两种棉花的基因组鉴定，进化估计和功能表征CKI.基因类型

背景

酪蛋白激酶I (Casein kinase I, CKI)是一种在动植物中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。虽然个别成员的分子功能CKI.这个家庭已经被调查过了拟南芥对它们的进化和在生物中的作用知之甚少棉属．

结果

本研究以五个棉花品种为研究对象CKI.在棉花基因家族中，应用了22个种来追踪棉花基因的起源和分化CKI.基因。获得了四个重要的见解：（一）棉花CKI.根据基因的结构特征将其分为两类(ii）两种类型的CKI.基因在棉花中用四倍体事件扩增;（iii）两种类型的CKI.基因可能在大约15亿年前就开始分化，当时红藻和绿藻开始分化;(iv)两种棉花CKI.高度表达叶片中高度表达的基因对光周期（昼夜钟）和光信号进行了更强的反应，以及大多数两种类型CKI.四倍体棉花花药中高表达的基因在花药发育过程中表现出相同的热诱导表达(棉花)．

结论

这项研究为棉花的进化史提供了全基因组的洞见CKI.为进一步研究两种类型的功能分化奠定了基础。CKI.特定发育过程和环境胁迫条件下的基因。

酪蛋白激酶I（CKI）是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在动植物中高度保守[1.,2.,3.]. 与其他蛋白激酶相比，CKI蛋白含有四个短的保守肽：HIPXR、LPWQGLKA、EXSRRDD和LLGPSLEDLF[4.］．由于广泛分布CKI.基因家族成员及其底物，CKI.基因已被发现参与许多生物活动。在酵母中，CKI.在基因表达调控、囊泡运输、细胞形态发生、细胞周期、细胞定植和DNA修复等方面发挥重要作用[5.,6.,7.,8.]. 在哺乳动物身上，CKI.参与细胞增殖、细胞因子的产生，以及与凋亡和肿瘤产生和发展相关的多种信号通路的转导和调节，如Wnt和Hedgehog[9,10.,11.］．

这个CKI.一些植物的家庭已经研究过。这个CKI.家族被分为两种类型，一种类型是典型酪蛋白激酶1，另一种类型是植物特异性酪蛋白激酶1 [12.,13.]. 在拟南芥，有17名成员CKI.家庭，其中13个成员是典型酪蛋白激酶1，属于CKI样（CKL）簇，4个成员是植物特异性的CKI，属于慕的母蛋白样激酶（MLK）簇[12.]. 在rice, there are 9 canonical casein kinase 1 and 6 plant specific casein kinase 1 [13.］．两种类型的两种类型CKI.家庭在调节各种与生长和发展有关的生物过程中具有重要功能，以及对环境刺激的各种反应[14.]. 在rice, abscisic acid (ABA) and brassinolide caused up-regulation ofOscki1.(典型酪蛋白激酶1)Oscki1.缺乏造成较短的主要根部和更少的侧向和不定根[2.]. 在拟南芥， 这酪蛋白激酶I-like 2 AtCKL2和ATCKL3.是ABA调控种子萌发、根系生长和基因表达所必需的[15.,16.,17.]，也是过度表达AtCK1.3或者AtCK1.4新疆长日照条件下的延迟开花拟南芥[13.]. 在A.DDition,MLK3型，一种植物特异性酪蛋白激酶1，对于维持适当的花期至关重要[18.]. 棉质面料，GhCKI公司推测不仅调控绒毡层程序性细胞死亡（PCD）和花药开裂[19.]，还可以通过调节生长素稳态来实现体细胞胚胎发生[20.]. 因为大多数CKI.高等植物中的基因大多是未知的，它们的鉴定和特性对于了解它们的作用以及利用它们作为遗传资源提高作物对生物和非生物胁迫的防御能力是非常必要的。在棉花中，没有全基因组的特性CKI.基因家族的研究至今已有报道。此外，对这两种类型的起源和分化也没有系统的研究CKI.基因。幸运的是，最近发表的棉花品种基因组信息为鉴定奠定了坚实的基础CKI.基因组水平的基因。在这里，我们已经调查了有关的几个基本问​​题CKI.基因家族进化：（i）基因结构和棉花结构域架构的多样性CKI.家庭;（ii）棉花的进化膨胀CKI.家庭(（三）投机的起源和分歧CKI.家庭;（iv）棉花的表达轮廓CKI.不同条件下的基因。总之，我们重新回避了CKI.基因，以便更好地了解其基本要素，从而能够利用这一知识的植物生长发育。

酪蛋白激酶Ⅰ的鉴定与分类(CKI.)在棉属

提取CKI.序列棉属建立了隐马尔可夫模型（HMM）拟南芥CKI蛋白，然后是五种测序棉质物种的蛋白质数据库（G雷蒙迪,G植物园，和G粗毛。TM-1型，巴巴多斯岛,G.Herbaceum.）[21.,22.,23.,24.用HMMSERACH提取。结果，鉴定了31,29,27,58和57个CKI成员G雷蒙迪(D基因组),G植物园（基因组），G.Herbaceum.（基因组），g .分子（广告组织）和巴巴多斯岛（AD基因组）分别（表S1). 为了更好地理解CKI之间的系统发育关系，利用CKI蛋白序列构建了一个无根系统发育树G雷蒙迪,G植物园,G.Herbaceum.,g .分子acc。TM-1型，巴巴多斯岛．显然，CKI被分类为棉花的规范CKI（名为I类）和植物特定的CKI（名为II型）（图。1.a).主要是CKI.基因在二倍体中只发现一次G雷蒙迪， 曾在G植物园，曾在G.Herbaceum.四倍体中有两个拷贝g .分子根据TM-1和两份副本巴巴多斯岛3–79（图。1.a） 表明四倍体CKI家族起源于a、D二倍体。

四倍体的棉花品种g .分子，是世界上栽培最广泛的棉花品种，被认为是由大约100万到200万年前发生的多倍体事件形成的，涉及D和a基因组物种[25.］．因此,g .分子基因组信息被用来描述位置CKI.染色体上的家族基因。GhCKI公司在At和Dt亚基因组上几乎均匀分布(图。1.b），因此复制事件可能会照亮关于扩展的机制GhCKI公司基因家族。然后利用MEGA 6软件独立构建GhCKI系统发育树(图。2.a） 是的。全部g .分子CKI蛋白分为两组，与Fig。1.a. I型CKI蛋白进一步分为三个亚类:a、B、C类;II型CKI蛋白分为D类和E类。

鸡CKIs的基因结构、保守基序和结构域g .分子

为了更好地理解I型和II型的多样化GhCKI公司基因g .分子，分析了外显子/内含子组织。最多GhCKI公司同一组内的基因在外显子长度和内含子数方面显示出非常相似的外显子/内含子分布模式（图。2.b）。例如，大多数类型我GhCKI公司A、B和C组的基因有13到15个相似长度的外显子，而II型的成员GhCKI公司D组和E组的基因含有更多的外显子。然后，利用模因程序对模因进行了进一步的分析(http://meme-suite.org/tools/meme.)进一步了解GhCKI蛋白基序组成的多样性。如图。2.C，保守的母题1-8被鉴定。我们清楚地观察到I型和II型GhCKI蛋白具有不同的基序组成，I型GhCKI蛋白除Gh_A13G1711和Gh_D13G2059外共有5个相似的基序组成，而II型GhCKI蛋白大多有8个基序组成。这意味着在同一类型的GhCKI成员可能执行类似的功能，一些母题可能发挥重要作用。而II型GhCKI的E组出现分化，可能说明E组成员具有多元功能。总体而言，GhCKIs的基序组成与系统发育类群的一致性进一步证明了GhCKIs之间的密切进化关系，也说明了我们的系统发育分析的可靠性(图1)。2.一种）。因此，属于同一组的成员显示出类似的外显子/内含子组织和类似的基序组合物，表明其功能相似之处。和外显子数量的不同进化模式CKI.基因可能暗示其在基因表达中的功能多样性。这些结果进一步支持了I型和II型之间的分类GhCKI公司基因。

GhCKI蛋白的保守结构域g .分子使用在线程序保守域搜索服务进行了研究(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wpsb.cgi.)．I型GHCKI蛋白在激酶结构域和N末端高度保守，但在C末端域的长度和主要结构中有显着不同（图S1一个，图S2a). I型GhCKI蛋白的基因结构与之前的报道一致[3.,4.,26.］．II型GHCKI蛋白也呈现了保守的激酶结构域。然而，与I型GHCKI蛋白相反，II型具有可变的N末端和保守的C末端（图S1B和图S2b） 是的。此外，一些短序列在CKIs中是绝对保守的，在其他激酶中没有发现。为了进一步确认Ⅰ型和Ⅱ型GhCKI蛋白中是否存在保守片段，进行了序列比对。结果显示，I型GhCKI蛋白具有四个短序列LLGPSLEDLF、HIPXR、EXSRRDD和LPWQGLKA（图S1一种）。II型GHCKI蛋白包含四种保守序列中的三种（LGPSL，SRRDD和LPWQG）（图S1b） 是的。然而，与Ⅰ型CKI蛋白相比，Ⅱ型GhCKI蛋白中仅存在两个特异片段LGKGGFGQV和HGDVKPEN。综合来看，LGPSL、SRRDD和LPWQG在Ⅰ型和Ⅱ型GhCKI蛋白中均有表达。其他实验也得到了同样的结果棉属。雷蒙迪)（图S3)．

CKI.在棉花中利用四倍体事件扩展家系

从古代被子植物发育到四倍体棉种阶段，在棉花中发现了四个复制事件：被子植物进化早期的一个古代全基因组复制事件、一个三倍体事件、一个棉花特有的最近的WGD事件和四倍体事件[25.,27.,28.］．在此基础上构建系统发育树(图1)。1.a） 哦，GhCK我可能会通过二倍体的杂交来扩展到基因组种类和D基因组物种[29.］．为了进一步研究GhCKI公司基因，首先在二倍体基因组之间进行了基因共同分析（一个基因组：G.Arboreum.和D基因组：G雷蒙迪）四倍体基因组（AD基因组：G.Hirsutum.)(图。3.a).所含染色体区域的共线性CKI.基因表明这些基因是WGD或分段重复的产物。显然，两种类型的大部分基因均具有二倍体基因组的同源基因和两倍的四倍体基因组中的两个同源。例如，I型基因GrCKI3型(哥莱005G050700)关于D基因组和加基(Gar03G24920型)从一个拷贝扩展到两个拷贝GhCKI3A型(国税局A02G0391） 和GhCKI3D(gh_d02g0444.)在AD基因组上（图。3.b）。II型基因GrCKI25(gorai.004g018000.)关于D基因组和加基(Gar08G01750型)从一个拷贝扩展到两个拷贝GhCKI25A型(Gh\ U A08G0110型） 和GhCKI25D型(gh_d08g0154)在AD基因组上（图。3.C）。这些结果表明，I型和II型CKI.基因在棉花四倍体事件中被复制。此外，我们还研究了两种类型的选择压力CKI.通过计算每个非同义位点的非同义替换（Ka）与每个同义位点的同义替换（Ks）（omega）的比率来计算上述三个基因对中每个同源基因对的基因棉属种类（表S2)．基因g .分子作为参考。我们发现了所有CKI.基因处于负选择（图。3.d） 是的。结果表明CKI.基因在演变过程中受到高度保守棉属，这说明CKI.基因棉属．

两种类型的起源和分歧CKI.家庭

棉花是从与人类共有的祖先分离出来的可可树至少60 Myr以前，葡萄个体染色体片段类似于祖先的真双子叶植物基因组结构[27.］．进一步探索两种类型的进化历史CKI.基因方面，我们首先研究了三种双子叶植物之间的进化：葡萄、可可、棉花。4.a） 是的。在棉花上观察到，有两种类型的CKI.葡萄，可可和棉花共同性中的同性恋关系。因此，两种类型的分歧CKI.基因应该早于Dicots的形成。有趣的是，可以观察到有更多类型的I长江基建比二型长江基建葡萄和可可的共线性（图。4.a） 是的。也许这就是为什么会有更多的I型CKI.基因比II型CKI.棉花中的基因。然后对两种植物进行系统发育分析G雷蒙迪和拟南芥（真双子叶植物）和水稻（单子叶植物）S4)．显然，两种类型CKI.真双子叶植物的基因(G雷蒙迪和拟南芥)单子叶植物（水稻）存在于所有亚组中（图1）S4)．这些结果表明存在两种类型的散度CKI.植物中的基因在单焦/申申之间的分歧之前。

更好地跟踪两种类型的来源CKI.基因分化，CKI.来自藻类、苔藓、蕨类植物、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物等18个物种的基因被发现构建了系统发育树（表1）S1，表格S3). 可以清楚地发现CKI.所有物种的基因也分为两种类型（图。4.b）。当我们计算两种类型的数量时，发现了极其吸收的结果CKI.分别的基因（图。4.C）。I型CKI.基因存在于所有物种中，但除了绿藻之外，II型基因在藻类中丢失。根据一些报道，红藻类和绿藻分歧约1,500 mya接种[30.]其次是次生内共生藻类[31.]，因此上述结果可能暗示I型基因起源于一个非常古老的时代和II型基因CKI.在红藻和绿藻的分歧时新产生基因。此外，两种类型CKI.在包括苔藓，蕨类植物，裸子植物，单子叶和单滴水的植物中的同源物表现出从降低到更高植物增加的趋势，结果意味着在红藻和绿藻的分歧后，绿藻产生了II型CKI.随后的进化过程中的基因，然后是两种类型的CKI.基因在随后的进化过程中膨胀，形成两种类型CKI.今天家里各种各样的植物。

CIS作用元素分析GhCKI公司和GhCKI公司在不同组织中的表达谱g .分子

顺式作用元素在植物中基因表达调控中起重要作用。我们在启动子中找到了许多CIS作用元素GhCKI公司基因并确定四种主要类型的顺式作用元素：轻响应元件，非生物应激响应元素，植物激素响应元素，植物生长和开发相关元素（图S5). 这一结果表明CKI通过不同的顺式作用元件参与多种生物过程。为了进一步确定CKI在棉花中的主要作用，采用定量RT-PCR（qRT-PCR）方法研究了CKI在棉花不同器官/组织（包括根、茎、叶、花瓣、花药和花后5dpa胚珠）中的表达g .分子. 由于A亚基因组与D亚基因组cdna序列高度相似，同源基因的调控区也很相似，因此我们将其命名为58个推测基因G毛茛基因作为GhCKI1A / D来GhCKI31A/D公司。我们设计了一对普通引物进行分析CKIA / D.基因的表达。对每对引物的特异性进行验证后，对44对(26对)I型引物进行qRT-PCR检测CKI.基因与18型IICKI.基因）的CKI.基因（33型I.CKI.基因和28个II型CKI.基因)(表S4)．如图所示S6，大部分是I型和II型CKI.基因表现出不同的组织表达。GHCKI2A / D.,GhCKI3A / D,GhCKI8A/天,GhCKI10A/天,GhCKI11A/D公司,GHCKI14A / D.,GHCKI15A / D.,GhCKI18A / D,GhCKI20A/天，和GHCKI27A / D.在每个受试组织中都有组成性表达，这意味着这些基因可能在多个发育阶段发挥调节作用。另外，一些基因在叶片和花药中相对表达较高，如GHCKI4A / D.,GHCKI14A / D.,GhCKI19A/D公司,GhCKI20A/天,GHCKI27A / D.,GhCKI28A/天,GHCKI29日,GhCKI30A/天．其中一些基因，如GHCKI4A / D.,GHCKI14A / D.,GhCKI20A/天，和GhCKI27A / D,在叶片中优先表达。有趣的是，这些基因在进化中也相对保守，可能有更早的分化时间(图1)。3.D，表格S2). 这些结果进一步揭示了它们在棉花不同生长发育过程中的作用。

昼夜节律和光信号调节GhCKI公司基因表达

绿藻和红藻分化后[30.]绿藻进一步发展成适应陆地生活的更高植物[32.]. 在This process, adaptation to biological processes such as light and circadian rhythm occured. Besides, analysis of cis-acting elements shows both types ofGhCKI公司具有许多光响应成分和植物生长发育相关元素，包括昼夜节律（图S5)．所以CKI.表达研究的昼夜节律和光反应进行。判断棉花是否表达两种类型CKI.基因受光周期(昼夜节律钟)调节，转录水平G毛茛研究了不同昼夜条件下的基因。三十六G毛茛基因表达水平足以评估其昼夜节律调节(图。5.)．在短日（SD）条件下，所有36CKI.基因在8:00时出现高表达高峰，表达GhCKI公司基因在黑暗中逐渐增加并在光中减少（图。5.)．在漫长的日期（LD）条件下，12型I基因（GhCKI1A / D,GHCKI2A / D.,GhCKI3A / D,GhCKI8A/天,GHCKI13A / D.，和GHCKI14A / D.)和10个II型基因(GhCKI19A/D公司,GhCKI20A/天,GHCKI27A / D.,GhCKI28A/天，和GhCKI30A/天）在12:00显示高表达峰。但是，八种I基因的表达峰（GHCKI4A / D.,GhCKI11A/D公司,GHCKI12日，和GHCKI15A / D.)和6个Ⅱ型基因(GhCKI18A / D,GHCKI26A / D.，和GhCKI31A/D公司）在长期（LD）条件下16:00（图。5.)，和ghcki14d和GhCKI26D型在进化过程中也相对保守（图。3.D，表格S2). 此外，36GhCKI公司LD条件下，光照条件下的基因数高于黑暗条件下的基因数，与SD条件下的基因数不同，LD似乎模拟了红藻向绿藻进化过程中日照时间的增加。这些结果确定了一套时钟调节GhCKI公司显示不同阶段的基因，并提供了额外的洞察，了解昼夜节律的调制潜在机制。

进一步调查两种类型长江基建参与光信号，表达g .分子(无花果。6.)CKI.基因和G雷蒙迪（图S7，表格S5)在光照和黑暗条件下，用qRT-PCR检测子叶。最重要的表达CKI.基因都在g .分子和G雷蒙迪在灯下被上调，除了GhCKI19A/D公司(无花果。6.),GrCKI6,GrCKI14,GrCKI25，和GrCKI26（图S7)，这两种类型之间只有轻微的差异CKI.基因。结果表明I类型和II型CKI.可能与植物光信号有关。然而，有趣的是，在叶片中优先表达的基因对光信号的反应更强烈，例如GHCKI4A / D.,GhCKI20A/天,GHCKI27A / D.，意味着进化上保守的CKI.基因可能在棉花对光信号的反应中发挥更重要的作用。

CKI.棉花花药发育过程中基因对高温的响应

CKI.基因在棉花花药中表现出最高的表达，除了GHCKI14A / D.和GHCKI27A / D.（图S6)．CKI.启动子还包含许多非生物胁迫反应顺式作用元件（图S5)．同时，我们以前的研究表明，一个成员CKI.基因家族，GhCKI公司(gh_a07g0121/GhCKI11A)在高温条件下，在H05（高温敏感系）花药中诱导，而在84021（耐高温系）花药中不诱导[19.]. 全基因组分析G毛茛在花药发育过程中响应HT的基因可能为进一步了解HT耐受性或HT敏感性所涉及的机制奠定基础。在本研究中，利用包含三个不同花药发育阶段（TS，四分体阶段；绒毡层降解期；高温和NT胁迫下84021和H05的ADS、花药开裂期、对高温最敏感的三个时期[33.］．观察到61个国家中有34个GhCKI公司基因(19个来自I型和15个来自II型)在HT和NT下的84,021和H05表达差异，即使经过绝对阈值日志过滤_2.（折叠变化） ≥ 1（图。7.一种）。我们发现，在HT暴露后，大多数基因在H05中升高，例如I型基因（GhCKI10型和GhCKI11号)及II型基因(GhCKI20型和GhCKI27)(图。7.一种）。为了验证结果，还进行了QRT-PCR实验（图。7.b） 与RNA-seq数据一致，大多数CKI基因在HT条件下H05上调。我们还分析了HT诱导的差异选择性剪接（AS）的影响CKI.基于RNA-seq数据的基因[33.]. 几个CKI基因在HT诱导的AS事件中存在差异（图S8，表格S6）， 例如，GH_A10G0586(GhCKI18A型)有保留的内含子事件，gh_a11g1211(GhCKI8A)有一个跳过的外显子事件（图S8，表格S6). 这些结果表明HT影响了基因的表达和选择性剪接GhCKI公司种植过程中的基因。

结构特征G毛茛基因

动物的某些特征CKI.影响其活性的因素已经在蛋白质水平上被确定:结构相关调控、亚细胞定位、与其他蛋白质的相互作用以及翻译后修饰[34.］．作为丝氨酸/苏氨酸特异性激酶的超家族的成员，磷酸化的功能是关注的优先权。在植物中，发现了一些研究CKI.家族分为两类，Ⅰ型为典型酪蛋白激酶1，Ⅱ型为植物特异性酪蛋白激酶1[12.,13.]. 然而，系统地研究了棉花的鉴定和特性CKI.没有分析基因。在这项研究中，我们首先系统地确定了CKI.5个棉花品种的基因序列分析(G. Raimondii，G. Arboreum和G. Hirsutum,G.barbadense, G.herbaceum)(图。1.a） 是的。基于序列比较和系统发育分析，棉花CKI.与其他报道相似，基因分为两种类型，即I型(典型酪蛋白激酶1)和II型(植物特异性酪蛋白激酶1)。CKI.分别的基因（图。1.a） 是的。基序组成，外显子/内含子分布模式g .分子同意我们的假设（图。2.)．

丝氨酸/苏氨酸激酶结构域包含假定的激酶催化环、底物识别区和ATP结合位点。关于N-末端和保守C-末端区域的功能特征，以前在哺乳动物中的报道表明，CKI呈现β-N-末端叶和主要是α-螺旋C-末端叶，它们通过铰链区域连接，形成底物和ATP结合的催化裂缝[35.,36.］．在c端区域，一个特定的磷酸基结合基序被识别，允许磷酸化的蛋白质底物，这被认为参与CKI.监管互动。这些报道表明N端和C端叶在底物磷酸化中起重要作用。在这项研究中，I型CKI蛋白在其激酶结构域内高度保守，但其C端结构域的长度和一级结构显著不同（图1）S1，图S3)，这与以前的报告是一致的[3.,4.,25.,33.,37.]. 有趣的是，与I型相反，II型CKI蛋白也呈现保守的激酶结构域，并具有可变的N端和保守的C端区域（图1）S1，图S3). 根据植物的特性CKI.基因，我们假设I型和II型CKI.基因由于结构的不同而具有不同的功能，特别是在磷酸化功能方面。功能研究将需要在未来进一步探讨这种差异。

这两种类型的进化扩展CKI.基因家族

的进化棉属其特征在于不同阶段的多个基因重复的历史，如在四个重复事件中（古老的AnvioPerm WGD事件，一个三份事件，特定和最近的棉花WGD事件和四倍体事件）[25.,28.,29.]. 首先，我们观察了这两种类型的扩展CKI.棉花基因（图。3.a） ，并发现这两种类型CKI.利用棉花四倍体事件进行基因扩增。大多数基因在二倍体中是一个拷贝，在四倍体中变成两个拷贝。但三个棉种染色体区域的共线性并非全部包含CKI.基因。例如，gh_d10g2569.(I型)和gh_d10g0542（II型）在联合块之间没有同源基因G雷蒙迪和G多毛的。植物园和g .分子(无花果。3.a） 是的。我们推测这些基因是在棉花四倍体事件中新产生的拷贝，即基因组组装错误。为了更好地追溯这两种类型的起源和发散CKI.收集18个种的基因组，构建系统发育树。我们发现了CKI.所有物种中的基因分为两种类型，红藻没有II型基因（图。4.). 但是第二类CKI.在绿藻中鉴定了基因（图。4.），与之前的研究一致[38.]. 红藻和绿藻在1500mya前开始分化[30.]其它藻类均为次生内共生[31.]. 然后绿藻进化成植物[32.］．因此，我们推测两种类型CKI.基因在1500兆年前就分化了CKI.在绿藻进化到高等植物期间，基因在不同物种中以不同的种类进行了不同的方式。此外，拥有古老进化历史的基因家庭具有重要功能，如疯了基因[39]，生长素反应因子S [40),或不对称LEAVES2-LIKE / LOB-DOMAIN转录因子(41］．因此，我们推测这一点CKI.基因在植物的发育过程中起着重要的作用，并参与各种各样的生物学作用以适应环境胁迫。

表达模式GhCKI公司基因

迄今为止，虽然只有一个功能CKI.对四倍体棉花的基因进行了鉴定[19.]但无需棉花不同组的表达模式无系统功能分析CKI.基因家族完成了。在这项研究中，我们证明CKI.基因显示不同组织中的表达分歧（图S6)．例如，GHCKI2A / D.,GhCKI3A / D,GhCKI8A/天,GhCKI10A/天,GhCKI11A/D公司,ghcki15a / d，和GhCKI18A / D在每个被测组织（如根）中都有组成性表达，这意味着这些基因可能在多个发育阶段发挥调控作用。在拟南芥,ATCKL2.和ATCKL3.ABA调节种子萌发，根生长和基因表达需要[16.,17.]. 在rice,Oscki1.缺素导致初生根缩短，侧根和不定根减少[2.］．类似的表达模式表明这些倾向于或明确地表达陆地棉基因可能在根的形成和发育中起重要作用。在这61个CKI.基因，GhCKI公司(即GhCKI11A)是唯一被推测调控棉花绒毡层程序性细胞死亡和花药开裂的基因[19.]. 在高温条件下，ATCKL2.和ATCKL7.在绒毡层、9-12期花药小孢子和13-14期花药花粉粒中均有表达ATCKL2.和ATCKL7.可能是ht下塔皮特开发的关键调节因素[42］．除了GhCKI11A（以前GhCKI公司)，的GhCKI1A / D,GhCKI5A/天,GhCKI9A/天,GHCKI12日,GHCKI13A / D.,GhCKI19A/D公司,GHCKI26A / D.,GhCKI28A/天,GHCKI29日,GhCKI30A/天，和GhCKI31A/D公司基因仅在花药中表达。这一发现建议CKI.基因是调控花药发育的复杂转录网络的组成部分。

以前的研究表明，HT压力会导致Tapetum的过早编程细胞，导致雄性不育和灾难性损失作物生产[30.,43,44,45]. 然而，HT下雄性生殖发育成功的机制仍不清楚。除了GhCKI11A（以前GhCKI公司)在高温胁迫下调控绒毡层发育的基因[20.]， 没有其他CKI.基因已被证实参与花药发育的调控。在本研究中，Ⅰ型和Ⅱ型的表达CKI.分析了棉花花药对HT反应的基因，Ⅰ型和Ⅱ型之间无差异CKI.基因被发现（图。7.). 因此，有两种类型CKI.这两个基因都参与了高温胁迫下雄蕊发育的调控，这将在以后的研究中得到应用。

生物钟是分子计时器。许多植物利用光周期(昼夜节律钟)信息来为日常环境变化做准备，并提高它们在变化环境中的适应性[46］．生物钟具有相似的反馈回路网络结构，这些反馈回路是由生物钟组件之间的转录和翻译后调节形成的[47,48]. 磷酸化是一种常见的翻译后修饰，是昼夜节律调控的重要组成部分[49]. 另一个功能CKI.是通过磷酸化各种底物来进行一系列的生物过程[3.]. 在拟南芥， 两个都CK1.3和CK1.4在LD条件下，在黑暗前有一个高表达峰，这表明CK1.3和CK1.4受昼夜节律严格监管;过度表达CK1.3或者CK1.4在LD条件下延迟开花[13.]. 然而，四倍体棉花在棉花中的系统功能尚不清楚CKI.基因家族参与光周期（昼夜时钟）。在我们目前的研究中，表达了CKI.基因是昼夜节律的。在长日照条件下，光照条件下的表达高于暗照条件下的表达。在短日（SD）条件下，36个基因的表达均为阴性CKI.基因在黑暗中表现出高表达。(无花果。5.). 结果表明，在大肠杆菌中CKI.严格受昼夜节律的调节。根据这些证据，我们建议至少CKI.基因是昼夜节律复合网络的组成部分。这些功能GhCKI公司在日节律上调节生物钟的基因将在未来的工作中进一步被描述。

植物对光信号的接收及其反应对植物的生长发育具有重要意义。在拟南芥,对照基因主要通过磷酸化参与光信号通路；酪蛋白激酶1蛋白CK1.3和CK1.4磷酸化蓝光受体CRY2，调控蓝光信号[13.］．我们的研究结果表明，大多数I型和II型的表达CKI.与黑暗相比，在光照条件下基因表达上调(图1)。6.，图S7). 因此，我们认为第一类和第二类CKI.基因参与对光信号的响应。但我们不知道它们是否通过磷酸化光感受器Cry2或光信号组件参与光信号，包括HY5，HF5，HFR1，COP1和PIF1拟南芥被酪蛋白激酶2蛋白磷酸化[49］．我们还不知道这两种基因的途径和能力是否相同。

我们发现了GhCKI公司涉及光响应元件、非生物胁迫响应元件、植物激素响应元件、植物生长发育相关元件，因此我们携带了两种类型的棉花CKI.高温响应，生物节律和光响应的表达分析。表达分析结果表明GhCKI公司基因可能涉及上述生物学功能。所以，GhCKI公司也许通过不同的CIS元素参与这些生物学功能。虽然I型和II型的表达式模式CKI.在我们的研究中，基因基本相同，我们认为这两类基因由于结构的多样性而在功能上存在差异，这需要进一步的研究。

我们的研究提供了一个有前途的景观，无法解开棉花的潜在结构特征和进化扩展CKI.并进一步阐明其在不同组织和不同条件下的表达模式；这对于更好地了解它们的特性和阐明它们在调节植物生长发育的各个方面的精确功能是至关重要的。

数据库的搜索和识别CKI.基因

从表中显示的网站检索二十二种物种的基因组信息S3．这个CKI.基因A.Thaliana.是从TAIR下载的(www.arabidopsis.org.）数据库。隐藏的马尔可夫模型（HMM）是用17个建造的拟南芥使用HMMER（v3.2.1）的hmmbuild命令生成CKI蛋白[50]. 用hmmsearch命令（-e1e-20）搜索其余21个物种的蛋白质数据库[50]. 一切可能CKI.在这21个物种中鉴定出了基因。进一步保证每一个的准确性CKI.基因，我们确定了保守的激酶结构域（结构域id为：http://pfam.xfam.org/family/pf00069.）使用智能可能的CKI蛋白（http://smart.embl-heidelberg.de/)，Pfam(http://pfam.xfam.org)．只有包含保守激酶结构域的基因被认为是正确的CKI.．

染色体定位、基因结构和系统发育分析

染色体位置GhCKIs公司从棉花基因组数据库中获得（https://www.cottongen.org/)，然后基因复制事件GhCKIs公司基于前一项研究中描述的原则来检测[51[此外，大通-0.69软件用于可视化染色体位置和基因复制[52]. 序列比对用CLUSTALX生成[53]并且在树木建造之前调整CKI之间的对准。在线基因结构显示服务器2.0 [54] (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）用于识别外显子/内含子组织。G.Hirsutum.CKI蛋白序列提交在线MEME (Multiple EM for Motif Elicitation)程序[55] (http://meme-suite.org/tools/meme.)鉴定保守的蛋白质基序。采用最大似然法、Poisson修正模型、完全缺失法和bootstrap法构建系统发育树，共2000个重复[56］．

共线性分析和选择压力的估计CKI.基因

染色体位置CKI.根据GFF3文件获取各基因组的基因。当同源CKI.这些基因位于同一条染色体上，中间插入的基因不超过一个，这些基因被定义为串联重复基因。我们使用Maher等人所描述的方法来识别大规模的重复事件[57］．如果两个基因位于相同的复制块中，则在侧面的蛋白质序列在氨基酸水平上非常相似。因此，我们找到了CKI.基因组上的基因，并使用该位置作为初始锚位点，以分别获得每个位点的上游和下游的20个蛋白质编码基因[56］．选择含有41个蛋白质编码基因的染色体区域用于使用MCScan的Python版本进行共同性分析[58］．

通过使用Nogaps参数将编码序列对准并引导蛋白质序列的对准[59］．PAML包中的YN00过程用于计算每个非型位点（KA）对每个同义基因对的每个同义位点（KS）的同义替换的比率[60]. 根据Ka/Ks的定义，小于1的值表示负选择或净化选择，而大于1的值表示正选择。用Ks去除基因对，排除了饱和效应 > 2.5.

CIS作用元素分析GhCKI公司发起人

促进剂序列GhCKI公司从棉质地质序列中提取基因（1,000bp上游的启动密码子“ATG”（https://cottonfgd.org/), PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_care.html.)用于预测基因的顺式作用元件GhCKI公司启动子序列[61[分析了光响应元件，非生物应激响应元件，植物激素响应元素，植物生长和发育相关元素。

高温诱导差分交替拼接CKI.基因检测

我们使用rMATS从我们的RNA-seq数据中提取了所有假定的高温诱发的差异AS事件[33.,62］．在弱以低于40％样本的情况下被过低40％的样本后，如果使用RMATS在两个条件之间的PSI的差异超过严格阈值（FDR≤ 0.05, ΔPSI ≥ 10%). ThoseCKI.含有作为高温诱导差异的事件的基因CKI.基因。

植物材料、生长条件和胁迫处理

本试验所用棉花四份，由华中农业大学提供。对于不同器官/组织中的表达谱g .分子简历。YZ1是从5 DPA的铃上小心地切下胚珠、根、茎、叶、花瓣、花药中提取的。的表达模式分析陆地棉在NT和HT条件下不同花药发育阶段的基因，两种棉花（棉花）在本研究中使用HT下性能明显差异：84,021，其耐受HT和H05，对HT敏感33.]. 作为正常条件，这些植物在28°C至35°C/20°C至28°C昼夜的温室中生长。在高温处理期间，这些植物在35℃～39℃／29℃～31℃的条件下在温室中昼夜栽培。当植株经HT处理7d后，在HT和NT处理下采集不同长度（6-7、9-14和大于24mm）的芽。切下花药，立即在液氮中冷冻；然后将其储存在-80°C下直至使用。基因的转录组谱CKI.从RNA-seq数据中分离出基因[33.]. 在或者Der to analyze the diurnal regulation ofg .分子长江基建基因表达,g .分子简历。YZ1分别在短光照（8h光照/16h黑暗）和长光照（16h光照/8h黑暗）条件下生长。收获了4个叶期棉花植株的叶片。我们还收集了光照和暗照条件下的子叶G雷蒙迪和g .分子CV.YZ1分别。

定量逆转录聚合酶链反应

采集各种植物样本，立即用液氮冷冻，并在-80°C保存。总RNA从收集的棉花组织中分离，使用之前发表的方法[63］．使用M-MLV逆转录酶（Invitrogen）从3μg总RNA产生第一链cDNA。CDNA用作QRT-PCR的模板。使用7500个实时PCR系统（Applied Biosystems）进行QRT-PCR反应。本研究中使用的引物列于表中S4，表格S5．

支持结果的数据包含在文章及其附加文件中。如有合理要求，可向相应作者索取其他相关资料。

CKI公司：

酪蛋白激酶I

阿巴：

脱落酸

EL1：

早开1

Hd16：

航向数据16

PCD:

编程细胞死亡

MLK3：

mut9样激酶3

CKL:

酪蛋白激酶1状

等级：

G雷蒙迪

生长激素：

g .分子

工作组：

全基因组复制

DPA:

花后天数

热处理：

高温

新台币：

常温

TS码：

四分体阶段

TDS公司：

绒毡层退化期

广告：

花药开裂期

LD：

工作时间长

标准偏差：

短日

不适用

本研究的设计和温室费用得到了国家重点研究开发项目（2016YFD0101402）的资助。数据的分析和解释得到了国家重点研究发展计划（2018YFD0100403）的支持。

作者指出

1. 李彦龙和李瑶瑶对这项工作做出了同样的贡献。

从属关系

1. 2 .华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，湖北武汉430070

   李彦龙，李瑶瑶，陈媛媛，王茂军，张宪龙，朱隆福，闵玲

2. 生命科学学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，华南农业大学，广州，510642，广东，中国

   李耀耀

3. 新疆农业科学院经济作物研究所，新疆，新疆，830091

   景阳与孔杰

贡献

Y.L.用Y.L进行实验。和J.Y，Y.L.和y.l.wrote主稿文本，Y.C.和M.W.分析了数据，L.M，X.Z和L.Z.设计和监督研究和L.M，J.K.。修改了手稿。所有作者都审查了稿件。

相应的作者

对应于杰香港或者凌敏．

道德认可和参与同意

不适用。

出版许可

不适用。

竞争利益

作者声明没有利益冲突。

出版商说明

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。

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