比较生理和全长转录组分析揭示了秋葵中褪黑素介导的盐耐盐性的分子机制（gydF4y2BaAbelmoschus esculentus.gydF4y2BaL.）gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

褪黑激素是一种多功能信号分子，在多种植物的生长发育和胁迫反应中发挥着重要作用。秋葵(gydF4y2BaAbelmoschus esculentus.gydF4y2BaL.）是一种营养和医疗保健价值极高的食物作物。最近的报道揭示了褪黑素在缓解盐胁迫方面的保护作用。然而，关于秋葵盐胁迫的调节机制很少熟知。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

本研究探讨外源褪黑素预处理是否能缓解秋葵植株的盐胁迫(300 mM NaCl)。结果表明，外源施加褪黑素(50 μM)显著增强了植株的耐盐性，表现为抗盐表型，净光合速率、叶绿素荧光和叶绿素含量均高于未施加盐胁迫的植株。此外，褪黑素预处理显著降低了脂质过氧化和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容和清除OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba}在褪黑激素预处理的植物中，其可能归因于更高水平的酶活性，包括POD和GR。此外，第三（PACBIO）和第二代（Illumina）测序技术的组合应用于秋葵的全长转录组。获得总共121,360个unigenes，并且转录长度的尺寸范围为500-6000bp。Illumina RNA-SEQ分析表明：与对照，1776,1063和1074个差异表达基因（分别分别鉴定出分别的三种处理（分别为NaCl，MT50和Mt + NaCl）。这些基因富含10个以上的术语和34 kegg途径。在所有三种治疗中显着富集氮代谢，硫代谢和丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢。许多转录因子，包括MYB，WRKY，NAC等，也被鉴定为DEGS。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的初步结果表明，褪黑素预处理首次增强了秋葵植物的耐盐性。这些数据在秋葵中提供了第一组全长同种型，更全面的见解进入褪黑素反应对盐胁迫的分子机制。gydF4y2Ba

土壤盐渍化是限制植物生长和发展的主要非生物胁迫之一，导致全球农业生产过度减少[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba那gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，特别是在干旱和半干旱地区[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba]．目前，19.5％的灌溉田地地区受盐度污染（gydF4y2Bahttp://www.plantstress.com/articles/index.aspgydF4y2Ba）.盐胁迫增加了钠离子的积累（NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba）并抑制钾离子的摄取（kgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba，从而破坏植物细胞的离子和渗透平衡。盐胁迫诱导的活性氧(ROS)过量产生导致膜损伤和氧化应激[gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba]．为了抵抗盐水应激，植物已经进化了复杂的抗氧化系统，该系统调节ROS稳态，包括抗氧化剂（例如过氧化物酶（POD），过氧化物酶（猫），过氧化物歧化酶（SOD）和自由基清除剂。gydF4y2Ba

最初鉴定褪黑激素（N-乙酰-5-甲氧基氨基氨基胺），磷酸和两亲氨基氨基分子，并从牛松果腺中分离出来[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba]．它作为一种动物激素参与各种生理过程，如昼夜节律[gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba10gydF4y2Ba[免疫学改进[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]及抗氧化活性[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．直到1995年，在血管植物中发现了褪黑激素[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba那gydF4y2Ba14gydF4y2Ba[随后相当大的研究揭示了重要的缓解压力。作为抗氧化剂和自由基清除剂，外源性褪黑素的应用增强植物的抗性与生物和非生物胁迫[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba那gydF4y2Ba16gydF4y2Ba那gydF4y2Ba17gydF4y2Ba那gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，通过改善光合作用和氧化还原稳态，增强抗氧化酶的活性，激活下游信号和调节应激反应基因的表达，从而增强植物的抗逆性[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba那gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]．近年来，许多研究表明，外源褪黑素处理增强了多种植物的耐盐性[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba那gydF4y2Ba19gydF4y2Ba那gydF4y2Ba22gydF4y2Ba那gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]．然而，迄今为止褪黑素对盐胁迫的响应是普遍的，仍然是其他植物的普遍性。此外，褪黑素介导的耐盐性的分子机制仍然模糊不清。gydF4y2Ba

转录组织为系统性地揭示基因转录图及其调节提供了一个重要的基础，阐明了复杂生物学性状的分子机制，并理解遗传和环境因素之间的相互作用机制[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba那gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．第二代高吞吐量测序技术易于产生许多不能拼接的片段和重叠组，并且丢失诸如可变剪接之类的重要信息[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba那gydF4y2Ba27gydF4y2Ba那gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．近年来，利用Pacific Biosciences (PacBio)平台开展了一系列基于单分子实时测序(SMRT)的转录组分析研究，包括第二代和第三代测序杂交剪接或第三代校正技术等gydF4y2Ba萨尔维亚米尔蒂希萨gydF4y2Ba［gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba［gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba毛竹竹gydF4y2Ba［gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

秋葵(gydF4y2BaAbelmoschus esculentus.gydF4y2BaL.），也被称为gydF4y2Ba夫人的手指gydF4y2Ba是一种一年生粮食作物，叶大，裂，花白色至黄色，蒴果为金字塔状长方形。它在非洲被引入，现在已经在世界各地广泛种植。近年来，秋葵因其极高的营养和保健价值而受到越来越多的研究人员的关注[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．但在苗期对盐胁迫非常敏感gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。为了深入了解褪黑激素介导的耐盐分子机制，本研究将外源褪黑激素应用于秋葵幼苗，探讨其在应对盐胁迫中的作用。研究了NaCl胁迫下植物生长、光合作用、活性氧积累及其抗氧化反应。此外，我们利用PacBio和Illumina的杂交测序分析了褪黑素对盐胁迫下秋葵的影响。本研究为深入了解褪黑素介导的秋葵耐盐生理和调控机制提供了依据。gydF4y2Ba

外源褪黑激素预处理缓解了秋葵植物的盐胁迫gydF4y2Ba

为了探索外源褪黑激素预处理是否可以缓解秋葵植物的盐胁迫，将褪黑激素（50μm或100μm）施用于秋葵幼苗，观察到表型性状。与暴露于正常条件的那些，显着抑制暴露于盐胁迫（7天）的秋葵幼苗的生长（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)，明显表现为真叶矮化和颜色加深(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).盐胁迫植株第二真叶长度和叶片总鲜重分别比对照降低31和47%(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag, h)。然而，褪黑素预处理的植物在盐胁迫下表现出明显的缓解作用，表现为颜色变浅，叶片变大(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba与盐胁迫相比，褪黑激素显著增加了叶片第二真叶长度和总鲜重(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag, h)， 50 μM的褪黑素效果优于100 μM。值得注意的是，在最佳条件下生长的褪黑激素预处理幼苗之间的表型(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC，D）和对照幼苗（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa）没有明显的差异，表明无毒性症状。上述结果表明，褪黑素预处理可以减轻盐度诱导的生长抑制。gydF4y2Ba

褪黑素预处理对盐胁迫下秋葵光合作用的影响gydF4y2Ba

为了进一步评估褪黑激素对秋葵盐应激反应的影响，监测PSII（FV / FM）的最大光化学效率和净光合速​​率（PN）。如图1所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab，与mock相比，NaCl处理显著降低了秋葵的Pn，占对照的30.3%。反之，褪黑素(50或100 μM)处理可有效缓解盐胁迫导致的叶片Pn下降。以50 μM和100 μM褪黑素处理的秋葵植株为例，经过盐胁迫后，其Pn均高于单独处理的秋葵植株，分别占对照的46.2%和47.5%。同样，褪黑素预处理显著提高了第二片真叶Fv/Fm(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa，c）。另外，在最佳条件下生长的褪黑素预处理幼苗的FV / FM和PN几乎不变（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.在对表型和光合作用的两种考虑的基础上，在以下实验中选择50μM浓度的褪黑激素。gydF4y2Ba

褪黑素预处理对盐胁迫下秋葵叶绿素含量和氧化应激的影响gydF4y2Ba

探讨盐胁迫诱导氧化损伤和外源褪黑素预处理对ROS清除，叶绿素，MDA和H的影响gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容，以及o的生产率gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba}估计。在盐胁迫下，叶绿素含量下降，然而，通过褪黑激素预处理减轻了下降的下降（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa). MDA含量是表征细胞膜受损程度的指标，盐胁迫植株的MDA含量显著高于对照植株(2倍)。与盐胁迫相比，褪黑激素预处理植株的MDA含量(为对照植株的1.5倍)显著降低(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）。单独的NaCl治疗增加了H.gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba叶子的含量为2.74倍和o的生产率gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba}1.8倍（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC，D）。然而，与对照相比，褪黑激素预处理显着清除了hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和o.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba}在NaCl处理后7天的叶子分别在7天内，分别为0.82倍和0.83倍降低（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC，D）。此外，总叶绿素，MDA和H.gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容，以及o的生产率gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba}与褪黑激素治疗的秋葵植物与对照植物相比没有显着差异，揭示施用的褪黑激素浓度与植物无害。gydF4y2Ba

褪黑素预处理对盐胁迫下秋葵抗氧化酶活性的影响gydF4y2Ba

为了评估褪黑激素的ROS积累是否与抗氧化系统的激活有关，检查豆荚，猫，草皮和GR水平的活性。如图1所示。gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba，单独的盐胁迫显着增加了与对照植物相比猫和分脂的活性。有趣的是，褪黑激素预处理的应力植物显示出更高的豆荚和GR活性（图。gydF4y2Ba4.gydF4y2BaA，D）与非生成的应力植物相比，而猫和SOD活性显示NaCl治疗中没有显着的变化（图。gydF4y2Ba4.gydF4y2Bab，c）。另外，在最佳条件和对照幼苗中生长的褪黑素预处理的植物之间存在抗氧化酶的活性（图。gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

使用PACBIO续集平台的秋葵转录组分析gydF4y2Ba

从三种类型的秋葵组织(根、茎、叶)中提取总RNA。将高质量RNA均匀混合，构建文库。在PacBio Sequel平台上对库进行了测序。采用Iso-Seq标准分类和聚类方法获得完整的转录本序列。使用SMRTLink(5.1)过滤后，共获得3,644,038个子reads (8.5 Gb干净数据)。经过子reads之间的校正得到286,218个循环一致序列(circular consensus sequence, CCS)，其中221,014个(77.22%)为全长非嵌合reads (Full-length non-chimeric reads, Flnc)，包含条形码引物和polyA tails (Additional file)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。平均亚亚血统长度为2345 bp，N50为2715bp。用于纠错（ICE）的聚类算法和迭代聚类用于提高共识准确性。完成短读Illumina测序以通过RORETEC软件量化ISO-SEQ同种型。CD-HIT软件用于通过聚类清除冗余和类似的序列。我们获得了121,360个非冗余共识同种型。转录长度的尺寸范围为500至6000bp（图。gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

功能注释gydF4y2Ba

利用BLAST技术对NR、Swissprot、KEGG、KOG、GO、NT和Pfam等7个数据库进行了功能注释分析。至少有一个数据库注释了72,608个亚型，所有数据库注释了35281个亚型(图)。gydF4y2Ba5.gydF4y2Bab）。分配了40七千四百九十分十九种同型，通过Kog数据库分析了25个功能群集。“仅限常规函数预测”（18.08％，8574）是最大的类别（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。通过NR数据库对其他植物进行爆破，获得秋葵与近缘植物序列之间的相似功能信息。秋葵异构体有最高的点击率gydF4y2BaGossypium raimondii.gydF4y2Ba(22547次)，其次是gydF4y2Ba陆地棉gydF4y2Ba(17355支安打)和gydF4y2Ba木本棉gydF4y2Ba（17,268次）（图。gydF4y2Ba5.gydF4y2Bac），暗示秋葵和棉花之间的高同源性。gydF4y2Ba

为了研究这些基因在生物通路中的功能，我们通过KEGG通路数据库鉴定了这些基因的亚型。共有46,816个亚型被分为5个主要KEGG功能类别和213个KEGG通路(图)。gydF4y2Ba5.gydF4y2Bad-i和附加文件gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba:表S2)。高比例的亚型分布在“新陈代谢”(22070)(图。gydF4y2Ba5.gydF4y2Bai)，如“碳水化合物代谢”(5504)、“全球和总览图”(3614)、“氨基酸代谢”(3040)。为了进一步对秋葵转录本进行分类，我们根据分子功能、细胞组分和生物过程三大类进行了GO注释分类(附加文件)gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba:图S3)。在生物过程分类中，“代谢过程”(24,020个亚型)、“细胞过程”(22,818个亚型)和“单一生物过程”(13,849个亚型)是三大类型。细胞组分的主要类别为“细胞(9294亚型)”、“细胞部分(9294亚型)”和“膜(6378亚型)”。涉及“结合”(33223个亚型)、“催化活性”(24049个亚型)和“转运体活性”(2859个亚型)的亚型在分子功能亚群中具有高度代表性。gydF4y2Ba

不同处理间差异表达基因(DEG)及功能富集分析gydF4y2Ba

为了研究褪黑激素介导的秋葵耐盐性的分子机制，利用Illumina平台测定了褪黑激素和NaCl处理对秋葵耐盐性影响的总基因的转录表达。所有样本对之间的皮尔逊相关系数热图显示，每个样本都是可靠的，具有良好的重现性(附加文件gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba:图S4)。从12个cDNA文库中共生成551,871,356条原始reads(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.其中，去除适配器序列，过滤低质量reads，获得539,294,676条(97.72%)干净reads。我们使用RSEM软件对领结2进行比较，得到每个样本中每个基因的读计数，然后进行FPKM转化，分析基因表达水平。DESeq2 [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]软件分析DEGs，筛选阈值为Padj < 0.05。输入数据为基因表达水平分析得到的readcount数据。聚类分析确定不同实验条件下DEGs的表达模式。利用不同实验条件下不同基因的FPKM值进行层次聚类分析(图)。gydF4y2Ba6.gydF4y2Baa).这些deg的表达趋势如图所示。gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba湾事实证明，在NaCl治疗中，共鉴定了总共1776次，其中包括572和1204个下调。在MT治疗中，共鉴定了总共1063℃，包括393次，并鉴定下调670℃。与模拟相比，总共474只高度表达MT + NaCl处理（图。gydF4y2Ba6.gydF4y2BaC）。此外，我们使用Venn图比较了三个数据集（图。gydF4y2Ba6.gydF4y2Bad）。详细地，将“NaCl与Mt”，“NaCl与Mt + NaCl”和“Mt与Mt + NaCl”组的℃分别测定为193,408和206。三个比较群体有96只常见。gydF4y2Ba

为了阐明这些DEGs的生物学功能，对富集的氧化石墨烯进行了分析。富集前10个氧化石墨烯项如图所示。gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba．在NaCl处理中，“结合”，“催化活性”和“有机环状复合结合”是分子功能中的前三大阶段;在细胞组分中，“膜”，“细胞”和“细胞部分”是前三大术语;在生物学过程中，“代谢过程”，“细胞过程”和“有机物质代谢过程”是最大的三大术语。在Mt治疗和Mt + NaCl处理中，“结合”，“催化活性”和“杂环化合物结合”是分子功能中的前三个最大的术语，并且细胞组分和生物过程中的前三个最大术语是与NaCl治疗中的那些相同。gydF4y2Ba

共34条富集KEGG通路(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba8.gydF4y2Baa).在NaCl处理下，23条通路显著富集。“硫代谢”、“光合-天线蛋白”和“氮代谢”富集途径最多。MT处理共鉴定出16条富集KEGG通路，其中“氮代谢”、“硫代谢”和“内质网蛋白加工”富集通路最多。在MT + NaCl处理中，有15个显著富集的途径降低了DEGs。“氮代谢”、“戊糖与葡萄糖醛酸的相互转化”和“淀粉与蔗糖的代谢”是富集的前3个途径。氮代谢、硫代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢均显著富集。图中显示了“氮代谢”和“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”途径的DEGs表达谱。gydF4y2Ba8.gydF4y2Bab和c。gydF4y2Ba

转录因子在植物生长发育和面对逆境胁迫的各个方面发挥着关键作用。我们利用iTAK软件预测秋葵的转录因子。注释的前30个最大转录因子家族的数字显示在柱状图中(附加文件)gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba：图S5）。MYB，WRKY和NAC家庭是三个学习的转录因子家庭。四组中的三个TF系列的表达谱呈现在热图中（图。gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba一个)。其中大多数由NaCl治疗和通过褪黑激素治疗下调的下调。为了进一步验证RNA-SEQ数据，随机选择9个MYB，WRKY和NAC TF系列进行QRT-PCR（图。gydF4y2Ba9.gydF4y2Bab).这些基因的表达模式与Illumina RNA-seq的FPKM值基本一致，证实了测序数据的可信度。gydF4y2Ba

Abelmoschus esculentus.gydF4y2BaL.是一种可食用的药用植物，从研究人员中获得了越来越多的关注，成为一个热门的研究领域。它含有多种营养素和重要的植物化学物质，包括章程，黄酮类化合物，糖苷等[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]．此外，它具有各种生物活性，如抗氧化剂，抗菌，抗癌和抗炎和免疫调节活动[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．盐应激，响应土壤盐渍化是限制植物生长和产量的主要因素之一。多个出版物报道，褪黑素预处理可以缓解各种植物物种中的盐应激触发的ROS，但由于没有参考基因组和转录组数据，严重阻碍了秋葵介导的乳蛋白介导的乳蛋白介导的耐盐性的参与和分子研究gydF4y2Ba答:esculentusgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

由于秋葵的复杂遗传背景在很大程度上仍然不为人知，秋葵的研究受到严重阻碍。目前，组合NGS和SMRT的混合测序增加，可以提供高质量和完整的转录组件，尤其是具有测序基因组的物种[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba那gydF4y2Ba36gydF4y2Ba那gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]．在本研究中，利用Illumina测序和长读SMRT测序技术，获得了更完整的秋葵转录组，我们的研究提供了第一套全面的秋葵全长亚型。SMRT转录组共生成了8.5 Gb干净数据，包括221,014个FLNC reads和121,360个非冗余一致亚型(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。根据NR数据库的序列比对，秋葵与棉花的同源性最高(图2)。gydF4y2Ba5.gydF4y2Bac)，这与它们在进化中的遗传关系一致，它们都属于锦葵科。gydF4y2Ba

在本研究中，通过植物抗性表型记录（图，褪黑素对秋葵对盐诱导的抑制的反应的缓解作用（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）以及与非处理的盐胁迫植物相比，通过净光合速率和叶绿素含量的净光合速率和叶绿素含量的清除，以及褪黑素预处理植物的清除（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba那gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.Illumina测序和SMRT结合，在NaCl、MT和NaCl+MT处理下的秋葵幼苗中分别鉴定出1776、1063和474个DEGs(图2)。gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba）.这些基因的GO富集分析表明，细胞和分子事件参与了褪黑激素诱导的秋葵耐盐性(图。gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

代谢稳态的调节也参与了褪黑素介导的非生物胁迫耐受性的促进[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba那gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．在该研究中，参与多种代谢途径的DEG，显着富集，包括氮代谢，硫磺代谢，戊糖和葡糖醛酸酯互连，淀粉和蔗糖代谢，谷胱甘肽代谢和丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢代谢（图。gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba）.在这些途径中，碳水化合物和多种氨基酸代谢是盐胁迫对渗透适应的重要反应[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]．在所有三种处理中显着富集了氮代谢，硫代谢和丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢。以前，我们对秋葵进行了一系列研究，并通过下一代测序分析了秋葵生物活性成分的合成基因，并探讨了盐胁迫下秋葵蛋白质组水平的变化[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba那gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．差异表达的蛋白质（DEPs）与代谢的生物学过程强烈相关，并对应力反应。这些结果表明，氨基酸和碳水化合物和氮代谢的主要重新定位可以参与盐胁迫中褪黑素的底层机制。因此，包括多糖，有机酸和氨基酸的代谢调整为褪黑激素处理的植物响应盐胁迫提供了有益的效果。此外，植物激素信号转导和肌醇磷酸盐代谢仅为Mt + NaCl处理中富含两种途径。褪黑激素广泛涉及各种植物激素的新陈代谢，如乙烯，细胞分裂素，甘油酸，IAA和脱落酸[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]．在盐胁迫下，还通过蛋白质组学分析鉴定了与盐信号转导相关的DEPs。在盐胁迫条件下，一些耐盐植物积累了大量的肌醇[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba那gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

仅在褪黑素治疗的秋葵植物中有八种途径，包括半胱氨酸和甲硫氨酸代谢，碳固定光合生物，二萜类生物合成，蛋白质出口，丙酮酸代谢，谷胱甘肽代谢，植物病原体相互作用和内质网中的蛋白质加工。这些途径可能在秋葵蛋白介导的秋季盐胁迫中发挥重要作用，表明褪黑素的普遍效应。植物中褪黑素的生物合成涉及几种酶[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，包括色氨酸脱羧酶(TDC)、色胺5-羟化酶(T5H)、咖啡酸o -甲基转移酶(COMT)、5-羟色胺n-乙酰转移酶(SNAT)和n-乙酰5-羟色胺o -甲基转移酶(ASMT)。snat和asmt被认为是褪黑素生物合成的限速酶。叶绿体和线粒体是褪黑素生物合成的主要场所，已有充分的文献记载[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba那gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]．这两个细胞器比其他细胞结构更容易氧化应激，从而产生更多的RO。因此，两种细胞器中的褪黑素生物合成可以容易地为植物提供保护作用[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]．此外，叶绿体是植物中光合作用的主要部位。我们以前的蛋白质组学分析表明，有317型且主要位于叶绿体（113蛋白）中。有13种与“卟啉和叶绿素代谢”相关的13℃，这与NaCl下的转录组分析一致。此外，焦糖素 - 预处理植物中的“碳固定光合生物”的富集 - 褪黑素对盐胁迫下秋葵中光合作用和叶绿素含量增强的影响，这可能是由于扫荡褪黑素的ROS。gydF4y2Ba

据报道，各种TFS在植物应激反应中起重要作用，其以序列特异性方式识别DNA以调节应力响应基因表达。这些TFS包括乙烯响应转录因子，Bzips，Mybs，Nacs，Wrkys等。迄今为止，一些TFS已被充分记录涉及褪黑激素介导的应力耐受性。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，锌指gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba6（ZAT6），一种半胱氨酸2 /组氨酸2型锌指TF，参与通过激活CBF途径映射褪黑素介导的冷冻应力阻力[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]．最近发现MEWRKY79和热冲击转录因子20（MEHSF20）通过与N-乙酰苯甲钛素O-甲基转移酶2结合来推动褪黑激素生物合成酶（gydF4y2BaMeASMT2gydF4y2Ba)启动子，赋予木薯对木薯白叶枯病的耐受性(gydF4y2BaManihot Esculenta.gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．在番茄中，转录因子热休克因子A1a (HsfA1a)靶向褪黑素生物合成基因启动子中的HSEgydF4y2BaCOMT1gydF4y2Ba并激活转录表达gydF4y2BaCOMT1gydF4y2Ba，从而增加褪黑激素的积累，进一步提高番茄植株对镉(Cd)的抗性[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]．本研究中，bHLH、WRKY、NAC、MYB等多种转录因子在不同处理下表达差异显著。在NaCl处理下大部分基因表达上调，而在褪黑素处理下大部分基因表达下调。这与一些出版物的观察结果一致，即多种TFs参与褪黑激素诱导的对各种压力的抵抗[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba那gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．许多重要的生物学过程都依赖于转录因子的调控。这些结果表明，TFs可能有助于提高褪黑素处理秋葵植株的耐盐性。gydF4y2Ba

这项研究总结在秋葵中的第一组全长同种型，以及褪黑激素在秋葵对盐胁迫的证据。这可能归因于应激相关基因的全身转录调节，代谢稳态调节以及抗氧化剂的活化。gydF4y2Ba

植物材料、生长条件及处理gydF4y2Ba

秋葵的种子gydF4y2Ba（Abelmoschus Esculentus.gydF4y2Ba“鲜芝”购自浙江省农业科学院蔬菜研究所。种子在直径3 cm的黑色塑料罐中发芽，罐内填充蛭石、泥炭和珍珠岩的混合物(1:2:1,v:v:v)，在光强为300 μmol m、光周期为14/10 h的生长室中生长gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在28/24°C昼/夜温度下，60% RH。所有幼苗每2天均匀浇水一次，每周用1/2强度的霍格兰溶液施肥[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]．当两个子叶完全膨胀时，将均匀尺寸的幼苗转移到较大的塑料盆（直径为7厘米）。gydF4y2Ba

确定的影响外源褪黑激素的应用在植物盐胁迫耐受性,幼苗(真叶和新展现年轻的叶子)第一次灌溉与0,50或100μM褪黑激素(50 mL /植物)根总共三次(每隔一天一次)。褪黑素用酒精溶解，然后用米力q水稀释。6天后，用300mm NaCl(每株50 mL)灌洗。7天后，在测定生理参数后，采集叶片(生长点下的第二个真叶)样本进行生化分析。采集的样品在液氮中快速冷冻，在−80°C保存，直到生化测量[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]．在以下实验中使用50μM浓度的褪黑激素。gydF4y2Ba

增长参数gydF4y2Ba

在盐处理的第7天，测量幼苗的第二真叶长度。之后，收获每种植物的所有叶子，记录叶片鲜重量。gydF4y2Ba

气体交换和叶绿素荧光的测定gydF4y2Ba

使用Li-6400便携式光合作用系统（LiCor-6400，Lictor Inc.，Lincoln Ne，USA）测量第二真叶的净光合速率（PN），根据制造商的说明，使用红色/蓝光源。光合光子磁通密度（PPFD）和温度和外部COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度设定为1000μmolmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba} s^{−1gydF4y2Ba}， 30°C, 400 μmol molgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},分别。gydF4y2Ba

采用Dual-PAM 100 Chl荧光分析仪(Heinz Walz, Effeltrich, Germany)在遵循Wang等人的方法进行30分钟暗适应后，测量光系统II (PSII) (Fv/Fm)的最大光化学效率[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]．Fv/Fm图像由叶绿素荧光成像仪(CF成像仪)检测(technica，英国，gydF4y2Bahttp://www.technologicagydF4y2Ba．Co.UK/）。gydF4y2Ba

叶绿素含量测定gydF4y2Ba

来自第二真叶的总叶绿素在80％（v / v）丙酮中暗到24小时，然后通过测定663nm和645nm处的吸光度来计算。gydF4y2Ba

丙二醛，HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿,gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^·-gydF4y2Ba和抗氧化酶活性gydF4y2Ba

丙二醛（MDA）和H.gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用江苏基思生物技术研究所（苏州）的测定试剂盒测量含量和GR活性。为了测定MDA含量和GR活性，将0.1g叶片组织接受粉末，其中1ml缓冲液I [50mM磷酸盐缓冲液（pH7.8），含有0.5％（w / v）Triton-100,0.1mm EDTA，和2% PVP], centrifuged at 10,000 rpm for 20 min at 4 °C and then the supernatant was used for determination according to the manufacturer’s protocol. For the determination of H_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容物，1 ml丙酮取代提取缓冲液I。gydF4y2Ba

OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^·-gydF4y2Ba根据elstner和heupel描述的方法测量[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]．简而言之，用3ml 65mM磷酸钾缓冲液（PB）（pH7.8）均化约0.1g叶片，并在4℃下以10,000rpm离心20分钟。然后，将0.5ml上清液与0.1ml 10mM羟胺盐酸盐和0.5ml PBS混合，并在25℃下温育20分钟。随后，将1mL 7mMα-萘胺和1ml 58mM磺酰胺加入温育混合物中，并在25℃下再孵育20分钟。然后，加入3ml氯仿并离心10,000rpm 5分钟。在530nm下测量吸光度。gydF4y2Ba

为了测量荚，猫和SOD活性，在50mM磷酸盐缓冲溶液（pH7.8）中均化约0.2g叶组织。将提取物在4℃下以10,000rpm离心20分钟。如Hou等人所述，收集上清液用于酶活性分析。［gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

RNA的制备及质量评价gydF4y2Ba

所有样品用液氮研磨，用TRIzol试剂提取总RNA，用DNase I (Takara)去除DNA。使用Nanodrop2000 (ThermoFisher, Waltham, MA, USA)测定RNA纯度(OD260/280)。使用Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies, CA, USA)检测RNA完整性。gydF4y2Ba

PacBio库的准备、测序和数据分析gydF4y2Ba

在OD260 / 280> 2.0，OD260 / 230的RNA，选择在1.8-210和完整性数> 8中进行后续研究。使用Clontech Smarter PCR cDNA合成套件和BluePippin尺寸选择系统协议制备ISO-SEQ库（PN 100-092-800-03）。对PACBIO续集仪进行测序。使用SMRTLINK 5.1软件处理序列数据。通过亚reads之间的校正获得亚曲线序列。根据序列是否含有5'END引物，3'end引物和PolyA尾，将序列分为全长序列和非全长序列。同种型级别聚类用于聚类全长序列以获得群集共识序列;最后，使用非全长序列用于抛光所获得的共分序列以获得后续分析的高质量序列[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]．通过CD-HITV4.6封装（-C 0.95 -T 6 -G 0-0.00-0.99）删除校正共识读取中的任何冗余，以获得后续分析的最终转录物。gydF4y2Ba

Illumina文库准备、测序和数据分析gydF4y2Ba

每个样本的总RNA量为3 μg，用于文库制备[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．NEBNEXT®Ultra™RNA库预备ill forIllumina®（Neb，USA）用于产生如制造商所述的测序库。通过寡核苷酸（DT）磁珠富集MRNA，并且MRNA随机中断。使用片段化的mRNA作为模板，在M-Mulv逆转录酶系统中合成第一条cDNA，并且使用DNA聚合酶I合成第二条cDNA。在末端修复纯化的双链cDNA，“a”添加尾巴并连接到测序适配器。通过Ampure XP珠粒筛选约250-300bp的cDNA并通过PCR扩增。通过Ampure XP珠粒再次纯化PCR产物，最后获得了文库。在Illumina Hiseq x十平台上测序图书馆，并生成配对读数。通过删除包含适配器的读取来获得清洁读取，读取包含PLOY-N和低质量从原始数据读取的读取。每百万次映射读数（FPKM）每千碱基的片段用于估计基因表达水平。使用DESEQ R包（1.10.1）进行差异表达分析。 Genes with an adjustedPgydF4y2Badeseq发现的value <0.05被分配为差异表达[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

unigenes的功能注释gydF4y2Ba

抄本在七个公共资料库中检索[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]：NR（NCBI非冗余蛋白序列）;NT（NCBI非冗余核苷酸序列）;PFAM（蛋白质）;Kog（蛋白质群体的簇）;Swiss-prot（手动注释和审查的蛋白质序列数据库）;Ko（kegg ortholog数据库）[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba];去（基因本体论）。gydF4y2Ba

用GOseq R包进行氧化石墨烯富集分析，校正P<0.05的氧化石墨烯项被认为显著富集。使用KOBAS软件检测KEGG通路中DEGs的统计学富集程度。gydF4y2Ba

定量rt - pcr分析gydF4y2Ba

使用Sybr®Mifix前Taqtm套件（Takara，Japan）在Roche LightCycler480仪器上进行定量RT-PCR测定[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]．一个内生秋葵gydF4y2Ba肌动蛋白gydF4y2Ba基因作为内参基因。实验中使用的引物列在附加文件中gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba:表S3。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有数据采用单因素方差分析(ANOVA)，邓肯多量程检验gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05使用SPSS 16.0 (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)。所有图形均表示为三个重复的平均值±标准差(SD)。gydF4y2Ba

所有转录数据都沉积在NCBI序列读取档案中（PACBIO ISO-SEQ测序的BIOPROJECT：PRJNA685320，gydF4y2Bahttps://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra/SUB8747384/overview;gydF4y2BaIllumina测序项目:PRJNA668637，gydF4y2Bahttps://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra/SUB8322037/overviewgydF4y2Ba）.本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

圆荚体:gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

猫：gydF4y2Ba

催化剂gydF4y2Ba

草皮：gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

CCS：gydF4y2Ba

循环共识序列gydF4y2Ba

Flnc:gydF4y2Ba

全身non-chimericgydF4y2Ba

冰：gydF4y2Ba

错误校正的迭代聚类gydF4y2Ba

DEG：gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

TF：gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

涉及植物研究gydF4y2Ba

这项工作植物的实验研究与田间研究符合IUCN政策声明，涉及灭绝风险的研究和濒危野生动物群和植物群贸易公约。gydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(no . 31801891);浙江省林木育种工程项目(no . 2016C02065);浙江农林大学科研基金项目(no . 2020FR057)。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 浙江A＆F大学农业与食品学院，杭州311300，浙江，中国gydF4y2Ba

   詹宜华，吴婷婷，赵璇gydF4y2Ba

2. 湖州学院生命科学学院浙江省媒介生物学与病原控制重点实验室，浙江湖州313000gydF4y2Ba

   詹琪王gydF4y2Ba

3. 2 .浙江省农业科学院园艺研究所，浙江杭州310021gydF4y2Ba

   岳晨gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

YZ和YC设计并指导研究;YZ、TW、XZ、ZW进行实验;YZ、TW、XZ对数据进行分析;手稿是YZ和YC写的。所有作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Bay华詹gydF4y2Ba或gydF4y2Ba岳晨gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba