这第450页多岛家族枫扎恩和洞察二萜合成

背景

细胞色素p450s（p450s）是在所有生物体上的生理学上重要化合物的生物合成中起关键作用的酶。虽然它们的特征在大量的植物物种中，但没有与这些酶有关的信息可以从属中获得枫扎恩(家庭大戟科)。枫扎恩是重要的，因为属包括物种，生产具有医学意义的环氧-噻二烷天然产物，其中之一已被批准作为抗癌治疗。

结果

比较种叶代谢组分析表明枫扎恩物种具有与各种其他植物物种不同的化学曲线。多样性和表达概况枫扎恩研究了叶片和根组织的p450。全长共103和123首第450页基因Fontainea picrosperma和Fontainea venosa.分别（以及另外127/125个局部长度），其将系统归化为氏族，家庭和亚属植物。多数的第450页鉴定在根组织内最活跃（66.2％F短小精子，65.0%F. venosa.). CYP71D和CYP726A中的代表在枫扎恩这是二萜素合成的优秀候选者，其中CYP726A1，CYP726A2和CYP71D1似乎是排他性的枫扎恩与叶组织相比，物种在根组织中显着更高度表达。

结论

本研究提出了一个全面的概述第450页基因家族枫扎恩这可能会对在属中发现的药用的外环氧树脂 - 蒂氏二萜的生物合成的重要见解。

含有二萜类或异戊二烯的二萜是一种结构不同的小分子，这些小分子在整个植物王国中普遍存在。Diterpenes展示了许多和各种各样的生物活动，因此对其潜在应用有重大的商业兴趣作为药物，食品和工业化学品[1那2那3.那4.那5.]. 从苹果果实中提取的新型环氧虎胆烯二萜酯Fontainea picrosperma（大戟科）[3.那6.，由于其作为一种局部治疗人类和伴侣动物多种癌症的有效药物，目前特别受关注[3.那7.那8.那9.]. 最近，TT被欧洲和美国的监管机构批准为治疗非转移性犬肥大细胞肿瘤的兽药。

TT不能在商业规模上合成，而是通过从植物的果实中提纯获得F. Picrosperma.[10.]．尽管如此，植物的所有组织都可能积累二萜[11.，因此，同时的果实F. Picrosperma.是纯化TT的原料，TT可能存在于植物的所有组织中。为此，导致TT等蒂氏酯类生物合成的天然生物合成途径目前未知，但对于其他大环偶联（例如，富丙烷和ingenane）而言，根部可以是生物合成的部位[12.那13.]．鉴于初级和次级代谢产物生产的生物合成途径中的重要作用（p450s），[14]，这可能是他们是关键的生物合成TT和环氧烷更普遍。

P450s广泛分布在真核生物中，在那里它们形成一个由超过35,000名成员组成的大而多样化的酶[15那16]并在天然产物的生物合成中发挥重要作用，异种症的降解，类固醇激素的生物合成，药物代谢和次生代谢物的合成[14那15]．它们在生物合成途径中催化许多化合物的反应，如生物碱、黄酮类、木酚素、类异戊二烯、酚类、抗氧化剂和苯丙素[17那18]．在植物中，P450超家族是最大的酶蛋白基因家族之一，例如，它是存在于植物中的第三大基因家族拟南芥[19]．目前，5100株植物p450已被注释聚类为A型和非A型两大类和11个不同族[20]. A型P450酶分为CYP71家族，而非A型酶又分为10个家族——CYP51、CYP72、CYP74、CYP85、CYP86、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727和CYP746[14那15那19]根据标准命名系统[21]. CYP71家族包括超过50%的植物P450[22那23]．

尽管植物中含有丰富的二萜类物质，但我们对其生物合成途径的认识仍存在较大差距。迄今为止，在大戟科中，CYP71D和CYP726A成员(在CYP71家族内)的功能特征是二萜修饰[24那25]．此外，这些P450基因存在于基因组生物合成簇中，也存在甲壳基合酶，并且该组织在研究中被研究过（即，对于来自基因组的那些物种）进行了保守的（即可用的那些物种）[26那27那28那29]．这导致了P450S是植物二维分集的驱动力的理论[26]．基于少量的实验基因表达数据，这些二萜生物合成基因具有广泛的组织表达，从叶子到根、花和茎[25那30]．

迄今为止，没有报告第450页基因枫扎恩然而，下一代测序（NGS）方法为其在该属中阐明的理想工具提供了理想的工具。Fontainea picrosperma和Fontainea venosa.是近缘物种，可能产生类似的天然产物阵列，包括环氧二萜。在这项研究中，我们报告了这两种药物的一般代谢谱枫扎恩物种，与非枫扎恩种为了更好地理解这些相同点和不同点，我们使用了原子学来阐明枫香P450家族及其在叶片和根组织中的相对基因表达，特别侧重于预期参与二萜合成的那些。

代谢物分析和P450鉴定

针对不同组织(根、叶、树皮和果实)中的TT进行了靶向分析F. Picrosperma.证明了其在所有组织中的存在（附加图。1)．基于此结果，以及以前的证据表明二萜类生物合成酶广泛表达[31那32]，选择叶片进行多物种代谢组学比较。植物叶片组织的代谢组学分析F. Picrosperma，F.Venosa还有4个非枫扎恩植物物种提供总共49,098个质谱离子，从LC-MS数据集中提取。进行局部最小二乘判别分析（PLS-DA）以分析样品中的化学大学（DOI：https://doi.org/10.25907/00049)．具有三个组件的PLS-DA模型占总方差的20.8,25.0和15.8％，显示了这一点F. Picrosperma.和F. venosa.与其他物种明显分离(图。1a).该非靶向代谢组学分析表明枫扎恩与两种大戟属相比，物种与化学视角相比，物种比例更密切相关（Manihot Esculenta，Ricinus Communis)和两种非大戟科(拟南芥，Solanum lycopersicum） 植物。

调查化学大学是否与P450多样性相关，F. Picrosperm.一个和F. venosa.通过NGS、de novo参比组装和基因本体初步鉴定P450。转录组文库由两者的根和叶组织共同构建F. Picrosperm.一个和F. venosa.使用Illumina HiSeq 2500（150–200）的植物 英国石油公司）。总共为生成了12 Gb和30 Gb的原始读取F. Picrosperma.和F. venosa.N50 1450 bp为192,639个contigs, N50 1248 bp为246,608个contigs。从这些参考枫扎恩转录组，我们确定了103和123个全长第450页基因(和127和125部分长度)F. Picrosperma.和f . venosa它们都包含保守的细胞色素P450结构域。4个不同的P450基序/区域(I-helix, K-helix, PERF和血红素结合[33]）呈现出指出的保守（图。1b).在代谢组学分析中使用的同一6个物种的P450序列同源性比较分析，基于90%的序列同源性，表明枫扎恩与其他种类的异疱疹和非偏异液（图）相比，分享更多P450同一性（48％）（图。1c)．大戟科的非大戟科种A.拟南芥和S圣女果共享NO P450（> 90％的身份）F. Picrosperma.或者F. venosa.．

F. Picrosperma P450.基因分为10个家族，其中有37个家族和45个亚科（表1）1）．在F.Venosa，P450基因被分为9种族，含有37个家族和67个亚属（表）2)．的一般特性枫扎恩还研究了全长P450蛋白，包括氨基酸（AA）长度，分子量，等电点（PI）和分泌信号肽的存在。长度从300到618 aa变化F. Picrosperma.和301-632 AAF. venosa.，分子量为~ 27-71 kDa。pI值范围为5.22 ~ 9.8 inF. Picrosperma.和5.29–9.91英寸F. venosa.．我们还计算了他们不稳定指数（ii）并发现18 F. Picrosperma.和52F. venosa.P450稳定（稳定因子） < 40). 所有P450蛋白的肉汁值均为负值，表明它们具有亲水性。在里面F. Picrosperma.， 68个P450被预测具有二级通路信号肽，而只有5个序列(FpCYP74B2、FpCYP707A2、FpCYP707A3、FpCYP707A4和FpCYP88A1)含有叶绿体靶向肽。在f . venosa78个P450有通路信号肽，3个FvCYP707A1、FvCYP707A2和FvCYP707A4有叶绿体靶向信号肽。没有P450与线粒体靶向信号肽。

P450的系统发育和推定功能分析

从6种含有1042个P450S的系统发育分析（F. Picrosperma，F.Venosa，R. Communis，M. Esculenta，A. Thaliana和S圣女果）证实了大多数F. Picrosperma.和F. venosa.P450不会向大戟属植物外部的物种（另外一侧）显示P450的实质性相关性。2)．有72第450页基因独家枫扎恩(身份> 92%)。一个枫扎恩-特异性P450的系统发育显示F短小精子，16个CYP85基因分入7个家族，CYP72基因分入3个家族，共17个基因（无花果。2一种）．在f . venosa14个基因被分为7个家族，形成一个单一的CYP85分支。在CYP72分支中，17个P450聚集成4个家族。一个P450在CYP710家族（FpCYP710A1，FvCYP710A1）和CYP51家族（FpCYP51G，FvCYP51G）中表达，它们在系统发育上与CYP85最为相关。

多数的F. Picrosperma.P450属于CYP71氏族（57个基因; 57.68％），其次是CYP72和CYP85氏族，其也称为型（无花果。2B.)．CYP71氏族负责生物碱，SesquiterPenoid，环状萜类化合物和黄酮类生物合成。多数的F. venosa.P450还属于CYP71氏族（68个基因; 55.28％），其次是CYP72和CYP85氏族（无花果。2B.）. 非A型包括其余46个P450，隶属于9个P450宗族和21个家族F. Picrosperma.．在f . venosa有55型P450，属于8个部落和19个家庭。注意，来自CYP711的代表P450缺席F. venosa.，而CYP97更良好地代表F. venosa.相比F. Picrosperma.．

比较表达第450页基因之间的枫扎恩物种

全面的第450页表达模式证明，在两种物种中，根组织表达更高（66.2％）F短小精子，65.0%F. venosa.)，与叶组织相比（无花果。3.a） 是的。72个同源基因的表达谱热图第450页基因，两种物种共同Fontainea,结果表明，大多数基因在根组织中(44.4%)比在叶组织中(25.0%)更活跃。（无花果。3.B.）．在F. Picrosperma.，有6个第450页只在叶组织（CYP82C7、CYP81T1、CYP89A3、CYP73A1、CYP94A1和CYP727B1）和根组织（CYP90D1-D2、CYP78A5、CYP71A1-A2、CYP707A4）中表达的基因。也在F. Picrosperma.，8第450页6个基因在根组织中表达量较高，在叶组织中表达量较高。在F. venosa.，8个独占叶组织（CYP90D1-D2，CYP734A1，CYP78A5，CYP71A1-A2，CYP707A4和CYP716E1）和4第450页基因仅在根组织中表达（CYP82C7，CYP89A3，CYP73A1和CYP81T1）（无花果。3.B.）．只有2第450页基因在叶组织中显着更高度表达，并且一种基因在根组织中显着更高度表达。

第450页参与二萜代代谢的基因候选者

系统发育分析枫扎恩在CYP71D和CYP726A家族中发现的P450与其他大藓科物种(麻风树姜黄那大戟培养那大戟属植物乳胶和R. Communis.)，证实了它们在这些推测的二萜P450亚家族中的位置（无花果。4.一种）．通过扩展的保守基序分析另外支持这一点（除了I-Helix，K-Helix，Perf和Heme结合图案）。4. F. Picrosperma.CYP726A，FPCYP726A4最分歧。识别出单个CYP726AF. venosa.(FvCYP726A1)，与FpCYP726A1-A2形成枝链。的三个枫扎恩两者都存在二萜p450F. Picrosperma.和F. venosa.但不是在其他肉豆蔻泥中。

目的:探讨组织表达的共性枫扎恩二萜第450页基因CYP726A1、CYP726A2和CYP71D1，另外9个生物样本F. Picrosperma.通过将RNA-SEQ映射到参考转录组来定量分析（总共12.1次）。与叶组织相比，这些数据显示了根组织中所有3个基因的统计学显着较高的基因表达水平（无花果。4.B.那附加文件3.). 管家基因甘油醛-3-P脱氢酶（GAPC）和伸长因子1α（EF1α）在叶和根组织中表达一致，在根组织中的表达高于叶组织[12.]．

Cytochrome P450s是进化的保守酶，这些酶涉及许多反应所需的催化，生长，发展，防御[34]二次代谢[14]．在这项研究之前，没有第450页该属的任何一个物种的基因都已被鉴定，更不用说特征了Fontainea。这很重要第450页对于未来的生物合成途径，基因可能是重要的，这是生产出药物显着的二萜酯的生物合成途径，例如TT，这是独特的枫扎恩．朝着这一目标，我们已经确定并归类规定的全长第450页编码两种物种的基因枫扎恩那F. Picrosperma.和F. venosa.．系统发育分析允许我们鉴定基因组，以便进一步评价。此外，还研究了它们在叶和根组织中的表达谱，特别是在叶和根组织中第450页与二萜生物合成相关的基因，可能参与TT的生产。

我们报告103和123全长第450页基因来自F. Picrosperma.和f . venosa分别被分类为氏族，其累积为37个家族和67个亚壳，其适合于符合植物衍生的功能，最突出地具有二萜类，黄酮类化合物和其他功能。Ortholog比较显示P450基因枫扎恩与大戟植物和非官方的其他植物物种相比，物种在很大程度上是独一无二的。支持我们的代谢组科分析，S圣女果和A.拟南芥P450与枫扎恩物种。这可能归因于诸如此外的磷酸酯特异性的二萜类衍生物的独特生物合成，发现枫扎恩和其他大戟科家族的成员。

总数枫香P450在本研究中确定的是与其他植物转录组织中发现的一致第450页研究，包括全长序列，氏族，家庭和亚属的总数[30那35那36]．例如，转录组研究允许阐明151个全长第450页基因金发氏粳稻[35]，118全长Taxus chinensis.[36]和116全长丹参[30]. 然而，在美国miltorrhiza，用于转录组学的组织包括叶、根和花L. japonica，使用花和芽。我们的研究确定了127和125部分第450页基因F. Picrosperma.和F. venosa.， 分别。为了获得全长序列，来自茎，花和水果的额外RNA-SEQ是有帮助的，以及不同的发展阶段。此外，这可以通过基因组测序互补。

如果一个物种的基因组是可用的，它确实提供了另一种机制第450页基因鉴定，通过基因组询问。在A.拟南芥共鉴定出246个基因，分为9个家族47个家族[20那37]，而从大豆(g·马克斯)及米(粳稻)基因组，含有332和355第450页基因,分别38]．豆科植物(Medicago Truncatula.），推定151名第450页确定基因，其中包括135个新颖第450页[39]．我们预计一旦基因组可用枫扎恩，一个更完整的全长列表第450页将建立基因。

我们使用这些预测的蛋白质特征分析(即分子量、细胞定位、功能)的结果与之前对P450蛋白的研究一致。p450通常固定在内质网的表面[40]，有些可能针对质体或线粒体[41]．动物的CYP锚定在线粒体上很常见，但植物的CYP具有线粒体定位尚未见报道[39]除了玉米，已经报道了3种CYPs(Zea Mays.) [42]．在我们的研究中F. Picrosperma.或者f . venosa没有推断出P450蛋白具有线粒体靶向肽。CYP74A1、CYP74B1、CYP74B2F. Picrosperma.和F. venosa.CYP726A4和CYP71B12F. Picrosperma.被发现在叶绿体中。在其他植物中，如Triticum Araraticum，Z.MaysCYP74和CYP701的所有成员都靶向于叶绿体[42]．

不同品种p450的多样性F. Picrosperma.和F. venosa.，和其他物种，很可能是导致其化学结构的差异，包括二萜[25]. 在迄今为止研究的所有植物物种中，最大的P450族是CYP71[21]．在植物进化过程中，这个家族的家系和亚家系发生了显著的分化，其中许多家系都参与了类黄酮和生物碱的次生代谢产物的生物合成[43]．同样，CYP71系列是最大的P450氏族枫扎恩（见图。2). 相反，两名CYP711代表来自F. Picrosperma.，但缺席f . venosa虽然CYP711已在其他植物物种中描述[23]. 在我们的系统发育树中，CYP74家族与CYP711家族相邻，表明枫扎恩CYP711还可以在奥氧化物和杂芳酮信号的代谢内起作用[23[植物中是否已被鉴定为植物中的分支抑制激素，并且几种CYP711已被实验证实为杂皮内酯生物合成酶[44那45]. 我们还发现F. venosa.有更多的CYP97基因相比F. Picrosperma.；CYP97家族参与类胡萝卜素的羟基化[46]．类胡萝卜素是一组广泛分布的颜料来自普遍存在的异戊二烯生物合成途径，并在植物初级和次生新陈代谢中发挥不同的作用。类胡萝卜素含有两种颜料，胡萝卜素和叶黄素，吸收和转移能量以保护叶绿素[37]．我们推测这可能部分解释为什么F. venosa.有较深的叶子相比F. Picrosperma.．

基于其他研究，与叶组织相比，P450生物合成基因在根组织中相对较高表达[25那47那48那49]．在我们的研究中，我们也发现了枫扎恩（F. Picrosperma.和F. venosa.）第450页基因在根组织中的表达量高于叶组织(见图。3.）．在根中显着更高表达的那些（N = 3) have been associated with fertility reduction (CYP78A), UV stress tolerance (CYP84A), gibberellin metabolism (CYP714A) and jasmonic acid metabolism (CYP74A) [50那51那52那53]．叶片中显着更高表达的那些包括先前与植物激素jasmonoyl-异亮氨酸的连续氧化步骤催化的那些用于分解代谢转换（CYP94），表达ABA 8'-羟化酶并影响ABA水平以控制种子休眠（CYP707A），类胡萝卜素（CYP97）的羟基化，芸苔类化合物生物合成途径（CYP85A）和葡糖苷代谢（CYP83）中的Castasterone的生物合成[40那46那54那55那56]．P450同源组织表达存在物种变异(见图。3.b).这可能是因为采集组织的植物生长发育阶段不同，p450参与调节植物激素代谢，生长发育，激素参与花、叶、茎和果实的形成和发育[57]．

二萜类化合物是高等植物中分布最广的次生代谢产物之一，是由碱性异戊二烯单元（C_5.H_8.)，并进一步被各种氧化还原酶、酰基转移酶、脱氢酶和糖基转移酶修饰[58]．P450依赖性氧化修饰对于Diterpenes的生物合成至关重要[58]．植物中形成的无数产品，其中二萜类化合物是最多样化的群体之一，由12,000多种代谢物组成[27]已经被证明是有价值的治疗药物[59]．我们的二萜类生物合成CYP71氏族成员的系统发育分析显示枫扎恩有代表在CYP71D和CYP726A。

全部F．短小精子二萜生物合成第450页基因在根组织中的表达量显著高于叶组织。基因的表达受植物发育阶段、环境条件、季节和日效应以及生物和非生物胁迫的影响[60]．因此，未来的研究应该探讨所识别的表达第450页在这些不同的情况下和在其他组织中的基因。在其他植物中，与叶和花相比，二萜生物合成P450基因在根组织中高表达[30]．尽管如此,枫扎恩CYP71D和CYP726A基因是涉及二萜类生物合成途径的优异候选者，特别是Sexoxy-Tigliane二萜酯的生物合成，其仅在物种中发现Fontainea,虽然需要进一步的实验来确认这一假设。它们的鉴定允许对其功能进行实验分析，例如，蛋白质的体外表达，然后进行基因表达检测，或者通过敲入和敲除可以完成。根据稳健的实验系统的可用性，这可以在体内进行基因表达检测。此外，高TT生产分析F. Picroserma.与低生产商相比，将提供关于可能调节TT生产的P450（和其他基因）的指导。

这项研究代表了理解角色的重要第一步第450页与二萜酯的生物合成相关的基因枫扎恩种代谢组学分析显示枫扎恩物种具有与其他植物物种不同的化学曲线。这至少可以部分地由独特的多样性解释第450页中发现的Fontainea。进一步的属内化学变异可能是由于第450页特别是那些被预测参与二萜代谢的基因(CYP71D1、CYP726A1和CYP726A2)，它们在根组织中的表达显著高于叶片组织。这些P450是强大的候选关键酶，需要生物合成具有重要意义的环氧-tigliane类二萜酯。

Tigilanol Tiglate分析的植物组织收集

收集根，叶，树皮和果组织样本F. Picrosperma.在阳光海岸大学种植的幼苗（USC，Sippy Downs）温室。植物在独立的盆中生长，并根据Mitu等人在环境温度和湿度下保持温室。[12.]．干燥(~ 150毫克)F. Picrosperma.用甲醇提取根，树皮，水果和叶组织，并使用标准HPLC-UV技术确认的TT的存在。简而言之，使用Agilent 1260 HPLC系统，在249nm，卤素RP酰胺2.7μm，150mM×4.6mm柱和乙腈/水溶性方案，将UV型材与使用TT制备的线性标准曲线进行比较（由生态生态学提供）在0.0003和0.3mg / ml之间。

代谢分析

新鲜成熟叶片F皮克罗斯佩玛，F。维诺萨，M。埃斯库伦塔，R。共产主义，S。圣女果和A.拟南芥采集自至少2株单株植物。树叶被清洗干净，然后放在密封袋里，在室温下的黑暗中放置2周。从0.1 g干燥的碎叶中加入3ml甲醇。在室温下进行超声提取1分钟，然后过滤到预先称重的20 mL硼硅酸盐玻璃闪烁瓶中。在相同条件下，用3ml甲醇再次提取残渣。滤液中的甲醇用日内瓦离心EZ-2蒸发器蒸发。干燥后的残渣在甲醇中重新生成1mg /mL的溶液，并在−20°C的黑暗中保存。分离是在配备有Kinetex C的ExionLC uHPLC系统(岛津)上进行的₁₈柱(2.1 × 150 mm, 100 Å)。柱室保持在40℃，自动进样器保持在15℃。流动相为0.1%甲酸水(v/v)(溶剂A)和0.1%甲酸乙腈(溶剂B)，流速为0.5 mL/min。线性梯度从2%的B溶剂0.1 min开始，增加到100%的B溶剂14.5 min，然后保持在这个水平1.4 min。启动条件在0.5 min内完成，再平衡3.5 min，导致总uHPLC运行时间为20 min。进样量为5 μL。配备正模式ESI源的X500R QTOF质谱仪(Sciex)由Sciex操作系统软件控制。幕气体、气体1、气体2分别设定在25psi、40psi和50psi。喷淋电压为5500 V，散射势为100 V，碰撞能为35 V。光谱数据记录在质量范围m/z公司100–1500 检察官。使用mzmine2（版本2.53）从LC-MS数据中提取MS离子，设置参数包括保留时间0.6–17.5 最小，保留时间公差为0.1 最小质量范围m/z公司100–1500 Da，质量公差为0.02 预处理的峰值表数据矩阵被提交到基于web的服务元分析中(https://www.metaboanalyst.ca/)，用于代谢组学数据分析。

用于转录组学的植物组织收集

F. Picrosperma.和F. venosa.幼苗是由生态生态学有限公司提供的，植物在USC（Sippy Downs）温室中生长。植物在独立的盆中生长，并根据Mitu等人在环境温度和湿度下保持温室。[12.]．在2 - 4年生的健康、充分展开的叶片和活跃生长的根尖，包括顶端分生组织和根冠被解剖(每个植株的单叶)和(1厘米²从每个物种的植物中的根部）并按照MITU等人描述的程序保留。[12.]．

RNA隔离

从12株~ 100 mg的叶片和根组织中分离到总RNAF. Picrosperma.和3个人F. venosa.使用Qiagen微型植物工具包(Hilden，德国)，根据制造商的协议。使用Nanodrop分光光度计2000c (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)在260和280 nm波长下测定RNA的初始收率和纯度，并进行琼脂糖凝胶电泳。使用安捷伦生物分析仪2100(安捷伦技术，美国)分析RNA完整性数(RIN)。高质量总RNA (RIN > 7)提供给Novogene(北京，中国)进行cDNA合成(cDNA快速文库制备试剂盒，Roche, Mannheim，德国)和Illumina HiSeq 2500对端测序(Illumina, San Diego, CA, USA)。

从头组装和功能注释

两个参考转录组文库是由两个单株植物样品f . picosperma和F. venosa.叶和根组织．使用FASTQC单独检查每个图书馆的原始读取质量[61]和Trimmomatic [62]. 不同RNA-seq文库的修剪读取F. Picrosperma.和F. venosa.在使用Trinity组装之前分别合并[63]，适用De Novo重建方法。使用内置的三位一体perl脚本评估组件的质量以生成N50值。使用Program Bowtie计算对准覆盖率[64]截止设定为70％。在组件之后，转频器用于预测开放阅读框（ORF），默认参数最小100个氨基酸长度。序列数据集可以在NCBI（NCBI;www.ncbi.nlm.nih.gov.)， SRA数据库注册号为PRJNA687112。组装后的蛋白序列分别用于NR蛋白数据库(NCBI非冗余蛋白序列)、Nt (NCBI非冗余核苷酸序列)、Swiss-Prot(人工注释和回顾的蛋白序列数据库)、KO (KEGG Ortholog数据库)和GO(基因本体)来识别假定的蛋白质功能，使用BLAST算法，e值截断值为10^− 5.[65]．

分类和表征枫香P450基因

一个集成的HMM搜索和互斥验证方法被用于识别假定的第450页基因家庭枫扎恩物种。P450家族HMM模型通过HMMER3使用[66]．过滤序列使用NCBI进一步喷射（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）随着截止的电子值10^− 5.．收集注释为P450成员的序列。使用ExPASy中的核苷酸序列手工鉴定全长P450蛋白[67)，基于陈等人。30]并在注释那些与任何与任何植物物种不匹配的那些序列后被丢弃。过滤后，检索所得对象的编码序列。最后，手动整合和纠正了这两种方法的结果。爆炸搜查F. Picrosperma.和F静脉瘤P450以前确定的814基因第450页来自4种不同植物物种的基因（A.拟南芥。共产主义。埃斯库伦塔，S。圣女果）是为了第450页基因分类。

所有的完整的第450页基因根据标准P450命名法命名[21]．简而言之，40,55和97％的序列同一性分别用作家庭，亚家族和等位基因变体的截止值。根据前一项研究[57]确定P450氏族的功能。我们还使用扩展工具计算其不稳定指数（ii）（https://web.expasy.org/protparam/)．使用expasy工具预测的每个全长P450蛋白的理论异构电点（PI）和分子量（KDA）评估调用P450s的物理化学特性（http://www.expasy.org/tools/)．肉汁值是用肉汁计算器(http://www.gravy-calculator.de/). 使用TargetP1.1服务器预测蜂窝位置，特异性> 0.95 (http://www.cbs.dtu.dk//服务/ TargetP /)。此外，通过Motif Elicitation (Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation, MEME)程序确认P450 Motif, Motif编号设置为10，其他参数均为默认值(http://alternate.memesuite．org /）[68]．从中收集P450蛋白序列F. Picrosperma，F.Venosa以及其他有合适基因组数据的物种:A.拟南芥。共产主义。埃斯库伦塔，S。圣女果．f . picrosperma。使用带有默认参数的遗传R111.0.2进行成对BLASTp比较。

P450的系统发育分析

一百零三(103)个全长基因F. Picrosperma.和123个基因F. venosa.用于系统发育表示枫扎恩物种．序列比对使用genies11.02软件执行ClustalW比对。利用FastTree和最大似然(ML)算法构建系统发育树。通过重新采样氨基酸位置1000次，评估每个分支的统计bootstrap支持。最大似然系统发生树和进化分析采用iTOL web服务器(https://itol.embl.de/) [69]．对于保守域识别，多序列比对全长枫扎恩物种蛋白序列使用ClustalX程序使用默认参数进行[70]．对齐文件已提交至网页徽标生成软件，以生成保存域的徽标，网址为(http://weblogo.berkeley.edu/) [71]．

相对第450页基因表达

从3个不同的叶子和根组织中提取总RNAF. Picrosperma.和F. venosa.使用来自QIAGEN®(Hilden, Germany)的RNAeasy植物提取试剂盒提取植物。12.]．表达水平第450页使用CLC基因组11.01软件包按照默认参数计算基因。rna测序数据的原始计数F. Picrosperma.和F. venosa.基因被标准化为每百万（TPM）的转录物。表达水平表示为叶子和根组织之间的转录物丰度的LOG2比率。接下来，我们为测序深度归一化读数计数生成Z分数。通过正常聚类分析了叶片和根组织中每种酶的表达。相对表达概况第450页用z-score和Clustvis (https://biit.cs.ut.ee/clustvis//) [72]，使用默认参数和层次聚类分析评估生物样本的亲缘关系。我们还鉴定了两者的同源序列枫扎恩物种（身份百分比92％）。另外的热爱图是用每个物种的3种不同植物的平均TPM值的Z分数构建．为了确定同源物序列的叶片和根组织之间的统计学意义差异，我们使用Microsoft Excel Software 2013进行学生T.-测试。值报告为来自三种不同植物的平均Z分数枫扎恩物种。显着差异：P. < 0.05.

二萜的系统发育和定量分析第450页

发现二萜第450页来自邻戟植物的成员的S基因从NCBI获得（NCBI;www.ncbi.nlm.nih.gov.），然后用来识别枫扎恩二萜第450页通过同源性的基因。使用鉴别的11.02软件在Clustalw对准之后使用鉴定的基因来构建系统发育树。使用最大似然法构建系统发育树，如上所述。对于定量分析，来自12的叶片和根组织的RNA-SEQ F. Picrosperma.个人使用。将高质量的清除reads与F. Picrosperma.按照默认设置使用CLC genomic workbench 11.01引用转录组。为了确定它们的基因表达值，如上所述计算了TPMs值，并用它们的平均TPM值创建了一个条形图。二萜类基因在小麦根和叶组织中的差异表达具有统计学意义F. Picrosperma.由学生决定t型-使用Microsoft Excel软件2013进行测试。数值报告为12个不同工厂的平均TPM值F. Picrosperma.．显着差异：P.< 0.01。

本研究中的原始序列数据已保存在公开访问的NCBI序列读取档案（SRA）数据库中，登记号为PRJNA687112。本文中生成和使用的所有数据都包含在附加图中1-4和其他文件2和3.．

P450酶:

细胞色素P450

EF1α：

伸长因子1-α

kDa公司：

kilodalton

GAPC：

甘油醛-3-磷酸脱氢酶1，细胞溶质

汤:

水病价值的盛大平均值

TT：

Tigilanol Tiglate.

TPM:

每百万成绩单

我们感谢阳光海岸大学的特雷西·麦克马洪提供的技术援助。我们也要感谢EcoBiotics有限公司提供的植物材料。

作者承认生态生态有限公司和阳光海岸大学的金融支持。

隶属关系

1. 阳光海岸大学基因生态研究中心，Maroochydore DC，昆士兰，4558，澳大利亚

   Shahida A. Mitu, Steven M. Ogbourne, Anne H. Klein, Trong D. Tran & Scott F. Cummins

2. 科学，技术与工程学院，阳光海岸大学，Maroochydore DC，昆士兰州，4558，澳大利亚

   Shahida A. Mitu，Steven M. Ogbourne，Anne H. Klein＆Scott F. Cummins

3. Ecobiotics Ltd，Yungaburra，昆士兰州，4884，澳大利亚

   保罗·w·Reddell

贡献

SAM进行实验，分析数据，写论文，准备数字和/或表格。AHK帮助进行转录组分析，TDT进行代谢组学分析。该项目的概念是由SMO、PWR和SFC提出的。所有作者都参与了手稿的起草和提交的版本的批准。

通讯作者

对应到斯科特F.康明斯．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

SAM，AHK，SFC和TDT声明没有竞争利益。PWR是Ecobiotics Ltd.和Qbiotics集团的股东和执行董事。SMO是Qbiotics集团的股东和非执行董事。

出版商的注意

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