转录组和蛋白质组的综合分析揭示了植物-传粉者相互作用中的蜜腺和花蜜性状gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba鲍勃罗夫gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

Nitraria Tanguteum.gydF4y2Ba是一个重要的沙漠灌木，表现出对干旱，盐和风腐蚀胁迫的抵抗力。它是其地区的中央生态物种。在这里，我们研究了如何gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba已经适应了成功的繁殖策略gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们发现了gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba主要是由Hymenoptera，Diptera和Coleoptera订单的昆虫授粉。gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba花很小，蜜腺由分泌花蜜的表皮细胞组成，位于花瓣内侧。此外，通过对四个连续花发育阶段转录组的分析发现，与花和蜜腺发育、花蜜生物合成和分泌、类黄酮生物合成、植物激素信号转导和植物与病原互作相关的主要差异表达基因均呈现动态表达。从花蜜中鉴定出7种重要的蛋白质，其中l -抗坏血酸氧化酶蛋白最早在植物花蜜中发现。根据这些蛋白的生理功能，我们预测花的花蜜蛋白gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba在防御微生物侵害和清除活性氧方面具有重要作用。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这项研究表明gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba是一种昆虫授粉植物，其土壤由专门为分泌毛细胞的秘密表皮细胞组成。我们鉴定了大量差异表达的基因控制花和土壤发育，花蜜生物合成和分泌，黄酮类生物合成，植物激素信号转导和植物病原体相互作用。我们建议蛋白质存在gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba花蜜可能具有抗菌和氧气清除效果。这些结果为探索生殖系统的生殖系统提供了科学依据gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba和其他干旱的沙漠植物功能。gydF4y2Ba

授粉成功率是植物繁殖的关键，因此是植物生殖生态学和进化生物学的主要重点之一。花粉的运动在很大程度上决定了植物之间的基因汇率，为物种演化的研究提供了基础[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．通常，植物可以用昆虫作为携带者进行施肥，以实现更准确和有效的遗传信息传播。特别是对于较小的花器器官，使人工授粉非常不方便。因此，昆虫的辅助授粉是主要重点之一。为了吸引昆虫，花卉特征，水平形态和花蜜特征是最重要的因素，它们在植物和粉丝簇之间的关系中发挥着关键作用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

蜜腺是几乎所有现有开花植物所拥有的分泌器官[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．在不同的植物物种中，水平的形状和尺寸变化，但内部结构通常相似，通常由一层分泌表皮细胞和几层细胞分泌组织细胞组成[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．蜜腺的位置和结构可以与不同的花结构联系在一起，进一步影响传粉者的行为[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．例如，花蜜刺可以限制传粉者的类型，从而促进生殖隔离;例如，管状花往往由蜂鸟授粉[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．以往的研究发现许多发育基因在蜜腺中表达，并且是其发育所必需的，如gydF4y2Ba蟹爪gydF4y2Ba（gydF4y2BaCRC.gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba叶子gydF4y2Ba（gydF4y2BaLFY.gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba不寻常的花器官gydF4y2Ba（gydF4y2Ba飞碟gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba刀片上的叶片1gydF4y2Ba（gydF4y2BaBOP1gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba刀片 - 叶片2gydF4y2Ba（gydF4y2BaBOP2gydF4y2Ba)，gydF4y2BaApetala2.gydF4y2Ba（gydF4y2BaAP2.gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba无性生殖的gydF4y2Ba（gydF4y2BaAG)gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba防碎的gydF4y2Ba（gydF4y2BaSHP.gydF4y2Ba）gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2BaAGL1 / SHP1.gydF4y2Ba，gydF4y2BaMYB24gydF4y2Ba，gydF4y2BaMYB57gydF4y2Ba和gydF4y2BaPIN6gydF4y2Ba［gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

众所周知，花蜜不仅是蜂蜜的直接来源，而且是许多昆虫生存的基础。当昆虫在花蜜上喂食时，他们的身体会携带花粉。因此，花蜜的特点也将直接影响粉丝器和授粉效率的类型。花蜜是糖，蛋白质，氨基酸，多酚，脂质和其他物质的混合物，其组分在不同物种之间变化[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]．当花蜜被分泌出来时，它会在花的基部或一定距离处聚集。暴露在外的花蜜往往会吸引甲虫、苍蝇、短吻蜂和飞蛾。然而，隐藏在花冠深处的花蜜主要吸引长鼻蝴蝶和飞蛾[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba]．花蜜的数量也会吸引不同的传粉者，例如大黄蜂和蝙蝠喜欢大量的花蜜，而花虻和小型独居蜜蜂则喜欢少量的花蜜[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba]．同样，花蜜的一致性也将影响传粉机类型。以前的研究发现了几种基因涉及调节花蜜合成和分泌物，例如gydF4y2Ba细胞壁INVERTASE4gydF4y2Ba（gydF4y2BaCWINV4.gydF4y2Ba)，gydF4y2BaMYB21gydF4y2Ba，gydF4y2BaMYB305gydF4y2Ba，gydF4y2BaNEC1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNEC3gydF4y2Ba，gydF4y2BaJMTNTR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaSweet9和Cyp86b1.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．此外，一些花蜜蛋白质具有抗菌，氧清除或能量代谢功能，主要包括Nectarin I，II，III，IV，V，II类和III章节酶（CHI2，CHI3），超氧化物歧化酶（SOD），单羟基血基酸盐还原酶（MDAR），过氧化物酶（POD），橡胶伸长因子蛋白（REF），非特异性脂质转移蛋白（NSLTPS）和果糖-1,6-双磷酸酶（FBP2）[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

Nitraria Tanguteum.gydF4y2Ba自从长时间以来，在中国西北部的干旱沙漠地区生存和生长，对干旱，盐和风蚀压力产生了强大的耐受性[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．它的叶子含有多种矿物元素和挥发油，营养丰富，口感好，是干旱地区适宜的饲料植物[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．此外，果实gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba帮助降低血压和血糖[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba]．所以，gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba有趣的生态和经济前景。此外，其繁殖过程已经开发了对周围环境条件的适应性，它可以产生种子进行物种维护。因此，了解其繁殖过程至关重要。出于这些原因，在这里，我们通过各种调查和实验全面地研究其生殖的生态特征，包括研究人员物种的研究及其行为，与土壤的行为，形态和发展，与土壤发育和花蜜分泌相关的基因，以及鉴定花蜜的蛋白质。本研究拓宽了对花卉和授粉剂之间的关系的现有知识，并含有关于花蜜合成的分子和代谢机制的新数据以及它如何协助防御微生物。因此，从生态学的角度至关重要，利益对干旱沙漠植物的进一步育种研究。gydF4y2Ba

花的发育及访花者的行为模式gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba

Nitraria Tanguteum.gydF4y2Ba鲜花的身材较小，双性恋与雌蕊围绕着由AndroeCium包围。我们观察到开花期从5月到六月起，完全盛开的阶段持续约3-5天。为了表征花卉发展，我们在四个形态上截图中观察到其花。在平方期间，致密地布置花瓣（高度高，直径为3mm）（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA，第1阶段）。然后，花瓣在早期开花期间开始扩大和分裂，黄耐力逐渐出现。在这个阶段，花的高度和直径均为3mm（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB，第2阶段）。在完整的盛开时期，每朵花清楚地显示五个径向布置的小白花瓣，其直径约为5mm及其高度恒定。（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba花期结束时，花瓣和雄蕊逐渐枯萎脱落，子房外露，子房发育为果实(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD，第4阶段）。gydF4y2Ba

在完全盛开期间，所有昆虫觅食花蜜或花粉。我们观察到昆虫收集花蜜或花粉，它们授粉花。当游览鲜花时，他们通过使用脚来固定花瓣以固定身体，一般保持在一朵花10-30岁，然后飞到另一个花。他们的访问发生在9:00-17：00之间。根据我们的观察和记录的花卉游客，它们主要是Hymenoptera，Diptera和Coleoptera。Hymenoptera游客包括gydF4y2Ba蜜蜂科gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa - c),gydF4y2BaMegachilidae.gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad），gydF4y2BaPteromalidae.gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae）和gydF4y2Ba蚂gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaF）。Diptera访客包括gydF4y2Ba蝇科gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bag)和gydF4y2Ba蚊科gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaH）。鞘翅目的访客包括gydF4y2BaCoccinellidae.gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba我和gydF4y2BaChrysomelidae.gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba它们可以用口器从蜜腺中采集花蜜。蜜蜂体表密集的绒毛能附着花粉，完成授粉。我们还发现蜜蜂在腹部携带花粉块(如图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)，而蚊子在它们的腿上携带花粉(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba基于我们的观察，我们发现除了蚂蚁可能是花蜜窃贼外，其他的访花者也是有效的传粉者，他们可以在采集花粉或吸蜜的同时进行授粉。gydF4y2Ba

的特征gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba蜜腺结构gydF4y2Ba

当固定花样进行蜜腺结构观察时，我们发现透明液体在花瓣的底部分布（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一种）。在第1阶段，分泌表皮细胞并不明显，但具有常规表面。它们是椭圆形但尚未突出（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).随后，在第2阶段，分泌表皮细胞开始与周围细胞明显分化，并逐渐向外突出。细胞的顶端更亮，可能是由于花蜜即将分泌(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC）。在第3阶段，分泌表皮细胞显示出大量短的乳头状突起。此外，分泌表皮细胞显示出条纹角质层（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad）。在第4阶段，秘密粒瘤的数量和长度达到其最大值。分泌表皮细胞逐渐开始缩小并显示它们明显的条纹角质层，最后与花瓣一起脱落（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

四个连续花卉发展阶段的全局转录组变化与比较分析gydF4y2Ba

根据我们之前的表型观察gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba在蜜腺及其传粉昆虫中，一些关键基因是否可能在花的发育中起重要作用。我们对花发育的四个连续阶段的样本进行了rna测序，在每个阶段应用三个生物复制。总共，我们在bgiiseq -500平台上对12个样本进行了测序，每个样本产生的测序量约为6.22Gb。平均72.97%的读取被映射(表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)．然后我们确定了所有样本之间的Pearson相关性(图。gydF4y2BaS1gydF4y2Baa)，发现复制样本相关性很强，证实了我们RNA-seq数据的一致性。数据集显示了基于每千碱基外显子每百万reads图谱(FPKM)值和基因注释构建的基因表达水平gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．每个样品的基因表达分布如图2所示。gydF4y2BaS1gydF4y2Bab.我们通过比较不同发育阶段鉴定了初步差异表达基因(DEGs)(图。gydF4y2BaS1gydF4y2BaC）。gydF4y2Ba

为了分析连续发展阶段的差异表达的基因的功能，我们做了三个独立的阶段比较。首先，在阶段1和2（过渡期：1-2天）之间，鉴定了21,351只次数，具有3526个上调基因和17,825个下调基因，所有三个比较中最大的含量最多，显示出高表达第一阶段过渡的动态（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一种）。Kegg Encropment揭示了这些基因的主要功能是核糖体生物发生，吲哚生物合成，抗坏血酸和醛酸盐代谢，淀粉和蔗糖代谢和类黄酮生物合成物（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

第二，在第2 - 3阶段(过渡期半天)，共鉴定出4235个基因，其中上调基因2253个，下调基因1982个，是3个阶段中基因数量最少的(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC）。上调和下调基因数量没有明显的差异。对该第二转变的Kegg浓缩分析主要揭示了次级代谢物的代谢途径，二次代谢物的生物合成，氨基酸生物合成，昼夜节律，戊糖和葡糖醛酸酯互联和花青素生物合成术（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad）。gydF4y2Ba

最后，在阶段3和4（过渡期：3-5天）之间，我们鉴定了11,865次，具有7706个上调基因和4159个下调基因（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae).大量基因在第4阶段表达上调。更重要的途径有次生代谢产物的生物合成、代谢途径、生理节律、植物激素信号转导、植物与病原菌相互作用、苯丙素生物合成和花青素生物合成。此外，我们还鉴定了一些光合作用相关的途径，如光合作用-天线蛋白、光合作用、卟啉和叶绿素代谢(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaF）。在此期间，花瓣逐渐脱落。水果通过光合作用和抵抗病原体积累碳水化合物，以确保正常发育。gydF4y2Ba

花卉开发期间的时间课程RNA-SEQ分析gydF4y2Ba

进一步调查可能调节花发育的生理过程的关键基因并响应粉丝器探访，我们分析了在所有四个阶段之间差异表达的基因，并确定了28,983次（数据集）gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．然后根据它们的表达模式，将它们分为10个簇，可以通常分为四种类型：上调（簇1和5），下调（簇6和8），上调（簇6和8），下调（簇2,3和7）然后下调（簇4,9和10）（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一种）。考虑到那种花gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba在阶段2和3期间绽放和分泌花蜜，我们专注于分析簇2,5和7中的基因，这可能有助于我们探索靶向基因或途径。簇2由在阶段2和3中强烈表达的基因组成。Kegg富集表明，在该簇中富集了“戊糖和葡糖醛酸酯互连”和“植物 - 病原体相互作用”（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)。For cluster 5, genes were highly expressed during stages 2–4, and the main functions of these genes were ‘Glutathione metabolism’, ‘Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor biosynthesis’, ‘MAPK signaling pathway’, ‘Flavonoid biosynthesis’, ‘Glycolysis/Gluconeogenesis’, ‘Plant hormone signal transduction’ and ‘Starch and sucrose metabolism’ (Fig.5gydF4y2BaC）。对于群集7，基因在第3阶段高度表达，然后快速下降。这些基因的功能是“MAPK信号通路”，'果糖和甘露糖代谢'，'乙醛酸和二羧酸代谢'，'二萜类生物合成'和'植物激素信号转导'（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad）。gydF4y2Ba

此外，我们还鉴定了大量参与花和蜜腺发育的DEGs和酶(gydF4y2BaaggydF4y2Ba（gydF4y2Ba榴弹炮gydF4y2Ba)家庭gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2BaAGL11gydF4y2Ba，gydF4y2BaAGL18gydF4y2Ba，gydF4y2BaAGL27gydF4y2Ba，gydF4y2BaAGL30.gydF4y2Ba，gydF4y2BaCRC.gydF4y2Ba，gydF4y2BaAP1.gydF4y2Ba，gydF4y2BaAP2.gydF4y2Ba)、淀粉和蔗糖代谢(-果呋喃糖苷酶(gydF4y2Baβ-FFasegydF4y2Ba），Gdsl酯酶/脂肪酶（gydF4y2BaGELPgydF4y2Ba)、糖基转移酶(gydF4y2BaGTsgydF4y2Ba），Fructokinase（gydF4y2BafrgydF4y2Ba），葡萄糖苷酶（gydF4y2Baglu.gydF4y2Ba)，gydF4y2BaCWINV4.gydF4y2Ba，gydF4y2BaSWEET2gydF4y2Ba，gydF4y2BaSWEET5gydF4y2Ba，gydF4y2BaSWEET6gydF4y2Ba，gydF4y2BaSWEET7gydF4y2Ba，gydF4y2BaSWEET9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba甜蜜的14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba糖果15.gydF4y2Ba），黄酮类生物合成（gydF4y2BaFLS的gydF4y2Ba)、植物激素信号转导(gydF4y2BaIAAsgydF4y2Ba，gydF4y2Ba阿富汗二月gydF4y2Ba， br信号激酶(gydF4y2BaBSKsgydF4y2Ba），德拉，gydF4y2BaGID1.gydF4y2Ba，含茉莉齐米域的蛋白质（gydF4y2Bajaz.gydF4y2Ba)和植物与病原体相互作用(gydF4y2BaRPS2gydF4y2Ba，gydF4y2BaWRKYgydF4y2Ba） （图。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)．根据上述结果，我们发现这些基因主要富集糖合成，互连和代谢和抗微生物活性。gydF4y2Ba

花卉发育通常由各种转录因子（TFS）调节;因此，我们预测了编码TFS并根据其TF系列对其进行分类的参数（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba， 桌子gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)．在我们对阶段1至2的比较中，差异表达的TFS主要包括来自的基因gydF4y2BaBhlh.gydF4y2Ba，gydF4y2BamygydF4y2Ba，gydF4y2Ba南汽gydF4y2Ba，gydF4y2BaAP2-ereBP.gydF4y2Ba，gydF4y2BaWRKYgydF4y2Ba和gydF4y2Ba麦斯gydF4y2Ba家庭（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA-B），其中大部分在阶段2中被下调2.在阶段2和3之间，我们无法检测到TF表达的显着差异，并且差异表达的TFS的数量非常低（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba光盘）。它们还参与了花卉发育，代谢途径和应力耐受性。在阶段3和4之间，更多的TFS被上调，主要包括gydF4y2BamygydF4y2Ba，gydF4y2BaAP2-ereBP.gydF4y2Ba，gydF4y2BaWRKYgydF4y2Ba，gydF4y2BaBhlh.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba南汽gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae).以TF家族下调为主gydF4y2Ba麦斯gydF4y2Ba，gydF4y2BamygydF4y2Ba和gydF4y2BaBhlh.gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaF）。gydF4y2Ba

识别和功能诠释gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba花蜜的蛋白质gydF4y2Ba

从先前的转录组数据中，我们检测到许多花蜜合成和分泌和植物病原体相互作用基因的表达（图。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)．所有这些基因与花蜜及其潜在功能有关。然后使用Coomassie辉煌的蓝色R-250染色以在十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶中可视化花蜜蛋白质。蛋白质尺寸范围为约7至67kDa，在两个重复的车道中，我们可以区分九个不同的带（图。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．然后，从凝胶基质中分离九个单独的蛋白质条带，并通过液相色谱 - 串联质谱（LC-MS / MS）检查它们的内容物。我们通过搜索瑞士-PLAT数据库成功地获得了检测到的肽上的基本信息（蛋白质名称，蛋白质加入，蛋白质分子量，麦白分子量，麦白分子量，命中肽）（表gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

使用Blast2GO作业用基因本体(GO)术语注释花蜜蛋白，然后根据三个主要GO类别对鉴定的蛋白进行分类(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）：生物过程（BP），细胞组分（CC）和分子功能（MF）。对于BP类别，预测大多数蛋白质在代谢，细胞和单生体过程中起作用，以及对刺激的反应。关于CC类别，我们发现大多数蛋白质预测用于将其定位于细胞和细胞器，然后是膜，细胞外区域，大分子复合物，细胞结和膜封闭的腔。最后，在MF类别中，大多数蛋白质可能具有催化和结合活性。总之，所识别的蛋白质中最高度代谢的GO类别是代谢，细胞和单生体过程，以及催化活性（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，根据条带的位置，蛋白质的分子量，得到的多肽和其他植物报道的蛋白质，我们选择了7个有趣的蛋白质(表)gydF4y2BaS3gydF4y2Ba）：SOD，MDAR，POD，REF，FBP2，NSLTPS和L-抗坏血酸氧化酶（AO）。值得一提的是，AO首先在植物花蜜中找到。一起服用，这些研究表明了花蜜蛋白gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba可以主要具有抗菌和活性氧气清除效应。gydF4y2Ba

real time qPCR验证RNA-seq数据和LC-MS/MS数据gydF4y2Ba

旨在验证我们RNA-SEQ和LC-MS / MS数据的准确性，我们通过QRT-PCR随机确定了几种基因的表达水平。gydF4y2BaAOgydF4y2Ba在叶子和花中发现的表达，在阶段1-3期间最高（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Baβ-FFasegydF4y2Ba和gydF4y2Baβ-1,3-glusgydF4y2Ba，在第2期表达量最高，在第3-4期表达量下降(图3)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab和c)。此外，我们发现gydF4y2BaCRC.gydF4y2Ba在花中非常高，而叶和茎几乎没有它(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bad)。同样的,gydF4y2BaFLS的gydF4y2Ba与其他组织相比，在花卉开发期间高度表达（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bae)。最后，糖运输司机（gydF4y2BaSWEET5gydF4y2Ba和gydF4y2BaSWEET9gydF4y2Ba）随着花的发展进展，在花组织中表达了高度表达，但在花的寿命结束时表现得非常强烈地减少（图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaF-G）。在我们的QRT-PCR数据和RNA-SEQ或LC-MS / MS数据之间观察到良好的相关性，这证实了它们的高可靠性。gydF4y2Ba

参与参与生理进程的基因或酶，NECTAL分泌和抗微生物活性gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba

基于转录组和蛋白质组分析，我们发现主要有两个级联网络由许多途径组成，调节育种系统gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．其中一个是糖合成，互连和代谢，包括淀粉和蔗糖代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢，果糖和甘露糖代谢和糖酵解/葡糖生成。另一种是抗微生物活性和活性氧的清除，包括谷胱甘肽代谢，植物激素信号转导和植物 - 病原体相互作用。主要是基因gydF4y2BaCRC.gydF4y2Ba调控蜜腺发育的基因在所有四个阶段都有高表达。蜜腺成熟时分泌花蜜。随后，蔗糖合酶(gydF4y2BaSS.gydF4y2Ba）和蔗糖磷酸合酶（gydF4y2BaSPSgydF4y2Ba）合成蔗糖，然后通过β-果呋喃糖苷酶水解（gydF4y2Baβ-FFasegydF4y2Ba）生产D-果糖和D-葡萄糖。果糖的进一步代谢需要果糖酶磷酸化（gydF4y2BafrgydF4y2Ba），产生D-果糖-6P和β-D-果糖-6P。D-果糖也可以通过β-D-葡萄糖苷转化为D-葡萄糖（gydF4y2BaβgcgydF4y2Ba）和1,3-β-葡聚糖（gydF4y2Baβ-1,3-glusgydF4y2Ba)．β-D-果糖-6P和β-D-果糖-1,6PgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba可以彼此转换。D-果糖-6P可用于合成蔗糖-6（蔗糖-6），其通过蔗糖 - 磷酸合酶催化（gydF4y2BaSPSgydF4y2Ba)．我们进一步确定了双向糖转运蛋白gydF4y2Ba甜蜜的5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba甜蜜的9gydF4y2Ba．这些酶大部分在第2和第3阶段高表达。gydF4y2Ba

随着花蜜分泌的，它吸引了粉碎机的探索（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．昆虫可能携带细菌，激活植物的防御相关基因。研究发现，与油菜素内酯途径(gydF4y2BaBak1.gydF4y2Ba，gydF4y2BaBKI1gydF4y2Ba，gydF4y2BaBSKgydF4y2Ba，gydF4y2BaBZR1.gydF4y2Ba)的表达量在第4阶段最高，这可能是由于这是果实形成的关键时期。的gydF4y2BaWRKYgydF4y2BaTF在第4阶段的表达水平也是如此。其他与防御相关的基因，如gydF4y2BaPR-1gydF4y2Ba，gydF4y2BaAOgydF4y2Ba，gydF4y2Ba草皮gydF4y2Ba，gydF4y2Ba荚gydF4y2Ba和gydF4y2BaMDARgydF4y2Ba我们在花蜜的蛋白质组中也检测到，在整个花的发育阶段2和3中高度表达了这些结果描述了花卉发育的生理过程gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba在基因表达水平并显示出该研究的相关性。gydF4y2Ba

授粉生态学gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba

作为从第三个时期幸存的植物，gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba直到现在一天能够茁壮成长，这使得研究其育种行为具有重要意义。gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba拥有大量的特征，有助于其性繁殖，如鲜花，这些花很多，而且减少了花挡风阻力，并阻止它们容易被吹掉。花冠是白色的，允许在花内的温度调节，确保花粉发育，同时也吸引了昆虫授粉，导致施肥成功。以前的研究报告说gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba具有混合亲和力和自相容性，但特定粉丝师没有详细的报告[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在本研究中，我们发现传粉昆虫gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba主要包括Hymenoptera，Diptera和Coleoptera（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．很可能是由于尺寸小，曝光花蜜的小体积小，gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba花主要吸引小昆虫。此外，这些昆虫在内蒙古生长的大多数植物上都能找到[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．它们的拜访行为可以促进异花授粉gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba，这证实它是一种昆虫授粉植物。gydF4y2Ba

花卉发育过程中的基因调节gydF4y2Ba

花的发育涉及许多受大量基因调控的生理过程。在本研究中，我们发现花的逐渐开放，淀粉的合成和分泌的花蜜发生在第1到2个阶段gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba花的发育，与核糖体生物发生、吲哚生物碱生物合成、抗坏血酸和醛达酸代谢、淀粉和蔗糖代谢以及类黄酮生物合成相关基因的差异表达有关。第2阶段和第3阶段的代谢和碳水化合物合成转化相关基因的表达存在差异，这可能与植物分泌大量花蜜及对传粉者来访的反应有关。在第3 ~ 4阶段，DEGs主要与代谢途径、抗菌途径和抗性途径有关，可能是由于花已经凋落，果实的正常发育更为重要。这些结果与从其他植物中提取花朵的结果相似[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

此外，TF家族在植物中广泛发生，主要参与控制植物生长，花卉发育，应力调节，器官发展和黄酮类生物合成，如gydF4y2BaBhlh.gydF4y2Ba，gydF4y2BamygydF4y2Ba，gydF4y2Ba南汽gydF4y2Ba，gydF4y2BaAP2-ereBP.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba麦斯gydF4y2Ba和gydF4y2BaWRKYgydF4y2BaTF的家庭(gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．将这些调查结果与我们发现丰富的途径相结合，在此阶段可能是花卉发展gydF4y2Ba麦斯gydF4y2Ba,而gydF4y2BamygydF4y2Ba和gydF4y2Ba南汽gydF4y2Ba调节的类黄酮生物合成。gydF4y2BaBhlh.gydF4y2Ba，gydF4y2BamygydF4y2Ba，gydF4y2BaWRKYgydF4y2Ba和gydF4y2BaAP2-ereBP.gydF4y2Ba与抗菌素和病原体的耐药性途径有关。gydF4y2Ba

金刚的gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba由分泌骨质组成gydF4y2Ba

在这项研究中，蜜腺gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba，详细评估由分泌颗粒组成的花被细胞（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．花被在植物王国中经常发现，最常见的金黄土植物是气孔土壤的[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．蜜腺位于花瓣基部，使分泌的、暴露的花蜜更有利于昆虫觅食。此外，分泌毛状体可以阻止花蜜的蒸发。这些结果与之前的研究一致[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

Nectaries在植物王国的许多不同形状和大小发生中发生[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]．众所周知，他们在花和结构内的位置，并且许多基因都是众多基因调节其发展。我们发现了五个基因gydF4y2Ba榴弹炮gydF4y2Ba家庭，gydF4y2BaAP2.gydF4y2Ba和gydF4y2BaCRC.gydF4y2Ba动态表达期间gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba蜜腺开发(无花果。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

合成和分泌gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba花蜜及其职能gydF4y2Ba

我们的研究结果发现一些酶和基因与gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba花蜜，包括gydF4y2Baβ-FFasegydF4y2Ba，gydF4y2BaGELPgydF4y2Ba，gydF4y2BaGTsgydF4y2Ba，gydF4y2BafrgydF4y2Ba，gydF4y2BaBGL.gydF4y2Ba，gydF4y2BaCWINV4.gydF4y2Ba，gydF4y2BaSWEET2gydF4y2Ba，gydF4y2BaSWEET5gydF4y2Ba，gydF4y2BaSWEET6gydF4y2Ba，gydF4y2BaSWEET7gydF4y2Ba，gydF4y2BaSWEET9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba甜蜜的14.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba糖果15.gydF4y2Ba（图。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)．迄今为止，没有研究研究gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba花蜜的蛋白质。在这里，我们发现花蜜蛋白的条带是众多和复杂的，在一个1D蛋白凝胶上形成了总共9个不同的条带。我们在花蜜中鉴定了7种有趣的蛋白质gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba，其中六种以前曾在其他植物的花蜜中发现[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba] (SOD、MDAR、POD、REF、FBP2、nsLTPs)，并首次在花蜜中鉴定出AO。此前的一项研究表明，花蜜蛋白主要有两个功能:对传粉者分泌后的花蜜糖水解和防御微生物[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．我们发现花蜜蛋白质gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba可能具有抗菌效果，以及氧气清除效果。可能是可能的gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba通过分泌更多种类的花蜜蛋白来应对特定的生长环境。如果花蜜没有提供强大的抗菌防御，微生物将不受抑制地生长，并直接改变花蜜的成分，从而失去对传粉者的吸引力，降低植物的繁殖。这些发现提供了重要的信息gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba花蜜组合物，并表明已知在其他植物的花蜜中发生的蛋白质也可能在沙漠植物中具有功能。gydF4y2Ba

总之，这项研究揭示了gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba是一种昆虫授粉的植物，那种粉碎机gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba主要包括膜翅目、双翅目和鞘翅目。此外，它的蜜腺是由分泌的表皮细胞组成，专门分泌毛状体和分泌花蜜。通过对不同花发育阶段转录组数据的比较，鉴定了控制花和蜜腺发育、花蜜生物合成和分泌、类黄酮生物合成、植物激素信号转导和植物与病原菌相互作用的DEGs。此外，我们还鉴定了几种存在于gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba花蜜并发现它们可能具有抗菌和氧气清除效果。结果将使研究进入干旱沙漠植物的育种行为，并提供洞察如何gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba具体处理其恶劣的环境。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba栖息地和样品集合gydF4y2Ba

Nitraria Tanguteum.gydF4y2Ba是一种灌木，有着大量密密麻麻的枝干，每株植物都有数万朵花朵。当枝条被沙覆盖时，不定根容易向下发芽，不定芽容易向上发芽。gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba自然栖息地是在内蒙古市内（106°09'-107°10'e，40°09'-40°57'n）内的邓家口。该地区的特点是长时间的阳光，白天和夜间的温度差异，降雨量。年平均气温为9.8°C。最近10年的平均降水量为150.6毫米。这里的土壤主要是含沙，植被由杂草灌木支配。gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba是该地区的主要种类之一，其他一些原生物种存在gydF4y2BaAmmopipthus蒙古斯gydF4y2Ba格言。，gydF4y2BaArtemisia OrdosicagydF4y2Ba克拉斯克。和gydF4y2BaArtemisia sphaerocephala.gydF4y2Ba克拉斯克。gydF4y2Ba

作者京波张某负责正式鉴定样品。但是，对于我们的知识，没有植物标本馆可以存入这种特定材料的凭证标本。所有材料都是通过许可获得的。gydF4y2Ba

花卉花蜜收集和花盆游客物种/行为观测gydF4y2Ba

为了防止花蜜被粉碎者或其他污染物污染，我们在开花前用透明袋围住着鲜花。生的gydF4y2BaN. Tanguteum.gydF4y2Ba花蜜从盛开的花朵收集，5：00-7：00。为避免蒸发花蜜引起的高温，我们使用10μL无菌塑料微量移液管轻轻收集花蜜液滴。将花蜜置于0.5ml离心管中，然后将其快速储存在液氮中。由于它们的小尺寸和每朵花的花蜜数量小，我们从一大堆鲜花中收集了花蜜。gydF4y2Ba

在花期(5月20日至6月10日)，随机选取3株生长习性大致相同的植物，由一人在固定地点观察每株植物1周。当观察到赏花行为持续10年以上时，研究人员用红外摄像机拍摄并记录了赏花者的行为。根据膜翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫的活动时间，选择晴天7:00 - 17:00进行观察和记录。gydF4y2Ba

使用扫描电子显微镜的水平形态学研究gydF4y2Ba

对于SEM调查，从三种不同植物的新鲜花样（每阶段约10-20朵花）固定在4％谷氨酸固定剂中，用渐进的醇系列脱水，致干燥gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba临界点和金子。照片由Quanta 200环境扫描电子显微镜拍摄[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

转录组测序和基因注释gydF4y2Ba

整个gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba基于四个发育阶段收集花，每次发育阶段收集三种植物（每次重复约10-15朵花）的重复，之后将它们在液氮中冷冻并储存在-80℃直至使用直至使用。然后将这些样品送入BGI（武汉）的转录组测序。为了从整个花中纯化总RNA，使用乙醇沉淀和CTAB-PBIOzOL试剂。对于RNA浓度和质量检查，使用纳米液滴。总RNA用于测序文库结构，总RNA量≥1μg。在图书馆质量检验后，进行Illumina测序。SOAPNUKE（v1.5.2）用于过滤适配器，低质量和高n比例读取。Hisat2（v2.0.4）用于构建参考基因组（未发布数据）索引进行读取映射。接下来，我们使用RSEM（V1.2.12）量化转录物。另外，估计或测量每个样品的样品可重复性，基因表达水平和基因表达分布。 Blast2GO (http://www.biobam.com/blast2go-command-line-tools/gydF4y2Ba)用于测序数据的注释。基因差异表达分析使用NOIseq (gydF4y2Bahttps://bioinfo.cipf.es/noiseq/doku.php?id =下载gydF4y2Ba)．意义阈值设定为loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba折叠| ≥ 1 and Probability ≥0.75. Clusters were classified using MeV (v4.9.0). Functional interpretation was further completed by KEGG (http://www.genome.jp/kegg/patpway.html.gydF4y2Ba)．使用TBTOOLS（V1.0）软件构建热图。对于DEG的转录因子（TF）预测，我们首先鉴定了DEGS ORF，然后使用HMMSECREARS将这些ORF与TF域对齐（gydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

1-D凝胶电泳和LC-MS / MS分析gydF4y2Ba

由于小尺寸gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba鲜花，很难获得大量的花蜜。Amicon Ultra 3 K离心过滤装置（Millipore，USA）用于纯化和浓缩花蜜，然后根据先前公布的方法测定蛋白质含量[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．用样品缓冲液将浓缩的花蜜(10 μl，总蛋白~ 20 μg)煮沸5 min，然后用SDS-PAGE 1-D凝胶电泳分析。为了鉴定目标蛋白，从1-D凝胶中手工提取含有蛋白质的凝胶切片，送到BIOMS(中国北京)进行LC-MS/MS分析。周(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]方法进行数据处理和蛋白注释。gydF4y2Ba

实时定量PCR分析gydF4y2Ba

选择来自我们的RNA-SEQ分析的七次参数使用RT-QPCR分析它们的表达。收集四个阶段的叶，茎和花组织以样本表达。提取RNA，变性，使用Hiscrip II第1链CDNA合成试剂盒（中国vazyme）合成第一链cDNA。使用Lighcycler 480 II实时PCR系统（Rioche，USA）进行RT-QPCR。使用SYBR方法，并用2计算基因表达水平gydF4y2Ba^{-ΔΔctgydF4y2Ba}方法(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．引物序列采用Oligo 7设计，列于表中gydF4y2BaS2gydF4y2Ba．所有样品采用(技术)三个重复，采用三个生物学重复。gydF4y2Ba肌动蛋白gydF4y2Ba作为内参基因。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

使用GraphPad Prism软件（6.0版）分析所有数据。使用单向分析（ANOVA）进行单向分析，进行了作为平均值±SE的数据的统计分析。gydF4y2BatgydF4y2Ba测试,*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05, * *gydF4y2BapgydF4y2Ba < 0.01 and ***pgydF4y2Ba< 0.001为显著性水平。gydF4y2Ba

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在文件和NCBI SRA数据库中（登录号：PRJNA686177，gydF4y2Bahttps://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra/SUB8746254/overviewgydF4y2Ba），并通过与相应作者联系（gydF4y2Bachenjh@njfu.edu.cn.gydF4y2Ba）合理要求。gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

TF：gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

SEM：gydF4y2Ba

扫描电子显微镜gydF4y2Ba

Kegg：gydF4y2Ba

Kyoto基因和基因组的百科全书gydF4y2Ba

RT-qPCR:gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

ORF：gydF4y2Ba

开放阅读框架gydF4y2Ba

去：gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

FPKM：gydF4y2Ba

每百万百万千岁的碎片读映射gydF4y2Ba

SDS-PAGE：gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳gydF4y2Ba

LC-MS / MS：gydF4y2Ba

液相色谱-串联质谱法gydF4y2Ba

作者希望感谢编辑和审稿人提供的有用的意见和建议。gydF4y2Ba

这项工作得到了江苏省（BE2017376），中国自然科学基金（31770715,32071784），江苏省清兰工程，江苏省杰出教授项目和江苏的优先学术方案开发高等教育机构（PAPD）。gydF4y2Ba

作者笔记gydF4y2Ba

1. 陈婷婷、周彦威对这项工作贡献相当。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 中国教育部森林遗传学与生物技术重点实验室，中国南京林业大学南京林业大学可持续林业共同创新中心，南京宣武，南京，210037gydF4y2Ba

   Tingting Chen，Yanwei Zhou，Zhaodong Hao，Ye Lu，Weihuang Wu，Jisen Shi＆Jinhui ChengydF4y2Ba

2. 中国林业科学研究院荒漠林业实验中心，内蒙古灯口gydF4y2Ba

   镜泊湖张gydF4y2Ba

3. 南京林业大学生物与环境学院，江苏南京210037gydF4y2Ba

   叶鹏＆tielong chenggydF4y2Ba

4. 2 .中国林业科学研究院国家林业和草原局盐碱地研究中心，北京100091gydF4y2Ba

   岫岩杨gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

CJH和SJ贡献了研究的概念和设计;CTT，ZYW，ZJB，YXY，PY进行了实验;CTT，ZYW，HZD，WWH，LY，CTL进行了统计分析;CTT写了稿件。所有作者均致力于稿件修订版，读取和批准提交的版本。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba金汇陈gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准，指导方针和同意参加gydF4y2Ba

这个物种gydF4y2BaNitraria Tanguteum.gydF4y2Ba该手稿在世界上任何地方都没有受到威胁，因此，作者没有报告潜在的利益冲突。所有方法均按照相关指南和规定进行。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

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再版和权限gydF4y2Ba