针对植物和微生物之间有益共生的调节蛋白磷酸酶2a亚基GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

蛋白质磷酸酶2a（pp2a）表达对于植物和各种微生物之间的共生关联至关重要，并且对这些共生过程的知识对于可持续农业来说是重要的。在这里，我们测试了PP2A监管亚基的假设，尤其是GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba和GydF4y2BaB”θ,GydF4y2Ba参与植物与菌根真菌或植物生长促进细菌之间的信号传导。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

番茄植株的处理(GydF4y2BaSolanum lycopersicum）GydF4y2Ba随着植物生长的促进relizobacteria（PGPR）GydF4y2BaAzospirillum brasilenseGydF4y2Ba和GydF4y2Bapseudomonas simiae.GydF4y2Ba提示PP2A B ' θ亚基在PGPR应答中起作用。丛枝菌根真菌受影响GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba具有典型丛枝菌根的土壤植物的转录水平。在植物根中GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在所有经过测试的条件下稀缺，比所有其他PP2A亚单位转录物更低。在转化的番茄植物中增强10倍GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在蛭石生长的植物中，菌根化频率降低。此外,高GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba表达与脱落酸和赤霉酸响应有关，已知参与植物生长和菌根化。GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba过表达植株生长不旺盛，虽然果实大小正常，但与原始品种相比，每个果实的种子数减少了60%。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

表达式的GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba番茄根中的基因受益微生物的强烈影响。分析GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba过表达番茄植株和已建立的番茄品种证实了其功能GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在生长和发育中除起菌根作用外。GydF4y2Ba

植物被各种各样的有益和有害的微生物占据[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．植物生长促进的流动杆菌（PGPR）和丛枝菌根真菌（AMF）等有益微生物可以改善营养采集和吸水，并保护宿主免受病原体和非生物应激。已经研究了PGPR的效果多年来，经常使用的细菌模型物种是GydF4y2BaAzospirillum brasilenseGydF4y2Ba和GydF4y2Bapseudomonas simiae.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．GydF4y2BaA. Brasilense.GydF4y2Ba已在农业上有实际应用[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba[田间研究表明，某些假单胞菌菌株和丛枝菌根真菌可以提高在次优施肥条件下生长的番茄植物的产量和质量[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．菌根是植物和真菌之间的共生，早在4.6亿年前发展，可能对植物来说是殖民地的重要性。菌根对吸收营养，对干旱的耐受性很重要，并且对于改善对抗病原体的防御也可能是重要的。丛枝菌根（AM）是最常见的菌根类型，超过85％的土地植物物种可以形成丛枝菌根。植物和微生物之间的信号传导的机制，建立和坚持共生仍远未理解。GydF4y2Ba

蛋白质磷酸酶2a是植物中的主要蛋白质磷酸酶，并参与调节代谢，发育，应力反应和与微生物的相互作用[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．PP2A复合物由三个标准亚基组成，催化亚基(C)，脚手架亚基(a)和调节亚基(B)。在番茄中至少有5个假定的C亚基，3个A亚基和15个B亚基[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．对于不同基板和蜂窝定位的各种PP2A复合物对各种PP2A复合物具有大量的B亚基对[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]．PP2A参与微生物和植物共生是从与玉米致病菌的合作中的明显GydF4y2BaPantoea stewartiiGydF4y2Ba以及广泛寄主(包括番茄)的病原体GydF4y2BaPhytophtora capsiGydF4y2Ba因为这两种病原体都产生了通过与PP2A亚基相互作用而削弱植物防御能力的效应子[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]．在酵母双杂交筛选中GydF4y2BaP. Stewartii.GydF4y2Ba与玉米调控B’亚基互作，并与来自GydF4y2Bap . capsiGydF4y2Ba与脚手架的脚手架互动，来自胡椒的亚基，GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba种虫害和GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba．PP2A催化亚基在高等植物中分为两个分支，两个基因GydF4y2BaC1.GydF4y2Ba和GydF4y2BaC2.GydF4y2Ba在番茄（亚家草1）中形成一个疏水板。先前发现亚家族1涉及对番茄和马铃薯植物中的细菌治疗的反应。在番茄中，GydF4y2Ba假单胞菌含油GydF4y2Ba增强催化亚基的表达GydF4y2BaC1.GydF4y2Ba,在GydF4y2Ba尼古利娜·宾夕法尼亚州GydF4y2Ba沉默的亚家族的密切相关催化亚基显示，他们涉及防御反应[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]．在本研究中，我们将两个番茄亚家族1基因都纳入表达分析中。GydF4y2Ba

在评估一系列植物物种时，发现制造菌根的能力与拥有一个称为B ' φ的调控PP2A亚基有关[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]．B’φ演化枝非常古老，没有扩展，表明它参与了一些基本功能。的GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba除了一些使用的研究外，对演化支的研究并不多GydF4y2Ba紫花苜蓿GydF4y2Ba和GydF4y2BaM. Truncatula.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]，并且我们的知识没有关于番茄的研究GydF4y2BaB'φ。GydF4y2Ba基于上述工作，我们选择了GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba参与番茄菌根形成的候选基因。ABA和赤霉素(gibberellins, GA)等激素在番茄根系AM的形成中起重要作用[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]．ABA还参与诱导患有PP2A表达的诱导GydF4y2BaM. Truncatula.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]．由于ABA在AM的形成中起着重要作用，因此，在番茄生长过程中，ABA对AM的形成起着重要作用GydF4y2BaBβ(进化枝III)GydF4y2Ba基因作为aba诱导基因的同源物被包含在GydF4y2BaMedicagoGydF4y2Baspp。GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．在本研究中也测定了ABA和GA反应的报告基因的表达。在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba那GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba曾被发现参与对微生物治疗的反应[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]和它在番茄中最接近的同源物因此被包括在所有的表达实验中。为了阐明PP2A在植物-微生物共生中的生理功能，在蛭石或土壤中分别对番茄植株进行PGPR或AMF处理。在番茄(cv。亨氏)，也在亨氏品种转化为过度表达GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba并用于研究菌根定殖。GydF4y2Ba

表达式GydF4y2Bapp2a.GydF4y2Ba不同组织中的亚单位基因GydF4y2Ba

选择的表达水平GydF4y2Bapp2a.GydF4y2Ba亚单位基因和GydF4y2BaTAS14GydF4y2Ba作为ABA响应基因[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]如图所示。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．惊人，GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在所有被检测的组织中表达水平非常低，在一些组织中几乎检测不到。表达式GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba与组织类型的影响并不多，但与土壤生长的植物相比，蛭石种植植物中总是较低的，最低值是蛭石生长植物的根。的GydF4y2BaBβ(进化枝III)GydF4y2Ba基因在根中表达量最低，在叶中表达量最高，在花蕾中表达量中等，但与ABA报告基因无相关性。的GydF4y2BaC1.GydF4y2Ba基因在土壤和蛭石中的根部具有高度表达，但与蛭石生长的植物相比，土壤生长的叶子和芽和芽的叶子和芽。GydF4y2BaTAS14GydF4y2Ba与土壤相比，在蛭石中总是更高度表达，表明更多ABA或更高的蛭石种植植物敏感性。来自Sol Genetics数据库的公开表达分析[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]揭示了这些基因在根中的类似表达模式并叶GydF4y2BaS. lycopersicum.GydF4y2Ba幼苗，证实了非常低的GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在所有组织中（补充sGydF4y2Ba1GydF4y2Ba图。a，b）。GydF4y2Ba

PGPR处理的效果GydF4y2Ba

研究了在蛭石生长的植物根中，用三株PGPR、GydF4y2BaA. Brasilense.GydF4y2BaSP245，GydF4y2BaA. Brasilense.GydF4y2BaFAJ0009(生长素产生缺陷突变体)GydF4y2BaP. Simiae.GydF4y2BaWCS417R。接种后2小时将样品收获（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba治疗1周后表达略有增加GydF4y2BaP. Simiae.GydF4y2BaWCS417r，但与所有其他基因相比，仍是表达水平最低的基因(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bag)。类似的效果GydF4y2BaA. Brasilense.GydF4y2Ba生长素缺陷突变株FAJ0009GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba表达表明该基因的表达无关。最引人注目的结果是瞬时降低的表达GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba2 h和24 h后，细菌处理的根，特别是响应GydF4y2BaP. Simiae.GydF4y2BaWCS417r(无花果。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab).这种反应也不依赖生长素，因为GydF4y2BaA. Brasilense.GydF4y2Ba生长素缺乏的FAJ0009诱导的效应与野生型相似或更强GydF4y2BaA. Brasilense.GydF4y2Ba．GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba表达在1和3周后重新获得控制水平。为了GydF4y2BaBβ（思工i）GydF4y2Ba基因的表达在24 h后降低，但这种降低在很大程度上被细菌处理所阻止。3周后，对照植株与接种植株之间无显著差异(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac)。GydF4y2BaBβ(进化枝III)GydF4y2Ba细菌处理的植物表现出比对照更高的表达（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad）。表达式GydF4y2BaC1.GydF4y2Ba但在细菌处理过的植物中，这一现象被阻止了。GydF4y2Ba2GydF4y2Bae）。表达式的GydF4y2BaC2.GydF4y2Ba基因和ABA报告基因对任何细菌菌株的影响并不多（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baf, g)。GydF4y2Ba

在接种后三周测量鲜重的根和芽，并显示PGPR处理的植物的根部比对照植物更高的鲜重，但这仅针对WCS417R（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.这种效果与蟾蜍蛋白无关，因为与SUXIN缺陷的FAJ0009菌株的接种表现出相当较强但与SP245菌株相比，根生长的显着增加。GydF4y2Ba

AMF殖民化的影响GydF4y2Ba

在土壤和蛭石中用AMF接种番茄植物。由于菌根的建立是一种需要时间的过程，因此在种植和接种amf后3.5个月收获基因表达的样品。显微镜分析表明，生长培养基的类型强烈影响了AM形态。在土壤中种植的根，当根通过多于一个AMF物种的殖民化时通常会观察到典型的典型手术[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa).根在蛭石中形成泡状菌根(VM)(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab).在对照植株中未观察到AM。GydF4y2Ba

将筛选出的PP2A亚单位基因在AMF处理后的土壤和蛭石植物中进行检测。GA水平的报告基因，GydF4y2BaGAST1.GydF4y2Ba（GydF4y2BaGA刺激的转录物1GydF4y2Ba）被包含在分析中[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．GydF4y2BaPT4.GydF4y2Ba（GydF4y2Ba磷酸盐转运蛋白4GydF4y2Ba)作为菌根诱导的无机磷酸盐转运载体的报告基因，是AM共生的标记[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba]．的GydF4y2BaPT4.GydF4y2Ba在与AM形成一致的土壤生长植物中加入116％后，基因对基因进行上调（图。GydF4y2Ba5AGydF4y2Ba）.蛭石种植植物中的上调仅为30％，这可以通过形成Vm而不是am的形成来解释。GydF4y2BaTAS14GydF4y2Ba如前所述，在蛭石中生长的植物的表达高于在土壤中生长的植物(Figs。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba,GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.amf接种后，GydF4y2BaTAS14GydF4y2Ba保持不变，而数据表明GydF4y2Ba使惊讶GydF4y2Ba，表明ABA / GA比值发生变化，有利于菌根形成[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．这些实验证实了GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba是GydF4y2Bapp2a.GydF4y2Ba基因以最低水平表达，在蛭石生长的植物中值特别低(fig。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba,GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.的表达GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba没有受AMF的影响。的表达GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba与土壤相比，在蛭石中生长的对照植物中的根部显着降低（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）与先前的实验一致（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa, d).引人注目的是，对于PGPR治疗，GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba受到amf治疗的下调，但仅在土壤种植的植物中，控制植物具有高水平的GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba成绩单(无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一个)。GydF4y2BaBβ(进化枝III)GydF4y2Ba在土壤中被上调了，然而GydF4y2BaBα(进化枝我)GydF4y2Ba在amf处理后的蛭石中含量上调。GydF4y2BaC1.GydF4y2Ba土壤和蛭石对AMF的响应也不同。GydF4y2BaC2.GydF4y2Ba不受AMF处理的影响。GydF4y2Ba

B'φ.GydF4y2Ba过度表达植物GydF4y2Ba

改变植物的过度表达GydF4y2BaBφφ(BGydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba）GydF4y2Ba与原始基因型(WT)相比，第1周的生长没有差异(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一个)。reafter, differences became visible, and theB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba与未转化植株相比，植株的生长较弱(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab，c）。在8周龄GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba嫩枝鲜重和根鲜重分别降低了66和70%(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad）。根长在原始基因型中类似和GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba，但叶片数量，茎高度和茎厚度降低GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba．尽管果实重量相近，但每个果实的种子数量减少了60%。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bae）。GydF4y2Ba

研究菌根定殖、WT和GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba(F0, F1)接种于土壤和蛭石中。在添加AMF 3.5个月后评估根系中AM的频率，由于定殖率低，土壤植物在8.5个月后再次评估(图2)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba一种）。在wt和wt之间没有发现殖民化频率的显着差异GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba在土壤(无花果。GydF4y2Ba7.GydF4y2Baa).蛭石植物的定殖频率高于土壤植物，且较高的定殖频率与ABA水平呈正相关，与ABA水平呈负相关GydF4y2Bapp2a.GydF4y2Ba尤其是表达式GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba和GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.WT和GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba在三个不同的实验中GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba后代F0和F1。平均地定子频率降低约50％GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

基因表达GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba

表达水平GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba正如所预期的那样，更高GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba比在WT中，高约10倍（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.表达的GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba刺激的表达GydF4y2BaBβ.GydF4y2Ba(枝I)基因在未处理AMF和处理后的根中表达量均增加了55%(图1)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.对于其他PP2A亚基基因，WT和GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba．表达的GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba导致ABA报告基因的表达减少，GydF4y2BaTAS14GydF4y2Ba和GydF4y2Ba数控GydF4y2Ba，和GA报告基因GydF4y2BaGAST1.GydF4y2Ba．这强烈表明GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba对番茄根中的ABA / GA激素平衡进行调节是重要的。这些植物的较低ABA反应与AMF的较少定植吻合一致。GydF4y2Ba

激素响应报告基因和PP2AGydF4y2Ba

ABA报告基因GydF4y2BaTAS14GydF4y2Ba三株PGPR菌株处理番茄根后表达量几乎没有变化(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.另一方面，报告基因表明ABA水平显著降低GydF4y2BaB'φ.GydF4y2BaAMF处理过表达植株与番茄原基因型的比较(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.的GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba植物中GA报告基因的表达也较低。可见，本构性高表达GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba干扰了番茄根系的激素作用。GydF4y2Ba

RGPR和AMF调控B '的表达GydF4y2Ba

细菌或amf治疗似乎秉承了一些PP2A基因的高表达，但对其他基因的活性降低，并且发现PP2A监管亚基的最有趣结果GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba和GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba．的GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba基因通过细菌处理后瞬时下调2和24小时，基因显示出醒目的反应（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.所有三种细菌菌株使用，GydF4y2BaP. Simiae.GydF4y2Ba(WCS417r),GydF4y2BaA. Brasilense.GydF4y2BaSp245,GydF4y2BaA. Brasilense.GydF4y2BaFAJ0009触发了in的瞬时下降GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba表达式。最强烈的效果是由GydF4y2BaP. Simiae.GydF4y2Ba，并且对PGPR中的生长素缺乏造成难以置信。有趣的是，患有AMF的土壤种植的植物也表现出低表达水平GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa），表明下调GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba参与植物与amf的相互作用。然而，不能排除添加AMF也可能刺激了PGPR在土壤中的生长，这在下一轮将会受到影响GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba表达式。这项研究表明GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba参与了形态的变化以及与植物，AMF和天然土壤细菌之间发生的复杂串扰相关的根殖民频率。AMF接种抑制GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba仅在土壤生长的植物(有原生细菌存在)中表达，而在蛭石生长的植物中不表达，而且只有土壤生长的植物显示典型的丛枝形式，通常在根被一个以上的AMF种定植时观察到[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]．的重要作用GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba也得到了观察的支持GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba下调与广泛应用的AM定殖标记基因上调有关GydF4y2BaPT4.GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa).较低的基底表达水平GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba与土壤相比，在蛭石中的植物中可能导致蛭石种植植物中观察到的含量较高的殖民化频率（凹凸菌疹）。以前的工作指出了GydF4y2Ba拟南芥b'θ.GydF4y2Ba它的两个最密切相关的基因参与了生物反应[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．目前的结果证实了这一点GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba在植物微生物相互作用中起着重要作用，在这里特别指出植物生长促进微生物的效果。在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba植物被淘汰GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba，增殖致病GydF4y2Ba假单胞菌含油GydF4y2Ba相对野生型植物减少[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．防止病原体扩散的防御反应，实施降低表达GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba可能是对植物存活的有用反应，并通过PGPR和AMF诱导。GydF4y2Ba

B'φ.GydF4y2Ba表达和表型GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba过度表达植物GydF4y2Ba

来自表达分析的最突出的结果GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba基因在所有组织和所有生长条件下的表达水平都很低(fig。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba图),S1。最初我们尝试用人工microRNA敲除番茄植株，实现基因沉默。然而，与之相反的是在GydF4y2BaMedicagoGydF4y2Ba仕达屋优先计划GydF4y2Ba．GydF4y2Ba[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba，数量GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba番茄中的转录物非常低。因此，选择淘汰/向下植物似乎不合理，技术上难以进一步验证。我们决定使改变的植物过度表达GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba基因获得有关该基因的功能的信息。血胸植物具有具有较小叶片的特征表型，茎厚度降低，根部减少，射击鲜重，并且每个果实差的种子套装（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.这种变化可能反映出改变的激素水平，ABA报告基因和GA报告基因都被下调GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba过度型植物（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.观察到的表型可以至少部分地由低GA水平解释[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]．菌根形成以前与增强的ABA水平有关[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]．表达的GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba似乎抑制了AM的形成(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)，这可能与激素报告基因显示的根系ABA水平降低和激素平衡紊乱有关(图2)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.本文的研究结果强化了这一观点GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba对AM的形成有调节作用。本工作还指出了GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在生长和发展中。太阳数据库[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]证实其表达水平极低GydF4y2BaB’φ在番茄红素中的表达GydF4y2Ba；根中未检测到或表达量极低GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba大约是美国的500倍GydF4y2BaC1.GydF4y2Ba表达水平(图S1a)。在Sol数据库中，低级别的GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba成绩单也被报告GydF4y2Ba美国pimpinellifolium。GydF4y2Ba有趣的例外是在果实发育早期(花期后0-4天)，用激光捕获显微解剖卵巢和果实组织，结合高通量RNA测序[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba)(图就是S1c)。在胚珠内(第0天)，GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba表达是三分之一GydF4y2BaC1.GydF4y2Ba比其他的都高GydF4y2BaB'GydF4y2Ba亚基（GydF4y2BaB'θ，B'κ，B'α，BβGydF4y2Ba-Clade i）（图S1C）。这表明了GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba可能在早期果实开发中具有功能，因此也形成种子。考虑到这一点GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在早期果实发育中有作用，异位表达水平很高GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba(图2)GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba)，可能会扭曲种子的形成(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.一起携带表型观察，我们的表达数据和公开的表达数据支持GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在种子形成外，除了在菌根形成中的作用。GydF4y2Ba

三种施用的细菌强烈，瞬时肿胀，降低了PP2A调节亚基的表达GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba，指向该基因在植物 - PGPR相互作用中的作用。GydF4y2Ba

一起工作GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba之前曾指出，低GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba表达比野生型更能抵抗病原体GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba．在对番茄的进一步研究中，设计和试验转基因植物将是很有趣的GydF4y2BaB'θ.GydF4y2Ba表达调查这种变化是否可以改善番茄中的病原体抗性。分析对GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba过度表达植物和原始品种证实了更广泛的功能GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在生长和发育中除起菌根作用外。PP2A的高表达GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba亚基基因减少了植物活力，显着降低了每种水果种子的数量，并干扰了菌根化。在进一步的工作中，应进一步鉴定PP2A相互作用蛋白（衬底），并进一步探索PP2A在微生物识别中的累积，与建立和维护共生。表达式GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在更具体的组织中，和研究的作用GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba在生殖发展的早期阶段就应该进行。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

种子GydF4y2Ba茄属植物lycopersicumGydF4y2Ba简历。Heinz 1706-BG (LA4345)从加州大学戴维斯分校番茄遗传资源中心(TGRC)获得。GydF4y2Bahttp://tgrc.ucdavis.eduGydF4y2Ba）.转基因植物过度表达GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba由Heinz品种的幼杆子产生使用GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba介导的转化。GydF4y2Ba

不同植物器官中基因表达分析的标准生长条件GydF4y2Ba

番茄植株生长在0.5 L的花盆中(75%盆栽土壤和25%蛭石)或双层蒸压蛭石中，0.4 L品红盒子(底部刺穿)，在22°C条件下，光照16 h /黑暗8 h。所有的植物都用霍格兰溶液[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]在播种含Macronourrients：1 mm khGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba阿宝GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba， 5毫米KNOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba5 mM Ca (NOGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba）GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba， 2 mM MgSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba和微量营养素：2.6 mg / l hGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba博GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba， 1.81 mg/L氯化锰GydF4y2Ba_2GydF4y2Bax4HGydF4y2Ba_2GydF4y2Bao，0.089 mg / l cusoGydF4y2Ba_4.GydF4y2Bax5HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba0.22 mg/L ZnSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Bax7HGydF4y2Ba_2GydF4y2Bao，0.029 mg / l hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaMoo.GydF4y2Ba_4.GydF4y2Bax1HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.由荧光灯提供照明(欧司朗L58W/77)。每周用自来水浇灌植物，每月用霍格兰溶液浇灌(只有蛭石)。将5 - 12mm的根组织、嫩叶和花芽在液氮中快速冷冻，在−80℃保存。然后样品在液氮中均质，并提取RNA。GydF4y2Ba

PGPR试验的植物生长条件GydF4y2Ba

在16小时光/ 8小时黑暗方案的人造光下，在22°C下，在0.4L洋红色糊状物中生长在0.4L洋红色盒中，在22°C下。在播种后的第41天，当植物获得足够的根肿块时，将50mL悬浮在10mM MgSO中的50ml细菌中接种同样发育的植物GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba， 5 × 10GydF4y2Ba^7.GydF4y2Ba细胞/毫升GydF4y2BaAzospirillum.GydF4y2Ba2.5 × 10株GydF4y2Ba^5.GydF4y2Ba细胞/毫升GydF4y2BaP. Simiae.GydF4y2BaWCS417R。给予控制植物10 mm mgsoGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba只要。接种后，将根组织收获2小时，24小时，1周和3周。GydF4y2Ba

植物促生菌株(PGPR)、生长与接种GydF4y2Ba

使用了三种菌株:GydF4y2BaAzospirillum brasilenseGydF4y2BaSP245野生型菌株[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]，其IPDC-POLKETOUT MUTANT FAJ0009（SP245 IPDC :: TN5）在疾病生物合成中受损[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Bapseudomonas simiae.GydF4y2Ba(原GydF4y2Ba荧光假单胞菌GydF4y2Ba) WCS417r，一种利福平耐药菌株GydF4y2Bapseudomonas simiae.GydF4y2BaWCS417原分离自巴西种植的小麦根际[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]．对番茄接种,GydF4y2BaP. Simiae.GydF4y2BaWCS417R在B王B中培养[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]50μg/ ml利福平在28℃下过夜。菌落在10ml 10 mm mgso中松散GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba，收集于15ml Falcon试管中，4000g离心5分钟，随后洗涤2次，将颗粒重悬于新鲜的10mm MgSO中GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba达到适当的浓度[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]．GydF4y2BaAzospirillum.GydF4y2Ba在37℃下培养菌株，在补充2.5mM CaCl的LB琼脂上培养48小时GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba2.5 mM MgSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba．对于FaJ0009，加入50μg/ ml卡那霉素。菌落用于在补充含有2.5mm CaCl的5ml LB肉汤中产生过夜培养物GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，2.5 mm mgsoGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba在37°C以180rpm摇动过夜。过夜培养（0.1mL）在50ml适当补充的LB肉汤中转移，并在相同条件下孵育。第二天，将细菌沉淀并重新悬浮在10 mm mgso中GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba到用于接种的浓度。GydF4y2Ba

植物生长条件适用于AMF实验GydF4y2Ba

AMF的接种是从商业名称“rootgrow”（Plantworks Ltd.，Seathbourne，UK）的粒状制剂中获得，其中包含孢子，菌丝和根部片段殖民的繁殖GydF4y2BaFunneliformis mossaeaeGydF4y2Ba那GydF4y2Baf . geosporusGydF4y2Ba那GydF4y2Ba黑穗病球囊，微聚集球囊，不规则叶蝉GydF4y2Ba[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．在每个盆/品红盒的种植孔中加入1.5 mL的Rootgrow颗粒，在播种番茄种子或播种幼苗前覆盖薄层土壤或蛭石。对照植物生长培养基中不添加颗粒(土壤)或三蒸压颗粒(蛭石)。植株在22°C条件下生长，光照16 h /黑暗8 h(土壤)或光照12 h /黑暗12 h(蛭石)方案，每周用自来水(土壤)或霍格兰溶液(蛭石)(磷酸盐浓度降低10倍(0.1 mM PO)GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba^3-GydF4y2Ba)，至少持续七周或直到植物显示出严重缺磷的迹象。此后，每周用常规的霍格兰浇水(土壤和蛭石)。收割前两周，这些植物只用自来水浇灌。GydF4y2Ba

明视野显微镜下的样品制备GydF4y2Ba

用自来水洗涤根，在10％KOH中煮沸1分钟，在室温下留在溶液中过夜。然后用自来水冲洗根部并浸入3.7％的盐酸溶液中2-3分钟。除去酸溶液后，加入染色溶液。染色溶液由1体积的：25％苯酚，25％乳酸，25％甘油，25％的4mg / ml台盼蓝储备溶液，加上两体积的95％乙醇[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]．将根组织置于EPPendorf管中，覆盖着染色溶液，并在沸水浴中加热1分钟，随后在室温下在振荡器上孵育4-16小时。除去染色溶液后，用脱水溶液（2.5g / ml水合物）覆盖根部[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]，室温孵育6h后更换新液，孵育过夜。在用70%的甘油覆盖根之前，去除去渍液。在10倍和100倍光学显微镜下观察AM结构，如孢子、囊泡和丛枝。AMF定殖频率(F%)计算为具有AM结构的根片段的百分比。GydF4y2Ba

质粒构建体和农杆菌制剂GydF4y2Ba

产生转基因植物过度表达GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba，全长DNA序列（1494 bp）GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba基因(NCBI参考序列:LOC101256045)在Xhol/SpeI位点克隆到pBA002二元载体[GydF4y2Ba40.GydF4y2Ba使用侧翼引物GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba:正向引物(5 ' - tagcactcgagatgacaaatttttcttgat TCTGAGACAG-3 ')和B ' φ:反向引物(5 ' -CCACTAGTTCACATTGCTG cattttttttttccc -3 ')。pBA002质粒含有花椰菜花叶病毒35S启动子，该启动子构成驱动转基因在所有植物组织中的高水平表达[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]．pBA002质粒还具有在细菌中选择大光霉素的抗性和在植物中选择除草剂磷霉素(BASTA)的抗性。生成转基因GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba将pBA002-B’φ质粒转入植物的ABI-1菌株GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2Ba通过冻融程序[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2BaABI-1菌株，众所周知的GV3101菌株的衍生物（PMP90RK）[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba，由挪威UiS Amr Ramzy Abass Kataya博士好心提供。转化前分别接种含50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL大光霉素的LB肉汤5 mLGydF4y2Ba农GydF4y2Ba并在28℃下在振荡器上在200rpm孵育两天，然后在100ml LB肉汤中培养1ml含有相同的抗生素并在相同条件下孵育约24小时，直至ODGydF4y2Ba_600GydF4y2Ba达到1。将细菌颗粒化，在MS液体培养基中重悬[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba] ODGydF4y2Ba_600GydF4y2Ba= 0.2 (GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba并用于番茄的转化。GydF4y2Ba

植物组织和转化GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba

番茄种子用75％乙醇的表面灭菌，1分钟，15％过氧化氢15分钟，用水冲洗，在MS培养基上发芽（4.3g / L ms盐（Sigma-Aldrice，USA），3％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.8）并在22℃下培养16小时/ 8小时黑暗方案20天或直至子叶完全打开。将转化前三天将下杆基切成7-10mm的外植体并置于预培养基培养基（MS Salts，3％蔗糖，维生素，0.5mg / L吲哚-3-乙酸（IAA），1mg / L苄基氨基嘌呤（BAP），0.7％琼脂，pH 5.8）[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]，在27°C暗箱中孵育72小时[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]．对于转化，所有的外植体都沉浸在GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba在室温下悬浮和摇动20分钟，呈涂干燥并转移到共培养介质（MS盐，维生素，3％蔗糖，0.7％琼脂，0.5mg / L Iaa和1mg / L Bap）中并孵育室温下的天在黑暗中[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]．外植体被放置在拍摄诱导培养基(MS盐、维生素、3%蔗糖、0.7%的琼脂,250 mg / L头孢噻肟,250 mg / L羧苄青霉素,10 mg / L BASTA 0.5 mg / L IAA和软面包卷2 mg / L)为进一步培养22°C 16 h光周期为90天,亚文化每30天新鲜培养基。产生抗basta愈伤组织的外植体产生了芽。从愈伤组织上取芽，转移到根诱导培养基(MS盐、维生素、3%蔗糖、0.7%琼脂、250 mg/L头孢噻肟、250 mg/L卡苄西林、0.5 mg/L IAA、10 mg/L BASTA)中培养30 d。利用Phire®Plant Direct PCR Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)对番茄外植体培养的植株进行基因分型，并将其转移到蛭石或土壤中进一步生长。从外植体中获得的转化植株被认为是FGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba后代的GydF4y2BaB'φ.GydF4y2Ba_牛GydF4y2Ba．F转基因系GydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba和FGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba使用后代进行进一步分析。GydF4y2Ba

半定量RT-PCR分析GydF4y2Ba

使用RNEasy®植物迷你试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）和CDNA使用Superscript™Vilo TM cDNA合成试剂盒（Invitrogen由Thermo Fisher Scientific，USA）制成CDNA的总RNA。使用Dreamtaq DNA聚合酶试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Vilnius，立陶宛），在10μL反应中进行聚合酶链反应（PCR）。将PCR产物在琼脂糖凝胶上分离并使用Bio-rad Image-Lab 6.0软件定量。三种植物的平均频段强度用于计算转录水平。转录物水平的相对定量基于关于参考基因的靶基因带密度的标准化GydF4y2Baactin41.GydF4y2Ba．半定量RT-PCR的底漆序列列于补充表中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

使用Excel统计包（版本Microsoft 385）或使用IBM SPSS统计信息26使用Tue-Wate Anova进行Tue-Wate Anova来分析数据。GydF4y2Ba

所有使用的数据都可以在文章和支持信息中找到。GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

本研究由挪威研究理事会(Norges forskningsad)支持，是Bionaer项目(Biofresh项目no 255613/E50)的一部分。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. IKBM，斯塔万格大学，4036，Stavanger，挪威斯塔万格，史科学和环境工程系GydF4y2Ba

   Irina O. Averkina, Muhammad Harris, Edward Ohene Asare, Berenice Hourdin & catherine LilloGydF4y2Ba

2. 挪威生命科学大学兽医学院，1433，Ås，挪威GydF4y2Ba

   穆罕默德•哈里斯GydF4y2Ba

3. NIBIO，挪威生物经济研究所，粮食生产和社会部门，挪威，邮政信箱115,NO-1431， ÅsGydF4y2Ba

   伊万·a . PaponovGydF4y2Ba

4. 目前地址:丹麦奥胡斯8200奥胡斯大学食品科学系GydF4y2Ba

   伊万·a . PaponovGydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

i.o.a.，i.a.p.和C.L.并构思和设计了实验。I.O.A.，M.H.，E.O.A.，B.H.进行实验。i.o.a.和C.L.起草了稿件。i.o.a.，i.a.p.和C.L. edited the manuscript. The author(s) read and approved the final manuscript.

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2BaCathrine Lillo.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

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