植物DNA甲基化对亲本种子含氮量敏感，影响水稻生长gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

氮是植物生长发育和农业生产的重要营养物质。氮胁迫可引起植物表观遗传变化。在我们的研究中，过度表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba以氮利用效率高的水稻植株为试验对象，研究内源和外源氮胁迫对水稻甲基化和生长的响应。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

结果表明，外源缺氮会降低过表达系的种子含氮量和植株生长。在子代生长过程中，我们发现过表达系中低亲本种子氮含量(LPSN)会导致子代种子含氮量、全株含氮量、产量和产量的降低gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba表达量分别为28、35、23和55%，与高亲本种子氮素(HPSN)相比差异显著。然而，在野生型中没有观察到这种减少。此外，甲基化测序结果显示，LPSN引起了大量的基因甲基化变化，富集在子代过表达系的20多条GO通路中，表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2BaLPSN过表达植株与外氮高的HPSN植株相比显著降低，这在野生型中没有表现出来。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们认为，在表观遗传水平上，亲本种子氮含量的降低诱导了DNA甲基化的变化，并显著降低了基因的表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在过表达系的两代中，导致N缺乏的遗传表型。gydF4y2Ba

大米(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2BaL.)是全球大部分人口的主要主食。氮是植物生长和作物生产力所必需的大量元素[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．水稻种植需要比其他作物投入更多的氮肥[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．缺氮是一种严重的环境压力，可损害作物生产，阻止植物有效吸收足够的氮以充分生长[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．此前有报道称，包括水稻在内的许多物种由于缺乏氮素而导致种子氮浓度降低[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,大豆gydF4y2Ba6gydF4y2Ba],豌豆[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]和棉花[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．当幼苗暴露在无外源氮的大豆溶液中时，种子氮含量越低，生长限制越大[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．在种子萌发期和幼苗生长早期施用氮肥可提高后代小麦的耐盐性[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．此外，种子氮还能提高水稻种子活力，加快种子萌发时间[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．但籽粒施氮对大田成熟水稻生长的影响研究较少。gydF4y2Ba

表观遗传学被定义为对有丝分裂和/或减数分裂可遗传的基因功能中DNA序列独立变化的研究[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．DNA甲基化是主要的可遗传表观遗传修饰，有助于核基因表达和基因组稳定性的表观遗传调控[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．DNA中的胞嘧啶残基在5 '位置甲基化[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba并在整个植物基因组中发生，包括CG, CHG和CHH (H = A, T，或C) [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．植物对养分胁迫反应的表观遗传调控研究很多[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．有报道称，磷酸盐饥饿可能导致植物中全球DNA甲基化的广泛重塑，并往往与基因表达的变化有关[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．缺锌可导致染色体区域的低甲基化和高甲基化[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．缺氮胁迫可诱导DNA甲基化的遗传性改变[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．Fan等人(2020)报道过表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba确实改变了水稻DNA甲基化状态[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．然而，关于外源种子和内源种子中营养物质对表观遗传影响的研究进展很少。gydF4y2Ba

OsNAR2.1是一种高亲和力的硝酸盐转运蛋白伙伴蛋白，它与osnrt2一起在水稻的硝酸盐吸收和转运中发挥核心作用[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．以前的报告已经证明使用gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba启动子而不是泛素启动子驱动gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba可提高水稻氮素的农艺利用效率和产量[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．Chen等人(2017)表明使用gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba本机启动器驱动gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba（gydF4y2BapOsNAR2.1: OsNAR2.1gydF4y2Ba)改善水稻栽培系统中硝态氮和铵的吸收，提高氮素利用效率[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．我们使用gydF4y2BapOsNAR2.1: OsNAR2.1gydF4y2Ba(Ox1)在Chen et al.(2017)中作为一种测试氮素利用效率高的水稻，并探索种子和外界氮含量对水稻生长的影响。gydF4y2Ba

本研究旨在阐明种子氮资源对野生型和高氮利用效率Ox1系幼苗和成熟期生长的影响，以及不同种子氮和不同外界氮资源对其甲基化的响应。gydF4y2Ba

缺氮可导致植物生长的遗传性下降gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba超表达行gydF4y2Ba

我们种植过表达线gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba(Ox1)和野生型乌云庚7号(WYG7)在300 kg N/ha (+N)和0 kg N/ha(−N)的田间处理(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, b)第一代(S0代)。在S0代，在-N条件下，WYG7和Ox1的株高比+N条件下分别降低了20和22%，分蘖数减少了44和46%，单株籽粒产量分别减少了44和51%(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一部)。的相对表达式gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在Ox1中-N场降低了62%，但在WYG7中未观察到+N和-N场之间的显著差异(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf).其他农艺性状表明，S0代缺氮使WYG7和Ox1穗长分别减少21和14%，结实率分别减少7和18%。而+N与-N处理在每穗粒重、每穗粒数、WYG7或Ox1的千粒重上无显著差异(表2)gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

S0代从+N和-N田收获种子，S1代和S2代种植在+N恢复田。我们发现，当氮处理在S1代恢复到+N时，S0代缺氮不影响S1代WYG7的株高、分蘖数和籽粒产量(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba胃肠道)。而在S1代高氮条件下，S0代缺氮导致株高降低4%，单株籽粒产量降低20%，而Ox1系分蘖数无显著变化(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba胃肠道)。此外，S0代缺氮导致了gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在S1中的Ox1线中为55%(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baj)，穗长减少7%，每穗粒重减少27%，结实率减少10%(表2)gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)在S1代。gydF4y2Ba

但在S2代持续高氮处理下，S0代缺氮不影响株高、籽粒产量和产量gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba野生型和Ox1系在S2代的表达。缺氮处理的Ox1在S0代分蘖数在S2代增加。gydF4y2Ba1gydF4y2Bak - n)。这与S0代和S1代分蘖数的变化不一致，因此，S2代分蘖数的变化与当前环境和种植密度的差异有关。gydF4y2Ba

综上所述，S0代缺氮导致高氮利用效率水稻Ox1株系生长下降，尽管恢复了高氮供应条件，但这种下降在S1代遗传。但是，这种下降在S2代并没有持续。gydF4y2Ba

氮肥利用效率高的品系中，亲本氮含量降低会阻碍幼苗生长gydF4y2Ba

已有报道表明，种子含氮量的降低是植物的内源氮胁迫，也会影响子代植物的生长[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．研究发现，在WYG7和Ox1系中，S0代土壤缺氮导致种子N含量分别降低了30%和32%，种子总N含量分别降低了62%和53%(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa、b)。gydF4y2Ba

为了分析种子氮对子代植株生长的影响，我们从+N和-N的田间收集了S0代的WYG7和Ox1种子(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa、b)。N含量高的+N田的Ox1种子标记为Ox1- hn, N含量低的-N田的种子标记为Ox1- ln。WYG7也做了同样的标记，从+N和-N产地采集的WYG7种子分别命名为WYG7- hn和WYG7- ln。为了区分，S0代收获的种子命名为亲本种子，S1代产生的种子命名为子代种子。我们在有nhh的水中种了四株植物gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba没有gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba(+N)和水(−N)持续1个月(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)，发现在30天内，WYG7-HN和WYG7-LN之间的幼苗茎长和根长没有差异(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad)。然而，从第15天开始，在+N和-N处理下，Ox1-LN幼苗的芽长明显短于Ox1-HN(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad, e)。在根部观察到同样的模式(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baf, g)。在+N条件下，Ox-LN的生物量和全氮含量显著下降了58%和55%(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, b)，与Ox1-HN相比，根部分别显著降低了57和58%(图1- hn)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac, d)。在-N条件下，Ox-LN的生物量和全氮含量显著降低59%和53%(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae, f)，在根中分别比Ox1-HN降低了55和58%(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bag, h)。我们还检验了的表达式gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba发现Ox1-HN芽中的表达量是Ox1-LN的3.5倍，且在+N处理中表达量显著高于Ox1-LN(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bai).在-N处理中，的表达式gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba与Ox1-LN相比，Ox1-HN的表达水平高1.5倍，但并不显著(图1。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baj).同时，在+N和-N条件下，的表达没有差异gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在Ox1-HN和Ox1-LN之间的根(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bak, l)。然而，在+N和-N条件下，无论是茎部还是根部，WYG7-LN的生物量和总氮含量与WYG7-HN没有差异(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa)。的表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba与Ox1(−LN和-HN)相比，两种处理中WYG7-LN和WYG7-HN的含量显著降低，但两者之间无差异(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba我)。由于OsNAR2.1是OsNRT2.1和OsNRT2.3a吸收硝酸盐的伙伴蛋白[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，我们检测了两者的表达gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3agydF4y2Ba在无花果。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba．结果表明，在+N和-N条件下gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3agydF4y2Ba在茎和根均无差异WYG-HN和WYG-LN(图。gydF4y2BaS1gydF4y2Baa)。但是表达gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3agydF4y2Ba在+N条件下，幼苗中Ox1-HN的含量显著高于Ox1-LN、WYG7-HN和WYG7-LN(图5)。gydF4y2BaS1gydF4y2BaA, c)，与的表达式相似gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在+N条件下拍摄。gydF4y2Ba

综上所述，低亲本种子氮含量(LPSN)会导致植株生长迟缓，生物量下降，幼苗氮素含量下降gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba与高氮亲本种子(HPSN)相比，子代高氮利用效率水稻Ox1系在幼苗中的表达。gydF4y2Ba

亲本种子含氮量的降低导致籽粒产量和籽粒含氮量的降低gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2BaHN肥田过表达系gydF4y2Ba

我们在四种不同氮含量的田间种植WYG7-HN、WYG7-LN、Ox1-HN、Ox1-LN，分别为300 (HN)、150 (MN)、75 (LN)和0 kg N/ha (NN)(图1)。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba模拟)。首先，在没有内源种子氮胁迫的情况下，田间缺氮可导致S1代WYG-HN和Ox1-HN的籽粒产量分别下降21%和31%，株高分别下降23%和32%，与S0代相似(图5)。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．此外，我们还发现，在Ox1-LN中，株高和籽粒产量分别比在HN中的Ox1-HN显著降低了7%和23%(图2)。gydF4y2BaS2gydF4y2Bae,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa). MN、LN和NN场没有观察到差异(图1)。gydF4y2BaS2gydF4y2Baf-h,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba罪犯)。WYG7-HN和WYG7-LN在所有HN、MN、LN和NN田的株高和籽粒产量均无差异(图1)。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba情况,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba模拟)。4个N处理田的分蘖数和叶绿素含量在Ox1-LN和Ox1-HN之间无差异，在WYG7-LN和WYG7-HN之间也无差异(图4)。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba我,gydF4y2BaS4gydF4y2Baa-d)，且不受LPSN的影响。其他农艺性状也表明，在HN条件下，Ox1-LN的穗长、每穗粒重和结实率分别比Ox1-HN显著降低7、27和10%。而在MN、LN和NN田间，这些农艺性状不受Ox1中LPSN的影响。同时，在4个田间，WYG7的穗长、每穗粒重、结实率、每穗粒数和千粒重均不受LPSN的影响(表2)gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，我们还分析了Ox1-LN的子代种子N浓度、种子总N含量和植株总N含量，发现在HN田中，与Ox1-HN相比，分别显著降低了26、28和35%(图1)。gydF4y2BaS4gydF4y2Bae和4e, i)。MN、LN和NN场无显著差异(图1)。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba情况和4 e-l)。对于WYG7, WYG7-HN和WYG7-LN在所有HN、MN、LN和NN田中子代种子N浓度、种子全N含量和植株全N含量均无显著差异(图1)。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba情况,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae-l)。同时，我们分析了gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba对四种植物在成熟期的表达进行了研究gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2BaWYG7系显著低于Ox1系。然而，WYG7-HN和WYG7-LN在所有四个领域中均无差异(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba大学出版社)。在HN字段中，的表达式gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在Ox1-HN中约为Ox1-LN的4.3倍。gydF4y2Ba4gydF4y2Bam)。但在MN, LN和NN字段中，的表达式gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2BaOx1-HN和Ox1-LN之间无差异(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba阻燃剂)。为了确定引起LPSN的表型，又重复了一年的各种N含量田间试验(数据见表)gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)．在植株生长的第三年与第二年相比，植株的株高、籽粒产量、子代种子氮含量、种子氮含量、植株氮含量以及氮素的表达均有相同的变化规律gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在HN条件下，Ox1-LN与Ox1-HN相比均显著降低，但在MN、LN和NN处理中没有。gydF4y2Ba

OsNRT2家族蛋白OsNRT2.1、OsNRT2.2和OsNRT2.3a需要osnr2.1参与硝酸盐的吸收[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba的表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2BaOx1系受LPSN的影响。因此，我们测试了表达gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba,gydF4y2BaOsNRT2.2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3agydF4y2Ba．在HN条件下，的表达式gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3gydF4y2Ba与Ox1-HN相比，Ox1-LN分别显著降低了约48和45%(图4)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, c).然而，的表达式gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba,gydF4y2BaOsNRT2.2,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3agydF4y2BaOx1-LN与WYG7-HN和WYG7-LN的差异无统计学意义(Fig。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa - c)。在NN条件下，的表达式gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba,gydF4y2BaOsNRT2.2,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3agydF4y2BaOx1-HN、Ox1-LN、WYG7-HN和WYG-LN之间差异不显著(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad-f)。因此，与Ox-HN相比，Ox-LN的LPSN不仅降低了的表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba但也减少了表达的gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3agydF4y2Ba．gydF4y2Ba

综上所述，当田间施氮量充足时，LPSN会导致植株生长、籽粒产量和表达量的下降gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

亲本种子氮含量降低导致全局甲基化变化gydF4y2Ba

由于Ox1和WYG7的基因组在一代内没有变化，但Ox1的表型受LPSN的影响，我们怀疑表观遗传变化发生在不同N处理的代之间。我们对HN和NN处理区中WYG7-HN、WYG7-LN、Ox1-HN、Ox1-LN系的甲基化状态进行了测序。描述、清洁测序读取数、有效C数、甲基化C计数以及mCs在CG、CHG和CHH中的百分比见表gydF4y2BaS5gydF4y2Ba．mCG比率为52 - 56%，非mCG比率为44 - 48%，与Li等人(2015)相似。与HPSN相比，在HN场中，LPSN子系WYG7和Ox1表现出较低的甲基化水平(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).然而，LPSN后代WYG7和Ox1在神经网络场中有更高的甲基化水平(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).此外，在HN场中，WYG7-HN与Ox1-HN、WYG-LN与Ox1-LN之间的甲基化水平相似，分别相差约0.1和0.8%(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).在NN场中，与WYG7-HN和WTG7-LN相比，Ox1-HN和Ox1-LN的甲基化水平分别提高了约10%(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).与WYG7-HN相比，WYG7-LN中三个上下文的甲基化水平均在HN中升高，在NN中降低，与mC总水平的变化相似(图7-HN)。gydF4y2BaS5gydF4y2Ba得了,eg)。gydF4y2Ba

然后我们分析了不同基因元素的甲基化水平，发现在HN条件下，不同C上下文的甲基化水平在四个样本之间没有差异(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab, c)。然而，与NN条件下的WYG7-HN和WYG7-LN相比，启动子区和基因间区Ox1-HN和Ox1-LN整体mC的甲基化水平更高。此外，WYG7-HN的CG甲基化水平高于WYG7-LN和Ox1-LN，且在基因区和5'UTR区均高于Ox1-HN(图4)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae, f)。这些结果表明，氮肥条件下Ox1和WYG7之间不同元素的整体甲基化水平没有显著变化。然而，与WYG7相比，在缺氮条件下，Ox1的整体甲基化增加，特别是在启动子和基因间区。与WYG7相比，Ox1中mCG基因和5'UTR区甲基化程度降低。此外，我们还分析了WYG7和Ox1系增强子的甲基化水平，发现在HN条件下，WYG-LN和Ox1-HN增强子的甲基化水平分别比WYG-LN和Ox1- ln增加了1.6和2.9%。在NN条件下，与WYG-LN和Ox1-LN相比，WYG-LN和Ox1-HN中增强子的甲基化水平分别提高了1.5和6.7%(图1)。gydF4y2BaS5gydF4y2Bad, h)。结果表明，在NN条件下，Ox1中LPSN对增强子的影响更强。gydF4y2Ba

在过表达系中，亲本种子含氮量的降低导致氮肥田中亚dmrs增多，缺氮田中超dmrs增多gydF4y2Ba

我们分析了HN和NN处理中WYG7-LN和WYG7-HN、Ox1-LN和Ox1-HN之间的差异甲基化区域(DMRs)，分别为WYG7-DMR和Ox1-DMR。我们发现，在HN田中，WYG7-DMR为28,880，比Ox1-DMR 25,546高约3400。而在NN条件下，WYG7-DMR为26288，比Ox1-DMR为19,765多6500。同时，46%的WYG7-DMRs在HN域，65%的WYG7-DMRs在NN域。另一方面，在HN条件下，75%的Ox1-DMRs过高，但在NN条件下，只有34%的Ox1-DMRs过高。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa, b, d, e)。我们得出结论，与HPSN相比，LPSN的降低导致WYG7在HN场中产生更多的sub - dmrs，而NN场中产生更多的hyper-DMRs，而Ox1在HN场中产生更多的hyper-DMRs，而NN场中产生更多的sub - dmrs。gydF4y2Ba

根据DMRs在基因组上的注释结果，将在基因或启动子区存在DMRs的基因定义为差异甲基化基因(DMGs)。WYG7和Ox1系在HN条件下均有超过10,000 dgs。在NN处理中，WYG7中有超过10,000 dgs，而Ox1中只有约8000 dgs(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac, f)。dmg的Venn结果表明，在HN条件下，WYG7与Ox1之间有5909个相互dmg，多于WYG7中4831个唯一dmg和Ox1中4617个唯一dmg。而在NN条件下，WYG7与Ox1之间有4912个相互dmg, Ox1有2925个唯一dmg，而WYG7只有6029个唯一dmg。综上所述，LPSN在WYG7和Ox1系中均产生超过10,000个dmg，其中大部分dmg在HN场中是相互作用的。然而，在NN条件下，LPSN在WYG7中引起超过10,000 dmg，在Ox1中仅引起约8000 dmg。WYG7中大部分dmg是特异性的，而Ox1中只有少数dmg是特异性的。我们假设在NN条件下，LPSN对WYG7基因甲基化状态的影响强于Ox1。gydF4y2Ba

此外，我们分析了场N缺乏诱导的WYG7-HN和Ox1-HN系的DMRs和dmg(图1)。gydF4y2BaS6gydF4y2Ba)，不受内源缺氮干扰。我们发现，场N缺乏对WYG7和Ox1的影响也相反。在WYG7-HN中，超过一半(83%)的DMR是由场N缺乏引起的低DMR，只有17%是超DMR。在Ox1-HN系中，91%的超- dmrs和9%的低- dmrs是由场N缺乏引起的(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa, b).结果与HN条件下LPSN对WYG7和Ox1的影响相似。田间缺氮和种子缺氮均可诱导WYG7株系产生更多的次dmrs和Ox1株系产生更多的超dmrs。dmg的Venn结果表明，在场N缺乏诱导下，WYG7- hn与Ox1- hn之间有7800个相互dmg, WYG7中有3813个唯一dmg, Ox1中有5214个唯一dmg(图1)。gydF4y2BaS6gydF4y2Bac). WYG7-HN和Ox1-HN中大部分dmg是相互作用的，与HN条件下LPSN诱导的WYG7-DMG和Ox1-DMG之间的dmg相似(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

基因的全局DNA甲基化模式受亲本种子氮含量的影响，且对田间氮含量敏感gydF4y2Ba

在HN条件下，WYG7系有4831个唯一dmg, Ox1系有4617个唯一dmg。在NN条件下，WYG7中有6029个唯一dmg, Ox1中有2925个唯一dmg(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac, f)。我们聚类分析了唯一dgs的基因本体富集(GO)(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bag, h).根据它们的具体过程，这些基因被分为生物过程、细胞成分和分子功能三大类。独特的Ox1-DMG而非WYG7-DMG显著富集22条通路，包括生物过程中的6条通路、分子功能中的13条通路和细胞成分中的3条通路，包括细胞生物合成过程、天冬氨酸型肽酶活性和细胞内等。只有两种途径被检测到，包括程序性细胞死亡和细胞凋亡，其中独特的WYG7-DMGs显著富集，而Ox1-DMGs则没有(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bag).在NN条件下，WYG7-DMG显著富集的通路有11条，其中生物过程中的5条通路，分子功能中的2条通路，含有细胞生物合成过程、水解酶活性和膜界细胞器等的细胞成分中的4条通路(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bah).而独特的Ox1-DMG显著富集的通路均被独特的WYG7-DMG富集。(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Bag h)。gydF4y2Ba

我们从DMG结果中选择了一些基因，并使用集成基因组学Viewer (IGV)可视化它们的甲基化状态(图5)。gydF4y2BaS7gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS8gydF4y2Ba)．我们选择的基因包括调节水稻硝酸盐易位的MADS家族基因[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba];影响水稻磷积累的WAKY家族基因[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba];氨基酸转运蛋白ATL家族基因[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba];对饥饿有反应的PHYB家族基因[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba];氨转运蛋白AMT家族基因[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，以及一些与甲基化和miRNA调控相关的基因[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．许多研究表明，基因甲基化与转录水平高度相关[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．因此，我们通过定量反转录PCR (qRT-PCR)分析这些基因的表达情况(图5)。gydF4y2BaS7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．结果表明，在12个基因中，有7个基因的表达受到基因体和启动子甲基化变化的影响，包括gydF4y2BaOsMADS95、OsATL15 OsWAKY46gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2BaS7gydF4y2Bab)gydF4y2Ba， ossmads59, OsATL16, OsATM4gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsDRM1bgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2BaS8gydF4y2BaB)， 7个基因的表达均因低甲基化上调。gydF4y2Ba

我们也看到了甲基化gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRTgydF4y2Ba无花果家族基因。gydF4y2BaS9gydF4y2Ba，在HN和NN条件下，四行之间没有甲基化差异。gydF4y2Ba

亲本种子氮含量对DNA甲基转移酶表达的影响gydF4y2Ba

总的mC水平和大量差异甲基化区域对LPSN和田间N含量的响应表明，DNA甲基化机制的部分编码基因可能受到差异调控。为了验证这一假设，我们使用qRT-PCR检测DNA甲基转移酶基因的转录水平。我们分析了MTase的相对表达，发现在HN场中，MTase的表达gydF4y2BaOsDRM3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsCMT3gydF4y2BaOx1-LN明显低于Ox1-HN，而gydF4y2BaOsMET1gydF4y2Ba,gydF4y2BaOsDRM2,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsCMT2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa-e)，所有MTase基因的表达在WYG7-LN和WYG7-HN之间无差异(图5)。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa e)。然而，在NN域中，的表达式gydF4y2BaOsDRM2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsCMT2gydF4y2BaWYG7-LN的表达明显低于WYG7-HN，且所有MTase基因在Ox1-LN和Ox1-HN的表达均无差异(图5)。gydF4y2Ba8gydF4y2Baf j)。结果表明，在HN条件下，Ox1的LPSN可影响其表达gydF4y2BaOsDRM2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsCMT2gydF4y2Ba，在NN条件下，WYG7的LPSN可以影响gydF4y2BaOsDRM3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsCMT3gydF4y2Ba．因此，在HN和NN处理下，LPSN可以影响Ox1系和WYG7系不同类型的甲基化。gydF4y2Ba

亲本种子含氮量引起的生长差异是不可遗传的gydF4y2Ba

我们从S1代的HN和NN场采集WYG7-LN、WYG7-HN、Ox1-LN和Ox1-HN的种子，在HN和NN场S2代种植8个株系，分析LPSN对生长的影响是否具有可遗传性。我们将S2代16个株系的表型特征列于表中gydF4y2BaS6gydF4y2Ba表中WYG7和Ox1不同亲本种子氮素含量的比较gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．我们发现LPSN可以影响S1代HN场Ox1的生长，但这种影响不会遗传到S2代。在HN肥田Ox1-LN的株高、籽粒产量、种子N浓度、种子全N含量和植株全N含量在S1代均较Ox1-HN有所下降，但在S2代均无下降。gydF4y2Ba

缺氮是一种严重的环境压力，它会损害作物生产，并阻止植物有效地吸收足够的氮以供生长[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．有许多关于环境氮胁迫影响水稻生长的报道，包括产量和结实率的下降[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．在本研究中，氮素缺乏胁迫导致WYG7和氮素利用效率较高的Ox1株高降低，籽粒产量、结实率和籽粒含氮量降低。而对于WYG7，缺氮诱导的表型变化却不影响其表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba．在Ox1株系中，缺氮不仅影响了其表型，而且导致了表达的减少gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)．此外，在生长，粮食产量，和gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba尽管Ox1系恢复了高供氮条件，但该表达在第二代中继承，而不是WYG7。然而，这种减少并没有持续到第三代。gydF4y2Ba

证实LPSN可以影响gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba过表达线，我们也生长过表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba线(Ov199)和gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Banipobare野型背景RNAi敲除系(NP) [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]在4个不同含氮田中籽粒含氮量不同。结果表明，Ov199-LN的株高、籽粒产量、种子全氮含量和植株全氮含量较HN田的Ov199-HN分别显著降低22.3、33、50和38%(图1)。gydF4y2BaS10gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS11gydF4y2Ba)，与Wuyungeng7背景相似。的表达式gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba与Ov199-HN相比，Ov199-LN只有一半。gydF4y2BaS12gydF4y2Ba)．但株高、籽粒产量、籽粒全氮含量、全氮含量及的表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在不受亲本种子氮含量影响的NP中，乌云根g7也相似。RNAi谱线结果相同(图。gydF4y2BaS10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)．结果表明，LPSN可诱导基因表达的降低gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba并减少增长gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2BaWuyungeng7和Nippobare背景下的过表达线。gydF4y2Ba

因为有报道认为种子中氮含量的降低是植物的内源氮胁迫，也会影响植物的生长[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，认为田间缺氮会降低Ox1系种子含氮量，影响S2代的生长。此前曾有报道称，较高的种子营养与幼苗生长的增加有关[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，但并不是所有的植物都有[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．种子含氮量的差异不影响小麦幼苗的生长[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，但会影响大豆幼苗的育性[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，可提高小麦幼苗的耐盐性，提高水稻种子活力，加快发芽时间[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．在加氮和不加氮的水条件下，生成含氮量显著不同的WYG7和Ox1种子，分析幼苗生长对水中不同氮肥的响应。结果表明，在缺氮和施氮的情况下，LPSN对Ox1系幼苗生长均有影响，但对WYG7无影响(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．的相对表达式gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba氮肥条件下LPSN Ox1幼苗显著降低，而缺氮条件下不显著降低(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bai, j)，两种条件下WYG7-LN和WYG7-HN幼苗之间没有差异(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba我)。结果表明，在苗期，LPSN - Ox1系抑制了幼苗生长，降低了表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba而在WYG7中无明显差异。gydF4y2Ba

以前的一些研究表明，在最佳管理条件下，早期生长可以保证更高的生物量和粮食产量[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，而另一些人则报告说，早期的旺盛生长并不能保证在成熟时获得更高的收益[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．Mayamulla等(2017)报道，在低肥力田间条件下，水稻干重与种子磷含量相关性较好，但与种子氮浓度相关性较低[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．在本研究中，在施氮条件下，HPSN能促进Ox1幼苗生长，提高籽粒产量和含氮量。而在缺氮或不适宜的管理条件下，成熟Ox1株系的生长和产量与幼苗早期生长无相关性。gydF4y2Ba

在我们的结果中，LPSN可以导致表达减少gydF4y2BaOsNAR2.1。gydF4y2BaOsNRT2家族蛋白OsNRT2.1、OsNRT2.2和OsNRT2.3a在参与硝酸盐的吸收时需要osnr2.1的参与[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．NRTs的表达受硝酸盐、N代谢物、N饥饿、昼夜节律、蔗糖和pH值的调节[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．NRT2家族的高表达导致水稻高产[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．Chen et al.(2017)证实，与野生型相比，gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba,gydF4y2BaOsNRT2.2,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3agydF4y2Ba在1.25 mM NH中，pOsNAR2.1:OsNAR2.1转基因系的基因分别增加了约73、68和76%gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba没有gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba．我们发现，无论是在幼苗+N条件下，还是在田间HN条件下，LPSN都能诱导低表达gydF4y2BaOsNRT2.1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3agydF4y2Ba与HPSN相比(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．但是通过可视化的甲基化状态gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRTgydF4y2Bas，我们发现LPSN未诱导甲基化变化，表明表达变化不受基因甲基化调节(图1)。gydF4y2BaS9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

结果表明，高效氮系Ox1的LPSN会导致幼苗生长下降gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba,gydF4y2BaOsNRT2.1,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsNRT2.3gydF4y2Baa在氮肥充足的田间表达，进一步降低了氮肥高效系Ox1的产量。gydF4y2Ba

由于植物的基因组在单代中不发生变化，我们假设一代的表观遗传变化会影响Ox1系的表型。胞嘧啶甲基化对各种生物和非生物胁迫有反应，并可能导致基因表达和由此产生的表型的改变[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．Villalobos等人(2015)报道，在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba暴露于低磷有效性的植物，与基因表达的变化有关[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．Kou等(2011)报道，缺氮诱导DNA甲基化发生变化，第一代胁迫植物体细胞中发生甲基化变化的50%在第二代中被重新捕获，然后稳定地遗传到第三代和第四代，为后代提供了更强的抗胁迫能力[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．Kou等(2011)的研究主要集中在幼苗中对环境氮胁迫的子代位点特异性甲基化改变响应，而我们的研究更多集中在Ox1和野外野生型植物对亲本种子缺氮响应的甲基化变化。在我们的研究中，我们发现在HN条件下，LPSN导致WYG7和mCG、mCHG和mCHH水平的全局甲基化水平升高(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个和无花果。gydF4y2BaS5gydF4y2Baa - c)。mCG、mCHG和mCHH的甲基化水平变化与Ox1中的mC变化不一致。此外，我们发现WYG7-HN和Ox1-HN的mC水平相似(17.67和17.7%)(图4)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).前期研究表明，在苗期，WYG7的相对mC数显著高于Ox1 [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．而在缺氮条件下，Ox1(−HN和-LN)的整体甲基化水平均高于WYG7(−HN和-LN)，说明缺氮可诱导Ox1系甲基化水平升高。此外，我们还分析了WYG7和Ox1系的基因元素甲基化水平。先前发表的结果表明，启动子和转座元件(TEs)上的DNA甲基化通常与转录抑制相关[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]，外显子的甲基化程度往往比内含子高，基因末端的甲基化程度与启动子区相似[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．与我们的结果类似，所有WYG7和Ox1系从启动子到基因和内含子都有减少。先前对植物的研究表明，DNA甲基化是在活性基因的CG上下文中发现的[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．在我们的研究结果中，活性基因的甲基化主要集中在CG上。在缺氮条件下，WYG7系不活跃基因和5'UTR区CG甲基化水平高于Ox1区。也有报道显示，DMRs在内含子和基因间区富集，启动子具有转录的保守和功能调控[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．我们发现Ox1系在启动子区和基因间区总甲基化水平较高。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae, f)缺氮条件下。然而，在N肥处理中，不同区域甲基化水平在四个样品之间没有差异(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab, c)。我们假设在Ox1系中，田间缺氮对植株总甲基化水平的影响强于亲本种子N含量的影响，非编码区DNA甲基化可能在N饥饿条件下响应性基因调控中起关键作用。此外，N缺乏对WYG7基因甲基化的影响主要集中在基因体CG上下文和5'UTR区，可能对活性基因产生较强的甲基化影响。启动子靠近转录起始位点(TSS)通常被认为足以启动和延长转录，但启动子驱动的表达水平普遍较低，高水平的基因表达需要增强子的参与[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．因此，我们分析了增强子的甲基化水平[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba结果表明，在NN条件下，LPSN对增强子的影响在Ox1中更强(图1)。gydF4y2BaS5gydF4y2Bad, f)。gydF4y2Ba

测定了不同种子含氮量品系间的dmr和dmg。Villalobos等(2015)报道，缺磷可诱导芽部20%的超dmrs和根部86%的超dmrs，基因本体富集分析显示，对低磷反应的差异甲基化在信号成分中强烈富集[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．在我们的研究中，在LPSN和HPSN系之间确定了dmr。我们发现，在N肥条件下，LPSN诱导WYG7中更多的sub - dmr和Ox1中更多的hyper- dmr。在缺氮处理中，LPSN在WYG7中诱导了更多的超- dmr，在Ox1中诱导了更多的次- dmr，这表明LPSN对DNA甲基化响应对外界氮含量敏感。此外，在WYG7中，LPSN在缺氮区诱导更多的dmg，而在Ox1中，在N肥区诱导更多的dmg(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．结果表明，在缺氮田，野生型DNA甲基化对LPSN更为敏感，而在氮肥田，Ox1系DNA甲基化对LPSN更为敏感。gydF4y2Ba

为了进一步研究甲基化对基因模式的影响，我们聚类分析了不同N场中唯一的dmg影响，发现在HN条件下WYG7和Ox1的唯一甲基化基因数量相似(4831和4617)(图4)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac).然而，有22个簇显著富集单一Ox1-DMG, 2个簇显著富集单一WYG7-DMG。然而，在NN处理中，LPSN在WYG7中诱导的dmg比在Ox1中更多，并且有11个簇显著由唯一的WYG7- dmg富集(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bag, h)。众所周知，基因甲基化与转录水平高度相关[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．在HN和NN条件下，我们选择了12个与营养调控相关的基因，其中7个基因的表达被低甲基化上调(图1)。gydF4y2BaS7gydF4y2Ba,gydF4y2BaS8gydF4y2Ba)．齐尔伯曼等人(2007)[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]报道了在转录区域内正常甲基化的基因的转录本由于甲基化的丢失而上调，我们的结果也显示了类似的模式。gydF4y2Ba

由于甲基化的变化响应LPSN和氮的外部供应，我们提出DNA MTase可能是不同的调节。grereco等(2019)报道，镉和铜都可以诱导DNA甲基转移酶的上调gydF4y2BaCMT3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaDRM2gydF4y2Ba在海草gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．Villalobos等人(2015)报道，DNA mase的转录水平(gydF4y2BaMET1gydF4y2Ba,gydF4y2BaDRM1gydF4y2Ba,gydF4y2BaDRM2,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCMT3gydF4y2Ba)受低磷胁迫调节[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．我们发现，与HPSN相比，gydF4y2BaOsDRM2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsCMT2gydF4y2Ba在LPSN Ox1系中显著减少。在缺氮场中，表达gydF4y2BaOsDRM3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsCMT3gydF4y2Ba在LPSN WYG7系中显著降低。DRM2负责所有位点的从头甲基化[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]， CMT2对非对称CHH位点有明显的偏好[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．DRM3可能与靶标或染色质环境相关，并且很可能与DRM2在rna定向的DNA甲基化中单独发挥作用[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．CMT3是对称CHG位点的植物特异性DNA甲基转移酶维持甲基化，并参与CHH位点的甲基化[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba59gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．我们的结果表明，Ox1和WYG7甲基化变化的原因之一是受MTase的调控。此外，小rna，包括microRNAs (miRNAs)和小干扰rna (siRNAs)，提供rna介导的基因组稳定性调控并影响基因表达[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．双链RNA也可通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)途径诱导DNA甲基化[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．LPSN诱导的DNA甲基化变化可能与转录后基因沉默(PTGS)过程中的rna定向甲基化有关[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba,gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

表观遗传调控由胞嘧啶残基上DNA甲基化的差异和翻译后组蛋白修饰介导[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]，组蛋白修饰也与基因活性相关[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．报告显示，高氮供应对NRT2.1转录的抑制与HNI9/ atiws1依赖性的组蛋白H3赖氨酸27三甲基化在NRT2.1位点的增加有关[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．OsNRT2.1作为模式蛋白也受组蛋白修饰的影响。因此，甲基化变化是LPSN诱导Ox1生长差异的原因之一。其他表观遗传调控，如组蛋白修饰，也可能是这一过程的一部分。gydF4y2Ba

先前的研究报告了环境诱导的表观遗传变异的遗传[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，可导致遗传表型修饰[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．Kou等人(2010)报道，缺氮可以诱导水稻(S0)胞嘧啶甲基化模式的位点特异性改变，在子代水稻(S1)中检测到甲基化模式改变的频率为47 - 59% [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．他们发现，两组S2植株来自同一个n缺乏胁迫的s0来源的S1个体。一株继承了S0时获得的应激修饰甲基化模式和表型。在我们的研究中，为了确定LPSN引起的表型变化是否具有可遗传性，我们在HN和NN田间又种植了8个品系WYG7-LN、WYG7-HN、Ox1- ln和Ox1-HN，发现Ox1中LPSN引起的表型变化是不可遗传的。因此，我们认为并非所有LPSN诱导的甲基化变化都是可遗传的，遗传变化的强度不足以影响表型。gydF4y2Ba

我们假设在缺氮场中，LPSN引起了大量的基因甲基化变化，但表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在WYG7和Ox1系中均不受影响。由此可见，无论是野生型还是氮利用效率高的Ox1株系，其表型都受到外界缺氮的强烈影响，而克服了亲本种子氮含量的影响。在HN田中，亲本种子氮含量在表观遗传水平上降低诱导的DNA甲基化变化，并显著降低表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba导致在Ox1系中经过两代产生缺氮的遗传表型。gydF4y2Ba

在本研究中，我们发现Ox1亲本种子氮含量的降低会影响子代幼苗的生长。此外，在高外源施氮条件下，还可诱发子代种子含氮量、植株含氮量和籽粒产量的下降。而WYG7在苗期和成熟期的生长均不受LPSN的影响。为了确定表型的机制，我们对不同外源N含量的亲本Ox1和WYG7系的甲基化数据进行了测序。结果表明，LPSN引起子代Ox1中大量的基因甲基化变化和差异甲基化基因富集在20多条GO通路中。的表达式gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在高外源氮条件下，LPSN子代Ox1的表达明显低于HPSN子代植株gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba因此，我们得出结论，在表观遗传水平上，亲本种子氮含量的降低诱导了DNA甲基化的变化，并显著降低了LPSN子代的表达gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba在过表达系中，两代产生了N缺乏的遗传表型。我们的研究结果可能为植物生长响应内源氮胁迫提供了一种新的观点，并为培育高营养效率植物指明了新的方向。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

OsNAR2.1gydF4y2Ba过表达线(Ox1)，背景为gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Bal . ssp。gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba简历。Chen等人(2017)对Wuyugeng7 (WYG7)进行了描述[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．gydF4y2BaOsNAR2.1gydF4y2Ba有背景的过表达线(Ov199)和RNAi线(RNAi)gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Bal . ssp。gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba简历。Nippobare (NP)在Yan等人(2011)中有描述[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba和范等人，(2020)[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．在田间生长的植物，所有材料都种植在浙江长兴浙江大学农业实验站的小块土地上。长兴地处亚热带季风气候区。土壤的pH值是7.2。在田间按标准水平添加钾和磷(225和450 kg/ha)。施氮量为300 kg N/ha的HN田，150 N/ha的MN田，75 N/ha的LN田，不施氮的NN田。样地面积为2 × 2.5 m，幼苗按10 × 10列种植[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba,gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．我们从每个地块随机选择了五棵幼苗，避开了边缘的那些。gydF4y2Ba

对于水培育苗的植物，从T5收集的所有种子用10% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)双氧水溶液浸泡30分钟，彻底冲洗，用去离子水冲洗6次。将大小均匀的种子在1 L的锅盖上发芽，每个锅盖有40个孔，每个孔有一颗种子。植物在温室中自然光照下生长，昼夜温度30°C/22°C，相对湿度60%。容器中加入2.5 mM的NHgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba没有gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba或纯净水。将10天大的幼苗移栽到一个7升的花盆上盖的孔中。gydF4y2Ba

生物量和总氮(N)的测量gydF4y2Ba

我们从田间收获WYG7和Ox1品系，105°C加热30min, 75°C干燥3天。采用凯氏定氮法测定氮浓度和全氮含量[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

对于水培生长的植物，每3天检测一次嫩枝长度。我们在30天后收获WYG7和Ox1，在105°C加热30分钟。生物量以茎干重或根重计算。gydF4y2Ba

基因表达分析gydF4y2Ba

从旗叶组织中提取总RNA，使用TRIzol试剂(Vazyme Biotech Co .， Ltd)。使用HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR试剂盒(Vazyme Biotech Co .， Ltd.)根据制造商说明对DNase - i处理的总rna进行逆转录(RT)。采用AceQTM qPCR SYBR Green Master Mix (Vazyme Biotech Co .， Ltd)进行定量分析。相对表达量归一化为gydF4y2BaOsActingydF4y2Ba（gydF4y2BaLOC_Os03g50885gydF4y2Ba)，表示为2-gydF4y2Ba△gydF4y2BaCT。所有用于RT-qPCR的引物见补充表gydF4y2BaS7gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

WGBS和数据分析gydF4y2Ba

从成熟植物的叶片中提取基因组DNA，并运送到Anoroad基因组公司(北京)进行全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)文库的制备和测序。gydF4y2Ba

对原始reads进行过滤和裁剪，得到干净的reads，并将所得数据与Oryza_sativa Japonica IRGSP-1.0参考基因组进行比较，得到Bismark (v0.9.0)比对结果[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．对于每个C位点，甲基化水平(%)用以下公式计算:100*(支持甲基化的读取)/(该位点的总读取深度)。对于甲基化区域，甲基化水平(%)用100*(该区域所有C位点的甲基化水平)/(该区域C位点总数)计算。gydF4y2Ba

甲基化差异分析在基于区域的水平上进行，差异甲基化区域(DMRs) [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．与对照组比较DNA甲基化异常情况。甲基化模式增加定义为超甲基化，而甲基化模式减少定义为低甲基化。DMR检测使用SMART (gydF4y2Bahttp://fame.edbc.org/smart readme.htmlgydF4y2Ba(1)每个C >的读覆盖率为4;(2)每个DMR中C的总数> = 5;(3) DMR长度> = 100 bp;(4)组间甲基化水平差异大于等于0.3;(5)将CPG站点与gydF4y2BapgydF4y2Ba-小于1e-10的值保留为最终DMR。根据DMR基因组注释结果，启动子(上游1Kb)与基因体区域重叠的基因被认为是差异甲基化基因(DMG)。gydF4y2Ba

GO分析使用AgriGO (gydF4y2Bahttp://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/index.phpgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据采用Duncan单因素方差分析(ANOVA)进行分析。有统计学意义的差异gydF4y2BaPgydF4y2Ba样本间< 0.05以直方图上或均值后的不同字母表示。所有统计评估均使用IBM SPSS Statistics版本23软件(SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)进行。gydF4y2Ba

本研究期间生成的全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)数据集(见《材料和方法:WGBS和数据分析》)可在NCBI GEO知识库中获得，登录号为GSE160884 (gydF4y2Bahttps://www.ncbigydF4y2Ba．gydF4y2Ba

nlm.nih.gov /地理/查询/ acc.cgiacc = GSE160884gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

感谢浙江大学毛传藻教授对农业实验站的帮助。gydF4y2Ba

基金资助:国家重点研发计划项目(2016YFD0100700)、国家自然科学基金项目(拨款31372122)、转基因项目(拨款2016ZX08001003-008)、111项目(拨款12009)、教育部中央高校基础科学研究创新项目(KYYJ201604、KJJQ201701)、教育部创新科研团队发展计划项目(IRT_17R56;江苏省科技发展计划项目(资助项目BE2019375-1);gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部长江中下游植物营养与施肥重点实验室，江苏南京210095gydF4y2Ba

   范晓茹，钱开云，陈景光，张玉月，谢鹏，徐曼，胡智，徐国华，范晓荣gydF4y2Ba

2. 南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京210095gydF4y2Ba

   范小茹，钱开云，张玉月，谢鹏，徐曼，胡智，徐国华，范小荣gydF4y2Ba

3. 维齐美生物科技有限公司，江苏南京210033gydF4y2Ba

   Laihua刘gydF4y2Ba

4. 中山大学农学院，广东广州510275gydF4y2Ba

   陈京广gydF4y2Ba

5. 南京农业大学生物信息中心，江苏南京210095gydF4y2Ba

   闫文凯，吴玉峰gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

XF(范小如)在概念和设计、数据的获取、数据的分析和解释等方面都做出了实质性的贡献，并参与了重要智力内容的稿件起草;LL、YZ、KQ、PX、MX和ZH是数据采集的一部分;JC对概念和设计做出了实质性的贡献，并对重要的知识内容进行了批判性的修改;WY和YW是数据分析和解释的一部分;GX提供一般支持;XF(范晓荣)对数据的构思、设计和解释都做出了很大的贡献，参与了对稿件的批判性修改。所有作者都审阅了手稿。所有作者都对即将出版的版本给予了最终的批准，并同意对工作的所有方面负责，以确保与工作的任何部分的准确性或完整性有关的问题得到适当的调查和解决。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaXiaorong风扇gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba