结合靶向代谢产物分析和转录组学分析，揭示不亲和大豆品种PI437654侵染大豆包囊线虫HG1.2.3.5.7的特异性化学成分和相关基因

背景

大豆囊肿线虫,异皮线虫属甘氨酸，是大豆最具破坏性的病原体之一，在世界范围内造成严重的年产量损失。不同的大豆品种表现出不同的反应h·甘氨酸在各种水平下感染，例如基因组，转录，蛋白质组学和代谢组水平。然而，尚未有关于感染不相容和兼容的大豆品种的差异响应的任何报道h·甘氨酸基于代谢组学和转录组学的综合分析。

结果

本研究以不亲和大豆品种PI437654和亲和大豆品种Williams 82、中黄13和和丰47为材料，研究HG1.2.3.5.7侵染前后的代谢物和转录组学差异。利用本地代谢物标定数据库识别可能存在差异的代谢物，比较接种HG1.2.3.5.7后不亲和大豆品种之间代谢物和代谢途径的差异。共鉴定出37个差异代谢物和20个KEGG代谢途径，可分为三类:亲和和不亲和大豆中重叠的代谢物/途径和亲和和不亲和大豆中特定的代谢物/途径。在预测KEGG代谢途径中发现了12个差异代谢物。此外，14种特定的差异代谢物(如显著上调尼古丁和下调d -天冬氨酸)及其相关的KEGG通路(如莨菪碱、哌啶和吡啶生物碱的生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、sphinglipid metabolism and arginine biosynthesis)在不亲和大豆品种PI437654中显著改变并大量富集，可能在防御HG1.2.3.5.7侵染中起关键作用。在被HG1.2.3.5.7侵染的不亲和大豆品种PI437654中发现显著上调的3个关键代谢物(n -乙酰氨甲环酸、尼古丁和D, l -色氨酸)被分为两类，并结合转录组表达谱进行联合分析。预测相关基因，以及可能相应的生物过程、细胞成分、分子功能和途径。

结论

我们的结果不仅鉴定了潜在的新代谢物和相关基因，涉及PI437654至大豆囊肿NEMATODE HG1.2.3.5.7的不相容响应，而且还为大豆和大豆囊肿线虫之间的相互作用提供了新的见解。

大豆囊线虫(SCN)异皮线虫属甘氨酸，是大豆最具破坏性的病原体之一，在世界范围内造成巨大的年产量损失[1，2，3.，4]．SCN是一个典型的迫害内甲虫线虫[3.]．SCN的幼体用一种被称为茎管的矛状取食结构刺穿大豆根[3.，5]．然后它们侵入大豆的根并迁移到维管束，在那里它们建立了一个被称为合胞体的复杂的取食点[6，7]．合胞体的形成和维持导致根部内部结构发生剧烈变化，影响根系，造成损害[3.]．此外，大豆根部产生许多防御相关化合物，例如反应性氧物质，并响应于线虫感染而激活激素信号传导途径，并且在SCN感染时在大豆根中观察到代谢物的大变化[8，9]．

近年来，“组学”技术用于获取生物数据的应用激增，最常用的组学方法有基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学[10.，11.，12.]．基于基因组和转录组分析，有许多研究报告解决大豆 - SCN相互作用[4，13.，14.，15.，16.，17.，18.，19.，20.]．SCN和许多大豆品种的基因组已经被评估，以进一步研究它们的生物学、特性和潜在的相互作用[4，19.，21.，22.，23.，24.]．基于全基因组关联研究(GWAS)，许多候选大豆抗性位点和/或基因已被鉴定[13.，18.，20.]．此外，许多关于不同植物组织的表达分析的研究，例如整个根样品和合胞结构，已在感染SCN的兼容和不相容的大豆品种中进行，以及许多差异表达基因（DEGS）和相关的KEGG途径已经预测了[14.，15.，17.，25.，26.]．

代谢组学用于表征代谢模式，进一步研究在生物和医学领域发挥重要作用的关键差异代谢物的功能和意义[27.，28.，29.]．植物代谢组学越来越受到关注，并成为研究生物和非生物胁迫的植物反应的成熟方法。因此，植物代谢组学被认为是植物病原体相互作用的研究中不可或缺的工具[30.]．植物通过产生与防御相关的代谢物，特别是植物次生代谢物来响应病原菌的侵染[31.]．代谢组学可以提供用于鉴定植物代谢物的技术支持，这是线虫控制的新化合物的潜在来源[32.]．对植物线虫的研究变得越来越丰富，特别是解决根结线虫的工作。Eloh等人。对马来酰亚胺处理的根结线虫进行的代谢组分分析，并证明了马来酰亚胺可以用作新的潜在杀线虫方法[33.]．此外，他们在根结线虫感染后研究了番茄植物中代谢物水平，发现番茄根表现出生物化学途径的变化，响应根结线虫感染[33.]．最近,Kantor等研究了不相容和相容西瓜根结线虫侵染的代谢物谱，发现不相容野生西瓜根结线虫侵染的代谢物丰富，但这些化合物在商品西瓜中含量较低品种(31.]．然而，基于蛋白质组学和代谢分析的大豆 - SCN相互作用存在一些研究[34.，35.]．在十多年前，通过传统方法鉴定了不相容和相容的大豆根之间的差异蛋白质和代谢物[34.]．最近，Kang等人研究了其作用芽孢杆菌单纯形通过结合先进的高通量转录组和代谢组学分析方法，研究了Sneb545对SCN侵染大豆次生代谢物的影响，发现Sneb545处理的大豆表现出较高浓度的各种杀线虫代谢物[35.]．

到目前为止，还没有关于不亲和大豆品种侵染大豆包囊线虫代谢途径差异的报道。在本研究中，不亲和大豆品种PI437654 [36.，37.，38.]和三个兼容的大豆品种，威廉姆斯82（WM82），中皇13（ZH13）和伊峰47（HF47）被选为研究材料，并使用LC / MS全扫描检测技术来研究代谢物和差异用HG1.2.3.5.7接种后不相容和相容豆豆品种的代谢途径。鉴定了与不相容的大豆品种之间的代谢物，鉴定了对不相容或相容的大豆品种的差异代谢物以及这些代谢物的潜在的KEGG代谢途径。此外，预测了与显着上调的微分代谢物相关的基因，并且将相关的基因分为两种类型。一种类型的基因与特异于不相容的大豆品种Pi437654的显着上调的微分代谢物相关，其他类型的基因与在不相容的大豆品种Pi437654中显着上调的重叠差异代谢物相关，但同时三种兼容的大豆品种显着下调。结果不仅鉴定了潜在的新代谢物和相关基因，涉及PI437654至大豆囊肿NEMATODE HG1.2.3.5.7的不相容反应，而且还提供了对大豆和大豆囊肿线虫之间相互作用的新见解。

HG1.2.3.5.7在感染下不相容兼容豆豆品种的代谢产物的分化

为了研究不亲和大豆品种间根系代谢物的差异，对不亲和大豆品种PI437654和3个亲和大豆品种(WM82、ZH13和HF47)的根系样品(图2)进行了分析。S1， 桌子S1)接种8 dpi的SCN HG1.2.3.5.7 (' _SCN ')，分别采集相应的对照根样品(' _0 ')。所有根标本均进行代谢组学分析。在不亲和大豆PCA图中，PI437654_SCN的所有6个重复样本聚在一起，PI437654_0的所有6个重复样本也聚在一起(图4)。1一个和S2）.此外，PI437654_SCN样本与PI437654_0样本也明显分离(图1)。1一个和S2），这表明用Hg1.2.3.5.7接种后，在接种后，不相容的大豆品种PI437654中代谢物的代谢物发生显着变化。P1-DA结果与PCA的结果类似，并且PI437654_SCN的样品也与PI437654_0的样品分离（图。1b和S2）.PCA和PLS-DA结果表明，3个亲和大豆品种WM82_SCN、ZH13_SCN和HF47_SCN分别与WM82_0、ZH13_0和HF47_0显著分离(图1)。1a、b、S2），表明，接种HG1.2.3.5.7引起了三种相容大豆品种的根代谢物明显变化。此外，根据模型的累积解释率为不相容和兼容的大豆种（图。1c,表S2)，都是R²和问²值接近1，清楚地表明两组模型的预测力和质量适用于随后的实验。这些结果表明，接种HG1.2.3.5.7引起了不相容的大豆品种PI437654和三种相容大豆品种的显着代谢变化。

鉴别差异代谢产物在不相容和兼容的大豆品种中的鉴定

以8 dpi感染HG1.2.3.5.7的不亲和大豆品种PI437654与相应的对照(指定为PI437654_SCN vs PI437654_0)相比，共筛选出19个差异显著的代谢物，其中7个代谢物上调，12种代谢物表达下调1）.在相容大豆WM82_SCN和WM82_0中，鉴定出17个明显差异的代谢物，其中3个上调代谢物，14个下调代谢物(表)1）.同样，ZH13_SCN与ZH13_0有12种差异显著的代谢物，均下调(表)1）.HF47_SCN与HF47_0有17个显著差异代谢物，包括3个上调代谢物和14个下调代谢物(表)1）.4个大豆品种间的差异代谢物表现出不同的分布特征，主要分为以下三类。

1. （1）

   不亲和大豆品种PI437654与亲和大豆品种之间的差异代谢物重叠。有4个重叠差异代谢物(表)1,无花果。S3)，包括D-亮氨酸、D、l -色氨酸、16-羟基十六烷酸和亚麻酸，均为氨基酸和脂肪酸。亚麻酸在不亲和大豆品种PI437654_SCN和3个亲和大豆品种PI437654_0中同时显著下调。d -亮氨酸在不亲和大豆品种PI437654_SCN与PI437654_0、亲和大豆品种ZH13_SCN与ZH13_0、HF47_SCN与HF47_0中显著下调，而在亲和大豆品种WM82_SCN与WM82_0中轻微上调。16-羟基十六烷酸在不亲和大豆品种PI437654_SCN与PI437654_0、亲和大豆品种WM82_SCN与WM82_0、ZH13_SCN与ZH13_0中显著下调，而在亲和大豆品种HF47_SCN与HF47_0中显著上调(表)1,无花果。S3）.D、l -色氨酸在3个亲和大豆品种中同时下调，而在不亲和大豆品种PI437654_SCN中显著上调(表1)1）.结果表明，D，L-色氨酸在由HG1.2.3.5.7感染的不相容大豆品种PI437654中具有防御代谢产物生产中的作用。

2. (2）

   亲和大豆品种的特异性差异代谢物。在亲和大豆品种PI437654_SCN和PI437654_0中，有18种差异显著的代谢物存在，而在不亲和大豆品种PI437654_SCN和PI437654_0中不存在(表)1,无花果。S3）.2-氧-4-甲基硫丁酸和4-羟基香豆素在三个亲和大豆品种中同时重叠和下调(见表)1,无花果。S3)，而其他16种代谢物仅存在于3个亲和大豆品种中的1个或2个(见表)1,无花果。S3）.Prunetin对WM82_SCN和WM82_0具有特异性并显著上调，而反式阿魏酸对HF47_SCN和HF47_0具有特异性并显著上调(表)1,无花果。S3）.3-羟基-7-甲氧基氟酮在WM82_SCN VS WM82_0中显着上调，但在ZH13_SCN VS ZH13_0中显着下调，而PC（O-14：0/2：0）在HF47_SCN VS HF47_0中显着上调，但显着地在WM82_SCN VS WM82_0中下调（表1,无花果。S3）.其余14种代谢物均明显下调。n-环己烷羰基十五烷基胺、异质基胺和drimenol在WM82_SCN vs WM82_0、ZH13_SCN vs ZH13_0中同时下调，二甘菊红素在WM82_SCN vs WM82_0、HF47_SCN vs HF47_0中同时下调(表)1,无花果。S3）.鼠李嗪、白桦脂酸对WM82_SCN和WM82_0特异，黄芩素对ZH13_SCN和ZH13_0特异，而ent-kaur-16-en-19-ol、异海松酸、commun酸、羟基香茅醛、十六烷酰胺对HF47_SCN和HF47_0特异(表1)1,无花果。S3）.在亲和大豆品种中差异代谢物的下调可能与HG1.2.3.5.7感染介导的基础防御或生理反应对取食场所的建立和发展有关。

3. （3)

   不亲和大豆品种PI437654的特异性差异代谢物。不亲和大豆品种PI437654_SCN与PI437654_0之间存在10个差异代谢物(见表)1,无花果。S3），包括七个下调和三个上调的代谢物（表1）.d -天冬氨酸和亚油酸是前两种显著下调的代谢物，显示PI437654_SCN与PI437654_0相比下降约70倍(见表)1)，而n -棕榈酰丙氨酸、环oleucine和D, l -2,4-二氨基丁酸在PI437654_SCN相对于PI437654_0分别减少约8倍、3倍和2.5倍(表2)1）.在3种上调的代谢物中，n -乙酰氨甲环酸和尼古丁在PI437654_SCN中含量比PI437654_0高约12.9倍和5.8倍(见表)1）.此外，在PI437654_SCN和PI437654_0中鉴定出5个明显差异的代谢物，包括2个下调的代谢物(哌果酸和没食子儿茶素没食子酸酯)和3个上调的代谢物(4-甲基喹啉、烟碱和l -反式-4-羟基- l -脯氨酸)。然而，这5种代谢物在不亲和大豆品种PI437654中并不是唯一存在的，在亲和大豆品种中也存在(表1)1）.这些结果表明，n -乙酰氨甲环酸和尼古丁的上调可能在不亲和大豆品种PI437654对HG1.2.3.5.7侵染的防御中发挥了潜在的作用。

不亲和大豆品种中差异代谢物的代谢途径

通过KEGG数据库检索，分析差异代谢物的代谢途径。不亲和大豆品种PI437654_SCN与PI437654_0共发生14个代谢途径的改变，亲和大豆品种WM82_SCN与WM82_0、ZH13_SCN与ZH13_0、HF47_SCN与HF47_0分别发生9、9和8个代谢途径的改变(图4)。2， 桌子2）.不相容的响应相关的KEGG途径是本研究的重点，并分为以下两类。

1. （1）

   在不相容和兼容的大豆品种之间重叠Kegg代谢途径。包括cutin，suberine和蜡生物合成（Ath00073），α-亚麻酸代谢（Ath00592）和不饱和脂肪酸（Ath01040）的生物合成的Kegg代谢途径在不相容的大豆品种Pi437654和三种相容的大豆品种之间富集和重叠与两个差分代谢物，16-羟基己二酸和亚麻酸（表2）.此外，在不亲和大豆品种PI437654和感染HG1.2.3.5.7的3个亲和大豆品种中，角质、亚蜡和蜡生物合成KEGG代谢通路(ath00073)均明显被激活(图1)。2， 桌子2），表明其在各种大豆品种的基础防御反应中对HG1.2.3.5.7感染的潜在作用。

2. (2）

   特定的Kegg代谢途径在不相容的大豆品种PI437654中。鉴定了氮素与三种微分代谢物相关的不相容大豆品种PI437654中的九种特异性Kegg代谢途径（表格）的三种差分代谢物相关的含有L-精氨酸，植物苷和D-天冬氨酸。2）.具体相关KEGG代谢途径包括鞘脂代谢(ath00600)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(ath00250)、精氨酸生物合成(ath00220)、单巴坦生物合成(ath00261)、氨基酰- trna生物合成(ath00970)、精氨酸和脯氨酸代谢(ath00330)、次级代谢产物的生物合成-非分类(ath00999)， ABC转运体(ath02010)和氨基酸的生物合成(ath01230)(表2）.虽然酞甲烷，哌啶和吡啶生物碱生物合成KEGG代谢途径（ATH00960）显示了不相容的大豆PI437654中最明显的差异（图。2)，并不是该不亲和大豆品种所特有的，而是在两个亲和大豆品种WM82和ZH13中也存在(表2)2）.在这9个KEGG通路中，鞘脂代谢(ath00600)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(ath00250)和精氨酸生物合成(ath00220)发生了显著变化(图2)。2;桌子2)，表明它们在不亲和大豆品种PI437654中对HG1.2.3.5.7侵染起主要作用。

不亲和大豆品种PI437654代谢产物上调相关基因

为了预测不亲和大豆品种PI437654差异代谢物上调相关基因，对不亲和大豆品种PI437654和3个亲和大豆品种WM82、ZH13和HF47及其相应对照的转录组进行测序，这些转录组数据与代谢组数据相结合。通过比较转录组分析，在不亲和大豆品种PI437654和被HG1.2.3.5.7感染的3个亲和大豆品种WM82、ZH13和HF47中鉴定出了15835个DEGs (6922_UP vs 8913_DOWN)、12,225个DEGs (6001_UP vs 6224_DOWN)、18,362个DEGs (9589_UP vs 873_down)和19,528个DEGs (8944_UP vs 10,584_DOWN)。分别(无花果。S4）.如上所述，在感染HG1.2.3.5.7感染的不相容大豆品种PI437654中，三种关键代谢物（N-乙酰基蛋白酸，尼古丁和D，L-色氨酸）被分为两种类型。一种类型特异于不相容的大豆品种PI437654，其它类型重叠但在三种相容的大豆品种中同时显着下调。

其中一种是在不亲和大豆品种PI437654中显著上调的代谢物，包括n -乙酰氨甲环酸和尼古丁。综合分析结果显示，14个潜在相关基因(10个正相关，4个负相关)同时与n -乙酰氨甲环酸和尼古丁相关，而68个(52个正相关，16个负相关)和54个(21个正相关，33个负相关)相关基因分别与尼古丁或n -乙酰氨甲环酸特异性相关(图)。3.一、表S3）.进行这些相关基因进行分析。生物过程中最丰富的GO术语是“翻译”，其次是“细胞质翻译”和“RRNA改性”（图。S5， 桌子S4）.在细胞组分范畴中，GO术语最多的是“核糖体”、“胞质核糖体”、“胞质小核糖体亚基”、“胞质大核糖体亚基”和“核仁”(图1)。S5， 桌子S4）.在分子功能范畴中，GO术语最丰富的是“核糖体的结构组成”、“mRNA结合”、“rRNA结合”、“RNA结合”和“无机阳离子跨膜转运活性”(图)。S5， 桌子S4）.相应的，相关基因在涉及unigenes最多的KEGG通路中富集，依次为“核糖体”、“RNA降解”、“真核生物核糖体生物发生”、“过氧化物酶体”和“自噬”(图)。4一、表S5）.

另一种类型是在三种相容大豆品种中同时显着下调的不相容大豆品种PI437654中的显着上调的代谢物，其包括D，L-色氨酸。在前150个最相关的基因中，80个基因表现出正相关，而70基因表现出负相关性（图。3.b,表S6）.在这些相关基因中，生物过程中最丰富的阶段是“对几丁质的反应”，其次是“乙烯激活的信号通路”和“防御反应”（图。S5， 桌子S7）.在细胞组分范畴中，GO成分最为丰富的是“胞外区”、“质外体”和“光系统I”(图1)。S5， 桌子S7）.关于分子函数类别，最丰富的GO术语是“转录因子活性，序列特异性DNA结合”，“血红素结合”和“氢醌：氧氧化还原酶活性”（图。S5， 桌子S7）.相关基因在涉及unigenes最多的KEGG信号通路中富集，依次为“植物激素信号转导”、“苯丙类生物合成”、“MAPK信号通路-植物”、“淀粉和蔗糖代谢”和“光合作用”(图1)。4b,表S8）.

这些代谢组学和转录组学联合分析的结果揭示了不亲和大豆品种PI437654代谢产物上调最显著的潜在基因，并提出了可能对应的生物学过程、细胞成分、分子功能和KEGG通路。

本研究以不亲和大豆品种PI437654和亲和大豆品种WM82、ZH13和HF47为材料，通过LC/MS分析，探讨大豆根系代谢产物对HG1.2.3.5.7响应的变化。共鉴定出37个差异代谢物和20个KEGG代谢途径，将其分为三类:亲和和不亲和大豆品种间共有的代谢物/代谢途径;亲和大豆品种的代谢物/代谢途径;不亲和大豆品种的代谢物/代谢途径(表)1和2）.发现某些差异代谢物，如亚麻酸和l -精氨酸，可能参与了一个以上的KEGG代谢途径，而其他差异代谢物，如尼古丁和胡椒酚酸，可能参与了重叠的KEGG代谢途径(tropane，哌啶和吡啶生物碱的生物合成途径)(表2）.然而，只有12种差异代谢物(32%)被发现参与了预测的KEGG代谢途径。

在这项研究中,一些基底与国防有关的潜在的代谢产物,如亚麻酸和16-hydroxyhexadecanoic酸,被发现在不兼容的大豆品种PI437654和三个兼容的大豆品种(WM82, ZH13和HF47)感染HG1.2.3.5.7,和我们的代谢组学分析结果与一些先前的报道一致39.，40，41.]．亚麻酸参与α -亚麻酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成[39.，40，41.，42.，43]．亚麻酸已被发现与非生物胁迫反应有关，如小麦的耐寒性[39.，40，41.]．不饱和脂肪酸被认为是新一代植物抗性诱导剂[42.，43]．Amruthesh等人。发现不饱和脂肪酸的施用诱导珍珠米中的柔软性抗柔性抗性[42.]．Clay等发现，抗性植物核膜中不饱和脂肪酸含量较高海岛棉与宿主抗性有关[43]．

根据相关文献，受HG1.2.3.5.7侵染的不亲和大豆品种PI437654的代谢物和相关KEGG代谢途径可能在植物胁迫、耐受性或抗性中发挥关键作用[44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61]．l -精氨酸是一氧化氮(NO)的前体，NO通过l -精氨酸-NO途径通过NO合酶由l -精氨酸合成。NO被广泛认为是生理和病理生理状态中细胞功能和沟通的重要调节剂[44，45，46]．NO是胁迫反应中的第二信使，参与植物对生物和非生物胁迫的反应[47，48]．l-精氨酸连接并参与许多KEGG代谢途径，如精氨酸和脯氨酸代谢、氨基酰- trna生物合成和ABC转运途径。已有研究表明，脯氨酸积累与植物耐受性呈正相关[49]．氨基酰基trna合成酶催化氨基酸与其同源trna之间的连接，并构成一组特定的酶，确保遗传信息从DNA转移到蛋白质的保真度[50，51]．ABC转运体通过利用ATP水解产生的能量转运物质穿过膜[52]．近年来，ABC转运体因其在农药抗性中的作用而受到越来越多的关注[53]．植物鞘氨醇(PHS)是鞘氨醇家族的一员，具有杀菌活性[54]．Castro等发现PHS降低了细胞的活力，诱导细胞凋亡粗糙脉孢菌［55]．d -天冬氨酸参与谷氨酸、谷氨酸和谷氨酸的代谢，而谷氨酸脱氢酶(GDH)是谷氨酸代谢的中心酶[56]．在小麦中的抗旱性增强与氨同化和低渗透应激下的NADH-GDH活性增加有关[61]．尼古丁被广泛用于杀死多种有害昆虫。58]．El的Vänninen发现尼古丁对Miridae物种的成年人进行了强烈的杀伤作用[60]．尼古丁通过代谢途径参与稀氧丁烷，哌啶和吡啶生物碱的生物合成[62]已经发现生物碱对向日葵柔软的霉菌真菌发起明显的抑制作用单轴霉属halstedii［59]．因此，l -精氨酸、植物鞘氨醇、d -天冬氨酸和尼古丁可能参与了大豆对大豆包囊线虫的不亲和反应。

相反，差分代谢物2-氧代-4-甲基硫丁酸，其在所有三种相容的大豆品种中显示出重叠但是在不相容的大豆品种中，预计将参与三种Kegg代谢途径，包括半胱氨酸和蛋氨酸代谢，葡萄糖酸酯生物合成和2-氧代羧酸代谢。此外，在用Hg1.2.3.5.7的三种相容的大豆品种（ZH13，WM82和HF47）中同时下调2-氧代-4-甲基硫酸酸，其可能导致葡糖苷的生物合成减少。据报道，葡萄糖苷是一种植物次级代谢物，对植物病原体和土壤植物害虫进行预防作用[63，64]．另外，据报道，黄芪生物合成和二萜类生物合成的Kegg代谢途径被发现富含植物抗原性的植物抗性，以富含一种或两个相容的大豆品种[65，66]．这些类型的差异代谢物及其相关KEGG代谢途径可能在操纵宿主先天免疫以建立和维持大豆包囊线虫发育的取食位点中发挥作用[67，68]．在本研究中，我们使用了一个本地代谢物校准数据库来识别潜在的差异代谢物，确保了结果的准确性[16.，69，70]．然而，这个数据库也存在潜在的缺点，因为它的容量有限，缺乏许多重要的化合物。本研究深入分析了不亲和大豆品种对大豆包囊线虫侵染的不同代谢组反应，并鉴定了关键差异代谢物和相关KEGG代谢途径。预测差异代谢物可能的功能及相关KEGG代谢途径。

本研究鉴定出在受HG1.2.3.5.7感染的不亲和大豆品种PI437654中显著上调的3个关键代谢物(n -乙酰氨甲环酸、尼古丁和D, l -色氨酸)，并将其分为两类。代谢组学分析与转录组表达谱的结合，有助于预测与不亲和大豆品种PI437654最显著上调代谢物相关的潜在基因，并提示可能相应的生物学过程、细胞成分、分子功能和途径。

本研究对不亲和大豆品种PI437654与感染HG1.2.3.5.7的3个亲和大豆品种的主要代谢组学差异进行了表征。共鉴定出37个差异代谢物和20个KEGG代谢途径，将其分为三类:亲和和不亲和大豆品种之间的代谢物/代谢途径重叠;亲和大豆品种的代谢物/代谢途径;不亲和大豆品种的代谢物/代谢途径。在预测的KEGG代谢途径中发现了12种不同的代谢物。此外，尼古丁显著上调、d -天冬氨酸显著下调等14个差异代谢物及其相关KEGG通路如莨菪碱、哌啶和吡啶生物碱的生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、不亲和大豆品种PI437654的鞘脂代谢和精氨酸生物合成显著改变并富集，可能在防御HG1.2.3.5.7中起关键作用。此外，结合代谢组学分析和转录组表达谱，有助于预测与不亲和大豆品种PI437654最显著上调代谢物相关的潜在相关基因，并提示可能的生物学过程、细胞成分、分子功能和途径。据我们所知，本研究首次采用代谢组学和转录组学相结合的方法研究了不亲和大豆品种感染大豆包囊线虫后的不同反应。本研究不仅鉴定了PI437654对大豆包囊线虫HG1.2.3.5.7不亲和反应的潜在新代谢物和相关基因，也为大豆和大豆包囊线虫的相互作用提供了新的认识。

大豆包囊线虫的制备与接种

不亲和大豆品种PI437654和亲和大豆品种WM82、ZH13和HF47的种子均来自中国国家基因库(http://www.nationalgenebank.org/）.大豆种子在1.0% (w/v) NaClO溶液中浸泡5分钟[71然后用消毒水清洗种子以去除残留的NaClO。种子表面消毒后，置于26°C的潮湿消毒滤纸之间。约48 h后，将萌发的种子移栽于75% (v/v)土壤和25% (v/v)沙土混合物中，置于温室中培养，昼夜温度设置为28°C/26°C，光周期为12 h [72，73，74]．

将HG1.2.3.5.7的单个包囊培养在兼容大豆品种ZH13的根上，在温室的蒸压土壤混合物中生长，温度为28°C/26°C，光周期为12 h [13.，73]．收集包囊并将其放置在500目(25 μm)的3 mM氯化锌筛上₂溶液然后在25℃下在黑暗中孵育[38.，73，75]．用玻璃管收集阴影的J2S [76]．14日龄大豆苗接种1000 jps /苗。接种后8 d，分别收获不亲和大豆品种PI437654和亲和大豆品种WM82、ZH13和HF47以及相应对照的根系样品。每种类型的根样本分为两部分进行代谢组学和转录组学分析。

青少年染色和囊肿计数

在8 dpi下收集不相容的大豆品种PI437654和三种相容大豆品种，WM82，ZH13和HF47的根样品，在水中冲洗，然后将5.25％NaClO溶液浸泡5分钟。然后将大豆样品在水中漂洗两次10分钟和15分钟。将大豆样品滴入沸腾的0.01％酸紫红色溶液30秒，然后冷却后在水中漂洗。将样品转移至甘油中并储存在甘油中[77，78，79，80]．观察到HG1.2.3.5.7线虫的形态，并用显微镜（Olympus-SZ2-ILST）计算不同大豆根内的数量。

在60 dpi时，大豆植株所在的土壤混合物样品悬浮在水中，大豆根部经过清洗和摩擦处理，以除去雌性和包囊。通过20目(850 μm，在顶部)和60目(250 μm，在底部)的嵌套筛分悬浮液，提取囊肿[81，82]．以每株植物的包囊形式记录的包囊数目[81，82]用立体显微镜（Olympus-BX53F）计数。

使用LC/MS的非靶向代谢组学

在8 DPI时，收获不相容的大豆品种PI437654的根样本和三种兼容大豆品种，WM82，ZH13和HF47，以及它们的相应控制，并命名为PI437654_SCN，PI437654_0，WM82_0，WM82_0，ZH13_SCN，ZH13_0，HF47_SCN和分别为HF47_0。将每个大豆根样品研磨成液氮中的粉末。然后将80mg的根粉末滴入1.5ml离心管中。然后，向管中加入20μl内标（0.3mg / ml L-2-氯苯基氨基氨基氨基（0.3mg / ml L-2-氯苯基氨基氨基）和1ml 70％甲醇（甲醇：水= 7：3（体积比））。将管置于-20℃以进行预冷，并将混合物用研磨机接地，在60Hz下进行2分钟。然后，在4℃下进行超声萃取30分钟。在20℃静置20分钟后，将样品以13,000rpm离心15分钟，在4℃下以13,000rpm，用注射器收获200μl上清液。对每个样品重复该过程三次，组合来自相同源的上清液。过滤通过0.22μm有机相针孔过滤器后，对应的上清液进行LC-MS分析。 LC-MS analysis was performed on an Agilent 1290 Series UHPLC system coupled to an Agilent 6540 TOF/MS instrument with a Dual AJS ESI source. Each treatment had six repetitions [16.，83]．

代谢物分析

代谢物通过使用本地代谢物校准数据库进行识别，该数据库包含约500个代谢物，基于保留时间和高精度质量值的峰值信息标准[16.，69，70]．使用SIMCA-P进行多变量统计分析，包括主成分分析（PCA）和局部最小二乘判别分析（PLS-DA）⁺14.0版本软件[84]，以区分不亲和大豆品种PI437654与受HG1.2.3.5.7侵染的3个亲和大豆品种WM82、ZH13和HF47之间代谢谱的差异。霍特林的T2区域，在模型的得分图中显示为一个椭圆，定义了模型变异的95%置信区间。根据t检验，变量为p-value < 0.05视为差异显著的变量[83]．代谢产物VIP(在投影中具有可变重要性)值为> 1.0和p- 选择<0.05被选为差分代谢物[83]．通过差异代谢物预测KEGG代谢途径p-value <0.05 [83]．

转录组分析

对相同的6个大豆品种取样，随机分为两组，代表两个生物重复。使用植物RNA试剂盒(中国天根)提取每个样本的总RNA。使用安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦)对总RNA进行定量和质量分析[85]．1微克RNA完整性值(RIN)高于8.0的总RNA用于随后的库的制备[86]．

兴建图书馆[78，85，86]，用富含寡核苷酸(dT)的磁珠富集和纯化mRNA，然后破碎成短片段。以裂解后的mRNA片段为模板，合成第一链和第二链cdna。使用AxyPrep Mag PCR clean kit (Axygen, USA)进一步纯化双链cDNA，使用End Prep Enzyme Mix (NEB, USA)添加适配器。使用AxyPrep Mag PCR cleanup kit (Axygen, USA)回收约450 bp的片段。PCR产物经纯化后，用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, USA)进行验证，并通过Qubit和real-time PCR分析(Applied Biosystems, USA)进行定量。采用2 × 150对端(PE)配置和Illumina Novaseq 6000系统进行RNA测序。

通过删除包含适配器和PLOY-N序列的读取和从原始数据的低质量读取来获得清洁数据[85，86]．参考基因组和基因模型注释文件从SoyBase网站(https://soybase.org/GlycineBlastPages/blast_descriptions.php）.配对结束清洁读数通过使用Hisat对齐参考基因组[35.]．HTSEQ用于计算映射到每个基因的读数的数量。在每百万片段（FPKM）值/百万千克/百万片段（FPKM）值的片段中测量基因的表达。显示绝对日志的基因₂将FC (fold change) >0.5和pvalue< 0.05定义为DEGs，使用DESeq2软件计算显著性[87]．GO (Gene Ontology)分析使用Blast2GO [86，88]．KOBAS 2.0用于检测KEGG通路中DEGs的统计富集[35.]．

代谢物和转录组数据之间的相关分析

相关分析如前所述进行[85，89]．简单地说，通过计算Pearson相关系数来整合代谢组和转录组数据。计算不亲和大豆品种PI437654与亲和大豆品种WM82、ZH13和HF47的代谢物的平均含量和DEGs的平均转录丰度。采用单因素方差分析(ANOVA)结合t检验，根据ap值< 0.05。在R (R Core Team)中进行了总转录组数据集的PCA [35.]．系数是从对数中计算出来的₂各代谢物的FC值和日志₂每个转录本的FC值。相关性根据R确定²系数> 0.9。使用Cytoscape说明了代谢物和转录组数据之间的关系。前150个相关基因是基于基因的数量和所涉及的网络的复杂性分析的焦点。

本研究使用的大豆品种来自中国国家基因库(http://www.nationalgenebank.org/）.支持这项研究结果的数据已储存在美国国家航空航天局(https://db.cngb.org/cnsa/)，登录号CNP0001271。

ABC转运蛋白:

ATP结合盒转运体

方差分析:

方差分析

度:

差异表达基因

DPI：

接种后的天数

舰队指挥官:

折叠变化

FPKM：

每公斤百万零件

国民幸福指数:

谷氨酸脱氢酶

去：

基因本体论

GWAS:

全基因组关联研究

HF47：

伊峰47.

j2:

第二阶段的少年

Kegg：

京都基因和基因组百科全书

LC / MS：

液相色谱-串联质谱法

地图：

促丝糖型活化蛋白激酶

NADH-GDH:

烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸-谷氨酸脱氢酶的还原形式

没有:

一氧化氮

PC:

聚碳酸酯

主成分分析:

主成分分析

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

体育:

Paired-end

PHS：

植物鞘氨醇

PLS-DA:

偏最小二乘鉴别分析

rin：

RNA完整性

SCN：

大豆囊肿线虫

TOF / MS：

飞行时间质谱仪

UHPLC:

超高效液相色谱法

VIP：

投影重要变量

与:

与

WM82:

威廉姆斯82

ZH13:

Zhonghuang 13

我们感谢彭欢博士从植物保护研究所，中国农业科学院，了解方法和修订的建议。我们感谢来自上海上海的上海奥博博博士，中国上海市中国上海有限公司提供数据分析支持。我们感谢中国国家基因银行为大豆品种支持。我们感谢来自中国农业大学的Vijai Bhadauria博士进行批判性校对。

该项目得到了中国自然科学基金（31872924），河南省重点科技项目（192102110003）和大豆产业技术系统（Cars-04-PS05）。该资助者在研究设计，数据收集和分析，数据解释或写作中没有作用。

作者笔记

1. 施雪红、陈谦四对这项工作做出了同样的贡献。

从属关系

1. 中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193

   施雪，刘世明，彭德良，孔林安

2. 中国河南郑州郑州烟草研究所

   Qiansi陈

3. 2 .黑龙江省农业科学院大豆研究所，黑龙江哈尔滨150086

   Jiajun王

贡献

LAK和DLP构思了这项研究;XS和LAK撰写了手稿。XS、QSC、JJW进行了实验;XS和QSC进行了统计分析;SML对手稿进行了修改。所有的作者讨论了结果，并评论了手稿，并批准了潜在的出版提交。

相应的作者

对应于刘德亮彭或者Lingan香港．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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