u-box e3 ubiquitin连接酶基因家族与中国白梨的干旱胁迫反应相关的基因组鉴定和功能分析（GydF4y2BaPyrus bretschneideriGydF4y2Ba)GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

植物U-box（PUB）蛋白是一类泛素连接酶（E3）家族，参与多种生物过程以及植物胁迫反应。然而，该系统的特点和功能分化GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因家族尚未在中国白梨中学过（GydF4y2BaPyrus bretschneideriGydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在目前的研究中，我们确定了62GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba在中国白梨基因组中。根据系统发育关系，62GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因聚集成五组。保守基序和基因结构分析的结果支持分类系统发育树。这个GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因在17条梨染色体上分布不均，其中15号染色体为梨的大部分染色体GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba家庭，有八个GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因。GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-作用元素分析表明GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因可能参与不同的生物过程，特别是在响应非生物胁迫。基于“党山苏里”七个组织的rna数据，我们发现GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因在七种组织中表现出不同的表达水平，并且QRT-PCR实验进一步支持RNA-SEQ数据的可靠性。为了鉴定与抗性相关的候选基因，我们进行了QRT-PCR实验梨种子植物在四种非生物胁迫下的表达水平，包括：ABA，脱水，盐和冷处理。一个候选人GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba选择脱水胁迫相关基因进行进一步功能实验。亚细胞定位显示PbrPUB18蛋白位于细胞核上。此外，异源过表达GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba表示过度表达GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba在干旱处理中能增强抗性。总之，我们系统地确定了GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba为梨的功能鉴定提供了有用的知识GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因在梨。GydF4y2Ba

植物在其生命周期中经常受到干旱、盐和低温等各种非生物胁迫。一些胁迫往往导致氧化损伤，并对植物生长发育产生不利影响。为了适应不利的环境条件，植物进化出了复杂而有效的机制[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba]. 以往的研究已经确定了四种非生物胁迫的信号转导途径，包括转录调控、转录后修饰、表观遗传调控和翻译后修饰[GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba]. 以及ubiquitination is one of the most significant post-translational modifications. The ubiquitin/26S proteasome system (UPS) pathway is a pervasive and effective route for protein removal in eukaryotes [3.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．UPS包括泛素（UB），泛素活化酶（E1），泛素缀合酶（E2），泛素连接酶（E3）和26S蛋白酶体。UPS的中央分量是高度保守的76个氨基酸蛋白泛素。泛素与特异性蛋白质结合，并以E1-E2-E3偏见级联方式的靶蛋白降解的作用[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]. 在该途径中，E3酶显然是决定底物特异性的关键因素。根据反应机理和亚基组成，将其分为四类：Ubox、HECT（与E6相关羧基末端同源）、RING（非常有趣的新基因）和Cullin-环连接酶（CRLs）[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]. U-box泛素连接酶的特征是约70个氨基酸的保守U-box基序。在E3泛素连接酶中首次发现了U盒泛素连接酶，并首次从酵母泛素融合降解蛋白-2（UFD2）中分离得到[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

与2个和21个U-box (PUB)基因比较GydF4y2Ba酿酒酵母酿酒酵母GydF4y2Ba和GydF4y2Ba智人GydF4y2Ba基因组中，分别有更多的U-box基因在植物中广泛分布。在GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba预测了61个植物U-box基因[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]，而77被发现GydF4y2Ba栽培稻GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba), 62年GydF4y2BaSolanum lycopersicum.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]，93英寸GydF4y2BaGossypium raimondii.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]，91 inGydF4y2BaMusa Quuminate.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba],61 inGydF4y2Ba截形苜蓿GydF4y2Ba[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba] 101GydF4y2Ba油菜GydF4y2Ba[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba大豆]和125GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．在Apple [GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba], 69GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba鉴定基因，并基于来自苹果的Pub蛋白的系统发育树分成七个亚组GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba. 许多研究表明PUB蛋白参与植物激素信号调节等生物过程[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba，自相容或伪自相容规则[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]以及生物应激[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]和非生物胁迫[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

干旱是影响世界农业作物产量最具威胁性的因素之一。因此，了解植物对干旱胁迫响应的分子机制，发展抗旱作物是十分必要的。干旱胁迫诱导的信号通路包括信号感知、信号转导和响应，以及代谢反应和生理反应的激活[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]. E3泛素连接酶可能通过抑制干旱胁迫信号通路发挥作用。它们可以消除胁迫信号通路的负调控因子，以响应刺激或减少胁迫，并在胁迫条件消失后及时消除信号通路，以维持植物的进一步生长。E3泛素连接酶也可能作为一种正反馈因子来增强应激信号[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］．在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba,GydF4y2BaPUB11.GydF4y2Ba通过泛素介导的干旱反应介导的受体的降解，如蛋白激酶LRRR1（富含亮氨酸的重复蛋白1）和Kin7（Kinase7）[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］．之前的一项研究表明GydF4y2BaPUB12.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPUB13.GydF4y2Ba通过靶向ABI1（ABA-Impsitive1）影响ABA介导的干旱耐受性[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

一般来说，转录因子的活性受上游组分的调控。经过修饰的sumoylation和泛素化，它们形成一个复杂的调控网络，影响应激相关基因的表达水平，进而调控多种代谢和生理过程[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaPUB25GydF4y2Ba和GydF4y2BaPUB26.GydF4y2Ba，两个U-box型E3泛素连接酶，触发冷信号负调控GydF4y2Bamyb15GydF4y2Ba提高植物抗冻性[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．在之前的一些研究中，U-box基因在干旱、低温和盐碱等不同的非生物胁迫反应中起调节作用。在GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba,GydF4y2BaATPUB18GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtpub19GydF4y2Ba通过诱导ABA超敏反应和ABA信号传导的负调节剂GydF4y2BaAtPUB22 / AtPUB23GydF4y2Ba在ABA独立途径中的干旱应激反应中是负调节因子[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaATPUB44GydF4y2Ba通过26个蛋白酶蛋白蛋白酶（脱离醛氧化酶3）并影响ABA生物合成[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]. 此外，GydF4y2BaATPUB46GydF4y2Ba和GydF4y2BaATPUB48GydF4y2Ba对干旱更敏感[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］．在大米、GydF4y2BaOsPUB15型GydF4y2Ba与正调控植物对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性有关[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．在苹果，GydF4y2BaMdPUB29GydF4y2Ba可以积极调节盐耐受[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

植物酒吧家族已被广泛研究非生物应力，主要是在模型植物中如GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，米饭和番茄，少于木质植物，如梨。梨属于GydF4y2BaPyrusGydF4y2Ba蔷薇科的一个属，是世界上最重要的水果作物和分布最广的水果之一。然而，由于非生物胁迫的影响，梨产量经常出现下降。这些非生物胁迫影响了梨树的生长发育，进而限制了梨树的产量[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba］．因此，研究与梨耐干旱、耐寒、耐盐碱相关的遗传决定因素对农业发展具有重要意义。以中国白梨(GydF4y2BaPyrus bretschneideriGydF4y2Ba)基因组GydF4y2Ba40GydF4y2Ba的系统表征GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba并进一步验证其功能GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba与干旱胁迫有关。这些结果为进一步的功能验证提供了新的思路GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因在未来。GydF4y2Ba

鉴定GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因家族成员GydF4y2Ba

在我们的研究中，我们使用了严格的管道来识别GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨基因组中的基因（见方法）。结果，共有91名候选人GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba对梨基因组中的基因进行了鉴定。使用智能工具验证91个候选样本的准确性GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因，我们删除了29个GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因缺乏U-box结构域。最后，62GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba获得具有完整U-box结构域的基因进行进一步分析。数量GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨中的基因与GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba苹果基因（69）[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．根据位置顺序GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因，我们命名为62GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因(表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．分子量(MW)为GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因家族范围为39.33kda～151.30kda（千道尔顿），等电点（pI）范围为4.99～8.83，平均值为6.78。细胞的亚细胞定位GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba结果发现，除6个位于细胞质，3个位于细胞膜外，大多数PUB蛋白位于细胞核(TableGydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

植物系统发育分析GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因家族成员GydF4y2Ba

研究人类的进化史GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨中的基因，我们使用Mega-X工具基于来自Pear（62个成员），番茄（62个成员）和番茄（62个成员）和的Pega-X工具构建了一种系统发育树（NJ，邻接）工具GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba（61个成员）（图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Baa） 是的。蛋白质序列GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba番茄的基因和GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba从以前的研究中获得[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]. 根据系统发育树的结果，共有185个成员GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba将来自这三种物种的基因聚集成五个亚组，包括I组，II组，III组，IV组和V组。III组的成员数是五个亚组中最大的，它是最大的，它是最大的64个GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因。然而，第四组的庇护率最低GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因,10GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因。一般来说GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨和番茄的基因被聚集成一个亚克士，表明梨和番茄相比表现得相对较近的关系GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

值得注意的是GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba这三种物种中的基因家庭是相似的。结果表明了数量GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba这三个物种的基因是保守的。为了探索梨在进化过程中发生了哪些群体的膨胀或丢失，我们测量了梨的数量GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba每个种群中每个物种的基因。在梨中，I、II、III、IV和V类包含11、21、21、3和6GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因家族成员，分别。在番茄中，I、II、III、IV和V类含有12、21、21、3和5GydF4y2Ba小盒子GydF4y2Ba基因,分别。在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，第I、II、III、IV和V组包括20、12、22、4和3GydF4y2BaAtPUB酒店GydF4y2Ba分别基因（图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Bab）。梨和番茄中每组的成员数量几乎相等，这表明与番茄相比，梨没有经历扩张或丢失。但是，与梨和番茄相比，我的群体GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba经历了快速扩张，而第二组GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba经历了快速的迷失。GydF4y2Ba

分析GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因家族保守基序与基因结构GydF4y2Ba

为了进一步验证系统发育树的分类结果，我们研究了它们的保守基序和基因结构GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba梨的基因。共有20个模因被用模因（Multiple-Em-for-Motif-Elicitation）软件估计，我们命名为模因1-20（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Baa, b，附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba：图S1）。其中1、3、5基序在各组中均有表达，表明在所有PbrPUB蛋白中高度保守。根据SMATR网站，我们确定U-box由Motif 1、Motif 3和Motif 5（附加文件）组成GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba：图S2）。这结果提供了支持准确性的证据GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba在我们的研究中确定的基因集。基于SMATR网站，我们还发现了另一个保守域:ARM和Pkinase域。ARM由motif 2、4和7组成;Pkinase由motif 11, 13和20组成。一般来说,最GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba同一组的成员有相似的保守基序。例如，第二组成员中的大多数含有基序6、10和8，这表明这三个基序可能是第二组PbrPUB蛋白的关键功能域，提示这些蛋白可能具有保守的功能。GydF4y2Ba

目的:探讨GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba在梨基因中，我们提取了62个基因的外显子-内含子信息GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba来自梨数据库的基因使用内部脚本。基于信息，TBTools软件被预先形成以显示基因结构GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Bac).外显子的数量GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因大大发散，从1到20起。62中GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨的基因，GydF4y2BaPBRPub24GydF4y2Ba包含最多的外显子(20个)，16个GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因(25.81%)仅包含一个外显子。此外，外显子和内含子的长度是不同的。有30个GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba已发现基因含有未翻译的地区（UTR）。同样地，对于图案分析的结果，GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因结构相似的基因聚集成同一亚类。例如，第二组的大多数成员只有一个外显子。这一结果表明，同一类群的成员具有相似的基因结构和保守的基序。这些来自保守基序和基因结构分析的结果为系统发育树分类结果的准确性提供了有力的证据。GydF4y2Ba

水稻染色体定位及同源基因分析GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

染色体分布模式GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba用TBtools预测了基因组上的dna序列（图1）。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa).位置信息GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨的基因是由我们的内部脚本提取的。结果，总共有50个GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba梨17条染色体上的基因定位不均匀(82.26%)GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因家族定位于8号染色体。因此，我们在图中没有显示8号染色体。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba. 另外，12个基因定位在支架重叠群上，我们也没有在图中显示它们。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba．染色体15最多GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因，有八个GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因，然后是染色体5，具有6个基因。染色体1,2,12均包含4GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因。两个或三个GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因被定位在染色体3、6、7、9、10、11、13、14和16上。4号染色体和17号染色体只包含一个基因。同时，我们还鉴定了其同源基因GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因家族使用McScanx软件。结果表明，在梨中鉴定了16对同源基因对GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因家族，包含26个同源基因。在染色体5和染色体10之间检测到三对同源基因对（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

CIS.GydF4y2Ba-作用元件预测GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

顺式GydF4y2Ba代理元素是预测基因功能的重要线索。转录因子云通过与特定生物过程中的Terget基因的CIS作用元件结合来实现靶基因的表达水平[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．为了进一步研究GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因，我们预测GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba推定启动子区的元素GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba使用PlantCARE数据库。结果，共62人GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-代理元素被识别(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba: Table S2.)，我们选择了15个感兴趣的GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-作用元素进一步分析。这15个GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-作用与胁迫、激素、植物生长发育有关。如图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa，一些不同的分布模式GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba的启动子区观察到-作用元件GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因，表明GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因家族的梨子特别在各种不同的生物过程中。与此同时，我们发现所有人GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因中GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 与激素调节有关，例如水杨酸，赤霉素（Ga），蟾蜍蛋白和茉莉酸甲酸甲酸甲酯（Meja）响应性元素。以前的研究报告说GydF4y2BaDSG1GydF4y2Ba它可以通过响应多种激素，如生长素、水杨酸和乙烯，来调节细胞的分裂和延伸[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]. ABA反应元件，简称ABRE，是其中最重要的一种GydF4y2BaCIS.GydF4y2BaABA诱导基因的启动子序列中的元素 - ABA治疗反应[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．在我们的研究中，是55GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba这些基因被鉴定为ABA的响应元件，表明GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因家族在ABA处理下可能具有特殊的抗性(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）。和在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba,GydF4y2BaATPUB9.GydF4y2Ba,GydF4y2BaATPUB18GydF4y2Ba,GydF4y2BaAtpub19GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaATPUB44GydF4y2Ba都参与了ABA反应[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．值得注意的是，44GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因，这表明GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因可能由GydF4y2Ba多年电价GydF4y2Ba基因对干旱胁迫的反应。而且，有30个GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因有GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 与寒冷相关的元素，表明这30个GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba在低温处理下，基因可能具有特殊的抗性。众所周知，黄酮类化合物的生物合成是植物逆境反应过程中最重要的现象之一。在这项研究中，我们发现GydF4y2BaPBR管10GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub24GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBR管道5GydF4y2Ba含有MYB结合位点参与类黄酮生物合成。GydF4y2Ba

组织特异性表达分析GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

进一步探讨其组织特异性表达GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因，我们从先前研究中收集了“Dangshansuli”梨的七组织的RNA-SEQ数据[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]. 我们使用RPKM（reads per kilobase per million）值来估计GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因。然后，我们调查了62的表达水平GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因。Pheatmap，R包，用于显示62的表达式模式GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa).基于62GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因，他们聚集成四个主要类别。第IV类基因在所有7种检测组织中均表现出高表达水平，而第II类基因在所有7种组织中几乎没有表达。Class I在梨叶中特异性表达，并且在Class III中检测到多样性的表达模式(图1)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa） 是的。在62人中GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因，52基因（83.87％）至少在一个组织中表达，即使某些组织的几个基因的转录物丰度相对较低。大约10个无表达GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba在七种组织中鉴定基因（rpkm值小于1），并且它们可能在进化过程中丢失了该功能GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨的基因家族。29GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因在7种不同的组织中均有表达，表明它们在不同组织的发育中有不同的作用。有意思，我们找到了28个GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因在叶片中表达量最高，提示这28个基因可能参与了叶片的发育。由于叶片是涉及抗性的重要植物器官，我们引用了这28个GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba在梨的生长发育过程中，基因可能具有特殊的抗性。GydF4y2Ba

为了验证转录组序列分析的可靠性，15GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba采用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)方法，研究砀山酥梨7个不同组织中的表达水平。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab).我们发现所有的15GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因在7个不同组织中表现出多样性的表达模式，这表明GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因家族可能在不同的组织中发挥作用，参与不同的代谢过程。七个基因(GydF4y2BaPbrPUB1号机组GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBR管道3GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBR管道7GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBR管道9GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub36.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub38GydF4y2Ba)表现出相似的表达模式，且在叶组织中表达量高，表明GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因在叶片发育过程中起着关键作用。在转录组数据中，这7个基因在叶片中均表现出高表达水平。这些结果进一步证明了转录组序列分析的可靠性。有趣的是，15个GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因在生殖器官中高度表达，这表明GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因可能与生殖器官的发展相关联。GydF4y2Ba

表达模式GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba非生物胁迫下的基因GydF4y2Ba

以前的研究已经广泛报道GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba涉及各种非生物胁迫的基因家族[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]. 探索GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因家族在梨中的表达水平GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba在幼苗样品中（GydF4y2BaPyrus betulaefoliaGydF4y2Ba)进行了4种不同的胁迫处理，包括脱水、低温、ABA和盐胁迫。11GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因被随机选择进行QRT-PCR实验。11基因由I组（GydF4y2BaPbrPUB1号机组GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub14GydF4y2Ba），来自II组（GydF4y2BaPBR管12GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub36.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub38GydF4y2Ba），来自第三组（GydF4y2BaPBR管道3GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub25GydF4y2Ba)， IV组2人(GydF4y2BaPBR管道7GydF4y2Ba和GydF4y2BaPbrPUB48电话GydF4y2Ba)第五组1例(GydF4y2BaPBRPub34GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

在十一中GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因,9GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因被上调表达和一个GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因(GydF4y2BaPBR管道7GydF4y2Ba)在脱水胁迫下表达下调（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa） 是的。然而，GydF4y2BaPBRPub14GydF4y2Ba在脱水胁迫下无显著差异表达。在9个上调基因中，GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba在脱水处理过程中表现出高度增加的表达水平，而GydF4y2BaPBR管12GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBR管道3GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub36.GydF4y2Ba在12小时脱水处理期间表达上调，并在24小时后回收到正常水平。GydF4y2BaPbrPUB1号机组GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub38GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub25GydF4y2Ba，在1h时表现出最高的表达水平，其中GydF4y2BaPBR管12GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub14GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBR管道3GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub36.GydF4y2Ba在脱水处理下在12小时显示最高的表达水平。这些结果表明GydF4y2BaPbrPUB1号机组GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub38GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub25GydF4y2Ba响应脱水治疗比GydF4y2BaPBR管12GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub14GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBR管道3GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub36.GydF4y2Ba．所以，GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨基因家族在梨脱水胁迫响应过程中起着重要作用。GydF4y2Ba

低温处理（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab） ，我们发现了4个基因(GydF4y2BaPBR管12GydF4y2Ba,GydF4y2BaPbrPUB3, PbrPUB36GydF4y2Ba和GydF4y2BaPbrPUB48电话GydF4y2Ba）在冷压力下表达上调，表明那些GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因可能会响应低温。GydF4y2BaPBR管12GydF4y2Ba,GydF4y2BaPbrPUB48电话GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub36.GydF4y2Ba在48小时的低温暴露过程中，其含量显著增加。表达水平GydF4y2BaPBR管道3GydF4y2Ba在1 h和48 h时达到双峰。GydF4y2Ba

在盐处理中（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC)，我们发现所有被选中的11个GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba200 mM盐胁迫处理下，基因表达量显著上调。的表达水平GydF4y2BaPBRPub14GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub25GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBR管道3GydF4y2Ba,GydF4y2BaPbrPUB48电话GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBR管道7GydF4y2Ba在12小时的盐暴露期间高度增加。此外，GydF4y2BaPbrPUB1号机组GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBR管12GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub34GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub36.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub38GydF4y2Ba在盐胁迫下4h表达量最高，表明这6个基因在盐胁迫下表达量最高GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因积极应对盐处理。我们专注于表达水平GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba．在4-8 h，表达水平GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba显着增加，然后在12小时下调下调，最终在36小时恢复正常水平。GydF4y2Ba

以前的研究报告说GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Baaba介导的干旱胁迫反应相关基因。在ABA处理中(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba11 .【答案】DGydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因对ABA胁迫有反应，这些基因在ABA胁迫后先不受调控表达，36h后表达下调。这些结果表明GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因在ABA调控途径中起重要作用。三个基因的表达水平(GydF4y2BaPbrPUB1号机组GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub25GydF4y2Ba,GydF4y2Ba和PbrPUB36GydF4y2Ba）在1小时内达到峰，表明这三种基因积极应对ABA胁迫。有趣的是，我们发现了GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba分别在ABA处理后6 h和12 h表达。GydF4y2Ba

PbrPUB18蛋白的亚细胞定位GydF4y2Ba

进一步验证生物功能GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba干旱胁迫下梨的基因GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba选择进行亚细胞定位实验。GFP对照的绿色荧光出现在细胞膜和细胞核中。GydF4y2Ba7.GydF4y2Baa).相比之下，35S:GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba-GFP蛋白仅存在核中并与DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）制度完美地集成（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bab） ，表明PbrPUB18蛋白位于细胞核内，这与我们在表中的预测一致GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

转基因水稻品系的耐旱性评价GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba

进一步证实GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba干旱胁迫下的基因，GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaCOL-0植物（WT）由花卉DIP方法转化[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba］．两个过度表达线OE-4和OE-5GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba通过PCR鉴定和MRNA水平的半定量PCR筛选出来。QRT-PCR还验证了表达GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba在OE-4和OE-5远高于WT(附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：图S3）。评估过表达的功能GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba在耐旱性方面，将20日龄的野生型和转基因株系置于相同的干旱环境中（12天不浇水）。在正常条件下，转基因株系与野生株系在形态上没有差异。经过12天的无水处理后，两个转基因株系表现出更强的耐旱性，与野生型植株相比，表现为更少的叶片萎蔫症状（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Baa).同时记录叶绿素荧光，进一步验证WT和转基因株系的耐旱性(图5)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bab）。光化学（FV / FM）值的最大量子效率不受物种和生长条件的影响，但在压力条件下，该参数显着降低。经过12天的干旱处理后，WT的FV / FM值显着低于两种转基因系，表明WT对干旱应激显示更多的敏感性（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bae）。电解质泄漏（EL）广泛用于估计干旱胁迫后植物的细胞损伤水平。与WT（37.3％）相比仅近似15％-20％，表明wt比转基因患者更严重的膜损伤GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba由overexpressingGydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bac).干旱胁迫下，转基因植株丙二醛(MDA)含量显著低于WT(图5)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bad).这些结果表明，2个转基因株系GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba遭受较轻程度的氧化应激。GydF4y2Ba

组织化学染色显示，干旱胁迫后WT叶片的染色深度高于OE-4和OE-5(图5)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Baf），建议WT型累积更多ROS（H.GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba以及GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba)．与染色结果相似，定量测定进一步表明，两个转基因株系的H显著降低GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba内容比WT类型的内容（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bag).此外，反OGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba两个转基因系的含量均显著高于野生型（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bah).这些结果表明GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba可增强抗旱性。GydF4y2Ba

水稻全基因组及系统发育分析GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba梨的基因GydF4y2Ba

作为泛素连接酶的家族，U字箱基因编码约70个氨基酸的保守U形盒基质，并调节基材的普发化[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba］．U-box基因在植物中广泛分布，据报道参与了植物激素信号转导等许多生物过程[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba，自相容或伪自相容规则[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]以及生物应激[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]和非生物胁迫[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba］．由于GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因在植物发育过程中起着重要作用，GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因已经在不同的植物物种中被鉴定，例如GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba（61）[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]，米饭（77）[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba，西红柿(62)[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]，棉花（93）[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]和香蕉（91）[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba］．梨是蔷薇科果树之一，在世界各地广泛种植。然而，分析相关GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨的基因到现在差。在本研究中，将62个基因鉴定为GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba利用生物信息学方法对梨基因家族进行了分析，并对其数量进行了研究GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨的基因与梨的基因相似GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba（61）、番茄（62）和苹果（69）。GydF4y2Ba

系统进化树分析表明，这3种植物共有185个PUB蛋白成员，其中梨62个，番茄62个，番茄61个GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba）分为五组（I-V）。系统发育树的结果与其他物种相似[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba］．例如，125GydF4y2BaGmPUB公司GydF4y2Ba使用系统发育树分析将大豆蛋白的基因分为六组[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．在69年苹果,GydF4y2BaU形盒GydF4y2Ba基因被聚为7组[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．通过系统发育关系分析，表明GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2BaS表现出更密切的关系GydF4y2BaSIU-boxsGydF4y2Ba和....相比GydF4y2BaAtPUBsGydF4y2Ba. 这一结果与梨与番茄的亲缘关系比番茄更为密切的事实相一致GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba. 虽然GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba三个物种的基因相似，我们发现GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba群体的基因经历了快速扩张和II组的迅速丧失。除U字幕结构域外，还发现62种PBRPub蛋白结合不同的结构域，包括犰狳（臂）重复，四肽（TPR）结构域和WD40重复。被阐明的用于生物学功能的大多数酒吧蛋白质来自u-box蛋白，臂重复[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．研究表明，ARM重复序列主要介导与底物的相互作用，表明相互作用使底物可被泛素化[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba］．25个成员GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨基因中只有U-box结构域，25个成员同时具有U-box和ARM结构域。TPR结构域存在于GydF4y2BaPBRPub14GydF4y2Ba基因和WD40重复序列GydF4y2BaPBRPub40.GydF4y2Ba基因。GydF4y2Ba

的函数预测GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨的基因家族GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 治疗和特异组织表达分析GydF4y2Ba

这个GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba- 推定启动子的分析表明GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因家族参与应激相关机制、激素调节和生长发育。之前的研究报道了这一点GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba用ABA来回应。例如，GydF4y2BaATPUB44GydF4y2Ba可通过26个蛋白酶体泛素化脱落醛氧化酶3调节ABA的生物合成[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba］．另外，ABI3的一个转录因子受到调节GydF4y2BaATPUB9.GydF4y2Ba增加了对ABA的敏感性GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba在幼苗萌发期间[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaATPUB18GydF4y2Ba,GydF4y2BaAtpub19GydF4y2Ba和GydF4y2BaATPUB44GydF4y2Ba被发现直接中断ABA的生物合成。在我们的研究中，55个基因包含推定启动子区的ABA响应元件。特别是，我们发现在启动子区域中鉴定了八个ABA响应元件GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba43.这一结果表明GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因可能在ABA信号转导期间发挥重要作用。在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba和GydF4y2Ba尼古利亚娜GydF4y2Ba，表达GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因受到非生物和生物胁迫的调节[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]. 已有研究表明MYB转录因子可以调控抗性基因的表达水平。例如，GydF4y2BaPBRMYB21GydF4y2Ba可以特异性结合到MYB的启动子识别位点GydF4y2BaPbrADC公司GydF4y2Ba并对抗旱性起到了积极的作用[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba］．在这里，我们还发现了参与干旱诱导响应元件的MYB结合位点，在启动子区GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨的基因表明GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因可能受相关转录因子调控，介导干旱胁迫信号转导。在该启动子区还发现脱落酸响应元件、防御和胁迫响应元件、低温响应元件、损伤响应元件GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因在梨。这些结果表明GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因可能涉及在梨生长和发展期间的生物过程中的多种。GydF4y2Ba

基于RNA-Seq数据和qRT-PCR实验，我们研究了GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba在七个组织里。在委员会的62个成员中GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨基因家族，29GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因在7种不同的组织中均有表达。另外，72.58%的GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2BaS在梨萼片中表达。而的GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2BaS在所有组织中均有表达，叶片中表达量最高的为45.16%，表明这些基因可能参与了梨叶片的发育过程。qRT-PCR分析显示15GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba在子房、叶片、萼片和花瓣中均有高表达，表明GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因可能在这四种组织的发育中起作用。GydF4y2Ba

角色GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因对不同非生物胁迫的响应GydF4y2Ba

之前的研究已经报道过了GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba参与应激反应过程的基因[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]. 大量的GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因在非生物胁迫条件下诱导表达[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］．本研究中，差异表达水平为11GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba利用qRT-PCR技术研究了脱水、低温盐和ABA胁迫等非生物胁迫下的基因表达。从结果来看，GydF4y2BaPBR管12GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBR管道3GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub36.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPbrPUB48电话GydF4y2Ba表明这3个基因对脱水、ABA、低温和盐胁迫均有响应。GydF4y2BaPBR管道7GydF4y2Ba在脱水压力下表达了下调，暗示GydF4y2BaPBR管道7GydF4y2Ba可能对脱水的反应过程有负性调节作用。GydF4y2Ba

在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba的功能GydF4y2Ba酒吧GydF4y2BaII组的成员被广泛研究了植物的非生物胁迫过程。GydF4y2BaAtPUB22 / AtPUB23GydF4y2Ba是aba独立途径中介导干旱反应的负调控因子[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaATPUB25GydF4y2Ba和GydF4y2BaATPUB26GydF4y2Ba通过调节蛋白稳定性参与植物对低温信号的响应GydF4y2Bamyb15GydF4y2Ba， CBF信号通路中的负转录因子[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaATPUB30.GydF4y2Ba通过促进BRI1激酶抑制剂1 (BKI1)降解负调控盐耐受性[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba］．此外,GydF4y2BaMdPUB29GydF4y2Ba，高度同源GydF4y2BaATPub29GydF4y2Ba，可积极调节耐盐性[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba］．我们推断出来GydF4y2BaPBR分组GydF4y2BaII族也可能与非生物胁迫有关。干旱是最关键的压力之一，可以显着影响植物的生长。在我们的研究中，我们发现了表达水平GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba第二组基因(GydF4y2BaPBR管12GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba,GydF4y2BaPBRPub36.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBRPub38GydF4y2Ba）在脱水治疗后显着上调。为了验证的角色GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba在干旱胁迫下，GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba选择了进一步的功能识别。GydF4y2Ba

亚细胞定位实验表明PBRPub18蛋白位于细胞核上。结果表明GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba可能在细胞核处行动生物学功能。以前的研究表明，在冷冻压力期间，MYB15充当负调节因子，GydF4y2BaPUB25GydF4y2Ba和GydF4y2BaPUB26.GydF4y2Ba能通过加速降解提高抗寒性吗GydF4y2Bamyb15GydF4y2Ba[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]. 这些结果表明GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba可能降解转录因子以正调控植物抗性，例如MYB转录因子。异源过表达GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba在干旱12 d时表现出较WT更低的MDA含量、更低的EL和更高的Fv/Fm等生理特性，表明过表达GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba可增强抗旱性。ROS含量分析表明，HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba以及更高水平的抗氧抗体GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba在转基因株系中，表明这种耐受性可能归因于活性氧清除系统的更强大的激活。GydF4y2BaAtpub19GydF4y2Ba和GydF4y2BaATPUB18GydF4y2Ba在H下游的ABA信号通路中起负作用GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]. 但是细胞机制是什么GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba干旱响应的调控仍不明确，需要在未来的研究中进行探索。总结，我们系统地鉴定了GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba梨的基因家族，进一步的功能鉴定为梨的功能研究奠定了基础GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba未来梨的基因。GydF4y2Ba

在我们的研究中，共62岁GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba在中国白梨(GydF4y2BaPyrus bretschneideriGydF4y2Ba)，在梨17条染色体上分布不均匀。根据系统发生树分析，GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba实验分为五组。保守的基序和基因结构分析为分类结果提供了有力的证据。GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-作用元素分析表明GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因可能参与不同的生物过程，特别是响应非生物应激和植物激素。来自不同七组织的转录测序数据表现出不同的表达水平GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因。利用qRT-PCR进一步鉴定与非生物胁迫相关的候选基因。此外,GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba被克隆和功能鉴定。亚细胞定位显示PbrPUB18蛋白位于细胞核上。异源过度表达GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba表示过度表达GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba可以提高干旱治疗的抵抗力。但细胞机制GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba在未来的研究中需要调节干旱反应。GydF4y2Ba

基因组鉴定GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba中国白色梨的基因家庭成员GydF4y2Ba

确定潜在的GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba基因家族，我们首先下载了梨基因组（GydF4y2BaPyrus bretschneideriGydF4y2Ba)从NCBI数据库[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．然后，U字箱域的种子文件（PF04564）用于搜索候选者GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba利用HMMsearch软件对梨蛋白数据库进行分析。HMMsearch结果中获得的所有候选PbrPUB蛋白进一步提交至SMART网站(GydF4y2Bahttp://smart.embl-heidelberg.de/GydF4y2Ba）确定U字箱保守域的完整性。此外，通过扩展来计算PIPBS蛋白的PI和MW。然后，我们还使用Cell-Ploc 2.0研究了PBRPubs的亚细胞定位[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

PBRPub蛋白的系统发育分析GydF4y2Ba

首先，我们收集了PUB蛋白序列GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，番茄和梨[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．共下载185条PUB蛋白序列。其次，利用MEGA-X软件的ClustalW功能对这185条PUB蛋白序列进行序列比对。第三，利用MEGA_X (Method, NJ;引导,1000)GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．最后，我们使用了Evolview工具（GydF4y2Bahttps://evolgenius.info//evolview-v2/#login.GydF4y2Ba)编辑PUB蛋白的系统发育树[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

基因结构，母序分析和GydF4y2Ba顺式GydF4y2Ba表演元素分析GydF4y2Ba

识别和可视化梨的结构组织（内含子，外显子和UTR）GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba利用内部脚本从梨全基因组数据库中提取基因家族、基因结构信息。这部小说保留了……的主题GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba基因通过模因序列进行鉴定(GydF4y2Bahttp://meme-suite.org/tools/meme.GydF4y2Ba)．共有20个主题和200个氨基酸的宽度限制用于分析与其他默认参数。使用TBtools将基因结构和保守基序分析结果可视化[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]. 上游2000bp区域GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba(同链)被定义为假定的启动子序列。的启动子序列GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba使用getfasta函数在bedtools [GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba］．GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba表演的元素GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba由PlantCare工具预测[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba］．根据功能注释GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba-acting元素(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba：表S2），获得感兴趣的元素以供进一步研究，并且GydF4y2BaCIS.GydF4y2Ba具有相同功能注释的元素集成到同一组。GydF4y2Ba

共线性分析与染色体定位GydF4y2Ba

同源基因对GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba通过BLAST软件与全VS-所有BLAST策略识别。然后，使用全vs-all blast的结果来通过mcscanx识别同时性区域[GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba］．我们绘制了circos图来表示共时基对的分布[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba］．染色体定位分析由TBTOOLS进行[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

基因表达分析GydF4y2BaPbrPUB公司GydF4y2Ba在RNA序列数据上GydF4y2Ba

从NCBI下载了“党山苏里”在7种不同组织中的RNA-seq数据[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．FASTP软件用于执行质量控制和过滤器。Bowtie2和Tophat2软件用于执行读取映射。RPKM值由FeatureCount软件和内部Python脚本测量。然后，我们使用HeatMap.2包来显示表达式模式GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba（日志）GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba（rpkm + 1））[GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

植物材料与胁迫处理GydF4y2Ba

种子GydF4y2BaPyrus betulaefoliaGydF4y2Ba采自我们的试验田（南京市互助梨树工程技术研究中心梨种质园）。然后，种子GydF4y2BaPyrus betulaefoliaGydF4y2Ba在国家梨工程技术研究中心（南京农业大学，南京）培养。进一步探索的功能GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba在非生物应激期间，幼苗进行四种不同的非生物胁迫，包括脱水，低温，盐和ABA处理。非生物治疗方法从我们以前的方法进行了轻微修正[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba］．在脱水处理下，选取6个时间点(0、1、6、9、12和24 h)采集胁迫下梨幼苗叶片。在冷处理,选择八个时间点(0、1、6、9、12、24、48和96 h)。盐治疗,选择7个时间点(0、2、4、6、8、12和36 h)。在ABA处理,选择7个时间点(0、1、3、6、9、12和36 h)。GydF4y2Ba

QRT-PCR分析GydF4y2Ba

使用植物总RNA分离套件（上游），提取压力下叶片材料的总RNA。然后，Primescript™RT试剂盒（Takara Bio，中国）用于逆转RNA至cDNA。QRT-PCR分析在RocheLightCycler®480II（德国Roche，Mannheim，Germany）上进行了使用LightCycler®SybrGreen I Master Mix套件（罗氏，中国）。我们设计了十五对特异性底漆（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:表S1)使用Primer5.0软件，使用NCBI在线软件(GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/GydF4y2Ba)GydF4y2Ba．QRT-PCR的反应系统和方案与我们之前的研究一致[GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba］．的相对表达水平GydF4y2BaPBR分组GydF4y2Ba使用2GydF4y2Ba^{−∆∆计算机断层扫描GydF4y2Ba}方法 [GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba］．的梨GydF4y2Ba微管蛋白GydF4y2Ba基因(没有。(AB239681)作为内部参考GydF4y2BaPyrus betulaefoliaGydF4y2Ba，而且GydF4y2Ba肌动蛋白GydF4y2Ba选择基因（No.Ay063980）作为内部参考GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

亚细胞本地化GydF4y2Ba

开放阅读框架（ORF）GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba的cDNA中克隆出了缺失的终止密码子GydF4y2BaPyrus betulaefoliaGydF4y2Ba使用引物对（GSP16，附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：表S1）。我们进行了35岁：GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba-GFP融合矢量基于先前研究[GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba]. 我们改造了35年代：GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba-GFP融合载体进入GydF4y2Ba根癌农杆菌GydF4y2Ba并转化35S:GFP作为对照组[GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba］．在渗透后72小时后，用共聚焦激光扫描显微镜（LSM800，德国）观察荧光信号，并通过用DAPI染色核的位置。GydF4y2Ba

拟南芥GydF4y2Ba转基因植物的转化与特性研究GydF4y2Ba

拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba转化生态型Columbia col0植株进行外源过表达GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba通过使用花卉DIP方法[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]. 以及GydF4y2Ba根癌农杆菌GydF4y2Ba包含矢量35S的悬架:GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Bagfp (ODGydF4y2Ba_600GydF4y2Ba= 0.80)用于转化。采用20 mg·L的MS固体培养基对T0种子进行鉴定GydF4y2Ba^{−1.GydF4y2Ba}使用特定引物对（GSP17，附加文件，通过PCR分析验证Hygromycin然后通过PCR分析验证GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：表S1）。根据之前的研究[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba]采用半定量RT-PCR和qRT-PCR方法进一步分析其转录水平GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba引物对(GSP18和GSP5，附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：表S1）。两条过表达线（OE-4和OE-5）GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba选择T3纯合子植株进行抗旱性试验。GydF4y2Ba

转基因株系抗旱性评价GydF4y2Ba

验证转基因株系的抗旱性GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba，转基因株系的幼苗(20天)GydF4y2BaPBRPub18GydF4y2Ba对照组（WT）经干旱处理（截留水分）12d。然后，我们收集了野生型和转基因株系的叶片样本，用于估计表型数据，包括EL、MDA、ROS含量。用电导监测仪测量电解液泄漏（日本TOADKK）[GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba］．按照制造商的说明，我们测量了MDA和ROS（H.GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba以及GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba)含量分别由特定分析试剂盒（南京建城生物工程研究所，江苏，中国）测定。进一步观察ROS（HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba和反oGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba)水平，我们也用DAB和NBT进行组织化学染色[GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba］．采用ImagingWin软件(Walz;Effeltrich,德国)。Fv/Fm值的详细参数和估计方法由Woo等人描述[GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

在我们的研究中，QRT-PCR的非生物应激和表达谱的每种音牙数据至少重复三次。数据以图为平均值±标准误差（SE）。所有统计分析都以R语言进行。GydF4y2BaT检验GydF4y2BaR中的功能用于测试治疗和对照组之间的关键类型数据的显着性水平（*GydF4y2BaPGydF4y2Ba< 0.05, * *GydF4y2BaPGydF4y2Ba < 0.01 and ***PGydF4y2Ba< 0.001)。GydF4y2Ba

来自七种不同梨组织的转录物测序的原始数据已经沉积在NCBI（GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?TERM=PRJNA498777.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

酒吧:GydF4y2Ba

植物U-box基因GydF4y2Ba

不间断电源：GydF4y2Ba

泛素/ 26 s蛋白酶体系统GydF4y2Ba

乌兰巴托:GydF4y2Ba

泛素GydF4y2Ba

E1:GydF4y2Ba

泛素激活酶GydF4y2Ba

E2:GydF4y2Ba

Ubiquitin-conjugating酶GydF4y2Ba

E3:GydF4y2Ba

泛素连接酶GydF4y2Ba

HECT:GydF4y2Ba

与E6相关的羧基末端的同源性GydF4y2Ba

戒指：GydF4y2Ba

真有趣的新基因GydF4y2Ba

利用:GydF4y2Ba

卡林环连接酶GydF4y2Ba

UFD2:GydF4y2Ba

泛素融合降解蛋白-2GydF4y2Ba

LRRR1：GydF4y2Ba

富含亮氨酸的重复蛋白1GydF4y2Ba

亲属7：GydF4y2Ba

Kinase7.GydF4y2Ba

ABI1:GydF4y2Ba

ABA-INSENSITIVE 1GydF4y2Ba

AAO3:GydF4y2Ba

脱落醛氧化酶3GydF4y2Ba

UTR:GydF4y2Ba

未翻译区GydF4y2Ba

阿坝:GydF4y2Ba

脱落酸GydF4y2Ba

Meja：GydF4y2Ba

甲基jasmonateGydF4y2Ba

气体：GydF4y2Ba

吉布林素GydF4y2Ba

伊稳定石：GydF4y2Ba

阿坝响应要素GydF4y2Ba

RPKM:GydF4y2Ba

每千基每百万读取数GydF4y2Ba

qRT PCR：GydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应GydF4y2Ba

GFP：GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

达皮：GydF4y2Ba

4, 6-Diamidino-2-phenylindoleGydF4y2Ba

阵线/ Fm:GydF4y2Ba

光化学的最大量子效率GydF4y2Ba

WT：GydF4y2Ba

宽型GydF4y2Ba

MDA:GydF4y2Ba

丙二醛GydF4y2Ba

EL:GydF4y2Ba

电解质泄漏GydF4y2Ba

轻拍：GydF4y2Ba

3, 3 ' -DiaminobenzidineGydF4y2Ba

电视台:GydF4y2Ba

硝基 - 蓝四唑氯化物GydF4y2Ba

ROS:GydF4y2Ba

活性氧GydF4y2Ba

TPR：GydF4y2Ba

TetratricopeptideGydF4y2Ba

臂:GydF4y2Ba

犰狳GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

中国国家科学基金会（2019YFD100022），中国科学基金（32072538），江苏农业科技创新基金（CX（18）3065），中国科学基金会（2019YFD100022）得到了支持的支持南京农业大学中央大学（KYZ201607），南京农业大学园艺学院（202011YX05），创新与企业家的本科培训计划（S20190040）。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 南京农业大学作物遗传学和种质增强国家重点实验室梨工程技术研究中心，南京，210095GydF4y2Ba

   王春萌，宋伯波，戴玉琴，张少玲，黄晓三GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

CMW和XSH设计并进行实验，CMW负责所有生物信息学分析并撰写稿件。YQD和BBS有助于基因表达分析。BBS和XSH指导并修改稿件。所有作者阅读、审查并批准最终稿件。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaXiaosan黄GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

道德认可和参与同意GydF4y2Ba

中国白梨基因组数据库(GydF4y2BaPyrus bretschneideriGydF4y2Ba），适用于我们在普通工程技术研究中心的允许下进行的研究。测试材料'GydF4y2BaPyrus betulaefoliaGydF4y2Ba经梨树工程技术研究中心许可，从南京市虎墅梨树工程技术研究中心的梨树种质园中采集。GydF4y2Ba

出版许可GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版说明GydF4y2Ba

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba