CSLazy1介导茶植物中的射碎和分支角度（Camellia Sinensis）

背景

分支角是茶厂建筑的枢轴成分。茶叶厂架构不仅影响茶材质量和产量，还影响了自动茶厂修剪的效率。然而，控制分支角的分子机制是植物架构的一个重要方面，在茶叶植物中尚不理解。

结果

在本研究中，三个CsLAZY通过序列同源分析从茶植物基因组数据中鉴定基因。系统发育树显示了CsLAZY基因序列相似性高懒惰的来自其他植物物种的基因，特别是木质植物中的基因。三个表达模式cslazys.在8个组织进行了调查。我们进一步验证了密钥的表达式级别cslazy1在八种茶叶中不同组织中的转录物发现cslazy1在茎中高表达。亚细胞定位分析显示，CsLAZY1蛋白定位于质膜。cslazy1被转移到拟南芥调查其在调节拍摄发展方面的潜在作用。值得注意的是，cslazy1在光照和黑暗条件下，过表达的植物比野生型植物对重力反演的响应更有效。结果表明cslazy1对茶树的向地性具有重要的调节作用。

结论

研究结果为理解其功能提供了重要的证据cslazy1调节秸秆植物秸秆植入茎枝角度的调节。本报告识别cslazy1作为改良茶树结构的一种有前景的基因资源。

茶树(茶树)是一种非常重要的经济作物。它的叶子可以用来生产最传统的咖啡因茶，这是世界上第二大最受欢迎的饮料[1那2]．茶叶植物的生产率受到茶叶植物结构的影响。精心设计的树架构应尽量减少与邻近作物的环境资源，如光。在浓密地种植的展台中，一个相对宽的分支角可以通过降低湿度来帮助植物逃避一些疾病，但它使植物占据更多空间并增加了阴影的程度[3.];因此，最佳树结构可能有助于提高作物的产量和产量稳定性[4.]．茶叶厂建筑受几何环境因素以及茶村种植园区的影响;此外，采用手动采摘，剪切收获和季风季节的采摘模式也会影响茶厂建筑[5.]．茶树按其分枝角度可分为三种植物建筑类型:开放式、半开放式和直立式。

植物结构与植物激素有显着相关，包括甘草酸（Ga），生长素，细胞蛋白和杂菌酮（SLS）。GA被认为促进向上的增长和抑制弯曲，并且很可能对哭泣性质负责[6.那7.]．以前的研究还表明与生长素和乙烯相关的基因可能在射击伸长率中发挥至关重要的作用[8.那9.]．细胞素被鉴定为调节植物芽分支的重要植物激素，它在根部合成，然后在整个工厂中运输以进行整个工厂的发展[10.]．SLs是新近发现的一组调节茎、枝、分蘖角的植物激素;主要通过降低局部吲哚乙酸(IAA)含量来抑制生长素的生物合成和减弱水稻的向地性[11.]．

许多环境信号，包括光和重力，可以影响植物的结构[6.那12.]．分枝角是确定植物结构的重要因素，并通过特定基因调节。迄今为止，已经确定了与分支角度相关的许多基因和转录因子。例如，过度表达OSPIN2.导致分蘖数增加，改变OSPIN2.通过遗传转化的表达可以直接用于修改水稻建筑[13.]．OSTAC1.控制米饭中的分蘖角度[3.]和变化TAC1此后已与其他植物物种的直立分蘖或分支角度相关联，包括拟南芥[14.]， 白饭 [15.]，poplar [4.]， 桃 [16.那17.， apple [18.]．OSTAC4.参与水稻分蘖角的调控，影响内源生长素含量，最终导致向地性降低，形成分蘖扩散表型[19.那20.]．

在许多植物种类中，懒惰在调节植物分支角度起着重要作用。例如，米饭懒惰突变体显示分蘖扩散表型，因为向地性减弱[21.]．在拟南芥，共有六个懒惰的基因已经被识别，并且发生了突变Atlazy1.在初级花序茎仍然垂直时导致分支角度的大变化[22.]．另一个懒惰的突变反转侧枝和根的生长角，表明懒惰的基因通过对不对称的控制来调节生长素极性运输的方向PIN3根帽霉菌中的表达[23.]．在Apple和Poplar中，证据表明懒惰的基因影响转基因植物的维管组织，从而改变分枝角度[4.那16.]．

虽然懒惰的已经表明基因在改变各种植物种类中的分支角度，在茶叶植物中的同源基因的潜在功能起到重要作用（茶树）仍然是未知的。分支角是茶叶植物的重要特征，可以影响植物建筑以及茶叶的机械收获。在这项研究中，三个懒惰的在茶树中鉴定了相关基因，并对其在不同组织中的表达水平进行了分析。cslazy1主要在茎中表达，位于质膜上。植物中cslazy1对重力处理的响应比野生型植物更有效。我们的研究结果确定了新的候选基因，可用于培育具有理想植株结构的新茶树品种。

识别，保守域和序列特征分析cslazys.

共有六个懒惰的确定基因拟南芥[22.]．随后,这六个AtLAZY基因在基本局部对准搜索工具（BLAST）分析中用作对茶植物基因组的疑问（http://tpia.teaplant.org/blast.html.）[24.]．最初，共有15个候选独特基因获得茶叶植物，以及所有序列对齐懒惰的基因在茶叶植物中进行，拟南芥还有大米(数据未显示)。结果显示，只有3个独特的基因包含保守序列V区域，该区域具有乙烯响应元件结合因子相关的两亲性抑制(EAR)基序(LxLxL)(图S)1)，这是LAZY不可缺少的保守领域[22.那25.]．此后，将三种获得的基因称为cslazy1（CSS025254），cslazy2.（CSS049138）和cslazy3.(CSS020288)，定位于不同支架(表1）.它们的氨基酸长度为399 AA（cslazy1），367 AA（cslazy2.)及251 aa (cslazy3.),分别。此外，分子量(Mw)cslazy1到cslazy3.44.2,41.2和29.0，它们的等电点分别为6.55,6.18和6.47（表1）.

进化和系统发育分析懒惰的基因

以前的研究和许多完全测序的植物基因组的存在使得可以进行比较基因组分析懒惰的各种植物种类的基因。懒惰的已被确定为在许多植物种类中识别出类似的角色，因此我们进行了迭代爆炸搜查以确定系统发育懒惰基因。懒惰从21种不同的植物物种和同源性分析中鉴定基因懒惰在藻类，低地物种，单焦点和Dicots中进一步了解该基因家族的进化过程（图。1A).系统发育分析表明这些懒惰基因高度保守藻类，单焦炭和双滴角懒惰尽管它们整体相对较低的序列相似度，但尽管它们的序列相对较低，从原始生物中的发展。很明显cslazy1有更高的序列相似性懒惰来自其他木质植物的基因，包括猕猴桃，葡萄，杨树和桃，表明这一点cslazy1在木质植物中的进化过程中更加高度保守（图。1一种）。

为了进一步了解他们的序列同源性和潜在的生物学功能，我们分析了包含所有的进化树懒惰的来自八种植物的基因家族成员，包括奥雅萨苜蓿那拟南芥那Solanum Lycopersicon.那Populus tomentosa那vitis Vinifera那Prunus Persica那Actinidia chinensis.和茶树．完整懒惰的采用32个成员的基因家族进行系统发育分析。这表明懒惰的基因主要分为三个分支:I类、II类和III类(图1)。1b）。cslazy1和cslazy2.被分组成I类，并且它们都与蛋白质序列具有高序列相似之处Aclazy1.那Aclazy2.和VvLAZY1基因。cslazy3.被分组成II级，并显示出高序列相似之处VvLAZY3那pplazy4.那Atlazy2.和Atlazy4.基因。

三种启动子的基因结构、顺式元件及组织表达模式分析CsLAZY基因

调查结构多样性CsLAZY基因，我们将外显子/内含子组织与各自的编码序列进行比较CsLAZY基因，展示这一点cslazy1到cslazy3.分别含有5,5和3个外显子（图。2一种）。在内含子和外显子长度方面，cslazy1是最长的cslazy3.是最短的。的编码序列cslazy1克隆并测序，结果表明克隆的cDNA与基因组参考序列完全一致。

探讨非编码区域的潜在差异cslazys.，获得翻译起始密码子上游的2-KB侧翼序列，并且使用该地方和Plantcare数据库来鉴定启动子中的许多推定的顺式调节元件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）.轻敏CIS元素，包括Box 4，TCT-MOTIF，ATC-MOTIF，ATCT-MOTIF，G盒，I-BOX，CHS-CMA1A，MRE和ACE，占所有元素的最大比例（图。2b）。cslazy1包含两种关键光敏顺式元件，包括两个G盒和一个ACE;cslazy2.包含七种光敏CIS元素，除了ACE和TCT-MOTIF元素。获得了七种激素敏感的顺式元素，包括CGTCA-MOTIF，GARE-MOTIF，TCA元件，ERE，ABRE，TATC盒和TGACG-MOTIF。值得注意的是，启动子地区cslazy1含有五种激素敏感的顺式元素，包括TGACG-MOTIF，ABRE，TCA元件，GARE-MOTIF和CGTCA-MOTIF（图。2b）。这些顺式元素是Meja，Ga-，Sa和ABA响应元件，暗示cslazy1可能在茶叶植物对激素的反应中发挥重要作用。

了解潜在的作用cslazys.在茶叶植物中，我们从茶树基因组数据库下载了八个组织的RNA-SEQ数据。数据显示三个表达水平CsLAZY基因明显特异于各种组织（图。2C)。例如，cslazy1茎中的表达水平最高，然后在芽和叶中，而基本上没有用水果或根。相比下，cslazy2.以花朵，和cslazy3.展示了叶中最高的表达水平。因为茎弯曲是分支角度开发的主要原因之一，cslazy1可能在调节茶叶植物的分支角度方面发挥着重要作用。

的表达模式cslazy1在不同茶叶中的组织中

进一步验证其组织表达模式cslazy1的组织表达水平cslazy1在不同的茶叶品种中。对本山、佛寿、腰山秀绿、铁观音4个开型品种和鄂茶5号、福枣2号、龙井长叶、正河大白茶4个直立型品种进行了分析。的表达式级别cslazy14个组织(叶、芽、根和茎)的转录水平差异显著(图4)。3.）.它表明了cslazy1在八种茶叶的根系中没有检测到转录物，它的茎中的最高表达水平，其次是叶片。值得注意的是，两种不同型茶叶植物之间观察到组织表达模式的明显差异。出乎意料地，在铁观音品种，cslazy1叶子中的表达水平最高，其次是茎。

CsLAZY1蛋白的亚细胞定位

在拟南芥， AtLAZY1定位于质膜和细胞核中，参与分支角度的调控[22.]．为了获得洞察CSLazy1蛋白的分子功能，我们构建了CsLazy1-GFP和PK7WGF2 35S-GFP融合蛋白表达载体，以检查其亚细胞定位。瞬态表达拟南芥原生质体表明CSLAZY1蛋白在质膜中定位（图。4.一种）。此外，将CsLazy1-GFP的质粒转移到农杆菌感染烟草benthamiana结果相同，即CsLAZY1蛋白定位于质膜(图。4.b）。

过度表达cslazy1在拟南芥

进一步研究cslazy1在射击船舶中，我们转移了cslazy1进入拟南芥蒂利亚纳。的表达cslazy1使用实时PCR测定检测cslazy1-Overexpression（OE）植物，但不在野生型（WT）植物中，三条OE线被命名为Oelazy1-11，Oelazy1-20和Oelazy1-24（图。5.随后，采用时移成像记录的重力性试验来调查WT和三条OE线对再定向的响应。所有主茎5 - 10cm的幼苗均进行90°倒置重力处理。在光照条件下，经过0、30、60、90、120 min的反演后，由计算机控制的摄像机采集图像(图4)。5.b），并且从图像中测量下胚轴的角度。OE植物在30分钟内略微向上弯曲，同时在WT植物中没有观察到弯曲。在倒置90分钟后，OE植物达到其最大弯曲角度，而WT植物略微向上弯曲（图。5.b）。在30分钟后，在OE和WT植物之间观察到弯曲角度的显着差异（图。5.C)。

在黑暗中，在反演0、30、60、90、120、150、180 min后采集图像，从图像中测量下胚轴的角度。WT和OE植物在黑暗中都比它们的相应植物在光照下更晚向上弯曲，暗示启动子中光敏顺式元件可能与启动子的功能有关cslazy1基因(图。6.一种）。在黑暗中，30分钟后，在WT和OE植物中没有观察到弯曲角度。OE植物在60分钟后略微弯曲，而WT植物在90分钟后略微弯曲（图。6.一种）。在90分钟后，在OE植物和WT植物之间也观察到弯曲角度的显着差异（图。6.b）。与表达式模式一致，证据表明cslazy1可能在茶叶茎秆中对颅重血主义的反应起到至关重要的作用。

农业生产力受各种环境因素的影响，可能导致较低的作物产量。工厂建筑是作物产量的主要限制之一，分支角度在植物建筑的形成中起着至关重要的作用[26.]．积累的证据表明懒惰在植物反应中起着至关重要的作用对船舶反应，然后调节分支角度[22.那23.那27.]．对于茶叶植物，分支角度是可以大大影响机械拔牙的生产率和效率的关键因素。然而，控制茶叶植物分支角的分子机制几乎已经理解到目前为止。在本研究中，我们确定了三个CsLAZY茶叶植物中的基因分析它们的系统发育关系，基因结构和组织特异性表达模式。随后，候选基因的生物学功能cslazy1研究了，包括其亚细胞定位，不同茶品种的组织特异性表达模式，并进行异源过表达分析，揭示了对重力的明显差异反应。

他们三个CsLAZY基因表现出不同的组织表达模式（图。2C)。cslazy3.与其他两个不同CsLAZY通过聚集到不同的亚亚的基因中，其在第二叶中具有高表达水平。cslazy2.显示出高序列相似之处cslazy1并且在花中表达了最高的表达水平，表明这一点cslazy2.可能在花的发展中发挥重要作用。相比下，cslazy1在茎中的表达水平远远高于其他组织（图。2C)，在其他几种木本植物中也观察到类似的组织特异性表达模式，如杨树[4.]， 桃 [16.]和苹果[18.]．识别是否cslazy1本研究以茶树为研究对象，以茶树分枝角度对开放型茶树(本山茶树、佛手茶树、药山秀绿茶树、铁观音茶树)和直立型茶树(鄂茶5号茶树、伏早2号茶树、龙井长叶茶树、正河大白茶)的表达进行了分类。不同茶品种间表达模式无明显差异(图。3.）.在杨树，转录水平PtLAZY1在不同组织中显示出类似的表达曲线，并且在窄冠和宽冠状疱疹之间观察到组织特异性表达谱的显着差异[4.]．在拟南芥，破坏Atlazy1.表达会导致重力响应的弱化，导致分支角度变大[22.那28.[从而结果占类似的表达模式cslazy1在不同的茶叶中（图。3.）.此外，亚细胞定位cslazy1分析，证明CSLAZY1蛋白位于质膜中，这与先前的研究一致拟南芥[22.那23.那28.]．此外,其他几个AtLAZY基因拟南芥都局限于质膜[22.那28.]．出乎意料的是，已经证实oslazy1位于核中，oslazy1的核定位对于其在水稻中的功能至关重要[29.那30.]．事实上，OSBRXL4蛋白在血浆膜处与OSLAZY1相互作用，它们的相互作用决定了OSLAZY1的核定位，从而通过影响LAZY1的核定位来调节茎重力和稻米分蘖角度[30.]．由此，来自不同植物物种的大多数懒惰1位于血浆膜中，只有稍微差异存在于水稻中的oslazy1定位。

懒惰的共享常见结构域序列的基因通常具有共同的原点，因此具有相似的功能[22.那25.]．同源性分析LAZY-like杨树基因和功能调查Pzlazy.建议Pzlazy.可能参与改变分支角度[4.]．在懒惰的基因，耳动图案位于保守区域V，其在控制激素系统中起作用并且与植物的重力响应有关。例如，裸照蛋白质与Aux / Iaa蛋白的耳动术的结合可以抑制毒素响应基因[30.那31.]．他们三个CsLAZY从茶树中获得的基因共享5个有限序列区域，在V区高度保守(图S)1)，表明它们可能在茶树的发育中发挥作用。系统发育分析表明cslazy1与...有高序列相似之处懒惰来自其他木本植物，包括葡萄，杨树和桃子的植物（图。1一种）。这个结果表明了懒惰在木本植物的进化过程中经历了更大的保护。

此外，我们获得了异源OE拟南芥植物，而在OE植物和野生型植物之间没有观察到表型的差异，这也与前一项研究的结果一致[32.]．值得注意的是，OE植物的表型显然与重力响应野生类型的表型（图。5.和6.）.据推测cslazy1可以通过作用于植物激素的运输来发挥作用改变分支角度。在拟南芥、6AtLAZY参与芽向重力性早期重力信号的基因[22.那23.那28.]．Atlazy1.导致植物蛋白的不对称分布，从而改变米饭分蘖角;Atlazy1.还在淀粉蛋白位移下游的语征中介导重力信号传导，导致重力响应器官的不对称性毒素分布的发展[33.那34.那35.]．在米饭，oslazy1.通过抑制生长素极性运输调节茎向地性来控制分蘖角[21.那29.那31.]．我们还分析了启动子中的顺式元件cslazys.并发现Meja，Ga，SA和三个ABA激素响应元素存在于启动子中cslazy1（图。2b）。统称，cslazy1可以通过作用于植物激素的运输来扮演重力的响应和改变分支角度的角色。

在这项研究中，我们确定了三个懒惰的来自茶植物的基因并命名为它们cslazy1到cslazy3.基于它们的序列相似之处懒惰的基因拟南芥．这cslazy1到cslazy3.基因在八种不同的组织中显示出明显的表达模式，并且分别具有茎，花和叶中的最高表达水平。组织特异性表达cslazy1还在不同的茶叶中鉴定出来，表现出不同的分支角度，确认这一点cslazy1在茎中表达量最高。通过亚细胞定位分析，将CsLAZY1蛋白定位于质膜。过度的cslazy1在拟南芥结果表明，在光照和黑暗条件下，过表达植物比野生型植物对重力加工的响应更有效。结果表明cslazy1对调节茶树梢向地性和影响枝角有重要作用。

植物材料

共有九名五岁茶植物品种（茶树var。‘Shuchazao’, ‘Benshan’, ‘Foshou’, ‘Yaoshanxiulv’, ‘Tieguanyin’, ‘Echa 5’, ‘Fuzao 2’, ‘Longjingchangye’, and ‘Zhenghedabaicha’) from the Tea Plant Cultivar and Germplasm Resource Garden in Guohe town (Anhui Agricultural University) were used for the collection of various tissues (the second leaf, apical bud, young root, and young stem). All tissues were sampled according to the demands of each experiment, and they were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80 °C until utilization.

分子克隆与鉴定cslazys.

核苷酸和推导的6个氨基酸序列AtLAZY基因拟南芥从TAIR（拟南芥信息资源）数据库获得（https://www.arabidopsis.org/）.范围内搜索6AtLAZY利用Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)对6个基因进行分析AtLAZY基因用作茶植物基因组的疑问（http://tpia.teaplant.org/blast.html.）[36.]．将所有非还原蛋白质序列与阿特拉昔和肌肿瘤进行比较，并选择具有枢转保守结构域的基因。验证编码区域cslazys.，设计基因特异性引物扩增CsLAZY来自年轻叶子的cDNA模板的基因茶树var。“蜀卓”。

系统发育分析懒惰的基因

从水稻、番茄、苹果、桃、杨树和葡萄中获得了基因序列。https:///phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html.），从Kiwifruit基因组数据库获得来自猕猴桃的基因序列（http://kiwifruitgenome.org/）.多个序列对齐懒惰的利用ClustalW程序进行蛋白序列分析。以全长氨基酸序列为基础，采用MEGA 6.0和neighbor-joining (NJ)算法生成系统发育树。使用1000个重复的Bootstrap分析来评估节点的重要性，并使用p距离模型来确保发散域可以对NJ树的拓扑结构做出贡献。

基因结构和启动子结构分析CsLAZY基因

使用T-咖啡进行氨基酸序列的对准（http://tcoffee.org/）[37.]．基于基因结构显示服务器（GSDS 2.0，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php.）计划，我们确定了外显子/内含子组织cslazys.通过将编码序列与其相应的基因组序列进行比较。调查启动子序列中的顺式元素CsLAZY测序结果表明，该基因在家族基因、翻译起始密码子上游的一个2kb侧翼序列中均有表达，http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)来鉴定启动子中的顺式调控元件。

RNA提取和实时定量PCR分析

根据制造商的协议，使用RNAPREP纯植物套件（Cat DP432，Tiangen，北京）从茶叶中提取全RNA。使用琼脂糖凝胶电泳检测每个RNA提取物的质量和数量和纳米玻璃器2000（Thermo Fisher Scientific，US）。在制造商协议之后，使用Primescript RT试剂盒（Cat RR036a，Takara，Japan）从总RNA合成第一链cDNA。对于QRT-PCR，使用10μL总反应体积，包括5μLGROG绿色，1.2μLcDNA，3.2μL水和0.6μL底漆，如前详细描述了该方法[38.那39.]．这CSGAPDH.选择基因作为内部对照，并使用2分析相对基因表达值^-△Ct方法(40]．所有反应均用三份的每个样品进行三份技术重复，进行三次生物重复。相关的引物列于其他文件中1和全长核苷酸和蛋白质序列cslazy1在附加文件中列出2．

CsLAZY1蛋白的亚细胞定位

这cslazy1用GFP融合的质粒由网关技术构建，以及ORFcslazy1通过RT-PCR扩增25bp载体载体。通过BP克隆酶混合物将PCR产物插入PDONR207载体中，然后通过LR反应转移到PK7WGF2中。将所得空载体和PK7WGF2-Lazy1质粒转化为拟南芥在转化后检查原生质体细胞，并在过夜后检查原生质体。此外，所得载体也转化为农杆菌GV3101感受态细胞，将构建物及空载体瞬时导入烟草benthamiana注射叶。在变换后，在黑暗中，在25℃下将烟草叶保持48小时，使用奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜（日本Olympus）检查烟叶和原生质体。

拟南芥转型和分支角测量

将cDNA全长序列连接到CaMV35S驱动的PBI121上，然后转入农杆菌菌株GV3101。拟南芥（COL）使用如前所述的花卉DIP方法进行转化[41.]．基于它们对卡那霉素的抗性选择转化的植物，并且4周龄纯合T3植物用于进一步实验。对三种转基因系进行90°倒进的重力处理，用于分析弯曲角度。

对重力角的植物响应如下确定：杆最初定位在标准对准中以允许检测到的每个时间点处的角度变化，沿着初始杆和沿着弯曲杆绘制切线。使用imagej软件测量两个切线之间的角度。

支持本文结果的数据集可在NCBI SRA数据库中获得（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）根据“项目登录号MW848488”。

OE：

超表达

WT：

野生型

QRT-PCR：

定量实时聚合酶链反应

国际宇航科学院:

吲哚乙酸

阿巴：

脱盐酸

SA：

水杨酸

GA：

吉布林素

惩罚:

茉莉酸甲酯

SLS：

Strigolactones.

BRXL4:

Brevis Radix-yex 4

销:

引脚形成

我们感谢茶树品种和种质资源园(中国安徽省庐江县果河镇)提供的茶树样品。

这项工作得到了安徽省自然科学基金会（2017年M621991）的安徽省自然科学基金（1808085QC92）的财务支持，以及中国的国家重点研发计划（2019YFD1001601）。

作者笔记

1. 小波夏，萧忠米和凌晋同等贡献了这项工作

隶属关系

1. 安徽农业大学茶厂生物利用国家重点实验室，西130，安徽省安徽省安徽省230036

   夏晓波，米晓增，金玲，郭睿，朱俊燕，谢辉，刘璐，安燕林，张操，魏朝玲，刘胜瑞

贡献

XBX进行了实验并写了稿件。XZM，LJ，RG，JYZ，HX，LL，YLA和CZ参与了实验和数据分析。SRL和CLW构建了该项目，设计了研究并修改了论文。所有作者都读过并批准了稿件。

相应的作者

对应于Chaoling Wei.要么刘淑瑞．

伦理批准和同意参与

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

同意出版物

不适用。

出版商的注意事项

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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