大众传播的Juniperus proceraHoechst。EX ENDL。从幼苗和筛查芽和愈伤组织提取物的筛选

背景

Juniperus procera赫斯特．Endl交货。是沙特阿拉伯的一种药用树木，主要分布在灌肠地区，但由于枯萎病和种子繁殖困难(种子休眠和发育不全的胚胎解剖，发芽率< 40%)，它在当地受到威胁。因此，再生产的替代方法Juniperus procera都是非常需要的为了保护和医药用途的大规模传播。

结果

在这个手稿中，我们阐述了成功的体外拍摄倍增和愈伤组织诱导J. Procera.通过使用幼苗作为外植体，检测到一个重要的抗菌和抗肿瘤产品。在不同类型的培养基上增加了外植体，在不同浓度下补充植物生长调节剂（PGR）的不同组合。拍摄乘法的最佳介质是补充有PGR的木质植物培养基（WPM）（0.5μm的IAA和0.5μm的烤盘或0.5μm的IBA和0.5μm壳体）。Whereas for callus induction and formation Woody Plant Media (WPM) with the addition of PGRs (0.5 μM 2,4-D and 0.5 μM BAP) was better than the Chu Basal Salt Mixture (N6), Gamborg’s B-5 Basal Medium (B5), and Murashige and Skoog media. The possibility of multiplication ofJ. Procera.离体技术在克服种子休眠困难、植物繁殖、树木保护和获得大量繁殖材料等方面具有显著的优势。桔梗的嫩枝和愈伤组织提取物J. Procera.经气相色谱-质谱联用分析，发现20多个与次生代谢物相关的化合物，其中含有铁三醇、视黄醇、喹诺酮等抗菌和抗肿瘤药物，并经DART-ToF-MS确证。采用sigma标准的高效液相色谱法对愈伤组织中鬼臼毒素(PTOX)进行检测，并经DART-ToF-MS和紫外光谱证实。

结论

成功地进行了离体芽增殖和愈伤组织诱导J. Procera.使用WPM的幼苗和PGR的不同组合，并检测了一种重要的抗菌和抗肿瘤产品，例如铁蛋白和阴道毒素。根据我们的研究结果，J. Procera.已成为新型生物活性化合物的新天然来源。

属Juniperus是地球上第二大最普遍的针叶树群[1]．Juniperus procera是针叶树的常青树或坟墓的灌木丛。有超过75种Juniperus[2]．Juniperus procera发生在灌肠区域的沙特阿拉伯南沙特阿拉伯，它通常被称为“Arar”。Juniperus procera原产于从东苏丹到津巴布韦的非洲东部山区和阿拉伯半岛西南部，广泛分布在沙特阿拉伯南部[3.]．Juniperus procera是天然药物的来源，具有潜在的抗癌、抗菌、杀虫和抗氧化作用[4.那5.那6.]．树脂的抗真菌活性J. Procera.测试过Pyrofomes demidoffii (列弗．）Kotl．观察到一个令人印象深刻的结果[7.]．据报道，树叶J. Procera.是新的类黄酮的来源[3.]．此外，水果还有治疗头痛和皮肤病的药用价值。它的树脂与蜂蜜一起用作兴奋剂和治疗溃疡和肝病的药物[8.那9.那10.]．许多选民J. Procera.使用GC / MS分析检测提取物并减少过表胶B2和G2的合成[11.]．此外，它具有各种经济、社会和生态价值[12.]．杜松物种已经用于许多目的，包括木材，景观和药用目的[2那13.那14.那15.]．另一方面，种子休眠是人工再生的主要障碍J. Procera.对经济及生态的重要性[16.]．在这方面，据报道，一些物种Juniperus产生了非常少的可存活的种子或解剖学上未发育的种子[17.]．此外，充分发育的种子数量少是这些树木有性繁殖的限制之一[18.那19.]．主要是由于干旱、土壤侵蚀和径流增加，该物种在世界许多地区逐渐减少[18.那20.]．在一些国家，它被认为是一种濒临绝种的树木[21.]．在许多情况下，迄今与传统林业技术一起使用的保护策略并不令人满意[16.]．因此，从种子再生潜力非常低的报道。因此，越来越多的人注意到在体外培养技术，这可能是不同针叶树种类的保护和质量克隆繁殖的替代方法[1]．相比之下,植物在体外传播不受环境和季节的限制，可以克服传统育种技术的问题。因此，它成为植物繁殖的可靠方法，尤其是濒危和稀有物种的产生[22.那23.那24.那25.那26.]．第一个工作在体外Javeed和他的合作者在1980年完成了对杜松的繁殖[27.]．关于杜松这一主题已经做了一些研究和报道在体外传播(2那28.那29.那30.那31那32]．因此,在体外杜松物种的繁殖应该被夸大，因为，微扑通可能是该组植物繁殖的唯一替代方法[1]．它应该优先考虑保护的可能性[33]和药物用途的大规模繁殖。根据 [34]植物组织培养是提高次生代谢产物产量的有效途径。因此，由于困难J. Procera.通过种子再生，可以采用微扑磁技术来生产用于药物目的的质量繁殖材料，从而将维持通过种子的种子自然再生。因此，研究的主要目标是在体外传播的J. Procera，克服无性繁殖和种子再生问题。其次，本研究针对次级代谢物的扫描，主要是抗菌和抗肿瘤产品的经济重要性。

植物材料与体外培养的建立

2019年秋天，四岁的年轻幼苗J. Procera.来自沙特阿拉伯南部的Elbaha地区的沙特国王大学食品和农业科学学院的植物园。首先，用自来水冲洗外植体5分钟。然后在25%高乐氏(v/v)中浸泡20 min，在层流柜无菌流动下用无菌蒸馏水清洗3次。扦插约1厘米，从4岁的苗的顶芽中至少有一个腋芽Juniperus。procera用作体外繁殖的外植体。

用于繁殖乘法的媒体和植物生长调节剂

研究了植物生长调节剂(PGRs)和培养基组成对幼苗增殖的影响:(1)木本植物培养基(WPM) [35]，（2）Murashige和Skoog（MS）培养基[36]， (3) Gamborg’s B-5基础培养基(B5培养基)[37]，(4)楚基盐混合物(N6培养基)[38(图。1)．每种PGR的组合，蔗糖作为碳源（30g / L），7g / L琼脂，并将pH调节至5.7，然后在121℃下高压灭菌20分钟。然后，对于每种治疗，在层状条件下培养了每次治疗四种外植体（每次治疗的三个罐子，总共576个外植体）。平均芽数，平均分支数，植物身高和存活率的平均次数均在增长五个月后记录（表2)．

愈伤组织归纳

外植体360个，按上述方法灭菌。然后，用不同组合和浓度的PGRs接种B5、MS、WPM和N62)．在每种治疗中，每罐三种外植物使用三种重复。将罐子在生长室中在25℃±1，在黑暗条件下孵育三个月。

嫩枝和愈伤组织提取物的制备用于气相色谱-质谱分析

100毫克射击和愈伤组织J. Procera.在将杵砂浆中置于杵砂浆中并在20ml 25mM磷酸钾缓冲液中进行冻干，pH为7.0。将匀浆在100ml锥形烧瓶中转移，在室温下摇动30分钟。然后，加入20ml乙酸乙酯，将混合物在室温下温育5分钟。然后，通过以5000rpm离心5分钟，分离有机和水相。收集有机相并在真空中蒸发。将残余物用1ml甲醇重构，并使用气相色谱 - 质谱（GC-MS 7890A; Agilent Technologies，USA）分析，配备了5975个质量选择探测器和7693个自动液体采样器，配有DB-5MS GC柱（30米长，0.25mm内径和0.25μm膜厚度）。

直接实时分析，飞行时间质谱(DART-ToF-MS)

提取样品通过DART-ToF-MS分析进行表征。质谱仪为日本JEOL公司AccuTOF LC-plus。萃取物的挥发性成分在250°C加热的氦流中蒸发，然后被激发的亚稳态氦原子电离，进入飞行时间质谱仪的离子源。在正电离模式下，分子主要是质子化而不碎裂。DART-ToF-MS分析提取物的实验条件列于(表)1)．

鬼臼毒素的色谱分析

愈伤组织和嫩枝中鬼臼毒素的鉴定Juniperus procera在g4226a软件控制的安捷伦液相色谱系统上进行。色谱柱为SB-C18 (1.8 μm, 4.6 × 150 mm);流动相为MilliQ水(溶剂A)和甲醇(溶剂B)，流动相组成为30:70 (v/v)。检测在290 nm处进行。采用岛津紫外分光光度计(UV - 1800)在200 ~ 400 nm范围内进行紫外光谱验证，并通过标准品的保留时间进行初步鉴定。

统计分析

使用一种分析方差分析来分析来自芽增殖和愈伤组织产生的数据，这是基于完全随机设计的比较。一种P.-value < 0.05认为有统计学意义。邓肯试验用于确定在(P. < 0.05) using SPSS Version 20–32 bit (IBM, USA).

植物材料和消毒

在实验过程中没有遇到污染问题。许多研究人员报告说，在这期间没有污染问题JuniperusSPP.．那当植物的不同片段被用作初始外植体时的离体繁殖[33那39]．根据文献综述，建立无污染培养的杜松外植体最好的方法是来自体外生长外植体的植物材料，因为它们不需要任何灭菌程序[40那41]这与我们的调查结果一致。

拍摄乘法

通过比较不同处理的芽增殖培养的效果，评价各处理芽的形态特征、成活率、芽数、芽长和每枝分枝数。增殖5个月后收集芽增殖数据，比较外植体在所有培养基上的反应。经过3周的培养，外植体在MS、B5和N6培养基中的颜色由绿色变为黄色(图2)。1a, b和c)。两周后，这些培养物由于外植体坏死而被排除，数据在统计分析中被丢弃(表)2)．拍摄形式Juniperus phoenicea在MS培养基上生长的L.显示褐变和坏死区。2]．数据表2显示了添加不同组合和浓度的PGRs对木粉的平均枝条数、平均枝条长、平均每枝分枝数和成活率的影响。外植体在6周内成功地产生了若干新芽，表明最佳培养基为WPM。在IAA (0.5 μM)和BAP (0.5 μM)的WPM上，原外植体的平均再生枝条数最高2和无花果。2在WPM上，IBA (0.5 μM)和BAP (0.5 μM)处理的平均茎长最长2和无花果。2A＆B）。而且，在WPM的2,4-D和ABP组合中，（1.0：1.0）响应是最好的（表2和无花果。2E＆F）。从杜松种类外植体的射击诱导范围为4至12.9级杜松队伍纳米奇斯根特。和杜菲娜朱菲娜L.分别由[31那39]．在我们的研究中，使用IAA (0.5 μM)和BAP (0.5 μM)的WPM每外植体诱导的最佳芽数约为14个2和无花果。2c和d). kater [31]据报道，谁是最好的射击伸长率杜菲娜朱菲娜在添加0.5 mg L的WPM中已经达到^{- 1}BAP和0.25或1毫克L^{- 1}2,4-d。我们观察到IBA和BAP或IAA和BAP的组合对剧烈生长，芽的发展，与WPM上的其他PGR组合相比，芽，生存率和细长芽的发展。因此，是该物种的大规模繁殖和保护的重要点。在文献中没有发现任何报告J. Procera.离体芽增殖。一般来说，刺柏物种对低水平的细胞因子和生长素有反应[30.]．例如，BAP的浓度为0.5 mg l^{- 1}WPM对3种刺柏幼苗增殖效果最好(juniperus excels excels m.bieb。那Juniperus horizontalis Moench。和juniperus chinensis roxb。）报告(2]．

愈伤组织归纳

数据表3.显示PGR补充在WPM，B5，N6和MS培养基中的影响。孵化五周后，愈伤组织诱导的最早标志（图。3.一种）。在处理中，产生的愈伤组织的量，愈伤组织诱导的百分比显着不同，例如，每次处理的产生量的愈伤组织在0.4至4.6g之间。这表明，在每种处理中，最好的愈伤组织和愈伤组织诱导率（4.6g）在WPM中，加入0.5μmBap和0.5μm2,4-d（表3.和无花果。3.使用补充有（0.25μm）2,4-d和（1.0μm）壳体的WPM获得B，C）和较少有效的愈伤毒弹诱导速率（0.4g）。虽然，在MS培养基中，诱导所有PGR组合中的一种组合（1.0μmbap+1.0μm2,4-d）诱导愈伤组织1.0g（表2和无花果。3.d).而N6和B5培养基具有相同的PGRs组合不能诱导愈伤组织，因此被排除。最好的愈伤组织品质来自j . thurifera在补充有0.5毫克L的WPM上实现^{- 1}BAP + 0.25 mg L^{- 1}2、4-D或0.25 mg L-1132 BAP + 0.25 mg L^{- 1}2,4 - d (31]．此外，最好的诱导愈伤组织Juniperus物种（juniperus excelsa，juniperus theultsis和juniperus chinensis）在WPM培养基中获得0.50mg / L的BAP和0.50mg / L，2,4-D [28.]．反过来，在针叶树种类中，要求促进和细胞蛋白的适当比例刺激[1]．虽然，Muranaka [42的研究表明，愈伤组织是由Juniperus对应用高浓度NAA (3.0 mg L .^{- 1})和KIN (0.2 mg L^{- 1})．产生的Calli的颜色变为棕色但是超过20天的亚文化消除了这个问题。众所周知，诱导的Calli可以在杜松物种中快速变褐色[1]．

气相色谱 - 质谱分析射击和呼叫Juniperus procera提取

一般来说，植物产生次生代谢产物作为生物和非生物胁迫的保护机制。另一方面，已经证明，体外繁殖是产生次级代谢物的工具，最终可以提供持续、可靠的生物活性化合物来源。此外，通过微繁殖技术可以实现重要次生代谢物的快速生产[34那43那44]．利用商业文库对提取物中的成分进行鉴定，并与对照品的质谱、匹配率和保留时间进行比较。山核桃芽和愈伤组织的GC-MS分析J. Procera.提取物中有20多种与次生代谢物相关的成分(见表1)4.)．但是，在茎和愈伤组织提取物之间观察到变异(表)4.)．这些检测到的化合物含有抗微生物和抗肿瘤剂，其中一个是丁蛋白（图。4.)．从愈伤组织和芽中得到的典型正离子光谱J. Procera.分子式（c_20.H_30.O±H)和m/ z286离子在愈伤组织和芽组织中检测到(图。4.)．这和铁酚(C_20.H_30.O, mol. wt 286.5)，与NIST标准参考数据库1A非常吻合[81]．由此可见，铁二酚生成的峰通常为285和301 [82]．铁二酚是一种二萜酚，由于其抗菌、抗肿瘤、胃保护和心脏保护等药理作用，近年来受到人们的关注[66]．此外，铁蛋白抑制癌细胞的生长速率[67]．此外，铁酚化合物对疟疾株3D7和K1进行了测试，并确定了一些抗疟活性的结构活性关系[68]．第二种重要的化合物是视黄醇(维生素A)，视黄醇属于内源性天然类维生素A，是合成视黄酸和视网膜的前体。视黄醇在治疗衰老和光老化方面起着有效的作用，据[83]．第三种重要的化合物是喹诺酮，它是一种含有双环核心结构的抗生素[84]．此外，据报道，喹诺酮类是一类具有广谱活性的抗生素和抗生素，可以抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌[75]．虽然J. Procera.已被广泛研究为具有抗癌、抗氧化、杀虫和抗菌活性的天然药物的来源[6.那7.那8.]．相关文献中未见相关报道J. Procera.体外繁殖和次级代谢物检测。自然筛选J. Procera.提取物反映了由[11.]．它与本研究透露的成分完全不同。尽管 [83的茎皮J. Procera.沙特阿拉伯成长产生了几种抗微生物二萜，如铁蛋白。此外，已从浆果中鉴定出两种已知的山烷醇（Totarol和Ferruginol）Juniperus procera那Juniperus excelsa和Juniperus phoenicea[45]．除了上面描述和突出显示的最重要的生物活性化合物。在芽和愈伤组织提取物中检测到其他植物化学成分Juniperus procera及其活动载于附表4.．

直接实时分析，飞行时间质谱法测定嫩枝和愈伤组织提取物J. Procera.

用DART-ToF-MS对离体芽和愈伤组织提取物进行鉴定;这证实了气相色谱-质谱分析的结果，从而验证了Figs中所示的铁三酚化合物。5.-6.和表5.和6.．DART-MS具有快速定量、活性化合物筛选的特点，为中草药以非常简单的方式完成实验过程提供了一种新的研究工具[85]．

鼠毒素毒素的鉴定

鬼臼毒素是一种次级代谢物，在癌症治疗中有强大的药物应用[86那87]．但是，来自目前的自然来源的波脱毒素的可用性，鬼臼草是有限的。因此，迫切需要替代能源[86那88]．本文对鬼臼毒素在愈伤组织和芽中进行了初步研究Juniperus procera通过比较它们的保留时间来使用HPLC和Podophyllotoxin标准（图。7.， a, b)Juniperus procera含有新型抗癌剂(PTOX)，而在Juniperus procera体外。植物部件的愈伤组织诱导可以增加生物活性化合物或甚至产生新的。这与[89]谁已经说明了，愈伤组织文化的Byrsonima verbascifolia（L.）DC。是一种生物活性化合物的新来源。Podophyllotoxin标准的保留时间为4.6分钟，如（图。7.a).到目前为止，愈伤组织中PTOX的鉴定是通过比较标准品和愈伤组织提取物的紫外光谱确定的。采用岛津分光光度计(UV - 1800)在200-400 nm范围内进行紫外可见分析。对愈伤组织中PTOX的紫外可见分析表明，PTOX在290 nm处有一个吸收峰。8.，B）和与Sigma Ptox标准的相应良好（图。8.我们的发现与[90， PTOX紫外光谱峰在290 nm处。根据文献记载，鬼臼毒素已在某些种中发现Juniperus在大多数情况下，在低水平下报告了[86]．DART TOF-MS结果表明，愈伤组织Juniperus procera含有鬼臼毒素(wt. 414.25)6.．

到目前为止，还没有相关的报道J. Procera.体外传播。因此，本研究首次证明了愈伤组织的诱导和芽的增殖J. Procera表明这种重要的、濒危的药用植物的离体繁殖是可能的。成功地进行了离体芽增殖和愈伤组织诱导J. Procera.使用WPM和不同组合的PGRs育苗。IAA和BAP在0.5 μM条件下的组合对WPM的茎蘖增殖和茎蘖成活率影响最大，2,4- d和BAP在0.5 μM条件下诱导愈伤组织的效果最好。离体繁殖J. Procera.为克服种子休眠的困难，使植物的繁殖，树木的保护，并获得大量繁殖材料的药物研究。黄芪茎部和愈伤组织提取物的GC-MS和HPLC分析J. Procera.已经提供了许多抗肿瘤和抗菌成分，其中包括Ptox和丁蛋白。通过UV分光光度计和直接分析实时进行了调查结果，飞行时间质谱。该结果可能导致大量生产体外升高的植物，用于生产植物化学和药物成分（新的次生代谢物新的自然来源），在沙特阿拉伯和其他地方提供保护目的。应在该植物的根部再生中进行更多的研究，因为它会增加这些植物的存活率和保护，并根据种子休眠导致的萌发率低，种子的不发裂，以及种子的发病死刑问题。因此，体外传播和营养繁殖可以提供有希望的解决方案。

本研究期间使用或分析的数据可从相应的作者/ ksu获得。

2,4 - d:

2,现在也是酸

软面包卷:

benzylaminopurine

多发性硬化症：

Murashige和Skoog媒体[36]

个字:

木本植物培养基，Lloyd and McCown [35]

B5:

Gamborg的B-5基础媒介，由Gamborg致电，等。AL.．[37]

N6:

Chu (N6)基盐混合物[38]

IAA：

吲哚乙酸

IBA:

Indole-3-butyric酸

PGRS：

植物生长调节剂

PTOX:

毒黄素毒素

GC-MS：

气相色谱分析-质谱法

RT：

保留时间

DART-ToF-MS:

直接分析实时，飞行时间质谱

不适用。

作者的贡献

上午。负责概念化，并有明显促成所有部分;上午，S.K.和m.n.提出并计划工作;A.M.，H.S.，S. A.，A. A.，N.A。方法;M. T（穆罕默德Tarroum）分析了数据并执行了这些数字;上午。写作原稿;F.A.监督工作。 The author(s) read and approved the final manuscript.

作者向研究与创新部副部长表示感谢，“沙特阿拉伯教育部通过项目编号IFKSURG-014资助了这项研究工作。

从属关系

1. 沙特国王大学理学院植物与微生物系，沙特阿拉伯利雅得11451 p.o. BOX 2455

   Abdalrhaman M. Salih, Fahad Al-Qurainy, Salim Khan, Mohamed Tarroum, Mohammad Nadeem, Hassan O. Shaikhaldein, Saleh Alansi和Aref Alshameri

2. 伊玛目阿卜杜勒拉赫曼本费萨尔大学理学院生物系，沙特阿拉伯达曼383信箱

   Nadiyah m . Alabdallah

通讯作者

对应到Abdalrhaman m·萨利赫．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

Abdalrhaman M. Salih为这项工作做出了重大贡献

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