实验室提供帮助。

这项研究是由德国联邦教育和研究部(BMBF)资助的，由授予Marcus a. Koch和Georg Zizka的一笔赠款(Evo-BoGa)。我们感谢德国科学、研究和艺术部(Baden-Württemberg)以及Ruprecht-Karls-Universität海德堡(Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg)在开放获取出版资助项目中提供的资金支持。

隶属关系

1. 德国法兰克福森肯贝格研究所和法兰克福自然历史博物馆，植物和分子进化系，森肯贝格根拉格25,60325

   Fabian Bratzel，Juraj Paule＆Georg Zizka

2. 有机体研究中心（COS）Heidelberg，海德伯格大学，海德贝尔大学，海德贝尔大学345,69120，海德堡，德国海德堡大学

   Fabian Bratzel，Anna Loreth，Annika NowoTny，Markus Kiefer＆Marcus A. Koch

3. 歌德大学生态、进化和多样性研究所，德国法兰克福市max -von- laue ße 13, 60438

   Sascha Heller，Nadine Cyrannek＆Georg Zizka

4. Marie Selby Botanical Gardens，811南棕榈大道，萨拉索塔，FL，34236，USA

   elton m. c. leme

5. 植物学系和生物多样性研究，生命科学系，维也纳大学，瑞安14,1030，维也纳，奥地利

   Walter Till, Michael H. J. Barfuss和Christian Lexer

贡献

上海、广州、JP、MAK、FB是本次研究的构思和设计。FB, SH, NC, JP, AL, AN, MK和MAK对数据的获取、分析和解释做出了贡献。EMCL, WT, MHJB提供了资料并提供了分类方法。FB撰写论文，JP, GZ, MAK, MHJB和CL贡献。所有作者阅读，评论和批准的最终手稿。

通讯作者

对应到法比亚布拉茨．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

本文已更新以添加正确版本的其他文件1。

开放访问本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．Creative Commons公共领域奉献豁免（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。

重印和权限