动态特性和功能分析为长链非编码RNA的响应提供了新的见解GydF4y2Baverticillium dahliae.GydF4y2Ba感染GydF4y2Bagossypium hirsutumGydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

黄萎病是一种广泛和破坏性的疾病，导致棉花产量和质量严重丧失。通过各种调节机制，长期非编码RNA（LNCRNA）涉及许多生物过程，例如植物疾病抵抗反应，但它们可能在棉花中的角色GydF4y2Baverticillium dahliae.GydF4y2Ba感染在很大程度上不清楚。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这里，我们测量了抗性的转录组GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba感染后,GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba鉴定出4277个差异表达的lncRNAs（delncRNAs）。定位和丰度分析显示delncrna在染色体上呈偏态分布。我们探讨了抗病相关lncRNAs在染色体分布、诱导表达谱、生物学功能等方面的动态特征，并根据其诱导表达谱将其分为三类。对于德尔恩克纳斯，687GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 成对和14,600GydF4y2BatransGydF4y2Ba-鉴定了lncRNA mRNA的作用对，表明GydF4y2BatransGydF4y2Ba-作用是棉花抗黄萎病相关lncRNAs调控靶基因的主要途径。分析delncRNAs的调控模式发现GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 和......GydF4y2BatransGydF4y2Ba-Acting Lncrnas有不同的方式来影响靶基因。基因本体（GO）富集分析显示Delncrnas的调节功能显着参与刺激反应过程，激酶活性和血浆膜组分。基因和基因组的京都百科全书（Kegg）富集分析表明Delncrnas参与了一些重要的疾病抵抗途径，例如植物 - 病原体相互作用，α-亚麻酸代谢和植物激素信号转导。另外，将21个DelncrNA和10个靶基因鉴定为与茉莉酸生物合成相关的α-亚麻酸代谢（JA）。随后，我们发现了GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba可能调节对GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba通过调节表达GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba涉及JA生物合成。进一步的功能分析表明GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba-沉默的幼苗表现出降低的抗性GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba，表达下调GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba和JA的含量下降。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究显示了多个文件中Delncrnas的动态特征，并提出了这一点GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba-GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba-JA网络参与响应GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba入侵。我们的结果提供了使用LNCRNA在棉花上旋转枯萎病的遗传改善的新见解。GydF4y2Ba

棉是其天然纤维和油籽中最重要的经济作物之一，并在全世界广泛种植。棉花的质量和产量经常受到果蝇的严重威胁，这是棉花中最具破坏性的疾病之一，值得有效地控制[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba]. 黄萎病是由GydF4y2Baverticillium dahliae.GydF4y2Ba，一种土传、木质部侵入、半生物营养型真菌病原。超过400种植物被入侵GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba，引起顽固的血管枯萎病，甚至死亡[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba］．它的微克洛蒂潜能潜能儿童可以在土壤中存活15年[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]对黄萎病的防治提出了严峻的挑战。GydF4y2Ba

茉莉酸(Jasmonic acid, JA)作为一种重要的植物激素，在植物对生物和非生物胁迫的响应中起着重要的调节作用。越来越多的证据表明，感知病原体攻击促进了植物从脂质中合成JA，而JA的积累激活了植物下游防御基因的表达，从而保护植物免受攻击[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]. 利用茉莉酸不敏感突变体，发现拟南芥中茉莉酸依赖的防御途径有助于对病原真菌的抗性GydF4y2Baalternaria brassicicola.GydF4y2Ba和GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]. 据报道，JA反应可降低番茄对烟草的敏感性GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba和GydF4y2BaFusarium oxysporumGydF4y2Ba[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．重要的是，已经证明JA响应途径对于棉花威胁抗性抗性至关重要[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

近年来，高通量技术已被广泛用于监测表达谱，并鉴定棉花中大量差异表达的基因/蛋白GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba．通过转录和蛋白质组学分析，揭示了植物激素信号转导、苯丙素生物合成途径、木质素代谢、细胞壁相关酶/蛋白、三磷酸腺苷(ATP)结合盒(ABC)蛋白、活性氧和棉酚在抗氧化中起着重要作用GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba在棉花GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．此外，鉴定了大量的葡萄霉菌基因和蛋白质。例如，先前我们获得了3027次葡萄原抗性unigenesGydF4y2Bag .取得GydF4y2Bacv pima90-53 [GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba[鉴定1717和1476型在抗性中差异丰富的蛋白质GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba简历。ND601和易感GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba简历。感染后CCRI8GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba分别为(GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．此外，还鉴定出了一些与棉花防御相关的microRNAs (miRNAs)GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba通过高通量测序[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］．这些研究不仅为棉花抗性的分子机制的研究提供了大量信息，还为了解长期非编码RNA（LNCRNA）在调节植物反应中的功能的基础GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba感染。GydF4y2Ba

LncRNAs的长度超过200个核苷酸(nt)，没有蛋白质编码能力[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．LNCRNA在开花时间监管中发挥重要作用[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba[光膀胱[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba]，生殖发展[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]，水果发展[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba,GydF4y2Ba28GydF4y2Ba,GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]生物和非生物应激反应[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba31GydF4y2Ba,GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．最近，LNCRNA在植物病原体相互作用中的作用引起了很多关注。在小麦中，LNCRNA参与对粉状霉菌和条纹锈病感染的反应[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba,GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］．几个lncrnas回应GydF4y2Ba病圃GydF4y2Ba已在拟南芥中鉴定感染[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．通过高通量测序，在泡桐中鉴定了110例响应植物感染的响应响应植物感染[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．已经发现，响应的许多LNCRNAGydF4y2Ba菌核病GydF4y2Ba感染GydF4y2Ba芸苔栗鸟GydF4y2Ba[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］．LncRNAGydF4y2Ba埃琳娜1GydF4y2Ba已经证明可以调节GydF4y2Ba病因相关的基因1GydF4y2Ba(GydF4y2BaPR1GydF4y2Ba）通过与介质亚基19a（Med19a）的相互作用，导致拟南芥抗性增强GydF4y2Ba假单胞菌注射器GydF4y2Ba[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba］．最近，已发现番茄LNCRNA23468可以作为竞争内源性RNA的功能进行调节GydF4y2Banbs-lrr.GydF4y2Ba通过诱骗miR482b在番茄和GydF4y2BaPhytophthora Infestans.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

如前所述，在棉花中检测到许多功能性LNCRNA。发现1296个LNCRNA与纤维引发有关，720克斯克拉斯在纤维伸长率和次级细胞壁生物合成中发挥作用[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba,GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]. 一些lncRNAs在GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba参与调节植物激素对抗干旱胁迫[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba］．确认LNCRNA（LNCRNA973）在增加棉花耐药性方面发挥重要作用[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba]. 此外，还发现了1236和1907个lncRNAsGydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba抗性感染GydF4y2Bag .取得GydF4y2Ba和易感GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba分别和谱系物种特异性（LS）LNCRNA响应于疾病鉴定[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba]. 然而，lncRNAs的功能和动态特性GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba仍然未知。GydF4y2Ba

本研究利用RNA-seq技术，从抗黄萎病菌中提取抗黄萎病菌的lncRNAsGydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba并通过病毒诱导基因沉默(VIGS)技术揭示了重要lncrna的功能。我们从染色体分布、诱导表达谱、生物学功能等方面探讨了与疾病应答相关的lncrna的动态特性，并通过连接感染过程GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba到lncrna动态表达谱。GydF4y2Ba反式GydF4y2Ba为试剂枯萎病相关的LNCRNA在棉花中调节靶MRNA的主要方式。重要功能GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba参与棉花抵抗力GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba通过GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba-GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba-JA网络被曝光。GydF4y2Ba

接种后，高达4277克尔氏菌在棉根中诱导表达GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba

为了研究抗性的转录组GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba回应GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba感染，孤立的总RNAGydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba使用高通量RNA-SEQ方法测序2,6,12,24和48小时的植物（CV.nongda601）在2,6,12,24,24和48 h后接种（HPI）（VD2HPI，VD6HPI，VD12HPI，VD48HPI）。为了比较，还测序模拟处理样品（MT2HPI，MT6HPI，MT12HPI，MT24HPI和MT48HPI）的转录om。通过质量过滤器，获得了大约10亿的清洁读数。通过转录组件，使用侧链的差分同种型和基因表达分析，这些清洁读数的约77.1-83.3％与参考基因组对齐GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba］．大约89％的对齐读数是独特的映射到单个基因组基因座，证明了RNA-SEQ读取的高质量和参考棉基因组（附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：表S1）。通过袖扣组件，最终获得了380,559令的转录物，其中计算了16,876个LNCRNA。GydF4y2Ba

表达量大于2倍的lncrna和GydF4y2BaQGydF4y2Ba-价值< 0.05为差异表达。结果，共鉴定出4277个delncRNA（图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Baa） 是的。为了验证测序数据的结果，使用qRT-PCR评估随机选择的6个delncrna在所有样本中的表达水平。RNA测序结果与qRT-PCR结果有很强的相关性(GydF4y2BaRGydF4y2Ba = 0.917,PGydF4y2Ba < 0.01) (Fig.1.GydF4y2Bab)，表明rna序列的高质量。GydF4y2Ba

delncrna在染色体分布和诱导表达谱上表现出明显的动态特征GydF4y2Ba

通过比较5个时间点delncRNAs的数量，我们发现delncRNAs的丰度有明显的差异。在2 hpi、6 hpi、12 hpi、24 hpi和48 hpi分别有1074、2411、1284、1307和1802个lncrna差异表达。而这些delncrna主要是上调的，尤其是在6 hpi时，上调率高达85.9% (TableGydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．这些delncrna表现出高度的时间特异性：大量的delncrnas是2 hpi，6 hpi，12 hpi，24 hpi或48 hpi的独特。特别是在6 HPI，约42.4％的Delncrnas（1022）是独特的（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba一种）。GydF4y2Ba

本地化分析显示LNCRNA的分布诱导GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba在染色体上并不均匀。AT05，AT11和DT05的DelncrNA较高，较低，AT06，DT10和AT02较高。此外，Delncrnas倾向于分布在染色体末端。我们还发现，Delncrnas在染色体上的分布随着感染过程而变化GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba2.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

所有的4277个DelncRNA根据其诱导表达谱被分为三类，每一类都有不同的诱导表达模式（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2BaC）。I型和II型集群表示由此引起的下调和上调的LNCRNAGydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba，分别约为21.7%和76.7%。尽管只有68个嵌合调控的lncRNAs被归类为III型，但它们的表达模式最为复杂GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba感染。例如，存在10个LNCRNA，其在6 HPI以6 HPI上调，然后在后面的一个或两个时间点下调。I型和II型集群分别分为两个子类。我们发现亚型I-1和II-1集群中的Delncrnas分别在一个时间点下调和上调。虽然亚型I-2和II-2簇中的DelncrNA更复杂，但下调和上调至少两个时间点，并且感应速率随感染时间而变化。这些结果表明Delncrnas接种后棉花在棉花中具有明显的动态特性GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

反式GydF4y2Ba-Acting是Delncrnas调节目标mRNA的主要方式GydF4y2Ba

据报道，LNCRNA可以通过以下方式调节基因活动GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-代理和/或GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 换来[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba,GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］．为了分析Delncrnas的潜在调节模式，我们选择了组成的差异表达的蛋白质编码基因GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-或者GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 与delncrnas的对。在这项研究中，687年GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-鉴定了lncRNA mRNA的作用对，更重要的是，鉴定了大量的GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 发现对（14,600对）。明显地，GydF4y2BatransGydF4y2Ba-在已鉴定的lncRNA mRNA靶对中，作用对占绝对优势，占95.51%（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa） ，这表明GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 为此是主要方式GydF4y2BaV. Dahliae-GydF4y2Ba诱导棉花中靶MRNA的诱导的LNCRNA。GydF4y2Ba

如图所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaB，GydF4y2BatransGydF4y2Ba-Acting对可以分为三个模式。图案1含有具有756个上调的LNCRNA和2405个上调的MRNA的14,146 LNCRNA-mRNA靶对;图案2包括具有78个下调的LNCRNA和290个下调的MRNA的448 LNCRNA-mRNA靶对;图案3仅具有6个LNCRNA-mRNA靶对，具有2个上调的LNCRNA和6个下调的MRNA。显然，属于图案1和2的LNCRNA-mRNA靶对是阳性调节作用对，而属于图案3的那些是阴性调节作用对，分别占99.96和0.04％（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaA和B）。这些建议的影响GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 在其预测的靶蛋白编码基因上的LNCRNA在正规调节中占主导地位。GydF4y2Ba

这个GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 基于LNCRNA的调节模型对其靶MRNA的调节模型进行了四种模式（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC）。图案1包括255个LNCRNA-mRNA靶对，包括214个上调的LNCRNA和243个上调的MRNA;图案2含有129个LNCRNA-mRNA靶对组成92个下调的LNCRNA和129个下调MRNA;图3表现出223个LNCRNA-mRNA靶对，其包含169个上调的LNCRNA和209个下调MRNA;图案4显示80 LNCRNA-mRNA靶对，具有66个下调的LNCRNA和76个上调的MRNA。显然，将阳性调节作用对聚集成图案1，图案2分别分为图案3和图案4，分别分别分为图案3和图案4，分别占55.90％和44.10％（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa和c).比较GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 为LNCRNA，负调节在积极调节中发挥了同样重要的作用GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 调节其目标mRNA的LNCRNA。GydF4y2Ba

DelncRNAs参与了许多抗病过程，并表现出时间特异性GydF4y2Ba

为了预测delncrna的潜在功能，对其靶mrna进行GO注释和KEGG富集分析。在生物过程的范畴内，大多数术语都与刺激反应和蛋白质修饰有关。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa） 是的。分子功能的前10项与激酶活性、蛋白质结合和核苷酸结合有关（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab).在细胞成分方面，生物膜可能发挥了重要作用(图)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bac） 是的。此外，前10条重要路径如图所示。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba天。值得注意的是，糖酵解，植物 - 病原体相互作用，α-亚麻酸代谢，脂肪酸降解，植物激素信号转导，萜类骨骨骨架生物合成，过氧化物血糖和黄酮化生物合成均与抗病性有关，表明这些Delncrnas涉及响应GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba感染。GydF4y2Ba

Go Encichment分析还表明，独特的Delncrnas的功能变化GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba感染时间（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Bad）。具体地，它主要与刺激反应，激酶活性和磷酸化，在2 HPI，刺激反应和缺氧响应的24hPI，刺激反应和单生体过程中的24小时，生物膜，24 hpi的细胞反应，在48 hpi下对缺氧的催眠反应。这些结果表明，LNCRNA可以迅速使一系列顺序反应迅速感染GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba进一步证实了棉花抗逆过程中delncrna的动态变化特征GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

JA生物合成中功能候选LNCRNA的调节作用及特征GydF4y2Ba

KEGG富集分析结果表明，α -亚麻酸代谢是感染后显著富集的途径之一GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba．另外，α-亚麻酸代谢与JA的生物合成相关。以前的研究表明，JA在棉花抵抗中发挥着重要作用GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．在该研究中，发现22个LNCRNA-mRNA对（21LNCRNA和10mRNA）涉及JA生物合成途径，并分配到四个基因家族：脂氧合酶（LOX），氧化烯类合酶（AOS），联烯氧化物环酶（AOC）和酰基-CoA氧化酶（ACX）（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：表S2）。具体而言，两种LNCRNA参与调节两种LOX家族成员，5例LNCRNA与AOS家族的三个靶基因进行调节关系，一个LNCRNA可能是两个AOC家族成员的潜在监管因素，13个LNCRNA参加了三个ACX的调节家庭成员。基于标准化的FPKM值分析了JA生物合成途径中涉及的21例DelncrNA的表达谱。结果表明，所有Delncrnas都在遭受袭击的棉状根部上调GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．相关分析表明，22对lncRNA-mRNA对均为正调控(附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：表S2）。在LNCRNA和靶基因之间的调节关系中，只有五个LNCRNA-mRNA对是一对一的调节关系，其余17对不在一对一的监管关系中，例如GydF4y2Baghacx.GydF4y2Ba（gh_a09g2434）由11个lncrnas调节（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：图。S2）。这些结果表明，这21个LNCRNA对其靶MRNA的调节作用是复杂的。GydF4y2Ba

ghlnclox3GydF4y2Ba在对GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba入侵和可能与JA生物合成相关GydF4y2Ba

LOX是植物通过α -亚麻酸代谢途径参与JA生物合成的重要酶。通过对lncRNA-mRNA对的分析，我们发现GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba属于目标蛋白质编码基因GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 设计LNCRNA LNC_015092，设计为GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba．而且，表达了GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba在所有时间点上调节，并以6 HPI达到达到约30倍。因此，我们推断出来GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba可能对GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba通过调节GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba表达影响JA合成。GydF4y2Ba

对8个抗病性不同的棉花品种进行了实时荧光定量PCR检测GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba．结果表明GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba在6hpi时，在所有品种中均上调。折叠调节GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba与棉花品种的抗病性正相关(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一种）。此外，靶基因GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba有类似的表达趋势吗GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba在所有品种（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba：图。S3）。什么时候GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba通过VIGS进行静音(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bae），植物表现出增强的易感性GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba与CK比较的叶片更严重的衰弱和氯化（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac） 是的。此外，疾病指数GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba- 在25dpi（白天接种后）的植物显着高于对照的植物（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad）。与控制相比，GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba-沉默植株的表达量较低GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba和JA含量（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baf和g）。相关分析表明表达水平GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba与GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bah） 是的。这些结果证实了我们的假设GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba通过调节表达影响了JA综合GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

执行IntaRNA程序计算两个分子间的潜在结合位点GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba和GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba]GydF4y2Ba．GydF4y2Ba结果，检测到具有-17.54k / mol的可想导致的具有自由能的结合位点（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab）。LNCRNA可以通过直接MRNA结合和募集到一些RNA结合蛋白来施加其效果以调节mRNA稳定性[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba,GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]. 因此，我们推断GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba可能会阻止GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba通过募集到一些未知的RNA结合蛋白质降解。结果进一步建议GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba调节棉花的抗病抗性GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba通过GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba-GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Baja模型。基于本研究的结果和之前的报告，我们提出了作用的示意图GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba提高棉花的抗逆性GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba我)。GydF4y2Ba

LncRNA是一种在真核生物广泛的生物过程中具有重要功能的分子[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba,GydF4y2Ba49GydF4y2Ba]. 由于lncRNAs的作用机制复杂多样，因此确定其生物学功能是一个挑战。越来越多的证据表明，lncRNAs可以通过多种途径调控某些靶基因GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-代理和/或GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 换来[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba,GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]. 然而，以往的研究大多集中在GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-代理lncRNAs[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba45GydF4y2Ba,GydF4y2Ba50GydF4y2Ba,GydF4y2Ba51GydF4y2Ba]. 例如，92种抗病反应GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 在棉中鉴定出LNCRNA-mRNA的成对[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba]. 在我们的研究中GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 抵抗lncrnaGydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba我国棉花产业率先建立；和14600GydF4y2BatransGydF4y2Ba-lncRNA mRNA的作用对被鉴定为与抗病性相关（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab）。的数量GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 成对的是21倍GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 一对，大约。因此，我们建议应对植物进行更多关注GydF4y2BatransGydF4y2Ba-未来的行动计划。此外，我们还研究了基因的调控模式GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-代理lncRNAs和GydF4y2BatransGydF4y2Ba动作片lncRNAs。研究结果揭示了我国的监管模式GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-代理lncRNAs和GydF4y2BatransGydF4y2Ba-作用于目标mrna上的lncrna并不完全相同。GydF4y2Ba反式GydF4y2Ba- 为lncrnas主要是积极的调节，而负调节在积极调节中发挥了相同的重要作用GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 调节其目标mRNA的LNCRNA。这些结果代表了一个表征重要地位和调节模式的第一个GydF4y2BatransGydF4y2Ba-参与植物对病毒侵染反应的作用lncRNAsGydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba．此外，我们的研究是与先前对LNCRNA的研究相互互补的GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba在棉花，耐用GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba是对易感者的补充GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba， 和GydF4y2BatransGydF4y2Ba-action lncRNA是互补的GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-ack rncrna。GydF4y2Ba

黄萎病响应lncrna具有明显的动态特性。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)，这可能与感染过程密切相关GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba．最近，张和赵监测了感染过程GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba在拟南芥和棉的根组织中[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]. 在6hpi时，分生孢子覆盖在拟南芥和棉花的根表面；到24hpi时，大量分生孢子开始萌发并延伸形成新生菌丝；48hpi时，棉花根部形成大量菌丝[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba52GydF4y2Ba］．在这项研究中，在6 HPI的刺激反应和缺氧反应中富集了独特的DelncrNA，这可能是由于孢子覆盖引起的根周长的局部缺氧;在24 HPI，它与生物膜有关，这可能是由于新生儿菌丝的延伸影响了膜结构;在48 HPI下，它富集对缺氧的细胞反应，这可能是由于氧气被大量菌丝捕获的事实，导致根组织中的细胞内缺氧。GydF4y2Ba

LNCRNA具有各种复杂的机制来调节多个水平的基因表达[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba49GydF4y2Ba,GydF4y2Ba53GydF4y2Ba]. 最近在植物中的研究已经鉴定了大量的lncRNAs，极大地提高了我们对lncRNAs生物学的认识。然而，lncRNAs的具体功能和作用机制尚处于起步阶段[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba,GydF4y2Ba39GydF4y2Ba,GydF4y2Ba49GydF4y2Ba]. 在这项研究中，lncRNAs根据靶蛋白编码基因的注释被分为几个GO和通路术语（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba），这将有助于我们了解LNCRNA响应病原体感染的潜在功能。GydF4y2Ba

植物必须在其开发过程中遇到各种生物和非生物胁迫。要处理这些逆境，植物已经进化了本构和诱导的防御系统[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．现在清楚的是，合成了几种内源性信号分子，例如水杨酸（SA），乙烯（Et）和Ja，并可激活一系列复杂的防御信号网络[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]. 已有研究表明，JA在棉花抗逆中起着重要作用GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．最近已发现18个茶lncrna通过调控JA相关基因的表达影响JA的生物合成[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]. 此外，lncRNAs在物种间的保守性较低[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba］．在本研究中，发现通过复杂的监管网络涉及JA生物合成途径的21个LNCRNA。GydF4y2Ba

LOX是JA生物合成在植物中的关键酶，并对生物应激作出重要作用[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba]. 例如，有人指出GydF4y2Ba托洛克斯GydF4y2Ba可能对GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba通过调节JA的生物合成来影响植物防御基因的表达[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba];GydF4y2BaCmLOX09GydF4y2Ba通过AOS途径在JA生物合成中发挥了积极作用，然后增加了抗性GydF4y2Ba白粉菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba59GydF4y2Ba］．在这项研究中，转录om数据分析显示联系GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba和GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba，这促使我们进一步调查的功能GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba. 为了弄清楚GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba参与棉花抗性枯萎性，与GH有正调节关系GydF4y2Balox3.GydF4y2Ba，我们测试了表达式的变化GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba和GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba在八种不同的棉花品种GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba感染。此外，GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba用VIGS技术沉默了，我们检测到GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba和JA在下调的巨大监管GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba- 植物。因此，我们初步表明了GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba-GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba-JA是一种重要的棉花抗性网络GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba，但对RNA干扰(RNAi)和过表达的进一步研究尚需补充。此外，两者之间有潜在的结合位点GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba和GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba预测（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab） 是的。近年来的研究表明，lncRNAs可以通过直接与mRNA结合和招募RNA结合蛋白来调节mRNA的稳定性[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba,GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]. 因此，我们推测GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba可能会增强GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba通过核酸结合和招募到一些未知的RNA结合蛋白。尽管这一猜想还需要进一步的研究来验证。GydF4y2Ba

在本研究中，使用高通量rna测序方法，共鉴定了4277种delncrna。这些delncrna在时间特异性、染色体分布、诱导表达谱和生物学功能等方面表现出明显的动态特征。虽然以往的研究多关注GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 这项研究表明GydF4y2BatransGydF4y2Ba-表演是学习的主要方式GydF4y2BaV. Dahliae-GydF4y2Ba诱导棉花中靶MRNA的诱导的LNCRNA。沉默GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba在棉抑制JA的积累并降低抗病性，下调GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba．这些结果表明GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba-GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba-JA网络在棉花抗逆中起着重要作用GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba感染。我们的结果将延长目前对LNCRNA防御的看法GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba感染并为棉花抗原抗性抗性遗传改善提供新见解。GydF4y2Ba

植物材料与病原真菌GydF4y2Ba

抵抗的GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba简历。Nongda601和Nongdamian8由我们的实验室培育。以前我们还筛选了419种，代表棉质种质资源的核心集合[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba]. 419份材料和农大601的病指数（DI）为25 我们实验室使用了至少30株尚未发表的幼苗。以农大601幼苗为材料，构建了链特异性cDNA文库，用于转录组分析。筛选出8个不同抗性品种（农大棉8号、碾棉9号、陕三元78-782号、中078号、芦棉6号、洞庭3号、E82-6078号、新547号）GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba对419份核心种质资源进行功能验证。GydF4y2Ba

在25℃的温室条件下，在25℃下的温室条件下在50％的Hoagland的溶液中生长棉花幼苗。每4天改变一次营养溶液，以确保幼苗的健康生长。一个非常侵略性的GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba菌株Linxi2–1[GydF4y2Ba61GydF4y2Ba[在4℃下储存，在马铃薯右旋糖琼脂（PDA）上培养2周，然后在25℃下在振荡器（130rpm）上培养到Czapek的培养基中10天。将结合悬浮液调节至10的密度GydF4y2Ba^7.GydF4y2Ba每毫升孢子患有50％的Hoagland的解决方案，作为接种的最终浓度。GydF4y2Ba

RNA分离和测序GydF4y2Ba

当第四个真正的叶子蔓延时，Nongda601的棉花幼苗用孢子接种GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba．根据我们以前关于感染过程的研究GydF4y2BaV. Dahlia.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]，分别在2、6、12、24和48hpi下收获根系。作为模拟处理，在相应的时间点收集用50%霍格兰溶液处理的植株。利用RNA制备纯植物试剂盒（北京天根生物技术有限公司）提取所有样品的高质量总RNA。用Ribo-zero-rRNA去除试剂盒（美国Epicentre）去除rRNA。根据制造商的建议，使用Illumina（美国内布拉斯加州）的NEBNext超定向RNA文库制备试剂盒产生链特异性cDNA文库。测序在Illumina Hiseq 4000平台和150平台上进行 生成bp配对末端读取。GydF4y2Ba

lncrna鉴定GydF4y2Ba

首先通过删除包含适配器的读取，读取包含PLOY-N和低质量读数的读取来处理所有序列数据。参考基因组和注释文件GydF4y2Bag .分子GydF4y2Ba是从CottonGen数据库下载的(http://www.cottongen.org). 使用Bowtie2V2.2.8构建参考基因组的索引，并使用TopHat2将成对末端清洁读数与参考基因组对齐[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba］．每个样品的映射读数由袖扣组装[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba］．根据lncRNA的特点，我们根据每百万片段映射的外显子的片段/千碱基(Fragments Per Kilobase of exon Per Million Fragments mapped, FPKM)、长度、外显子和编码势(FPKM > 0.5;长度> 200;外显子≥1;编码:没有)。GydF4y2Ba

表达分析GydF4y2Ba

袖扣提供了计算程序，用于计算每个样品中的LNCRNA和编码基因的FPKM，并且袖手倾斜提供了用于使用基于负二项式分布的模型来确定差异表达数据的统计例程[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba］．通过以下标准获得差异表达转录物：调整后GydF4y2BaPGydF4y2Ba价值< 0.05和至少两倍FPKM变化[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

使用kobas3.0对所列基因的所有路径富集和GO术语进行注释(GydF4y2Bahttp://kobas.cbi.pku.edu.cn/GydF4y2Ba)，与参考基因组背景(GydF4y2BaPGydF4y2Ba < 0.01).

鉴定GydF4y2BatransGydF4y2Ba- 和......GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 成对GydF4y2Ba

通过Pearson相关系数方法分析LNCRNA和mRNA之间的相关性以预测LNCRNA的靶基因。这个GydF4y2BatransGydF4y2Ba-通过以下标准获得作用对：相关绝对值> 0.95.GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-作用是lncRNA作用于邻近的靶基因。我们设定了GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-表演100对 用STME软件筛选出表达模式相同的lncRNA和mRNA[GydF4y2Ba64GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

棉花维格斯GydF4y2Ba

如先前所述[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba60GydF4y2Ba特定引物设计以扩增GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba片段并克隆到TRV2中：GydF4y2Ba00GydF4y2Ba向量。引物序列列于附加文件中GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba：表S3。空向量TRV2:GydF4y2Ba00GydF4y2Ba并包含候选片段矢量TRV2：GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba分别是用相等量的TRV1通过相同渗透的GydF4y2Ba根癌农杆菌GydF4y2Ba当子叶涂抹时，GV3101进入Nongda601的棉花幼苗。TRV2：GydF4y2Ba类别1GydF4y2Ba(GydF4y2BaCloroplastos Alterados 1GydF4y2Ba)和TRV2：GydF4y2Ba00GydF4y2Ba分别作为阳性对照和阴性对照。GydF4y2Ba

中收取植物接种GydF4y2Ba

当阳性对照出现脱色表型时，我们开始用至少30株植物进行接种GydF4y2Bav大丽花GydF4y2Ba应变Linxi2-1，至少有三个生物学重复。在6 HPI，叶子被从几家植物收获以评估GydF4y2Baghlnclox3GydF4y2Ba沉默度与分析沉默的变化GydF4y2BaGhLOX3GydF4y2Ba表达量和JA含量。在25 dpi时，观察表型，并根据前面描述的计算植物群体的DI [GydF4y2Ba61GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

定量实时（QRT）PCR分析GydF4y2Ba

使用RNAPREP纯植物套件（天根Biotech，中国）从棉根或叶中提取总植物RNA。使用Primescript RT-PCR试剂盒（Takara，China）从0.5μgRNA合成第一链CDNA。特定的引物（附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba：表S3）旨在将ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems，Waltham，Massachusetts，USA）的QRT-PCR在Sybr上实现GydF4y2Ba预混料的前女友GydF4y2BaTAQ II系统（大连Takara，中国）。QRT-PCR的程序如下：95℃持续2分钟，然后在95℃下进行40次循环，20s，55-60℃，20s和72℃。基因表达水平被标准化为GydF4y2BaGhubq14GydF4y2Ba（泛素14）表达[GydF4y2Ba65GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在当前研究期间生成或分析的数据包含在本发布的文章中及其补充数据文件中，并从相应的作者获得合理的请求。GydF4y2Ba

lncRNA:GydF4y2Ba

长非编码RNAGydF4y2Ba

delncRNA:GydF4y2Ba

差异化表达的lncrna.GydF4y2Ba

去：GydF4y2Ba

基因本体论GydF4y2Ba

KEGG:GydF4y2Ba

Kyoto基因和基因组的百科全书GydF4y2Ba

miRNA：GydF4y2Ba

小RNAGydF4y2Ba

PR1GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

病因相关的基因1GydF4y2Ba

Med19a：GydF4y2Ba

中介单元19GydF4y2Ba

伟大的人：GydF4y2Ba

病毒诱导的基因沉默GydF4y2Ba

HPI：GydF4y2Ba

接种后的小时GydF4y2Ba

JA：GydF4y2Ba

茉莉酸GydF4y2Ba

DI编号：GydF4y2Ba

疾病指数GydF4y2Ba

dpi:GydF4y2Ba

白天接种后GydF4y2Ba

SA：GydF4y2Ba

水杨酸GydF4y2Ba

等：GydF4y2Ba

乙烯GydF4y2Ba

RNAi：GydF4y2Ba

RNA干扰GydF4y2Ba

PDA：GydF4y2Ba

土豆葡萄糖琼脂GydF4y2Ba

类别1GydF4y2Ba:GydF4y2Ba

Cloroplastos Alterados 1GydF4y2Ba

VD：GydF4y2Ba

v大丽花GydF4y2Ba接种过的GydF4y2Ba

公吨：GydF4y2Ba

Mock-treatedGydF4y2Ba

所有作者都感谢实验室成员寻求帮助，建议和讨论。GydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(no . 31871672);中国农业科研体系建设项目(no . CARS-15-03);河北省科技支撑计划项目(no . 16226307D);资助机构为这项研究提供了资金支持，包括实验设计和实施、抽样和数据分析。没有资助者参与数据的收集、分析和手稿的撰写。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 中国农业大学华北作物改良与调控国家重点实验室，保定，河北，071001，中国GydF4y2Ba

   古陵王，兴芬王，闫张，君阳，李志坤李，李云吴，金华武，南武，李霞刘，正文刘，男子张，李强吴，桂银张＆zhiying maGydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

MZ和ZG设计了实验。WG、ZY和LL分别制备植物材料并进行RNA提取。WG, WX, WL (Lizhu Wu)， WJ, WN, ZM进行了功能验证。WG, YJ, LZ (Zhikun Li)， LZ (Zhengwen Liu)和WL (Liqiang Wu)进行了数据分析。WG写了手稿。MZ和ZG对手稿进行了修改。所有作者都阅读并批准了原稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2BaGuiyin张GydF4y2Ba或者GydF4y2BaZhiy Ma.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

出版许可GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

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斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。GydF4y2Ba

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