基因组识别CLE基因,家庭及其在黄瓜螺栓和水果轴承中的潜在作用（Cucumis巨大成功l .)

背景

信号肽是植物生长发育所必需的。在植物中，细胞间通讯、细胞增殖和分化、细胞自交不亲和和防御反应等生物过程都严重依赖于肽信号网络，如CLE (CLAVATA3/Embryo surrounding region related)。在植物生长发育的不同阶段，特别是在维持不同分生组织中干细胞增殖和分化的平衡中，cle是必不可少的。

工作系统继续教育重要经济蔬菜黄瓜(Cucumis巨大成功L.）尚未完全研究。黄瓜中染色体级基因组组装的分布模式为基因组的比较分析提供了基础继续教育这种植物的基因

结果

总共26个人继续教育在中国长黄瓜‘9930’中鉴定到的基因中，大部分属于不稳定的短碱性亲水肽。比较分析表明，两种动物的CLE基因发育密切相关拟南芥，甜瓜和黄瓜。所有的外显子内部结构的一半中海基因是单外显子基因，而motif 1是一个典型的靠近c末端的CLE结构域，在信号通路中起作用，除CsCLE9外，在所有黄瓜CLE蛋白中都存在。26个黄瓜上游区域的顺式调控元件(cre)分析继续教育基因表示可能的关系cscle.基因和激素反应元件的某些功能。结果与黄瓜亲缘关系密切拟南芥和甜瓜，有七和15个直字继续教育基因在拟南芥和甜瓜分别。另外，黄瓜中一对正交基因的计算分析表明，作为进化过程的一部分，继续教育基因正在经历一个积极的选择过程，导致功能分化。这些基因的具体表达在生长和发育期和组织中剧烈。黄瓜基因CLV3是在拟南芥转化植株T1代半数以上表现出生长点发育明显乏力、无抽薹、植株生长能力下降等现象。只有2个栓系荚果未发育或荚果短，其发育明显低于野生型。

结论

在这项研究中，26岁继续教育在中国黄瓜长' 9930 '基因组中鉴定到相关基因。的继续教育基因主要由碱性亲水不稳定蛋白组成。基因继续教育家庭分为七个班级，并与他们的同源物共享密切的关系拟南芥和甜瓜。对这些基因在不同生长和组织发育阶段的特异性表达进行了评估CLV3，家庭代表性基因过表达拟南芥，提示其对黄瓜的抽薹和结果有一定的作用。

信号肽是短肽链，其引导新合成的蛋白质转移到分泌途径，通常是5-30个氨基酸的长度。植物小信号肽在真核生长和开发过程中起重要作用，例如应力反应[1，2，3.]，顶端公司维护[4，5，6]血管束发育[7，气孔发育[8繁殖生长[9，细胞分裂[10]，以及吸收矿物元素[11]以及细胞 - 细胞通信，自我不相容确定和其他分子水平作用[12]．Clavata3（CLV3）/胚胎周围区域（CLE）肽，一种更好地研究的信号肽分子，包括12或13个氨基酸，包括可能或可能不含糖修改的羟基化的脯氨酸残基，并且在非细胞自主方式。它们在细胞外空间中用作细胞间隙，并与细胞表面受体样蛋白结合以传输信号。Cle多肽激素在植物生长和发育的许多重要过程中起着关键作用，特别是在不同的共同组织中维持干细胞的增殖和分化之间的平衡[13，14]．Cle肽激素，在调节细胞核中转录因子的茎分序WUS（WUSCHEL），促进干细胞标志物基因的表达CLV3，维持干细胞特性，同时表达CLV3抑制沃斯转录水平促进干细胞分化，并形成一个非常精确的反馈控制回路，用于控制茎商术中的干细胞数[13]．在远端根分生组织中，acr4 - cle40介导的信号与WUS家族转录因子WOX5之间也形成了一个自我调节的相互作用反馈回路，调节远端根分生组织的增殖和分化[13，14]．作为植物血管系统初始中心的血管结合，具有多能干细胞的特点。海拉川，费舍尔，特纳等。［15，16，17发现有一个调节机制，血管挂钩细胞分裂由PXY /热带病研究和培训特别规划表达的基因拟南芥挂钩细胞和CLE41 / TD1F基因表达于韧皮部分化抑制因子。Hirakawa等人[16的维管束拟南芥的过表达CLE41和CLE44被裂缝，导致过度分裂的促进细胞和血管区域的显着扩大。基因CLE41 / TDIF特别在韧皮骨折中表达拟南芥可以促进促进捕获细胞的增殖，并抑制促进捕获细胞的分化成导管分子。除了CLE41/44和CLE42，所有其他CLE多肽，包括CLV3，不具有此功能。CLE41/44受体的PXY/TDR突变会使原形成层细胞在分裂过程中失去定向，分化的木质部和韧皮部细胞减少，而未分化的原形成层细胞保留较多[15，16，17]．的表达水平沃斯同源基因WOX4在原形成层中被证明是由CLE41/44［16]．

黄瓜 （Cucumis巨大成功l;2n = 2 = 14)，是世界上一种经济上重要的蔬菜作物。它可以以未成熟或成熟、新鲜或加工的形式食用。由于黄瓜基因组较小(约367mb)和农业重要性，2009年初对其基因组进行了测序，这为了解其性别表达、抗病性、葫芦素生物合成和“鲜绿色”气味等特性提供了依据[18.]．该基因组由低覆盖率的Sanger序列和高覆盖率的Illumina短序列组合而成，其基因组覆盖率为中国长自交系“9930”的70倍，基因组覆盖率为72.2倍。多年来，研究人员对全基因组和全转录组测序表现出了兴趣，这导致了黄瓜基因组的几个版本，并提供了遗传信息。三根黄瓜线支架组件(中文长' 9930 '，Gy14 [19.]和B10)。黄瓜品种中国长‘9930’的主流基因组组装和基因注释已更新到第3版。黄瓜基因组版本3是使用PacBio长读、10X Genomics和高通量染色体构象捕获(Hi-C)数据组装的。这个精确的基因组装配包含174个总长度为226.2 Mb的contigs和8.9 Mb的N50，鉴定出1078个新基因，包括239个串联复制基因和1374个全长长末端反转录转座子[20.]．此外，还构建了许多黄瓜基因组和转录组数据库，为基因组研究和育种提供友好的查询界面。2012年，甜瓜的第一份基因组草图问世。对甜瓜双单倍体品系DHL92进行测序，获得甜瓜基因组375mb(83.3%)，包含蛋白编码基因27427个。由于古代的双二体三倍复制，最近的全基因组复制在甜瓜谱系中缺失，这可能导致甜瓜基因组比黄瓜基因组的大小增加[21.]．全基因组鉴定继续教育瓜类的基因及其与黄瓜的同源基因的进一步比较将有助于阐明瓜类的进化模式。现有的黄瓜基因组组装和丰富的工具加速了基因组研究，包括通过生物信息学方法进行基因家族分析。全基因组基因家族分析已用于许多黄瓜基因家族，包括MADS-box [22.,甜23.，生长素反应因子[24.]，脂氧合酶[25.，钙依赖蛋白激酶[26.], metacaspase [27.，谷胱甘肽过氧化物酶[28.和水通道蛋白[29.，但具体的生物和功能作用继续教育黄瓜中的基因目前还不清楚。

本研究侧重于基因组的分析继续教育基因在黄瓜。我们分析了所鉴定的基因的外显子-内含子结构、系统发育和同源性以及组织特异性表达继续教育基因，以及黄瓜的异种过度表达CLV3基因拟南芥．本研究旨在深入了解黄瓜和其他瓜类作物信号肽的遗传网络，为今后提高产量、营养价值和商品品质提供依据。

基因组识别继续教育基因在黄瓜

全基因组搜索继续教育对黄瓜进行基因比对。我们首先下载了已知的CLE蛋白拟南芥自我构建一个克莱马尔可夫模型。通过使用设计的CLIMARKOV模型扫描基因组组件32,317黄瓜编码蛋白，我们确定了26个CLE转录因子（S1表)。手动检查显示出良好的保存Cle转录因子（由术语“CSCLE”引用，其中序列号并由CLE域的电子值进行排序;表1）.除CsCLE24(1021个氨基酸)、CsCLE5(416个氨基酸)和CsCLE6(404个氨基酸)外，许多黄瓜CLE肽都是短肽(90个氨基酸长)。黄瓜CLE蛋白的分子量为5293.84 (CsCLE9) ~ 113323.11 (CsCLE24)，与黄瓜CLE蛋白的分子量相近拟南芥．大部分黄瓜CLE蛋白为碱性，理论pI范围为7.09 (CsCLE17)至12.11 (CsCLE10)，但有一种弱酸性蛋白CsCLE24 (pI = 6.52)除外。CsCLE4蛋白是稳定的，而其他蛋白是不稳定的。黄瓜CLE蛋白脂族指数为49.03 (CsCLE6) ~ 106.78 (CsCLE17)，肉汁指数为−0.935 (CsCLE9) ~ 0.17 (CsCLE21)。

26继续教育保持在染色体上的基因，包括在CHR6,6上的7上，每次在CHR1和CHR 2上，每个CHR 3，CHR4和CHR7上的CHR6，5。（图。1）.的继续教育基因CsCLE24和CsCLE25位于1 kB的短代际位置非常接近。除了，CsCLE13和CsCLE14地点也很近;这一发现表明这些基因可能是串联复制的。另外，有一对基因，CsCLE5和CsCLE6，在内部发现分段重复cscle.在黄瓜中，所鉴定的片段复制基因对分布在不同的染色体上(图2)。2）.

黄瓜Cle蛋白的系统发育关系与分歧

在本研究中，我们主要使用中国长'9930'的基因组组装。

只有31继续教育基因已鉴定(S2表)，而以前的一份报告显示拟南芥含有32个继续教育基因(30.]．总计25继续教育在甜瓜中鉴定基因（S3表)，使用计算方法。来理解继续教育葫芦科植物和模式植物的基因拟南芥，我们比较了基因拟南芥西瓜和黄瓜品种中国长‘9930’(图。3.）.这些cl根据系统发育关系将其分为7个副过敏类群(组1 ~ 7)，除组2和组6外，其余均由cl来自黄瓜和其他植物物种，表明黄瓜之间的密切关系cl和其他植物的。黄瓜的分布cl在这些群体中是不均衡的。第7组是最大的组，有12个成员，占黄瓜的近一半cl，其次是含有6和5个黄瓜的组1和5组cl， 分别。最少代表的亚壳是2和6组，没有黄瓜cl。

黄瓜基因结构继续教育基因

为了比较黄瓜基因，预测了它们的外显子结构（图。4）.利用黄瓜保守蛋白序列，采用最大似然法构建系统发育树继续教育基因。14继续教育其中单外显子基因10个，双外显子基因10个，三外显子基因1个。同一系统发育分类群内的外显子-内含子模式具有相似性。黄瓜基因CLE24是独特的，它的离散编码区被19个内含子分开。

保守的黄瓜CLE蛋白基序

MEME软件用于探索黄瓜中Cle蛋白的保守结构和图案。根据对准的升高值，从基序1到10列出图案（图。4）.几乎所有的黄瓜CLE蛋白都含有motif 1，这是一个典型的靠近c端CLE结构域，但CsCLE9除外。CsCLE5和CsCLE6蛋白在c端不同;在c端CLE区域附近均含有motif 4。蛋白CsCLE11包含4个串联定位的motif 6和1个CLE结构域，而CsCLE24包含2个串联的motif 2。这些结果表明，黄瓜CLE蛋白在系统发育树各分支的序列特征和生物学功能存在很大差异。这些蛋白在n端或中间还具有其他功能域，而其CLE结构域在信号通路中起作用。

上游顺式调控元件(CREs)

在PlantCare数据库中，上游启动子中的1500bp序列用于定位上游调节区中的顺式调节元件。通过分析26黄瓜上游区域的生物学功能继续教育可以得出结论，除了促进剂正常表达所需的大多数组分，例如在〜塔塔箱和甲箱中，可以分为以下四个类别。1）第一类元素是激素响应元件，例如APRE（ABA响应元件），TCA元素（水杨酸响应元件），TATC盒（赤霉素响应元件）和TGA元素（助长响应元素）等。在该实验中绘制这些元素（图。5）.2）第二种类型的元件是轻响应元件，例如Ace，G盒，ATA-MOTIF，灯元件等3）。第三种元素是共聚物表达元素。例如，HD-ZIP1（与培养基细胞分化有关的元素）和TGACG-MOTIF（与单次发育有关的元素）在CLE基因调控中起重要作用，对植物分生维持和器官发生。4）第四类是应激响应元件，例如，MBS，富含TC的重复，LTR等，以及在代谢调节中发挥作用的其他调节因素。

黄瓜CLE蛋白同源对

为了了解单祖先基因和重复基因的垂直下降，我们进行了比较分析，以确定同源、共同源和副同源基因对拟南芥黄瓜和甜瓜。

Orthomcl软件鉴定了24个直字，23个共同原理和8个副骨继续教育基因之间的双拟南芥黄瓜和甜瓜。该同源基因对网络与系统发育树高度一致，系统发育树明确分为三部分。这三个物种之间的同源基因如图所示。6．26根黄瓜中继续教育基因，甜瓜中的15个正非基因和7 in拟南芥被找到。

选择发散时间

为了调查选择机制继续教育在进化过程中，我们计算了同源对的Ka、Ks和分化时间CsCLE24-CsCLE25（S4表)。该组合的Ka值为1.08,Ks值为0.82,Ka/Ks比值为1.31P- 0.0098的值，表明该基因对正在进行阳性选择，导致功能分化。

黄瓜表达模式继续教育基因在开发过程中

我们研究了每一个的表达式继续教育使用已发表的RNA-seq数据(S5表格）植物和生殖发育期间23种不同的黄瓜组织。使用RPKM方法标准化每个基因的表达水平。十个黄瓜继续教育基因包括cscle1,2，4，5，14日,25，24.，23,15,17在23个样本中均表现出相对较低的表达水平，表明它们在黄瓜的发育过程中发挥的作用可以忽略不计。基因CsCLE9，10，18.,22.在多个样本中表现出相对较高的表达水平(图。7一种）。

使用QPCR，我们分析了黄瓜的表达继续教育基因(S6表格）在中国长'9930'幼苗的不同组织中。26根黄瓜中继续教育基因，在21个样本中检测到24个基因。基因CLE1.，2，7，8，9，17,18,19，和26.在所有的样本中都以相对较低的水平表达，而在至少一个样本中其他的则以相对较高的水平表达。黄瓜继续教育基因在点、茎、花等生长组织中表达量较高，而在根中表达量较低。的表达水平CsCLE4，6，11，14，21.，23.，24.,25.是最高的(图。7b). qPCR结果与公共数据库中现有RNA-seq数据高度一致。

不同的超表达的CsCLV3基因拟南芥

通过在PHB质粒上携带靶基因来成功构建表达载体，然后CsCLV3基因，代表基因继续教育家庭，被过度表达了拟南芥；我们把这些转化的植物称为阳性菌株。结果表明，在阳性菌株的表型中，弱点在生长期出现。与野生型相比，野生型的生长点直径拟南芥约0.66 mm(图。8故选ACsCLV3基因过表达阳性菌株约为0.54 mm。8b）。在相同的条件下，阳性菌株的生长点小于野生型。

在移植后，T1代中的几乎所有转化的植物都显示出明显弱点的生长点，无螺栓的发育明显弱点和植物生长的降低（图。9）.从T1植物获得的遗传种子极少，在随后的几代产生功能分析不可行。此外，很少有阳性菌株完成了生长和发展的过程。在这项研究中，只有两种螺栓菌株显示豆荚没有发展或豆荚短，并且其显着差不等于野生型（图。10a).随机选取10个转化子进行荧光定量PCR检测(图1)。10b）。结果 （S7表)显示，目的基因在所有转基因材料中均有表达，表达量较低的15号和8号的表型最弱，可结果但出果能力不强。同时，表达量高的1、12、13表型能力强，异常程度高，均不能脱出或结实。一般来说，表达水平CsCLV3基因与其表型一致。实验结果证明黄瓜CLV3基因在控制生长点、果实和植物抽薹的发育方面起着至关重要的作用。

我们的研究详细研究了黄瓜中的Cle家族基因。也定量验证了黄瓜中所有家族基因的时空表达特征。基因CsCLV3，这个家庭的代表性基因过度表达拟南芥．这项工作提供了了解黄瓜Cle蛋白在植物生长和发展中可能作用的新方向和想法，特别是在果实环境中。

的发现继续教育黄瓜基因家庭

一个新设计的继续教育马尔可夫模型在本研究中使用了哪些26个新的继续教育确定基因，证明由C-末端的14个氨基酸组成的CLE结构域是黄瓜的保守基序继续教育基因家族。

CLV3的CLE结构域替换实验表明，即使在上游的CLE结构域被不相关的序列替换后，融合蛋白的表达仍保持完全的生理活性[31.]．CLV3中变量域的消除实验表明，CLV3的功能不受变量域缺失的显著影响[32.]．在Kondo等人的研究中，通过人工合成的n端Arg或c端His缺失的CLE多肽，未鉴定出MCLV3活性[33.]．在处理合成CLV3多肽时，Fiers等人设法完全抑制CLV3的突变表型[34.]．前人的研究如上述证明了CLE结构域是CLE多肽功能的关键结构域[35.]．

在本研究中，几乎每个含有的含有基蛋白1的CleIF蛋白1代表了一种典型的Cle域，其中CSCLE9是未检测到典型CLE结构域的例外。在玉米中，Cle肽在器官的原始细胞中表达，但是被干细胞在干细胞中的迷住耳3的功能基因进行操纵和调节，其调节功能是通过富氨氨酸富重复受体实现的[36.]．在花发育的初始阶段，干细胞生态位通过同源结构域转录因子WUSCHEL (WUS)与CLAVATA3 (CLV3)配体受体系统之间的负反馈回路维持[37.]．当上述任何一个基因失去活性时，干细胞的特性和花分生组织的大小就会因此受到影响[38.]．在RNA-SEQ数据和中国长'9930'数据中发表的表达级别表明了可能的高表达CsCLE9在具有高度分生活性的组织中，这使得我们预测CsCLE9可以在分类尖端和底层组织中心的干细胞之间的Clavata-Wuschel反馈信号中起作用。此呼吁在以后的研究中进行进一步验证。

26个黄瓜继续教育在该实验中鉴定的家族基因在分析公共转录组数据分析和实时荧光定量分析中显示的繁殖组织，血管束和剧烈生长部位中具有高度基因表达。但是，只有26个黄瓜中的一个继续教育家庭基因，即CsCLE6，在植物根中表现出高度的表达，这一发现与以往的研究不一致。的组织分布继续教育基因在很大程度上影响它们的功能特异性，如在茎和根末端的Cle蛋白异位表达的许多测试中揭示，但基因表达的位置不是唯一的函数的唯一决定因素继续教育基因(39.的例子中所示CsCLE6和CsCLE9在目前的研究中。CLE多肽家族是一组分泌的肽激素，在植物的茎、根、维管组织和荚瘤的形成中起重要作用[40，41.]．大量研究表明CLE多肽是维持干细胞增殖与分化平衡的一种重要调节因子[34.，42.]．

黄瓜的系统发育分析与进化继续教育基因

根据系统发育关系的类型，继续教育从三种不同的植物种类中分为本研究分为七组，每个组内含有至少一个拟南芥顺序。这提供了确定保护的必要证据继续教育在不同的植物中。然而,继续教育基因不会在三种不同的物种中均匀地分布。在黄瓜中，有12继续教育基因和最多的拟南芥蜡烛基因是在第7组发现的，其中的cscle.确定基因。但是，在既不是第2组也不是第6组是黄瓜-或瓜继续教育基因的发现。这种差异可能意味着一定的生理意义。快速适应性进化更有可能发生在基因成员更多的群体中，而不是基因成员更少的群体中，正如先前研究的假设[43.]．就CLE多肽的生理功能而言[44.]， 这拟南芥蜡烛第7组的基因被归类为A类基因，其功能是抑制根尖分生组织干细胞和根尖分生组织干细胞的增殖和分裂。黄瓜和甜瓜继续教育分类为同一组的基因可以参考类似功能分析，该发现为未来对基因功能的研究奠定了基础继续教育在葫芦科。

如图1所示。11，我们比较了进化关系和物种关系，得到了同源基因之间的关系。由此可见，同源基因在系统发生树中的位置相当接近，说明了二者的进化关系继续教育三种物种中的家庭基因相对较近。基于这一点，我们可以推断黄瓜和甜瓜的相关基因与那些倒置的甜瓜拟南芥，随着后者以相对彻底的方式研究。如果CsCLE19是同源atcle26.，可以推断其功能是相似的atcle26.；atcle26.可以抑制顶端分泌和根系中的干细胞分裂，但不能抑制普胺的分裂和分化，也不能抑制初级木质血管的分化。该预测函数与其他几种正交基因对的预测不同，即，CsCLE3/cmcle23/AtCLE17，CsCLE15/CmCLE15/AtCLE13/AtCLE16和CsCLE17/CMCLE20./AtCLE10，能抑制根尖分生组织和根尖分生组织的干细胞。这种差异也可以通过测量基因表达来验证。基因CsCLE19表现出明显不同的时空表达模式CsCLE15和CsCLE17．在非茎尖和根尖分生组织中的表达，CsCLE19也有更高的表达。

考虑到同源基因CsCLE26被发现在拟南芥但不是在甜瓜中，假设CsCLE26在古代瓜类中被保留，但在瓜类进化过程中被淘汰。

假定的功能cscle.激素应答和植物生长中的基因

26个细胞中对激素响应的顺式调控元件如ABRE、AuxRR-core和tca -元件的鉴定cscle.基因表明CsCLE多肽与其他类型激素之间存在动态相互作用。在ABRE或aba依赖的反应中，顺式调节元件的频繁出现揭示了其功能继续教育严苛条件下ABA依赖反应的基因[45.]．基因名称继续教育化合物是由的名字衍生而来的吗CLV3基因的拟南芥和胚胎周边地区的那个（ESR)玉米基因[46.]．所有的继续教育最新发现的S具有非常相似的蛋白质结构[47.]，通常在N-末端的短分泌信号肽，在蛋白质的C末端之间的长变量结构域和保守的CLE域。这种保守的Cle结构域通常由12-13个氨基酸残基组成，并且对于Cle蛋白的功能性执行至关重要[48.，49.]．的主要特点之一继续教育基因的c端是高度保守的结构域。此外，也不可能确定这些人的身份继续教育使用高通量测序以相对低水平表达的成员。在基因研究的早期阶段，全基因组的鉴定继续教育利用BLASTP对植物基因进行分析。Oelkers等人采用隐马尔可夫模型和位置特定的迭代BLAST方法，以及100多个新的方法继续教育在19个不同的物种中鉴定出成员[46.]．

基本元素，如猫盒和其他重要的继续教育绝对检测到植物分生和器官组织过程中的基因调节。除了分析过表达的影响萝卜cl在次生根结构上编码CLE多肽Raphanus Sativus，Gancheva等。［50.研究了合成的CLE多肽处理对细胞的影响Raphanus Sativus和R. Raphanistrum植物。对于根中CLE多肽数量变化的植物继续教育过度表达或外源CLE处理，贮藏根组织的发育也随之改变。此外，在众多的光调节基因中存在着一组基本要素，与环境刺激相关的基本要素包括对生物和非生物胁迫的反应。上述四种基本要素的存在，揭示了其可能的作用继续教育基因的相应反应机制。

黄瓜CLV3基因在黄瓜螺栓和水果轴承中充当临界监管

过度的继续教育基因通常显示一种常见的矮子和短根表现型[51.，但在本研究中过度表达CsCLV3基因表现节间缩短，但总茎长无明显的矮化现象。布兰德等人[34.利用转基因植物过度表达CLV3结果表明，在第一个叶片(箭头)启动后，茎分生组织阻滞，表型结果与本研究相似。同时对clv3突变体的表型进行了观察，发现突变体花的器官数量增加，特别是心皮增加。CLV3是拍摄和花卉公司的特定监管机构[52.]．在芸苔属植物拉伯在多房角果基因的功能特性上，证实多房突变体含有较多的雄蕊和心皮BrCLV3而且其大部分是一个具有较短，圆角和更厚的形状和额外的床上的4个地方[53.]．油菜籽同源基因的敲除CLV3利用CRISPR/Cas9系统，发现双突变BnCLV3产生更多的叶片和多象是每种硅种子数量的种子，比野生型和单一突变植物更高的种子重量[54.]．基因CsCLV3的同系物拟南芥基因CLV3．F2群体和RIL群体的精细遗传定位和自然群体的关联分析得到证实CsCLV3为Cn(心皮基因)的候选基因[55.]．但是，至于芍药属rockii心皮，最近的遗传学研究[56.研究表明，表型心皮是复杂的基因调控网络。候选基因有多个，我们也在积极验证CLV3作为黄瓜心皮数的候选基因。相信在不久的将来，CSCLV3基因与黄瓜心皮数表型之间的具体关系将得到明确的描述。

T1代中，弱生长点和螺栓损失和水果轴承能力的表型显而易见。我们对代表异源过表达的实验CLV3基因拟南芥显示,超过一半的数量改变了light-demanding植物在发育不良等T1代体现反应点,缺少螺栓,植物收缩,等,和一些螺栓线长是短和阻碍菌株甚至明显比野生型菌株欠发达。相反，双突变BnCLV3产生更多的叶子和多室角质层，每种子数量显著增加，有助于增加种子产量。以上结果表明CsCLV3基因函数作为监管因素，最有可能在不同生长点和螺栓和水果轴承的过程中控制植物开发。

26继续教育在中国长'9930'Cucumber的基因组中鉴定了家族基因。几乎所有的家庭成员都包含在C终端的典型CLE域的主题1。基因上游启动子区的CRE分析预测，该基因家族可能与黄瓜生长和发育中的激素反应有关。间隙的结果进化分析表明继续教育黄瓜科与模式植物亲缘关系密切拟南芥与甜瓜同属，与黄瓜同属七株继续教育基因拟南芥甜瓜加15。对黄瓜中一对同源基因的分析表明，作为进化过程的一部分，继续教育基因正在经历一个积极的选择过程，导致功能分化。家族代表基因CsCLV3在表达量较低的正转化植株的生长点发育过程中起重要作用，在植株的抽薹和荚果的生长中起作用。

识别黄瓜继续教育基因

黄瓜基因组、基因序列及相应蛋白序列从黄瓜基因组数据库(CuGenDB，http://cucurbitgenomics.org/）.马尔可夫两个相同域的模型继续教育基因是利用已知基因构建的拟南芥CLE蛋白质。使用HMMER程序将所有黄瓜蛋白与这些马尔科夫模型进行比对(http://www.hmmer.org/）具有e的域截止的电子值^{- 3.}．的继续教育位于同一染色体或支架上的10kb距离的基因被认为是串联重复的基因。

模型植物的基因组和注释蛋白拟南芥从TAIR资料库(https://www.arabidopsis.org/)[57.]．基因组和注释蛋白Cucumis梅洛从Cugendb数据库下载。手动除去含有弦域的候选蛋白。protparam（http://web.expasy.org/protparam/)[58.用于分析这些分析物种中Cle蛋白的分子量，包括分子量，理论，等电点（Pi），原子组合式式，不稳定性指数，脂族指数和锯齿状（肉汁）的巨大平均值．

系统发育分析

利用隐马尔可夫模型(HMM)对拟南芥的CLE序列进行搜索，确定了假设的CLE。所有假设的cle进一步进行Pfam和SMART分析，以确定其保守域和特征序列。来自多个物种的蛋白质序列用于系统发育分析在Planta.．使用Gonnet蛋白重量矩阵ClustalX2程序进行两两比对和多重比对[59.]，利用MEGA程序(v6.06)，利用黄瓜的保守蛋白序列，构建最大似然系统发育树继续教育基因。采用统一率和同质谱系，以站点覆盖率截断值为70%的部分缺失进行空白/缺失数据处理。每个分叉分支的频率均大于50%。图是用Adobe Illustrator软件处理的。

基因结构和基序分析

使用基因结构显示服务器工具进行分析基因结构（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/，v2.0）[60.]．MEME软件（http://meme.nbcr.net/meme/， v4.12.0)用于在蛋白质中寻找基序(10 ~ 100 bp长)[61.]．只有在至少三个蛋白质序列中广泛分布的基序被保留下来。根据系统发育树，这些图案用两个独立的图形表示。报告了前10个主题(e值最低)，统计上显著(低e值)的主题在显示中排名第一。

上游顺式调控元件(CREs)

一个1500 BP片段位于启动密码子ATG之前继续教育利用perl脚本从黄瓜基因组序列中捕获基因家族，并在PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行了cre分析。图是使用在线软件GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）.

鉴定正交和递质基因

OrthoMCL软件(v2.0.3) [62.]，用于寻找同源基因、共同源基因和副同源基因拟南芥，黄瓜和甜瓜使用全部继续教育蛋白质序列。all-against-all BLASTP对准过程的e值截止设置为1e^{- 5}并且消除了与50低于50的匹配截止值的对齐。在蛋白质编码序列中的非同义（氨基酸替代，KA）和同义词（KS）取代率用于露出DNA序列的进化。用于估计DNA序列演化的选择强度的Ka / Ks比率;Ka / Ks> 1表示阳性选择，Ka / Ks <1表示纯化（负）选择，近1的Ka / ks表示中性突变[63.]．ParaAT软件(http://cbb.big.ac.cn/software)能够为大量同源基因平行构建多个蛋白质编码DNA序列[64]．评估重复的黄瓜的分歧继续教育使用由Kaks_Calculator工具和Paraat软件使用Nei和Gojobori开发的方法计算副吉隆对基因对基因对基因之间的基因，非同义率（KA）和进化约束（KA / Ks）（http://cbb.big.ac.cn/software）.使用公式T = Ks / 2R对同源对计算发散时间，其中R是来自植物的核基因的发散速率，并且是r = 1.5×10^{- 8}每年每地点双子叶植物的同义替换[65]．所选同源的对拟南芥使用Cytoscape软件收集和显示黄瓜和甜瓜（http://www.cytoscape.org，v2.8.3）[66]．

组织特异性基因表达分析中海

黄瓜的基因表达数据继续教育从CuGenDB (http://cucurbitgenomics.org/rnaseq/cu/17) (NCBI accession: PRJNA312872) [67]．从Cotyledon_4Week_Seedlings，FemaleFlower，Flesh_2Week_Fruit，Flesh_3Week_Fruit，Flesh_UnfertilizedOvary，FleshWeek_Fruit，Hypocotyl_4Week_Seedlings，MaleFlower_Bud，MaleFlower，OldLeaf，Peel_2Week_Fruit，Peel_3Week_Fruit，Peel_UnfertilizedOvary，PeelWeek_Fruit，Petiole_OldLeaf，Petiole_YoungLeaf，Root_4Week_Seedlings，根茎，卷须，TrueLeaf_4Week_Seedlings，UnfertilizedOvary和YoungLeaf的RNA-SEQ数据of cucumber cultivar Chinese long ‘9930’ were used. The TopHat program (https://ccb.jhu.edu/software/tophat/索引。shtml, v2.1.0)将测序结果绘制到黄瓜基因组;然后，利用Cufflinks软件(http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks， v2.2.1)，在GFF文件注释基因模型的指导下。黄瓜继续教育利用HemI程序分析每个样本的基因表达谱。每个样本中的基因表达谱使用RPKM(每千碱基reads /百万reads)方法进行标准化。黄瓜的表达谱继续教育对每个样本的基因进行聚类，并使用HemI程序绘制热图(http://hemi.biocuckoo.org/）.使用默认线性方法归一化后，使用水平轴和垂直轴的分层平均链接算法和欧几里德距离相似度公制算法集群表达数据。

Cucumber Line中的组织特异性基因表达，Chinese Long'9930'

以黄瓜线中国长‘9930’为植物材料进行了探索cscle.不同组织中的表达分化。将种子在55℃下在水中浸泡15分钟，并在28℃下放置过夜进行萌发。使幼苗在受控环境的生长室中生长，该环境生长室为16/8小时（光/暗）和28/18℃（日/夜）的气温。在四叶阶段，根，茎，成熟叶，幼叶，生长点和子叶中被收获并在液氮中冷冻。在开花阶段，在80°C储存之前收获鲜花并在-80°C储存之前进行进一步分析。

RNA套件（Takara，Kyoto，日本）用于根据制造商的说明从分离的植物组织中提取总RNA。主要脚本RT试剂盒（Takara，Kyoto，日本）用于逆转RNA进入cDNA。Primer 5.0软件用于根据此处设计特定的引物继续教育基因序列。以黄瓜肌动蛋白基因(CuGenDB名称:Csa6G484600)作为内对照，对不同样本间靶基因的表达水平进行归一化。使用了3个生物学和3个技术复制。每个反应在20 μL的反应混合物中进行，该混合物以稀释的cDNA样品为模板，SYBR Pre-mix Ex Taq (2×) (Takara)和基因特异性引物。采用CFX96单色实时荧光定量PCR检测系统(BioRad, Hercules, CA, USA)进行定量实时荧光定量PCR (qPCR)，循环曲线如下:95°C 20 s，然后在95°C 3 s和60°C 30 s下进行40个循环;并生成熔化曲线(65°C, 61个循环，10 s)，以检查反应的特异性。采用比较Ct值法分析基因的相对表达量。2 . RNA水平相对于肌动蛋白基因表达水平^-ΔΔct方法。的继续教育通过TBTOOLS软件分析基因表达集群[68]．

不同的超表达的CsCLV3基因拟南芥

基因名称继续教育是由CLV3拟南芥的基因Emeryo周边地区（ESR）玉米基因。在该实验中，代表基因CsCLV3的继续教育家族在拟南芥探讨可能的基因功能CsCLV3．以品种“GY14”为试验材料进行无性系试验CsCLV3基因及其cDNA通过与上述中国长'9930'的方法相同的方法获得。从Cucurbit基因组学数据库获得参考序列（Cugendb，http://cucurbitgenomics.org/feature/gene/CsGy1G014910）.通过氨基甲烯设计引物，并扩增靶基因。将基因克隆产品和表达载体pHb转化为大肠杆菌DH5α分别用双消化方法消化（消化遗产）消化后三世和XBA.I)， T4DNA连接酶连接，37℃过夜培养，通过细菌PCR筛选阳性克隆。通过测序，获得了正确装载目的基因的表达载体。

转基因植物的拟南芥通过花浸渍得到。将连接的PHB表达载体转移到感受态细胞农杆菌肿瘤术GV3101采用冻融法。用鉴定的菌体制备菌悬液A. Tumefaciens.单克隆利用转化缓冲液，并用于侵染植物拟南芥当OD值约为1.0时。将开花植株提前1天浇水，将所有花序倒置到转化缓冲液提前悬浮的菌液中约30 s;7天后重复一次。生长2-3周后，少浇营养液以加速老化，成熟种子收获后晾干。半强度MS (murashige和skoog培养基)(pH为5.8)固体培养基，30 μg mL^{- 1}利用湿霉素筛选转化植株的阳性幼苗。消毒后，将种子播种在筛选培养基上，4℃放置48 h，转培养箱培养。萌发和生长的条件为25°C、16 h/8 h(光/暗)、30000 lx光强、60%相对湿度。约2周后，移植和随访时，可鉴别出阳性菌株。

支持本文结论的数据集可在TreeBase存储库中使用[唯一持久标识符和数据集中的超链接http://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S27518?x-access-code=a142631fde4f4d2f9f68ba859afcbc38&format=html]．

我们感谢延西PEI教授，金旭教授，以及关于实验设计和论文写作的宝贵建议。我要感谢“协作创新中心，即可提高山西省温室蔬菜的质量和效率”，为我们的研究提供实验条件，如乐器和设备。我希望你能批准表达我的感激之情。

该项目由中国国家自然科学基金（NSFC）（NO.31601754）和山西省青年学者的自然科学基金资助（No.20001D11111204）。

隶属关系

1. 山西农业大学园艺学院，山西太谷

   秦楠楠，高阳，程晓静，杨阳，吴江，王金耀，李森，邢国明

贡献

Nannan Qin构思和设计了实验，分析了数据，编写了稿件，编写了数字和表格，并审查了稿件草稿。葛兴和森李·李德贡献了试剂/材料/分析工具，并修订了稿件草稿。杨高分析了数据。萧晶程，江武，杨阳，金瑶王培养了实验材料。作者读并批准了最终的稿件。

相应的作者

对应到森李或Guoming兴．

相互竞争的利益

两位作者宣称没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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