毒力相关milrna及其双向靶标的鉴定gydF4y2Ba辣椒gydF4y2Ba感染期间的玉米gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

吻合组1 IA (AG1-IA)gydF4y2Ba辣椒gydF4y2Ba是带状叶鞘疫病(BLSB)的主要病原体，在世界上许多作物中造成严重的产量损失。MicroRNAs (miRNAs)是一种约22nt的非编码rna，通过mRNA降解或翻译抑制负性调节基因表达水平。更好地了解AG1-IA感染过程中miRNA的功能有助于阐明真菌-宿主相互作用的分子机制。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，我们对接种后3天从AG1-IA分离物、未感染玉米鞘和混合玉米鞘中获得的三个小RNA文库进行了测序。共鉴定出137个保守的microrna样小rna和34个新的microrna样小rna (milRNAs)。其中，1个新的和17个保守的milrna被鉴定为潜在毒力相关(VA) milrna。随后，在AG1-IA和玉米中对这些mirrna的靶基因进行了预测，而这些靶点的功能注释表明它们与发病相关的生物学过程有关。此外，这些毒力相关的milrna的表达模式表明它们参与AG1-IA的毒力。最后，对一个玉米靶向基因的调控，gydF4y2BaGRMZM2G412674gydF4y2BaRhi-milRNA-9829-5p的基因，通过双荧光素酶实验验证，在两个玉米突变体对BLSB的抗性中发挥了积极作用。这些结果表明，全球差异表达的milRNAsgydF4y2Bar .以上gydF4y2BaAG1-IA参与AG1-IA和玉米靶基因的调控，增强其致病性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的数据提供了对va - milrna的全面概述gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba并通过直接干扰宿主靶向基因，确定它们可能是毒力因子。这些结果提供了新的见解的分子机制gydF4y2BaR.solanigydF4y2Ba侵染过程中与玉米的相互作用。gydF4y2Ba

带状叶鞘疫病(BLSB)是一种严重危害玉米产量的植物病害。gydF4y2Ba辣椒gydF4y2Ba属于土传担子菌属真菌，是BLSB的主要病原体[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。根据菌丝吻合的特点和生理生化特征，有14个吻合群，分别称为AG1 ~ AG13和AGBIgydF4y2BaR.solanigydF4y2Ba。其中吻合群1 IA (AG1-IA)是导致单子叶和双子叶27个以上科发生BLSB或褐斑的主要病原体[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。作为玉米BLSB的致病因子，AG1-IA通常以无性真菌的形式存在。偶尔，从它的远形态(gydF4y2BaThanatephorus cucumerisgydF4y2Ba)在田野[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。营养性菌丝体和菌核是主要的感染源gydF4y2BaR.solanigydF4y2Ba［gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。通常，病原菌首先在玉米地上的第一和第二叶鞘感染，然后向上扩散到穗部，导致严重的产量损失[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

迄今为止，已经报道了多种作物对病原菌抗性的遗传和分子研究[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。在玉米中，主要由数量抗病能力控制[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。位于染色体2、6和10上的三个重要数量性状位点(qtl)赋予了对BLSB的抗性[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。最近，一种f -box样蛋白ZmFBL41被发现通过木质素的次生代谢调控玉米对BLSB的抗性[j]。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。有趣的是，泛素蛋白连接酶的表达依赖于gydF4y2BaR.solanigydF4y2Ba特殊技能gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-启动子中的元素[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。为了探索防御相关基因，大规模测序技术已被用于鉴定数百种病原体诱导基因[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。许多催化酶，包括几丁质酶、葡聚糖酶和苯胺解氨酶，已被鉴定为对病原体的反应[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，以及几种致病相关的(gydF4y2Ba公关gydF4y2Ba)参与潜在防御途径的基因和转录因子[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。对于病原菌，采用水稻侵染病原菌菌株的全基因组序列gydF4y2Bar .以上gydF4y2BaAG1-IA于2013年使用Illumina技术生成，为AG1-IA的致病机制和病原体-宿主相互作用的分子基础提供了新的见解[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

mirna包括一类内源性单链非编码小rna，长度通常为21或22个核苷酸(nt)。虽然第一个miRNA基因gydF4y2Balin-4gydF4y2Ba的特点是gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba1993年[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，直到2000年，mirna才被证实是一类独特的生物调节剂[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。迄今为止，快速增长的研究表明，mirna通过调节靶基因的表达水平，在各种生物过程中发挥重要作用[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。在植物中，大多数miRNA基因被RNA聚合酶ii转录成初级miRNA (pri-miRNA)，主要被dicer-like 1酶(DCL1)切割，产生茎环结构，称为前体miRNA (pre-miRNA)。pre -miRNA被DCL1进一步加工成miRNA/miRNA双工，然后通过ARGONAUTE (AGO)蛋白的活性将miRNA纳入rna诱导沉默复合体(RISC)中，在转录后水平进行靶标抑制，而miRNA *通常被降解[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。尽管miRNA已经在植物和动物中得到了深入的研究，但在大多数真菌物种中，miRNA通路仍然知之甚少，甚至存在争议。最近，通过深度测序的应用，在几种真菌中发现了与动物和植物不同的小rna。例如，qirna在gydF4y2Ba粗糙脉孢菌gydF4y2Ba作为DNA损伤诱导的新型小干扰RNA，需要抑制缺陷-1 (QDE-1，一种RNA依赖的RNA聚合酶)、QDE-3(一种Werner和Bloom RecQ DNA解旋酶同源物)和dicer蛋白[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。然而，在真菌中发现mirna样小rna (milrna)之前，人们一直认为真菌不具有mirnagydF4y2BaN.crassagydF4y2Ba。令人惊讶的是，至少发现了四种不同的机制，它们使用不同的因子组合来产生milrna。与此同时，21或22 nt大小的不依赖于骰子的小干扰rna (disiRNAs)也被识别gydF4y2Ba脉孢菌gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。随后，在真菌中发现了许多milrna。例如，研究人员报告了15个micrornagydF4y2Ba绿僵菌属anisopliaegydF4y2Ba可能调节菌丝生长和分生过程[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。在植物病原真菌gydF4y2Ba菌核病sclerotiorumgydF4y2Ba，通过高通量测序鉴定出2种milRNA和42种候选milRNA [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]，而在真菌中观察到milrna及其发夹前体gydF4y2Ba新型隐球菌gydF4y2Ba利用生物信息学和northern印迹方法[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。此外，据报道，在几种丝状真菌中，milRNAs招募RNA沉默蛋白装置的不同组分来产生19至25 nt不等的小RNA [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。这些差异表明真菌milRNA的产生可能是独立于植物和动物的进化。有趣的是，小rnagydF4y2Ba葡萄孢菌gydF4y2Ba能够通过与AGO1蛋白结合来劫持宿主RNA干扰(RNAi)机制来抑制植物免疫，这表明跨界RNAi是真菌与植物相互作用中病原体的毒力机制[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。此后，越来越多的研究表明，真菌小rna可以转移到植物中，并为自己的利益发挥双向功能[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。为gydF4y2BaR.solanigydF4y2Ba， Lin等。[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]通过对菌丝和水稻叶片在不同侵染时期的混合RNA中提取的6个小RNA文库进行测序，共鉴定出177个microrna，其中包括15个新的致病microrna。gydF4y2Ba

为了进一步了解宿主-病原体相互作用的分子机制，我们应用小RNA高通量测序技术鉴定了玉米中毒力相关的微小RNAgydF4y2Bar .以上gydF4y2BaAG1-IA。此外，通过实时PCR和双荧光素酶实验研究了真菌milRNAs及其玉米靶基因的调控作用。此外，我们用两个EMS突变体验证了一个玉米靶基因作为BLSB的正调节因子。总之，我们的目的是阐明玉米AG1-IA的小RNA转录组，以了解真菌致病小RNA的功能。gydF4y2Ba

AG1-IA感染阶段小rna的高通量测序gydF4y2Ba

为了分析AG1-IA中表达的小RNA，并鉴定可能参与真菌与植物相互作用的微小RNA，我们使用Illumina技术对AG1-IA菌丝体(IA)、接种后3天感染AG1-IA的玉米鞘(IA-3d)和玉米鞘(maize)中的三个小RNA文库进行了测序。最终，IA、IA-3d和Maize分别获得14358,708、11012,296和14342,801条原始reads。在去除适配器、污染物和低质量序列后，IA、IA-3d和Maize分别获得14,345,211、10,976,072和14,304,313条高质量的清洁序列，大小为18 - 30nt。在这些reads中，19 - 25nt小rna占主要比例(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

IA和IA-3d的Clean reads与全基因组序列比对gydF4y2Bar .以上gydF4y2BaAG1-IA使用SOAP，分别显示13,929,970和10,611,599个总读取，分别对应2,215,557和1,681,014个独特读取，与真菌基因组序列完全匹配。此外，我们还对IA和IA-3d文库中的玉米基因组片段进行了分析，发现IA和IA-3d中分别有9,120,804和8,866,147个总reads与玉米基因组对应，分别对应1,756,096和858,176个unique reads。同时，将玉米的clean reads分别定位到B73(B73 RefGen_3v，释放5b+)和真菌基因组。最后，获得了11,698,169个总reads，代表3,414,618个独特的reads与玉米基因组相匹配，而7,325,577个总reads代表599,163个独特的reads被映射到真菌基因组(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.随后，我们将所有的reads与各自基因组的外显子和内含子序列进行比对。结果表明，IA和IA-3d中外显子区是产生reads的主要来源，分别占25.51%和10.38%。然而，大多数玉米序列(61.85%)是由内含子反义区产生的(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).由于小rna是非编码rna，因此在下次分析中将排除外显子和内含子的reads。同时，通过对Rfam数据库的BLASTN检索，鉴定出snRNA、tRNA、rRNA等小rna序列(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.未知的reads，被指定为未注释的小rna，提供了在AG1-IA和玉米中鉴定新的milrna的机会。对这些小rna的分析也表明，在第一个核苷酸位置存在U富集和C抑制的倾向(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC)，这与真菌的其他观察结果一致[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

AG1-IA中保守的和新的milrna的鉴定gydF4y2Ba

为了鉴定AG1-IA中的milRNA，使用改良的MIREAP和miRDeep2软件预测真菌milRNA的方法[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。最后，在IA文库中鉴定出137个保守的milrna，共88,161个转录本/百万(TPM) (gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba）.在137个保守的milrna中，有29个表达量相对较高，大于1000 TPM，表明它们在真菌中的丰度。此外，在IA文库中发现了34个新的milrna，总共有406个TPM, 10个新的milrna的表达水平超过10个TPM (gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba）.这些milRNA的前体都具有典型的发夹结构，随机选取的10个milRNA前体的二级结构如图所示gydF4y2Ba无花果S1。gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

mir - rna靶基因预测gydF4y2Bar .以上gydF4y2BaAG1-IAgydF4y2Ba

为了证明鉴定的milRNAs的潜在作用，使用psRNATarget预测AG1-IA基因组中的靶基因。因此，共鉴定出150种milrna的661个靶基因，其中包括119种保守的milrna和31种新的milrna (gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba）.在这150种milRNAs中，15种(10.00%)被预测至少有10个靶基因，而只有11种(7.33%)的milRNAs具有单一的预测靶标。有趣的是，661个靶标中有579个(87.59%)被预测由具有特定靶向位点的单个milRNA调控，而80个(12.10%)基因被预测由至少两个milRNA或具有多个不同位点的单个milRNA调控，如rhii - milr -7566和AG1IA_07036。21个milRNAs未发现靶基因，可能是由于AG1-IA基因组与milRNAs不匹配或基因组中缺乏靶基因注释。gydF4y2Ba

为了研究mirnas在致病性中的潜在作用，对661个靶基因进行了功能注释。AG1-IA基因组共注释了473个基因，包括9个ABC转运蛋白、15个细胞色素p450 (CYPs)、54个分泌蛋白和其他因子(gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba，gydF4y2BaS4gydF4y2Ba）.AG1IA_08015由rhii - milr -1203调控，属于真菌ABC转运蛋白G家族，可能与多效性耐药有关，并与磷脂分子易位有关[qh]gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。此外，6种AG1-IA转运蛋白被纳入转运蛋白分类数据库(Transporter Classification Database, TCDB) [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]被注释(gydF4y2Ba补充表S4gydF4y2Ba）.有趣的是，总共有54种分泌基因被预测为milRNAs的靶标(gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba)，表明在真菌感染过程中，milRNAs可能作为分泌基因的负调节因子。特别是，作为候选效应蛋白，54种分泌蛋白中有4种富含半胱氨酸的蛋白。gydF4y2Ba

在其他候选milRNA靶点中，有23个被归类为CAZymes，包括6个糖苷水解酶(GHs)和13个糖基转移酶(GTs)，它们参与真菌中糖原的生物合成和降解[qh]gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。被预测为rhii - milr -81靶基因的AG1IA_08946被注释为编码一种假定的纤维素酶，该酶可能通过降解植物细胞壁来促进真菌的毒力[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。14个Skp1-Cul1-F-box (SCF)基因通过与真菌中已知的SCF比对鉴定出来(gydF4y2Ba补充表S4gydF4y2Ba)，而Rhi-milR-1418-5p调控的AG1IA_01201预计编码一个SCF亚基。结果表明，通过靶向CAZymes、SCF复合物、MAPK和钙信号通路，milrna可能是AG1-IA毒力的必要条件(gydF4y2Ba补充表S4gydF4y2Ba）.有趣的是，由rhii - milr -1418-5p调控的不同靶基因同时参与MAPK和钙通路，表明milrna在真菌中具有多个生物过程的调控点。gydF4y2Ba

为了确定预测基因的潜在致病性，将473个靶基因编入病原体-宿主相互作用(PHI)数据库[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，导致37个基因受42个microrna调控，这些microrna被描述为PHIs (gydF4y2Ba补充表S4gydF4y2Ba）.我们发现23个PHIs与毒力降低有关，3个与毒力增加有关。此外，对这些基因的功能注释表明，它们包含8个CAZymes、4个ABC转运蛋白和2个分泌蛋白，这表明milRNAs可能在这些靶基因的致病性调控中发挥重要作用。gydF4y2Ba

为了更好地了解它们在AG1-IA中的功能作用，对预测的靶基因进行了基因本体(GO)分析。共有214个基因具有氧化石墨烯的分子功能、生物过程和细胞成分类别。这些基因对结合活性、信号转导因子和水解酶活性表现出很强的亲和力，所有这些在感染阶段通常都很重要(gydF4y2Ba补充表S5gydF4y2Ba）.这些发现表明，在感染过程中，milrna可能具有多种分子功能或通过其靶点介导多种生物过程。gydF4y2Ba

感染过程中毒力相关的微小rna和靶基因的鉴定gydF4y2Ba

鉴定毒力相关的milrna将有助于我们了解AG1-IA在感染过程中的分子调控。为此，我们选择IA和IA-3d文库中大于2.5 TPM的milrna的归一化表达水平进行比较。最后，fold-change大于1.5 (log)的milrnagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba比),gydF4y2BaPgydF4y2Ba-值小于0.05(卡方检验)被称为推定毒力相关的milRNAs (VA-milRNAs)，并选择作进一步分析。如图2所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba发现17个保守的milrna和新的- milr -108是va - milrna。在18个va - milrna中，7个上调，而10个保守的milrna和新颖的milr -108下调(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充表S6gydF4y2Ba)，与IA相比。gydF4y2Ba

为了证明va - milrna在致病性中的潜在作用，我们检测了这些先前在AG1-IA中预测的milrna的靶基因。共鉴定出89个受这18种va - milrna调控的靶基因(gydF4y2Ba补充表S7gydF4y2Ba）.其中，只有AG1IA_02109被两个不同位点的VA-milRNA (Rhi-milR-3126-5p和Rhi-milR-8530-5p)靶向，其他基因被单个VA-milRNA调控。gydF4y2Ba

随后，对这89个靶基因进行功能注释，以揭示它们的潜在作用。总共89个靶基因中有58个已在该基因中进行了功能注释gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba基因组(gydF4y2Ba补充表S8gydF4y2Ba）.其中，我们鉴定出4个ABC转运体，包括AG1IA_2109、AG1IA_3327、AG1IA_3597和AG1IA_6835, 3个CYPs、3个CAZymes、3个scf和6个含有2个富含半胱氨酸基因的分泌基因。此外，受rhii - milr -3126-5p调控的AG1IA_04862在MAPK通路和CAZyme成员中都被归类，表明其在感染过程中具有多种功能。gydF4y2Ba

为了探索这些va - milrna及其靶标的潜在作用，58个基因被分配到PHI数据库中。10种微小rna调控的9个基因被鉴定为重要基因(gydF4y2Ba补充表S8gydF4y2Ba）.AG1IA_05348和AG1IA_05617与致病性丧失有关，其余7个基因与致病性降低有关。此外，对9个PHIs的功能注释表明它们属于ABC转运蛋白、糖基转移酶、镉离子转运蛋白、异柠檬酸酶和DNA修复蛋白。这暗示这10种mirnas可能通过负性调节其PHI靶点参与发病机制。还进行了氧化石墨烯分析，以了解含有9种公共卫生信息的58个靶标(gydF4y2Ba补充表S9gydF4y2Ba）.结果表明，这些靶点参与细胞周期、代谢、微管和信号转导过程。上述结果表明，9种靶向公共卫生病毒的va - milrna可能参与了不同的影响致病性的分子生物学过程。gydF4y2Ba

AG1-IA中milrna及其靶基因的表达模式gydF4y2Ba

测定细胞培养过程中milrna的表达水平gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba，从171个已鉴定的milrna中随机选择14个进行实时RT-PCR分析。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，根据其表达模式将milrna分为四类。第一类含有rhihi - milr -2110、rhihi - milr -7197-3p和novel-19，在真菌培养过程中“逐渐减少”的milrna。同时，包括Rhi-milR-4577和Rhi-milR-5045在内的9种milrna的表达水平呈现“先下降后上升”的趋势，而Rhi-milR-31则呈现“先上升后下降”的表达模式。Rhi-milR-3126-5p的表达与其他三种类型略有不同，表现出“先升高后降低再升高”的趋势(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

在14个milRNA靶向基因中，AG1IA_03824和AG1IA_07031分别编码一个细胞分裂周期(CDC)蛋白和一个延伸因子，预计它们是rhii - milr -7197-3p的靶点。同时，AG1IA_00782编码一个含有WD-repeat的蛋白，预计会受到rhii - milr -2110的调控。这些结果表明，Rhi-milR-7197-3p和Rhi-milR-2110可能参与了gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba在玉米中通过调节它们的目标。此外，靶向AG1IA_00523的新型milR-19编码糖基转移酶在感染期间减少。一般来说，milRNA丰度的降低与靶基因的增加相关，表明AG1-IA的繁殖需要多个milRNA的调控和多种信号转导途径。这些结果表明这些mirnas存在于AG1-IA中，并参与了玉米的致病繁殖。gydF4y2Ba

为了验证上述18个va - milrna的表达模式，我们进行了实时RT-PCR。结果显示，15个va - milrna的表达模式与高通量测序检测结果一致，而Rhi-milR-100-5p、Rhi-milR-222a-5p和novel-milR-108略有不同(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.此外，我们还检测了感染12 h、24 h和5d时va - milrna的表达水平。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba结果显示，包括rhihi - milr -199a-3p和rhihi - milr - 4101 -5p在内的几种va - milrna的表达在12 h、24 h、3d和5d阶段持续下降，表明其靶点上调，并暗示这些va - milrna在致病性中起作用。此外，少数va - milrna，如rhihi - milr -222a-5p和rhihi - milr -8530-5p，在感染过程中几乎持续上调，表明其靶基因的表达受到抑制，暗示这些靶标可能负调控毒力。gydF4y2Ba

为了确定VA-milRNA靶向基因在AG1-IA中的表达模式，我们采用实时RT-PCR检测了由12种milrna调控的19个候选基因。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba结果显示，19个基因在感染后24 h表达量最高，说明毒力相关基因在这一阶段表达强度较高。为了评估这些靶基因是否受到milRNAs的负调控，我们对milRNAs的表达水平与其靶基因进行了相关性分析。在这19个基因中，12个靶基因的表达量与其milRNAs呈中度负相关(- 0.6 < r≤- 0.3)，5个靶基因的表达量与milRNAs呈弱负相关(- 0.3 < r≤0)。这些结果表明靶基因受va - milrna负向调控。而AG1IA_01120和AG1IA_04507的表达与VA-milRNAs的表达水平呈正相关。这可能是由于靶基因通过mirnas的翻译抑制或其他未知因素的协同调节而受到调控。gydF4y2Ba

预测VA mirrna的靶宿主基因gydF4y2Ba

病原体的小rna也作为操纵宿主靶基因的直接毒力因子[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。因此，我们分析了玉米中18种va - milrna的可能靶点。除了没有确定的靶基因的Rhi-milR-92a-3p和Rhi-milR-222a-5p外，其他16种va - milrna已被鉴定出靶向56个玉米基因(gydF4y2Ba补充表S10gydF4y2Ba）.其中，Rhi-milR-3126-5p和Rhi-milR-5045分别靶向10个和8个基因。相反，玉米中的单个基因也可能被不同的mirnas靶向。例如，GRMZM2G009555在不同的靶点上与Rhi-milR-4577和Rhi-milR-3126-5p匹配。gydF4y2Ba

为了确定VA-milRNAs在真菌-宿主相互作用中的功能，对其靶基因在玉米中的功能进行了注释。结果显示，在B73基因组数据库中已注释了28个基因(gydF4y2Ba补充表S11gydF4y2Ba)与植物免疫密切相关。其中鉴定了DNA甲基转移酶、谷胱甘肽转移酶和谷胱甘肽-1-p转移酶等5种转移酶。GRMZM2G064628编码的Teosinte branched/Cycloidea/ proliferation cell factor 18 (TCP18)是一类植物特异性转录因子，参与控制植物器官生长命运，调控部分激素生物合成和信号转导通路[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]，也被确定为Rhi-milR-5045的假定靶点。值得注意的是，GRMZM2G154449编码一种thaumatin样蛋白(TLP)，预计会被rhii - milr -4104-5p靶向。先前的研究表明，植物TLP属于PR蛋白家族5 (PR5)，并具有抗真菌特性[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。这些结果表明，Rhi-milR-4104-5p可能通过靶向TLP基因负调控玉米的抗性。此外，rhii - milr -7237-3p的推测靶点GRMZM2G357399编码adp核糖基化因子，可诱导烟草PR基因的表达和对真菌病原菌的抗性[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。此外，在靶基因中还鉴定出了形成蛋白样蛋白、WD-40重复家族蛋白、转运蛋白MRS2和atp酶。gydF4y2Ba

对这些va - milrna靶点进行氧化石墨烯分析。只有AC148152.3、GRMZM2G025592、GRMZM2G033219和GRMZM2G036720四个基因被归为GO类(gydF4y2Ba补充表S11gydF4y2Ba）.生物过程术语被划分为碳水化合物代谢过程(GO: 0005975)、DNA甲基化过程(GO: 0006306)、染色质组装或拆卸过程(GO: 0006333)、核黄素生物合成过程(GO: 0009231)和蛋白质折叠过程(GO: 0006457)。在氧化石墨烯分子功能类别中，鉴定了水解酶活性、DNA结合、染色质结合和肽基脯氨酸顺反异构酶活性。推测真菌milrna可能在感染过程中通过调控宿主靶基因，激活多种生物过程和多种分子功能，从而响应病原体与宿主相互作用的信号。gydF4y2Ba

为了进一步阐明真菌与宿主相互作用相关的靶基因的机制，利用PlantCARE (gydF4y2Bahttp://intra.psb.ugent.be:8080/PlantCAREgydF4y2Ba）.如gydF4y2Ba补充表S12gydF4y2Ba、多gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba鉴定出aba响应元件(ABREs)、P-box(赤霉素响应元件)和MYB结合位点(MBS)等与干旱诱导相关的逆境响应元件。这表明va - mirna的玉米靶标更倾向于选择胁迫应答基因。gydF4y2Ba

玉米VA-milRNAs可能靶基因的表达模式gydF4y2Ba

为了更好地了解玉米靶标的调控gydF4y2BaR.solanigydF4y2BaVA-milRNAs，我们选择了11个预测的靶基因，通过qRT-PCR分析表达模式(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Bae). VA-milRNAs表达水平与其玉米靶基因的相关性分析显示gydF4y2BaGRMZM2G353548gydF4y2Ba和gydF4y2BaGRMZM2G412674gydF4y2Ba与VA-milRNAs呈负相关(- 0.8 < r≤- 0.6)，而三个靶基因gydF4y2BaGRMZM2G086983gydF4y2Ba，gydF4y2BaGRMZM2G357399gydF4y2Ba和gydF4y2BaGRMZM2G414002gydF4y2Ba与VA-milRNAs呈中度负相关(- 0.6 < r≤- 0.3)。因此，这些玉米靶基因似乎受到VA-milRNAs的负调控。然而，其他6个基因的表达水平与它们的milRNAs没有负相关。总之，这些结果表明部分AG1-IA va - milrna可能在真菌-宿主相互作用过程中调控玉米基因。gydF4y2Ba

GRMZM2G412674是Rhi-milR9829-5p的一个靶点，参与对gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba

根据生物信息学预测，gydF4y2BaGRMZM2G412674gydF4y2Ba具有一个位于3'UTR的Rhi-milR9829-5p结合位点(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).为了确定该靶基因是否受到rhii - milr9829 -5p的负调控，我们在烟叶中进行了双荧光素酶(LUC)测定。我们发现GRMZM2G412674 3'UTR的荧光素酶活性在与Rhi-milR9829-5p共表达时降低，而含有突变的Rhi-milR-9829-5p靶向位点的阴性对照不影响荧光素酶的表达水平(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab).与qRT-PCR结果(图7e, g)一致，这些结果表明gydF4y2BaGRMZM2G412647gydF4y2Ba编码Kelch基序家族的一个成员是Rhi-milR9829-5p的真正靶标。gydF4y2Ba

为了评估GRMZM2G412674在玉米BLSB中的作用，我们鉴定了两个玉米甲烷磺酸乙酯(EMS)突变系，gydF4y2Baems3 - 001 f31gydF4y2Ba（gydF4y2Baf31gydF4y2Ba),gydF4y2Baems3 - 001 f33gydF4y2Ba（gydF4y2Baf33gydF4y2Ba)，来自玉米EMS诱导突变体数据库(MEMD) [gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。的gydF4y2Baf31gydF4y2Ba和gydF4y2Baf33gydF4y2Ba突变系在2150 bp和1105 bp位点进行核苷酸替换，分别导致早期终止密码子和同义突变(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).有趣的是，GRMZM2G412674在gydF4y2Baf31gydF4y2Ba和gydF4y2Baf33gydF4y2Ba分别为自交系B73的17%和63%(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac)。gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba对B73和2个突变系进行了田间接种。我们在5和14 dpi处计算病害指数，发现gydF4y2Baf31gydF4y2Ba和gydF4y2Baf33gydF4y2Ba突变体表现出比B73更严重的疾病症状(图3)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baf).的病变长度gydF4y2Baf31gydF4y2Ba和gydF4y2Baf33gydF4y2Ba在14 dpi时，与B73相比，分别增加了约109和81%(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad).因此，这些结果表明GRMZM2G412674是BLSB抗性的正调节因子。gydF4y2Ba

大量的mirna已经在植物、动物和微生物中被鉴定[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。尽管有报道称真菌中存在dicer样Argonaute蛋白，并且RNA沉默方法可作为抗病毒防御机制[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]，在植物病原真菌中鉴定出的mirna数量并不像在植物和动物中那么多。一种解释是mirna的丰度很低，或者它们只在特定的应激阶段表达，这使得它们难以用传统的方法(如微阵列)识别。近年来，随着小rna高通量测序技术的发展，建立大的小rna文库来检测较少的新型mirna已经成为可能。在这项研究中，获得了数百个小rna, 171个大rnagydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba采用高通量Illumina技术进行鉴定。使用gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba-水稻相互作用系统，Lin等。[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]在感染过程中鉴定出177个真菌mirrna。与以前使用的水稻系统不同[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]，在这项研究中，我们使用了gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba在AG1-IA中鉴定mirnas。虽然AG1-IA和玉米之间的一些保守的reads可能由于IA-3d reads映射到B73基因组的消除而被遗漏，但所描述的真菌milrna可能更准确。此外，不同于AG1-IA在水稻无植株叶片上接种[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，我们在活的玉米植株的叶鞘上接种了病原体，这更接近它们的自然相互作用。因此，在gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba提供了一个有用的工作流程来预测更多的真菌milrna。然而，需要进一步的实验方法来确认这些milrna的功能。gydF4y2Ba

在AG1-IA中预测了171种milRNAs的靶基因，它们的功能注释显示这些靶标在MAPK和钙、运输和水解等多种途径中发挥作用。此外，感染前后差异表达的milrna鉴定为18个va - milrna。在真菌中，功能为CYPs、ABC转运体、CAZymes、分泌蛋白和scf的靶标被包括在内。以往的研究表明，这些基因不仅在生长发育中发挥重要作用，而且在发病机制中也起着重要作用。据报道，真菌特异性milrna在植物免疫中的调节作用可能在于改变植物生长相关基因的表达，而不是调节植物免疫，从而使更多的能量或瞬时构型用于防御或耐受[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。因此，milrna是调节生长和发病的重要致病因子。此外，基于致病性PHI亚网络，对分配到PHI数据库的9个基因进行了表征，有助于在系统层面上了解感染过程中的致病因素。gydF4y2Ba

在玉米中，58个靶基因被预测为16个VA-milRNAs的靶标，28个基因在B73基因组数据库中被注释。在这些靶基因中，发现了一个编码adp核糖基化因子的基因(GRMZM2G357399)，该基因在细胞膜运输过程中起作用，并通过促进细胞扩增来增加器官和种子的大小[qh]gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。我们还观察到GRMZM2G353548编码的WD40重复家族蛋白受到真菌milRNA的调控。WD40蛋白具有多种功能，从信号转导和转录调节到细胞周期控制[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]，这些都是致病的关键。此外，还对调控植物器官生长命运、调控部分激素生物合成和信号转导通路的转录因子TCP18进行了注释[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。此外，GRMZM2G025592被注释为DNA甲基转移酶，参与发育和染色质组织过程中的基因组稳定性以及冷应激静止细胞中DNA甲基化状态的改变[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。编码MYB家族转录因子的GRMZM2G887276也进行了注释。以往的研究表明，MYB转录因子具有多种作用，包括增强非生物抗性和调节转移细胞的分化[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。特别是在抗真菌防御中起作用的thumatin -like protein (TLP) [gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，也有其特点。此外，GRMZM2G412674作为Rhi-milR-9829-5p的靶标，被证实是BLSB的正调节因子(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baf).该结果支持分析病原体与宿主之间的小RNA调控是探索BLSB调控因子的有效策略。此外，通过对VA-milRNAs表达模式与其推测靶点的相关性分析，只有5个靶点与其VA-milRNAs呈紧密负相关，表明它们是成功跨界转移和在宿主中发挥作用的更强候选者。根据这些信息，我们推断AG1-IA的va - milrna可能在感染过程中靶向玉米基因干扰宿主免疫。值得注意的是，rhii - milr -222a-5p和rhii - milr -92a-3p仅在ag1a而不是玉米中预测靶基因，这表明这两个milrna是真菌特异性调控因子。gydF4y2Ba

独联体gydF4y2Ba玉米靶基因的元素分析有助于揭示其可能的功能。在分析gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba在玉米的58个靶基因中，我们发现了多个gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-与生物和非生物应激反应相关的元素。最近的研究揭示了生物和非生物应激之间的重叠[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]，而mirna在这一过程中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，表示gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba对非生物应激反应的元件可能通过调控靶基因的表达参与发病机制。值得注意的是，真菌引发子反应元件(Box-W1)被鉴定出来，这表明这些基因可能参与了对真菌病原体的反应[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。然而，解剖这些过程中涉及的分子机制需要进一步的研究。gydF4y2Ba

我们获得了137个保守的和34个新的milrnagydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba并在感染过程中鉴定了18种va - milrna。对真菌和玉米中18种milRNAs的靶基因进行了预测，功能注释和氧化石墨烯分析揭示了它们可能参与发病机制。此外，mirrna的表达模式gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba通过实时荧光定量PCR检测感染过程，并与候选靶点在真菌和植物中的表达相关。最后，我们利用双荧光素酶实验验证了玉米基因GRMZM2G412674与rhii - milr -9829-5p共转化后的表达量减少，并通过接种证实了GRMZM2G412674是BLSB抗性的正调控因子gydF4y2Bar .以上gydF4y2Ba在EMS突变体中这些结果为探索玉米BLSB和AG1-IA的调控因子提供了有益的策略。总的来说，我们的研究为揭示mirrna在gydF4y2BaR.solanigydF4y2Ba探讨玉米BLSB病可能的致病机制。gydF4y2Ba

真菌菌株和植物材料gydF4y2Ba

的gydF4y2Bar .以上gydF4y2BaAG1-IA菌株YWK196在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA;20%马铃薯，2%葡萄糖和2%琼脂，w/v)， 28°C。玉米(gydF4y2Ba玉米gydF4y2BaL.)自交系B73在22°C、60%相对湿度、16 h/8 h光/暗循环的温室中生长。用ywk196接种地面第三个叶鞘，提取RNA。接种后不同时期B73菌鞘的症状见gydF4y2Ba无花果S2。gydF4y2Ba为了确定玉米EMS突变体的损伤长度，每系接种8株，分别在接种后5天和7天测量损伤长度。独立实验重复2次，进行显著性分析。gydF4y2Ba

小RNA文库构建及高通量测序gydF4y2Ba

AG1-IA、AG1-IA-3d和玉米样品的总RNA采用TRNzol通用试剂(中国天根)提取。通过15%的tbe -尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)从100 μg的总RNA中纯化出18 ~ 30 nt的小RNA，并在5′和3′端连接到特定的接头上。逆转录和扩增后，产物在Illumina GAII平台上测序。构建小RNA文库，进行2次高通量测序，分别进行2次独立的生物重复，计算平均值，进一步分析。原始测序数据提交给国家生物技术信息中心(NCBI)序列读取档案(SRA)， BioProject登录码为PRJNA596921，对应于BioSample数据库SAMN13642263、SAMN13642264、SAMN13642265、SAMN13642266、SAMN13642267和SAMN13642268。gydF4y2Ba

保守的和新的milrna的鉴定gydF4y2Ba

原始读取经过过滤，以使用内部perl进程获得干净的标记。在去除接头/受体序列、接头-接头连接污染物、插入标签和低质量标签后，通过SOAP软件将保留的清洁reads与参考基因组比对，分别排除与外显子义、内含子义、外显子反义和内含子反义匹配的标签。同时，使用默认参数对Rfam (version 13.0)中注释的所有非编码RNA家族进行clean reads blast [gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]并与NCBI基因库数据库中的所有植物和真菌群(gydF4y2Baftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/gydF4y2Ba)消除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA等小rna。剩余的小RNA reads被用于进一步分析，以鉴定保守的和新的milrna。gydF4y2Ba

鉴定…的候选milrnagydF4y2Bar .以上gydF4y2BaYWK196, miRDeep [gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]和MIREAP (gydF4y2Bahttp://sourceforge.net/projects/mireapgydF4y2Ba)软件使用上述标准在剩余小rna的前体中寻找发夹结构[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]。为了减少计算量，将每个标签的表达归一化为TPM，并排除2.5 TPM下丰度的读取。然后，使用BLASTN将miRDeep和MIREAP中存在的所有候选标签与miRBase数据库对齐。与miRBase序列匹配少于4个错配的候选milRNA被鉴定为候选保守milRNA，而其他milRNA标签被认为是候选新型milRNA。最后，候选的保守的和新的milrna的序列完全匹配gydF4y2Bar .以上gydF4y2BaAG1-IA基因组序列(加入号afrt0000000.1)被命名为保守milRNAs，而玉米基因组和cDNA未被命名为新milRNAs，保留用于进一步分析。gydF4y2Ba

mirrna靶基因预测gydF4y2Ba

为了预测milRNAs的潜在靶基因，psrnatart.com (gydF4y2Bahttp://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysisgydF4y2Ba) [gydF4y2Ba72gydF4y2Ba如前所述，使用默认参数。为了预测AG1-IA和玉米中的靶基因，将milRNA序列与ThegydF4y2Bar .以上gydF4y2BaAG1-IA基因组序列和B73基因组(gydF4y2Bahttp://www.maizegdb.orggydF4y2Ba，释放5b+)。gydF4y2Ba

真菌mirrna及靶基因的实时RT-PCRgydF4y2Ba

为了检测真菌milRNAs的表达水平，使用TRNzol通用试剂(Tiangen, China)分离总RNA，并用RNase-free DNaseI (Promega, USA)处理以消除基因组DNA。然后，使用miRNA cDNA合成试剂盒(CWBio，中国)与oligo-dT接头进行第一链cDNA合成。使用miRNA qPCR Assay Kit (CWBio，中国)对milRNA进行实时RT-PCR，其中成熟milRNA序列的正向引物和qTOWER3触摸实时系统(Analytik Jena AG，德国)上的通用反向引物。以18S rRNA基因表达为归一化对照。自动记录阈值周期(Ct值)，ΔΔCt方法[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]计算milRNAs的相对表达量。在AG1-IA中，将Rhi-18S rRNA基因归一化为内控。每个实验进行3个重复，3个生物样品。用于实时PCR分析的引物如表S13所示。gydF4y2Ba

用TRNzol通用试剂(中国天根)获得IA, IA-3d和Maize的总RNA，然后用PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) Kit (TaKaRa，日本)按照制造商的方案合成第一链cDNA。采用SYBR预混Ex Taq (TliRNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa)进行实时RT-PCR。将rhi18s rRNA和玉米β-Tublin基因分别归一化为真菌和玉米的内控基因。ΔΔCt法测定相对表达量。所有的反应在三种生物样品中重复三次。引物序列如表S14所示。gydF4y2Ba

milrna的差异表达分析gydF4y2Ba

为了表示归一化的milRNA表达水平，使用TPM，并按以下公式计算:实际milRNA计数/干净读取总数× 1000000。为了鉴定IA-3d和IA之间表达差异的milrna，采用fold-change = log2(IA-3d/IA)。只有具有fold-change的milrna才会出现gydF4y2BaPgydF4y2Ba选择-值< 0.01作为差异表达的milrna进一步分析。gydF4y2Ba

去分析gydF4y2Ba

靶基因的氧化石墨烯分析采用奇异富集分析(SEA) (gydF4y2Bahttp://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/analysis.phpgydF4y2Ba) [gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]。在分子功能、生物过程和细胞成分类别中，基因术语被认为是显著丰富的gydF4y2BaP -gydF4y2Ba值< 0.05。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

milRNA与靶基因的相关性分析采用经典Pearson相关检验，如前所述，使用SPSS16.0软件进行[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]和gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value < 0.05认为有统计学意义。同时，对实时RT-PCR结果采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，采用Graphpad Prism 7.0软件采用Tukey法进行两两多重比较。gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value < 0.05被认为具有统计学意义，并使用不同的小写字母突出显示。gydF4y2Ba

烟草叶片双荧光素酶报告基因测定gydF4y2Ba

验证Rhi-milR-9829-5p (gydF4y2Ba补充表S10gydF4y2Ba)，从玉米鞘中扩增出GRMZM2G412674的3'UTR序列，并插入到pCAMBIA1300-LUC中。为了生成成熟的Rhi-milR9829-5p，通过添加限制性内切位点(BamH I和Spe I为正向序列)合成成熟milRNA的正向和反向序列;Sac I和Kpn I为反向序列)并连接到pCAMBIA1300-35-X载体上。将构建的Rhi-milRNA载体与构建的目的基因载体共转化为gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba叶子。作为阴性对照，设计GRMZM2G412674基因突变的Rhi-milR-9829-5p靶向序列(5′- ttcgtgttgagtcggcatgc -3′)，构建载体后与Rhi-milRNA共转化。以双报告基因pGreenII0800-LUC载体(萤火虫荧光素酶基因和鼠兔荧光素酶基因)为内对照。采用Promega Glomax 2020 (Promega)，采用双荧光素酶报告分析系统(Promega)对萤火虫和豚鼠的荧光素酶活性进行了测定。荧光素酶活性采用萤火虫/Renilla (F/R)比测定，3个生物样品重复3次。所使用的引物列于gydF4y2Ba补充表S15gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

支持结果和结论的数据图表包含在文章和附加文件中。本研究测序产生的所有序列可在NCBI Short Reads Archive (SRA) BioProject PRJNA596921 (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA596921gydF4y2Ba)，对应于SAMN13642263、SAMN13642264、SAMN13642265、SAMN13642266、SAMN13642267和SAMN13642268。gydF4y2Ba

AG:gydF4y2Ba

吻合组gydF4y2Ba

BLSB:gydF4y2Ba

带状叶和鞘枯萎病gydF4y2Ba

DCL1:gydF4y2Ba

Dicer-like 1gydF4y2Ba

卢克:gydF4y2Ba

荧光素酶gydF4y2Ba

φ:gydF4y2Ba

宿植病原体相互作用gydF4y2Ba

Pri-miRNAs:gydF4y2Ba

主要micrornagydF4y2Ba

RISC:gydF4y2Ba

rna诱导沉默复合体gydF4y2Ba

microrna:gydF4y2Ba

小分子核糖核酸gydF4y2Ba

milRNAs:gydF4y2Ba

微rna样的小rnagydF4y2Ba

nt:gydF4y2Ba

核苷酸gydF4y2Ba

TPM:gydF4y2Ba

每百万份转录本gydF4y2Ba

公关:gydF4y2Ba

发病机制相关gydF4y2Ba

美国广播公司(ABC):gydF4y2Ba

磷酸腺苷磁带gydF4y2Ba

TCDB:gydF4y2Ba

运输船分类数据库gydF4y2Ba

φ:gydF4y2Ba

Pathogen-hose交互gydF4y2Ba

MAPK:gydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶gydF4y2Ba

TCP:gydF4y2Ba

大刍草分枝/圆形细胞/增殖细胞因子。gydF4y2Ba

疾病预防控制中心:gydF4y2Ba

细胞分裂周期。gydF4y2Ba

我们感谢华大基因科技帮助绘制图片和分析数据。我们感谢Blake C. Meyers教授(Donald Danforth Plant Science Center)提供的建议和对草稿的润色。gydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(31700219)和山东省重点研发计划项目(2017GNC10104, 2018GNC110018)资助。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 山东农业大学农学院作物生物学国家重点实验室，山东泰安271018gydF4y2Ba

   李宁，褚朝晖，李晓明gydF4y2Ba

2. 烟台市农业科学院，山东烟台265500gydF4y2Ba

   Shaoli王gydF4y2Ba

3. 浙江农林大学农业与食品科学学院浙江省农产品质量改良重点实验室，浙江杭州临安311300gydF4y2Ba

   杨魏gydF4y2Ba

4. 山东农业大学植物保护学院山东省蔬菜病虫害生物学重点实验室，山东泰安271018gydF4y2Ba

   新华社叮gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

Hongxu孟进行了实验。王少利准备了玉米植株。魏阳用AG1-IA接种玉米植株，并测量了病害长度。丁新华提供了评论并修改了原稿。Ning Li协助进行实时RT-PCR。朝晖设计了研究，修改了稿件。李晓明撰写了主要手稿，并准备了图表。所有作者都阅读并同意稿件的出版版本。作者阅读并批准了最后的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba朝晖楚gydF4y2Ba或gydF4y2Ba小明李gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

b施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

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