RcTGA1和硫代葡萄糖苷生物合成途径gydF4y2Ba参与堕落对抗病症的真菌的辩护gydF4y2Ba葡萄孢菌gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

玫瑰是重要的园艺经济作物。但其田间生长发育和采后品质受到灰霉病的影响gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba然而，目前尚不清楚玫瑰是如何抵御这种真菌病原体的。在这里，我们使用转录组学、代谢组学和VIGS分析来探索耐药的机制gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，蛋白质活性分析表明，防御酶的活性在受感染的植物中显著增加。植株感染0 h、36 h、60 h和72 h的RNA-Seq共产生54 GB的clean reads。其中，CK与T36、CK与T60、CK与T72的差异表达基因(DEGs)分别为3990、5995和8683个。基因注释和聚类分析揭示了多种防御反应gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba主要包括抗性(R)蛋白、MAPK级联反应、植物激素信号转导途径、植物-病原互作途径、CagydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}和抗病相关基因。QPCR验证显示转录组数据的可靠性。PTRV2-RCTGA1感染的植物材料显示出玫瑰易感性改善gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba所有样品共检测到635种代谢物，可分为29组。代谢组数据显示，T36、T60和T72共获得59、78和74个dem (T36:gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba接种玫瑰花36 h;T60:gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba接种玫瑰花60 h;T72:gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba接种玫瑰花72 h)，与CK比较。许多次级代谢物与生物抗病有关，包括单宁酸、氨基酸及其衍生物和生物碱等;它们在苯丙类生物合成、硫代葡萄糖苷和其他抗病途径中显著增加和富集。本研究为抗病新品种的选育提供了理论依据gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

通过RNA-Seq生成了54 GB的clean reads。R蛋白，ROS信号，CagydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}Old Blush反应中激活的信号通路、MAPK信号通路和SA信号通路gydF4y2Ba葡萄孢属c。RcTGA1gydF4y2Ba正向调节玫瑰抗性gydF4y2Bac葡萄孢属gydF4y2Ba．在所有样品中检测到总共635个代谢物。DEM富含苯丙烷化生物合成，葡糖苷和其他抗病途径。gydF4y2Ba

玫瑰是世界四大切花之一，具有很高的观赏价值和经济价值。黑斑病、蚜虫、灰霉病和害虫是影响玫瑰生产的三大病害。灰霉病主要发生在玫瑰花期后期或采后。这将导致减产约15% ~ 40%，而采后腐败将导致减产玫瑰市场严重的经济损失。gydF4y2Ba

玫瑰灰霉病是由gydF4y2Ba葡萄孢菌gydF4y2Ba，属于gydF4y2Basclerotinia.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba1gydF4y2Ba那gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba是一种典型的病症致病性真菌，通过调节程序化死亡途径而感染宿主细胞[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．它通常在早期感染植物组织，并停留很长时间。当环境适宜或寄主生理发生变化时，就会突然爆发，导致植物组织的恶化和腐烂。化学方法主要用于控制gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba如咪唑，二氨基酰亚胺和苯胺嘧啶。然而，由于长期使用化学药物，gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba已经为他们制定了宽容。效果越差，药物剂量越大。它不仅提高了经济成本，而且加剧了环境污染。因此，迫切需要找到一种有效的方法来提高中国玫瑰到真菌的抗性。gydF4y2Ba

随着生物技术的发展，许多植物的全基因组测序已经完成，并被用于研究植物的生长、环境互作和代谢等。近年来，转录组学和代谢组学已被用于探索植物病虫害的防御机制，如茶叶、玉米和芝麻[gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba，为探索玫瑰抗性机制提供了新的思路和方法gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba感染。gydF4y2Ba

植物有复杂的防御机制gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba，包括MAPK级联反应、植物激素信号转导途径、cAMP信号通路[gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba]．沉默MAPK-WRKY转录因子基因增加了烟草对大豆的敏感性gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba，表明MAPK级联反应参与了烟草对真菌的免疫应答[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba]．MPK3和MPK6可以增强拟南芥的阻力gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba通过诱导表达的gydF4y2Baglip1gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba]．lu等。确定gydF4y2BabZIPgydF4y2Ba从草莓全基因组中发现转录因子的表达gydF4y2BaFvbZIP46gydF4y2Ba明显增加gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba瞬态过表达和基因沉默gydF4y2BaFvbZIP46gydF4y2Ba表示,gydF4y2BaFvbZIP46gydF4y2Ba参与了草莓防御gydF4y2Bac葡萄孢属gydF4y2Ba［gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．植物激素信号和转录因子在植物抵抗力中发挥着重要作用gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba感染。Hu等发现外源施用n -癸酰-高丝氨酸内酯增强了番茄的抗性gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba通过激活番茄JA的生物合成和信号转导[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．Liu等发现感染后BR信号转导通路相关基因上调gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba，外源BR增强其防御反应gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba，表明BR参与了玫瑰的抗性gydF4y2Bac葡萄孢属gydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba). .外源2,4-表油菜素内酯提高了葡萄的抗性gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba通过抑制芽孢的萌发gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba增强葡萄果实的致敏机制[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba那gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．此外，一些microrna也参与植物防御gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2BaNie等发现过表达的miR825和miR825 *提高了拟南芥的易感性gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba相比之下，沉默的miR825和miR825 *增强了拟南芥的抵抗力gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba，表明MiR825和MiR825 *在拟南芥防御中发挥负面监管作用gydF4y2Bac葡萄孢属gydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

探索玫瑰的防御机制gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba， Old Blush被用作实验材料，整个基因组于2018年发表(gydF4y2Bahttps://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/gydF4y2Ba)．本研究测定了侵染植物的抗氧化酶活性gydF4y2Bac葡萄孢属gydF4y2Ba．然后组合转录组和代谢组分分析以比较CK和不同感染时间点之间的基因表达和代谢物谱（T36，T60，T72）。这些数据为未来的玫瑰抗性育种对灰色模具提供了重要信息。gydF4y2Ba

的影响gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba老红豆的表型和生物化学gydF4y2Ba

我们观察并记录了旧腮红的表型变化，以调查效果gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba旧腮红生长的感染。在接种24小时后，该花瓣发育了典型的疾病斑点，这在一个接种后72小时后继续形成明显的坏死症状。相比之下，在用模拟对照处理的对照花瓣中未观察到这种致病反应（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).在长期的进化过程中，植物形成了复杂的生化和生理机制来适应和抵抗各种致病菌。PPO、Glu和CHT在植物抗微生物侵染中起重要作用。因此，我们用酶学方法检测PPO、GLU和CHT是否对其有反应gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba感染。结果表明，这些酶的活性在不同处理间存在显著差异。36 h、60 h、72 h叶片的CHT活性分别提高了26.13、51.35和55.86%;PPO活性在36、60、72 h分别提高了5.72、41.87和59.66%;在36、60、72 h，谷氨酸活性分别增加78.65、86.86和88.92%。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab）。这些数据表明，旧腮红的防御系统响应于gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba感染。gydF4y2Ba

转录组学分析综述gydF4y2Ba

要了解基因表达的差异gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba-感染的花瓣和假花瓣，我们接下来进行了RNA-Seq分析。从12个生物样本中，包括9个感染样本和3个对照样本，总共产生了大约54 GB的clean reads。原始读的Q20平均值为95.88%，说明读的质量高。大约82%的reads被定位到通过Trinity剪接获得的参考基因组序列上。获得与Old脸红反应相关的基因表达谱的全面视图gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba感染后，我们使用DESeq2鉴定DEGs。根据FDR < 0.05和|log2FC| > 1的过滤参数，在CK-VS-T36、CK-VS-T60和CK-VS-T72中分别发现3990(2349上调，1641下调)、5995(3621上调，2374下调)和8683(4164上调，4518下调)基因的表达差异显著。此外，T36与T60、T60与T72、T36与T72比较发现529、6803和6244个DEGs(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

了解与之相关的deg的功能gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba感染时，用GOseq注释这些deg。这一注释导致了三个主要类别:生物过程、细胞成分和分子功能。大多数deg在“对外界刺激的反应”、“对外界刺激的反应”、“对外界生物刺激的反应”、“对压力的反应”、“次级代谢过程”、“类黄酮代谢过程”和其他功能类别中富集(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, b, c)。结果表明gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba感染激活了玫瑰的抵抗力。gydF4y2Ba

为了更好地理解由gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba通过京都基因和基因组百科全书(KEGG)对DEGs进行富集分析。在CK和T36文库中，有728个DEGs分布在127条KEGG通路上。在CK和T60文库中，有1102个DEGs被分配到130个KEGG途径。在CK和T72文库中，有1607个DEGs被分配到134个KEGG途径。在这些基因中，涉及“代谢途径”的基因最为丰富，其次是涉及“次生代谢产物生物合成”的基因。在“MAPK信号通路—植物”、“苯丙素生物合成”、“植物激素信号转导”和“谷胱甘肽代谢”中涉及了一些重要的抗病途径(图1)。gydF4y2Ba4.gydF4y2BaA，B，C）。该结果表明，感染后，在玫瑰中激活了一系列电阻途径gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

以了解差异基因表达的动态gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba感染，短时间序列表达矿工进行了不同时期表达模式的12,842次参数分析。通过该分析，四个时段的所有DEG的表达动态可以聚集成20个表达模式，其中10,334次显示7个显着的聚类模式（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。与0 h相比，整个感染过程中有3种下调表达模式(模式0、9、2)和4种上调表达模式(模式19、16、10、17)。其中，模式9和模式0的下调基因数量大于模式3。模式17和19的上调基因数量大于模式16和10的上调基因数量(图17和19)。gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

表达途径最多的下调基因是“代谢途径”和“次生代谢物的生物合成”。这还包括“淀粉和蔗糖代谢”、“卟啉和叶绿素代谢”、“光合作用”、“乙醛酸和二羧酸盐代谢”、“脂肪酸生物合成”和其他植物发育过程(图1)。gydF4y2Ba5.gydF4y2Bac).这些代谢途径主要参与植物的初级代谢，说明感染后参与初级代谢的基因表达减少，初级代谢过程减弱gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

相比之下，除了代谢途径、次生代谢产物的生物合成、苯丙素生物合成、植物病原体相互作用、MAPK信号通路-植物、植物激素信号转导、α -亚麻酸代谢、“谷胱甘肽代谢”和“单萜类生物合成”(图。gydF4y2Ba5.gydF4y2Bab）。这些代谢途径主要涉及植物的次生代谢，表明参与次级代谢物合成的基因的表达增加以提高玫瑰的抗性gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba综上所述，上述统计结果表明，玫瑰开始了自己的防御机制，以回应gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba通过平衡初级和次级代谢来缓解压力。gydF4y2Ba

开发了Deg Suplusters的热量，以更好地理解与旧腮红的抗性相关的关键次数gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba得到的热量显示植物 - 病原体相互作用的次数。基于它们的功能注释，这些基因包括2个突出的免疫（PTI）基因，3 r基因，1个反应性氧物质（ROS）代谢途径基因，4个钙调蛋白基因，3个钙结合蛋白基因，6例催乳素活化蛋白激酶（MAPK）信号传导途径基因和5次参与SA反应途径，包括1nPR基因，2 PRS和2转录因子TGA基因。另外，在热图中示出了21种防御酶基因，包括一个PAL，8 Glus，7 CHT，2PPO，2个GPX和一个SOD UNIGene（图。gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba)．这表明玫瑰的反应gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba通过激活信号转导途径基因，转录因子和抗病基因的表达。gydF4y2Ba

qPCR方法验证候选基因gydF4y2Ba

为了验证RNA-Seq分析得到的deg的可靠性，我们使用qPCR分析了12个候选基因的表达水平。这些基因包括3个TGAs (gydF4y2BaRcTGA3/6/7gydF4y2Ba)、4个防御酶基因(gydF4y2BaRcPAL1、RcPYL RcCHI,gydF4y2Ba和gydF4y2BaRCEP3.gydF4y2Ba)、2个植物激素信号通路基因(gydF4y2BaRCEIN3和RCBKI1.gydF4y2Ba)，一个致病相关基因(gydF4y2BaRcHELgydF4y2Ba）和2个MAPK信号通路基因（gydF4y2BaRcMKK9gydF4y2Ba和gydF4y2BaRcSNRK2gydF4y2Ba)．计算这些deg的RNA-Seq和qPCR结果之间的相关系数(r)(图)。gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba)．结果表明，相关系数大于0.7，表明RNA-SEQ数据是可靠的。gydF4y2Ba

沉默gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba增强了对gydF4y2Bac葡萄孢属gydF4y2Ba

TGA1-TGA7可与水杨酸信号通路的关键调控因子NPR1互作，调控植物抗病gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．基于NCBI BLASTx，我们鉴定和分离了gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba（基因ID：XM024330029.1）基因位于SA电阻路径中。检测表达式模式gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba为了应对gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba,我们接种gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba在老脸红的花朵上发现了她的表情特征gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba在花中进行qPCR(图。gydF4y2Ba8.gydF4y2Bad).结果表明gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba感染4 h后明显增加。感染后72小时内继续生长gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba这个结果表明gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba可能涉及到对玫瑰的反应gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

此前已有研究表明，trv介导的VIGS可用于玫瑰花发育相关基因的功能分析和花瓣颜色和香味的测定[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba那gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．确定SA反应途径基因表达的增加是否与Old Blush的耐受性有关gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba，我们克隆了碎片gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba（编码与SA信号通路相关的转录辅因子的上调的DEG），其长度为TRV载体，通过真空浸润与这些片段接种玫瑰花瓣盘。在一周的渗透后，我们随后挑战了TRV-RCTGA1和TRVgydF4y2Ba-gydF4y2Ba接种玫瑰花瓣椎间盘gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2BaTRV-RCTGA1接种植物显示出严重受损的抗性，如损伤大小显着增加所证明的（图。gydF4y2Ba8.gydF4y2Baa，b）。我们进一步使用QPCR来检测花瓣中的沉默效率。结果表明最显着的减少gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2BaTRV-RcTGA1浸润后表达(图。gydF4y2Ba8.gydF4y2BaC）。这些结果表明gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba是必不可少的gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba升玫瑰。gydF4y2Ba

代谢组学分析概述gydF4y2Ba

了解代谢物的变化和旧腮红感染的可能的防御机制gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba，对Old Blush flower样品(CK、T36、T60、T72)进行代谢谱分析。所有样本共检测到635种代谢物，可分为29组(见表)gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)．主要成分分析（PCA）表明不同治疗的可重复性良好。正交部分最小二乘判别分析（OPLS-DA）表明，OPLS-DA分析的结果可用于后续模型测试和差分代谢物分析。在CK和T36治疗之间，上调373，下调262例。在CK和T60治疗之间，上调397，下调238个。在CK和T72治疗之间，上调406个，下调229个。的levels of piperidine, γ-aminobutyric acid, L-histidine, 5-O-p-coumaroylquinic acid, chlorogenic acid, terminal acid, 2-hydroxyoleanolic acid, 2α-hydroxyursolic acid, and 3,4-digalloylshikimic acid increased significantly with the extension of infection time. This indicated that these secondary metabolites were involved in the resistance response of rose to葡萄孢属c。gydF4y2Ba

找出Old Blush反应的主要途径gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba我们将差异表达的代谢物绘制到KEGG生物通路上。32个显著差异的代谢产物被分配到50个KEGG途径，包括“氨基酰- trna生物合成”、“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成”和“氨基酸生物合成”。38个在CK和T60处理之间差异显著的代谢产物被分配到61个KEGG途径，包括“氨基酰- trna生物合成”、“2-氧羧酸代谢”和“硫代葡萄糖苷生物合成”。37个在CK和T72处理之间显著差异的代谢产物被分配到65个KEGG途径，包括“抗生素的生物合成”、“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成”、“丙氨酸、天冬氨酸”和“谷氨酸代谢”(见表)gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)．结果表明，玫瑰抗病相关的代谢途径明显富集，说明侵染后玫瑰的防御机制被激活gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

芥子油苷生物合成gydF4y2Ba

硫代葡萄糖苷的生物合成途径参与了许多植物对病原体的防御反应。在我们的研究中，硫代葡萄糖苷生物合成途径的关键代谢产物l -缬氨酸、l -异亮氨酸和l -亮氨酸在不同处理中表现出不同水平。与CK相比，T36的水平分别提高了1.78、1.09和1.08;在T60中分别增加了2、2.3、2.4的因子，在T72中分别增加了1.6、2.0、2.0的因子。这些结果表明，硫代葡萄糖苷的生物合成途径可能正参与了蔷薇与紫花蓟马的相互作用gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

Co-joint分析gydF4y2Ba

联合KEGG富集分析显示了85条共映射的路径。CK-VS-T36、CK-VS-T60和CK-VS-T72及其代谢物之间存在46、56和60条配对通路。有趣的是，在这些共映射的途径中，'代谢途径'，'次生代谢产物的生物合成'，'苯丙素生物合成'，'类黄酮生物合成'，'莨菪碱，哌啶和吡啶生物合成'，'酪氨酸代谢'，'戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换'，'氰胺氨基酸代谢'，和“抗坏血酸和醛达酸代谢”是它们显著富集的共同途径(图。gydF4y2Ba9.gydF4y2Baa, b, c)。这表明玫瑰通过协调初级和次级代谢途径对病原体感染作出反应。基于O2PLS模型，转录组学和代谢组学数据的联合分析表明，该模型可靠(R2 > 0.85)。Pearson相关系数显示，DEGs与代谢物的差异表达模式一致。进一步选取前250个deg与其代谢产物之间的相关性，并将其表示为热图(图2)。gydF4y2Bas1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

RNA-SEQ抗病性研究gydF4y2Ba

玫瑰是一种重要的经济园艺植物gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba在其生长期间或收获后会给农民造成巨大的经济损失[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．了解旧腮红耐受的机制gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba利用RNA-Seq和代谢组学分析了接种后不同时间点Old Blush的DEGs和demgydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba在我们的研究中，大量的DEGs和dem被推测与Old Blush对坏死营养的反应有关gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba许多deg参与不同的防御反应gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba，包括氧化还原相关基因，CagydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}、MAPK信号通路相关基因和植物激素信号转导通路相关基因。所有这些转录组数据表明，Old Blush中的多个过程与植物对病原体的防御有关，这与植物已经进化出一种复杂的防御机制的事实是一致的[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba那gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba21gydF4y2Ba那gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．当被病原体感染时，植物识别由gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba通过细胞表面的模式识别受体，触发一系列的细胞反应，包括ROS的产生、胞浆离子通量的改变、钙依赖蛋白和MAPK级联激活。在防止病原体感染的过程中，植物编码R蛋白激活效应触发免疫，并在感染部位产生超敏反应(hypersensitive reaction, HR)，促进细胞死亡[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]．在我们的研究中，在此后，FLS2和ROS途径基因显着上调gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba感染。这个结果表明gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba感染也引发了旧腮红的效应引发的免疫力。gydF4y2Ba

JA和SA信号通路的电阻gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

植物激素，如水杨酸和茉莉酸，参与植物对植物病虫害的防御反应[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba那gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．ren等人。沉默的Key JA合成基因AOS和JA团簇基因COI1，增加了旧腮红的易感性gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba说明JA通路在抵抗中起重要作用gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba罗斯[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．刘等。分析转录组数据，发现在玫瑰接种后上调了BR激素信号转导通路相关基因。外源BR增强了玫瑰花瓣的抵抗力gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba在这项研究中，Old Blush被接种gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba一种典型的坏死营养病原体。DEGs分析显示JA信号通路基因上调，包括gydF4y2Barcjaz.gydF4y2Ba那gydF4y2BaRcLOXs,gydF4y2Ba和gydF4y2BaRcCOIgydF4y2Ba．DEM分析表明，与JA合成相关的α-亚麻酸*的含量也显着增加，这与REN的结果一致。SA激活NPR1表达导致gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba增强全身抵抗力，提高抗病能力。在番茄叶片上施用SA显著提高了SA标记基因PR1(致病相关蛋白1)的表达水平，增强了番茄抗病能力gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba在我们的研究中，SA途径基因的表达gydF4y2BaRcTGAsgydF4y2BaOld Blush接种后PR1s上调gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba这一结果提示SA可能参与了Old脸红的抗性gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba在早期阶段。gydF4y2Ba

功能验证的gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba

天一等[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba发现MdTGA2.1过表达可补充sa敏感表型TGA2/5/6gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．van verk等。［gydF4y2Ba27gydF4y2Ba表明TGA2.2能与NtWRKY12特异性互作，调控体内外PR-1a的表达。以上研究表明TGAs是水杨酸抗性途径中的广谱抗性基因。在我们的研究中，表达gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba感染后继续增加gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba在玫瑰花瓣中沉默RcTGA1，然后接种gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba，瓣盘病变直径为对照组的2倍。综上所述,gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba正向调节玫瑰耐受性gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

代谢组学研究抗病性研究gydF4y2Ba

次生代谢产物决定了植物的颜色、气味和味道。它们广泛参与植物的生长、发育、防御或其他生理过程。当植物被病原体感染时，就会产生次级代谢物参与植物抗病[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．研究表明，糖代谢是一种主要的代谢过程，影响植物的敏感性，并在天然防御途径中起着关键作用。d -葡萄糖胺、肌醇和d -葡萄糖-6-磷酸的糖和醇含量与对照相比显著降低，这与转录组数据一致，表明淀粉和糖代谢途径相关基因的表达明显下调。生物碱、三萜类、单宁酸和酚酸也与植物抗病有关。在本研究中，与抗病性相关的次生代谢产物含量增加，而用于生长发育的代谢产物含量降低。这一结果表明，当感染gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba，提高抗病代谢产物的含量，同时保持自身的生长发育。gydF4y2Ba

芥子油苷代谢gydF4y2Ba

硫代葡萄糖苷具有广泛的抗菌活性。研究表明硫代葡萄糖苷代谢途径是拟南芥免疫病原体所必需的[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]．Stotz等人[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba[表明拟南芥中葡萄糖苷的含量增加，并激活了葡糖苷合成相关基因的表达gydF4y2Ba菌核病sclerotiorumgydF4y2Ba感染。在我们的研究中，当玫瑰被病原体感染时，相关基因的表达量和代谢物的含量显著增加。因此，硫代葡萄糖苷代谢途径可能参与了Old脸红的抗性gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

抗性调节机制gydF4y2Bac葡萄孢属gydF4y2Ba

基于我们的工作，我们提出一个假设模型来解释Old Blush的抵抗gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba在这个模型中，植物通过其固有的识别受体识别真菌分泌的PAMPs，引起一系列的细胞反应。同时，植物R蛋白激活ETI诱导植物超敏反应，导致细胞死亡，防止进一步感染。此外，JA合成及信号转导通路相关基因的表达gydF4y2Barcjaz.gydF4y2Ba和gydF4y2BarcloxgydF4y2Ba被激活。SA诱导抗性相关基因的表达，包括gydF4y2BaRcTGAsgydF4y2Ba和gydF4y2Barcpr1.gydF4y2Ba年代,也增加了。JA合成的前体α -亚麻酸和硫代葡萄糖苷代谢途径的代谢物如l -亮氨酸和l -缬氨酸的水平显著升高(图2)。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．我们推测Mapk-植物信号通路，CDPK基因，JA生物合成，SA抗性途径和葡糖苷代谢途径涉及玫瑰的防御gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba

综上所述，RNA-Seq生成了54 GB的clean reads。T36h、T60h和T72h与CK比较，分别获得3990、5995和8683个DEGs。通过功能注释和聚类分析，发现R蛋白、ROS信号、Ca等介导的多种防御反应gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}Old Blush反应中激活的信号通路、MAPK信号通路和SA信号通路gydF4y2Ba葡萄孢属c。RcTGA1gydF4y2Ba正向调节玫瑰抗性gydF4y2Bac葡萄孢属gydF4y2Ba．代谢组数据显示，与对照相比，T36h、T60h和T72h共获得59、78和74个dem。多种与生物抗病相关的次生代谢产物，包括单宁、氨基酸及其衍生物、生物碱等，在苯丙类生物合成、硫代葡萄糖苷等抗病途径中显著增加和富集。gydF4y2Ba

植物生长和植物感染gydF4y2Ba

r对gydF4y2Ba老红是在云南省农业科学院花卉研究所月季种质园种植的。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba接种物是由生长菌株产生的gydF4y2BaB05.10gydF4y2Ba在固体培养基（马铃薯右旋糖琼脂; 46克gydF4y2Ba^{1 * LgydF4y2Ba}dHgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, pH≈5.6)，在22℃下保存10 ~ 14天。通过在水中采集孢子，通过玻璃棉滤除菌丝，将滤液悬浮于马铃薯葡萄糖培养基(PDB;24g / L dHgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO) 10gydF4y2Ba^5.gydF4y2Ba分生孢子gydF4y2Ba^{1 * mlgydF4y2Ba}［gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]．四个2-μl滴gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba将接种物或PDB（模拟）滴在每个花瓣盘上。感染和控制盘以36小时，60小时的三个托盘中的每一个以随机的方式进行单独抽出，并且在每次点处具有三种生物重复，用于感染和对照处理。在收获时立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃。gydF4y2Ba

抗氧化酶活性测定gydF4y2Ba

利用冷冻花样品测定多酚氧化酶(PPO)、几丁质酶(CHT)和葡聚糖内切酶(GLU)的活性，并进行RNA-Seq分析。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定SA和JA的含量。该公司的服务有助于结合这些酶(牛血清白蛋白)，然后产生相应的抗体。gydF4y2Ba

RNA提取、文库构建和测序gydF4y2Ba

根据制造商的协议，使用Trizol试剂试剂盒(Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)提取总RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)评估RNA质量，并使用RNase-free琼脂糖凝胶电泳检查。提取总RNA后，用oligo(dT) beads富集真核mRNA，用Ribo-Zero™Magnetic Kit去除rRNA富集原核mRNA (Epicentre, Madison, WI, USA)。然后，利用片段缓冲液将富集的mRNA片段切成短片段，随机引物反转录成cDNA。用DNA聚合酶I、RNase H、dNTPs和缓冲液合成二链cDNA。然后，用Qia Quick PCR extraction kit (Qiagen, Venlo, the Netherlands)纯化cDNA片段，进行末端修复，添加poly(a)，连接到Illumina测序适配器。连接产物通过琼脂糖凝胶电泳、pcr扩增和Illumina HiSeq2500测序筛选[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

转录组数据分析gydF4y2Ba

为了获得高质量的干净读取，我们删除了包含适配器的序列、poly-N和低质量的读取。剩余的clean reads进一步用于组装和基因丰度计算。然后，使用HISAT2工具将干净的reads映射到参考基因组[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]．对于每个转录区域，计算FPKM（每百万映射读数的数千碱基片段）值，以使用Stringtie软件量化其表达丰度和变化[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba那gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

使用DESEQ2软件进行四种处理（CK vs.T36 / 60/60 / 72，T36对T60，T36对T72和T60与T72）的差异表达分析。gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]．假发现率(FDR)低于0.05且绝对fold change≥2的基因/转录本被认为是差异表达基因/转录本。gydF4y2Ba

GO富集分析提供了与基因组背景相比在deg中显著富集的所有GO术语，并过滤了与生物学功能相对应的deg。KEGG [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]是主要的公共通道相关数据库。途径富集分析发现，与全基因组背景相比，DEGs中的代谢途径或信号转导途径显著富集。gydF4y2Ba

定量实时PCR验证gydF4y2Ba

QPCR用于验证12种不同基因的RNA-SEQ数据。使用Premier 5软件（Paro Alto，CA，USA）设计了具体的引物。RNA样品用于合成cDNA，并且使用步进份数实时荧光定量PCR系统（TransStart®GreenQPCR超级混合物）来监测DNA的量。每种基因的测定重复三次。使用2评估量化gydF4y2Ba^{−(ΔΔCt)gydF4y2Ba}方法。gydF4y2Ba

功能验证的gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba

获得TRV-gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba表达载体，其ORF中250 bp片段gydF4y2BaRcTGA1gydF4y2Ba克隆到TRV载体PTRV2中，电孔至农杆菌菌株GV3011。为了建立玫瑰花瓣的VIGS，在玫瑰开放第2阶段从最外层的花瓣轮中分离花瓣。然后，从每个花瓣的中心打出一个12毫米的圆盘。如Zhang和Thomma所述，将带有TRV结构物的农杆菌真空浸润花瓣盘[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]．每次实验中使用至少16张光盘，VIGS至少重复3次。后gydF4y2Ba葡萄孢属c。gydF4y2Ba接种，学生的T检验进行了。所有底漆列于补充表中gydF4y2BaS1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

代谢物的提取和定量gydF4y2Ba

从花瓣中提取代谢产物，每个处理5个重复。提取的化合物进行分析使用一个LC-ESI-MS / MS系统(UPLC, Shim-pack UFLC日本岛津公司CBM30A,gydF4y2Bahttp://www.shimadzu.com.cn/;gydF4y2BaMS/MS (Applied Biosystems 6500 QTRAP))。在三重四极线性离子阱质谱仪(Q trap)上获得LIT和三重四极(QQQ)扫描[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]，AB SCIEX Qtrap6500系统，配备ESI-Turbo离子喷涂接口，以正离子模式运行并由分析师1.6.1软件（AB SCIEX）控制。操作参数如下：ESI源温度500°C;离子喷雾电压（IS）5500 V;窗帘气体（CUR）25 psi;和碰撞激活的解离（CAD）。QQQ扫描被收购为MRM实验，具有优化的整理潜力（DP）和每个单独的MRM转换的碰撞能量（CE）[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．m/z范围设置在50到1000之间。gydF4y2Ba

通过检索内部数据库和公共数据库(Mass Bank、KN Ap Sac K、HMDB、Mo to DB和METLIN)，并将m/z值、RT和碎片化模式与标准进行比较，鉴定代谢物[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

代谢组数据分析gydF4y2Ba

那些有gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05和VIP≥1的T检验的值被认为是这些组之间的差异代谢物。我们基于Kegg数据库中的信息构建了代谢途径。gydF4y2Ba

组合代谢物和转录组分析gydF4y2Ba

为了揭示基因表达与代谢物之间的调控和影响机制，我们基于基因表达和代谢物丰度分析了三种模型。将前250个差异表达基因与其代谢物的相关性绘制成热图。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的序列数据集可在合理要求下由通讯作者提供。gydF4y2Ba

我们感谢云南省生命科学院玉春陈和延红郭硕士，为实验援助。gydF4y2Ba

来自中国国家重点研发计划的资金（2018年至2018年），中国国家自然科学基金（第31860571号和31560565号）的资金支持这项工作，是云南省的主要科学和技术项目（No.2066ZA005）那youth top-notch talents training project of ‘ten thousand talents plan’ of Yunnan Province and leading talents of Yunling industrial technology.

从属关系gydF4y2Ba

1. 云南省农业科学院花卉研究所/国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明650205gydF4y2Ba

   高鹏华，张浩，闫慧君，王启刚，简红英，唐开学，邱先琴gydF4y2Ba

2. 西南林业大学，云南昆明650024gydF4y2Ba

   高鹏华，闫博gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

邱先琴、唐开学、高鹏华是本研究的实验设计者和实施者;张浩、颜慧君、王启刚、简红英、闫博参与实验指导，高鹏华参与数据处理和论文撰写。所有的作者审查了手稿，并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba凯夏唐gydF4y2Ba或gydF4y2Ba仙琴秋gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

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开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba