水稻灌浆期高温处理影响籽粒品质和小穗育性的基因筛选与鉴定

背景

由于气候迅速变化，近期气温上升对水稻产量和粮食品质产生了负面影响。特别是花期后的高温降低了小穗的育性，同时干扰了糖能的运输，并通过形成垩白粒对籽粒品质造成严重损害。以灌浆期双单倍体为材料，研究了高温对小穗育性和籽粒品质的影响₁通过杂交清清和南洞品种。数量性状位点(QTL)定位鉴定了与高温下小穗育性和籽粒品质显著相关的候选基因。

结果

我们的分析OsSFq3这有助于高温下的小穗肥力和籽粒品质。OsSFq3在3号染色体RM15749-RM15689区域进行了精细定位，预测了4个与淀粉成分直链淀粉的合成和分解相关的候选基因。四个主要的候选基因，包括OsSFq3分析了参与淀粉成分直链淀粉和支链淀粉合成和分解的10个不同基因及其相对表达量。OsSFq3在高温处理初期高度表达。它与禾本科植物中的FLOURY胚乳6具有高度同源性，因此可能具有相似的功能。

结论

QTL，主要候选基因，和OsSFq3本文所鉴定的基因可以有效地用于水稻品种的选育，以提高籽粒品质，同时耐高温，以应对气候变化。此外，连锁标记可以帮助标记辅助选择耐高温的优质高产水稻品种。

不同生育期温度对水稻产量和品质的影响不同[1，2，3.]。高温对水稻生长早期有积极的影响。特别是生长初期的高温刺激，促进养分的吸收，产生大量分蘖，可获得高产[4]。然而，生长后期的高温对其有负面影响。特别是灌浆期的高温，增加了细胞的呼吸量，减少了碳水化合物的积累。另外，通过加速老化，缩短了成熟期，由于种子重量的减少而降低了产量[5，6]。近年来，由于全球变暖导致的气温升高和异常温暖天气的频率正在增加，这些现象已知对水稻的产量和品质产生了严重的负面影响[7]。在过去的100年里，地球的平均温度上升了0.74°C，全球变暖的速度已经大大增加[8]。根据国际水稻研究所的数据，水稻生育期最低温度每升高1℃，水稻总产量下降> 10% [9]。特别是在水稻的整个生长期，繁殖阶段对温度极为敏感[10]，而这一时期的高温胁迫对生育力的影响最为严重[11]。全球变暖引起的高温胁迫对水稻的所有发育阶段，包括所有生长阶段和产量都产生了负面影响，给世界范围内的水稻种植造成了严重的经济损失[12]。此外，由于全球变暖导致冬季减少，夏季变得相对较长，在水稻成熟期间暴露在高温下的风险增加了。水稻在开花期刚过的时候暴露在高温下，会造成广泛的损害，例如由于生育力下降而导致产量下降和品质恶化;因此，研究水稻成熟期的高温耐受性是十分重要的[13，14]。水稻在开花期对温度最敏感，而在开花期前后对高温最敏感[15]。特别是水稻开花期后在38℃下暴露1 h，不孕症发生率显著增加，在41℃下暴露4 h，水稻受到极其严重的损害，完全不育[16，17]。粳稻开花期后45天的最佳成熟温度为21℃- 22℃[18]。如果此时平均温度> 26℃，稻米垩白比例增加，籽粒重量也减少。这种现象导致产量下降[19，20.]。白稻米发生的主要原因不是成熟前期的温度，而是同化产物供应不足，成熟中期以后供应能力下降。此外，水稻成熟阶段的高温胁迫通过改变淀粉合成相关基因的活性，是导致水稻口感变质的主要原因[21]。虽然糖在植物中被用作能量来源，但它已被证明是一种重要的信号物质[22]。此外，在水稻成熟阶段，大量糖被引入穗部，糖信号传导过程与水稻籽粒成熟过程密切相关[23]。高温胁迫是通过影响糖的迁移而阻碍籽粒发育和生长的主要环境胁迫之一，直接影响种子的品质和产量[j]。24]。除了高温胁迫外，各种非生物胁迫也会在糖/能量信号系统中引起共同的生理反应，这表明糖/能量信号系统的分析和作用基因的分析在耐高温胁迫水稻品种的培育中起着至关重要的作用[25，26]。对高温胁迫环境下水稻小穗育性的降低进行了多项研究[27，28，29]。特别是水稻在高温下由于穗内缺乏碳水化合物而不育，高温下穗内淀粉和淀粉生物合成酶活性的变化也是导致不育的原因[30.]。在高温下，灌浆前期淀粉的积累通过几种转录物的代谢过程受到抑制，氨基酸的积累增加，导致高温贮藏材料发生变化[31]。特别是Boden et al.， (2013) [32[文献]报道高温胁迫作用于植物种子发育过程中，组蛋白变异积累发生变化，随着基因表达的变化，产量下降。目前，对高温胁迫水稻的研究主要集中在以热休克蛋白为核心，提高高温条件下水稻的成活率和维持产量。然而，由于水稻籽粒形成过程非常复杂，且涉及多个基因，因此对籽粒品质的研究受到限制。数量性状位点(QTL)具有识别和操纵与调节作物性状的复杂性状相关的基因的能力[33，34]。QTL分析通过探索与该性状有关的染色体的特定组成部分，提供了快速准确的遗传背景信息。此外，由于植物表型差异受自然变异和环境的调控，QTL分析的优势在于能够比突变分析更实际地识别表型差异[35，36]。因此，本研究通过QTL定位，确定了高温处理胁迫下与小穗育性相关的候选基因，并在这些候选基因中筛选了影响籽粒品质的基因。此外，利用筛选到的候选基因，对耐高温敏感水稻品种的相对基因表达和蛋白同源性进行了鉴定。

在高温条件下成熟的稻谷呈白垩色

在灌浆期对水稻进行高温处理后，成熟后的籽粒呈现白色外观(图2)。1）.晶粒中间部分因高温而变白。然而，对照样品具有完美的晶粒形状，大部分是半透明的，而高温应力下的晶粒则呈现不透明的外观。通过扫描电镜分析完全成熟的颗粒，在正常条件下，淀粉体呈多边形，排列紧密。然而，在高温条件下，其形状不规则，淀粉体疏松，并且有许多空隙。在高温条件下，淀粉体的形状和排列发生变化，从而形成垩白颗粒。这一现象在耐高温系和敏感系均有观察到。但与耐高温系相比，易感系淀粉质体气孔较多，大小不规则。特别是cndh120系中CNDH22、CNDH71和CNDH75表现出高温耐受性，CNDH11、CNDH48和CNDH109对高温处理敏感(图2)。2）.在正常条件下，清清的完美粒率在2019年和2020年分别为95.7%和96.3%，但在高温处理下，2019年和2020年的完美粒率分别降至38.4%和40.2%(图2)。3.）.在正常条件下，2019年和2020年的完美粒率分别为92.9%和93.4%，但在高温条件下，2019年和2020年的完美粒率分别降至52.1%和55.3%。对耐高温品系cndh120、耐高温品系CNDH22、CNDH71、CNDH75和耐高温品系CNDH11、CNDH48、CNDH109进行了高温处理后的完美晶粒率分析。2019年，CNDH22、CNDH71和CNDH75在正常条件下的完美晶粒率分别为94.3、89.3和87.3%，高温条件下的完美晶粒率分别为58.4、63.5和63.4%。在耐高温的CNDH系中，CNDH22、CNDH71和CNDH75因高温而减少的完美晶粒比例分别为38%、28%和27%。2020年，CNDH22、CNDH71和CNDH75在正常条件下的完美晶粒比分别为94.8、88.7和87.2%，在高温条件下的完美晶粒比分别为60.1、64.3和64.5%。耐高温品系中，CNDH22、CNDH71和CNDH75因高温导致的完美晶粒减少率分别为36.6%、27.5%和26.0%。接下来，我们分析了cndh120中对高温敏感的cndh11、CNDH48和CNDH109在正常和高温条件下的完美晶粒比例。2019年，cndh11、CNDH48和CNDH109在正常条件下的完美粒比分别为93.1、90.5和91.8%，高温条件下的完美粒比分别为21.4、16.5和22.3%。在高温敏感的CNDH系中，CNDH11、CNDH48和CNDH109的高温完全晶粒还原率分别为77.0、81.7和75.7%。 In 2020, the ratios of perfect grains of CNDH11, CNDH48, and CNDH109 were 92.4, 89.3, and 92.5%, respectively, under normal conditions, and 19.3, 15.2, and 21.4% under high-temperature conditions, respectively. In the high-temperature-resistant CNDH line, the ratios of perfect grain reduction for CNDH11, CNDH48, and CNDH109 due to high-temperature were 79.1, 82.9, and 76.8%, respectively. Among the CNDH 120 lines, when both the tolerant lines and the sensitive line were treated with high-temperature, the perfect grain ratios decreased with a significant probability at the level of 1%.

灌浆期高温处理对籽粒品质影响的蛋白质、直链淀粉和水分含量变化

为分析水稻灌浆期高温对影响籽粒品质的蛋白质、直链淀粉和水分含量的影响，在灌浆期进行高温处理，并在收获后(开花后45天)测定籽粒中蛋白质、直链淀粉和水分含量(表1)1）.2019年和2020年，正常条件下清清的蛋白质含量分别为6.1±0.1%和6.1±0.1%。高温条件下分别为6.4±0.1%和6.3±0.1%。与对照组相比，在高温条件下，清清蛋白含量在1%水平上有显著提高。2019年和2020年，正常条件下，那东的蛋白质含量分别为6.4±0.3%和6.5±0.1%。高温条件下分别为6.7±0.2%和6.7±0.1%。灌浆期2年高温处理下，那东的蛋白质含量与对照无显著差异。在耐高温的CNDH系中，CNDH22、CNDH71和CNDH75的蛋白质含量存在差异。这3个CNDH系在2019年和2020年高温处理和正常条件下的蛋白质含量均无显著差异。在灌浆期高温处理下，对高温敏感的CNDH11、CNDH48和CNDH109在2019年和2020年均较对照显著提高了1%的蛋白质含量。 Next, the amount of amylose that affects grain quality was measured in Cheongcheong, Nagdong, and CNDH lines. In 2019 and 2020, the amylose contents of Cheongcheong were 17.4 ± 0.1% and 17.3 ± 0.2%, respectively, under normal conditions. However, the respective values under high-temperature conditions were 15.1 ± 0.2% and 15.0 ± 0.1%. Compared with the control group, the amylose content of Cheongcheong decreased with a significant probability at the 1% level under high-temperature conditions. In 2019 and 2020, the amylose contents of Nagdong were 17.9 ± 0.1% and 17.9 ± 0.1%, respectively, under normal conditions. However, the values were 16.4 ± 0.1% and 16.4 ± 0.3% in 2019 and 2020 under high-temperature conditions, respectively. When Nagdong was subjected to high-temperature treatment during ripening for 2 years, the amylose content decreased with a significant probability at the 5% level compared to that in the control. Among the CNDH lines, differences in amylose content were confirmed in CNDH22, CNDH71, and CNDH75, which were highly resistant to high-temperature. When CNDH22 was subjected to high-temperature treatment during the filling stage, in 2019, the amylose content decreased with a significant probability at the 5% level compared to that in the control, but it decreased with a significant probability at the 1% level in 2020. Moreover, CNDH71 and CNDH75 showed a decreased amylose content with a significant probability at the 1% level in both 2019 and 2020. In addition, CNDH11, CNDH48, and CNDH109, which were sensitive to high-temperature among the CNDH lines, showed decreased amylose content with a significant probability at 1% level in both 2019 and 2020 compared to that in the control under high-temperature treatment during the filling stage. Finally, it was analyzed whether high-temperature treatment affects the moisture content of grains during the filling stage. Cheongcheong, Nagdong, CNDH22, CNDH71, and CNDH75, which have high-temperature tolerance capacity, and CNDH11, CNDH48, and CNDH109, which were sensitive, were all treated at high-temperature during the filling stage in 2019 and 2020. We observed no significant difference in the moisture content compared to that in the control.

灌浆期高温对花粉活力的影响

花粉是水稻育性的关键调节因子。花后立即高温处理花粉，用I₂-KI染色(图;4）.高温处理使耐高温系和高温敏感系开花后立即花粉活力降低。在未经高温处理的对照样品中，花粉粒成活率> 90%，呈深黑色，形状均匀圆形。但在高温处理下，花粉粒形状不均匀，形状变化较大。此外，透明颜色的花粉粒所占比例高于深黑色。花粉粒数也有所减少。2019年，在高温处理下，清清和陇东的花粉活力分别比对照下降了56.1%和37.7%。高温处理下，CNDH22、CNDH71和CNDH75的花粉活力分别比对照降低了38.8%、38.6%和33.7%，CNDH11、CNDH48和CNDH109的花粉活力分别降低了71.6、65.6和76.0%。2020年的高温处理效果与2019年相似。高温处理下，清清和南洞的花粉活力分别下降了57.4%和37.7%，CNDH22、CNDH71和CNDH75的花粉活力分别下降了36.3%、35.7%和34.9%，CNDH11、CNDH48和CNDH109的花粉活力分别下降了68.8、66.3和74.7%。 When treated with high-temperature, the pollen viability decreased on average in both the high-temperature-tolerant and -sensitive lines, but the proportion of pollen viability in the susceptible line was significantly reduced compared to that in the tolerant line.

灌浆期高温对小穗育性和千粒重的影响

为研究高温对水稻灌浆期籽粒形成过程的影响，于2019年和2020年对水稻的小穗育性和千粒重进行了研究(表1)2）.实验将清清系、陇东系和CNDH 120系分为常温组和42℃高温组进行。正常条件下，2019年清清和那东的平均穗肥力值分别为92.3±1.3%和97.8±1.5%，2020年为93.5±1.1%和96.5±1.7%。但在高温处理下，2019年清清和那东的小穗育性值分别降至23.8±2.1%和53.8±2.5%，2020年降至24.7±1.8%和58.6±2.3%。与对照组相比，实验组所有这些值都以1%的显著概率下降。在正常条件下，CNDH 120系2019年和2020年的平均小花育性值分别为81.4±11.3%和81.5±10.5%，而在高温条件下，2019年和2020年的平均小花育性值分别为47.6±19.4%和46.6±17.2%。高温条件下，CNDH 120系也连续2年呈下降趋势，且极有可能在1%水平下降。高温胁迫对灌浆期千粒重的影响，正常条件下，2019年清清千粒重19.3±1.4 g, 2020年清清千粒重19.1±1.2 g, 2019年南东千粒重21.8±1.1 g, 2020年南东千粒重21.5±1.2 g。CNDH 120系2019年和2020年的千粒重分别为22.7±4.2 g和22.9±3.9 g。但在高温条件下，清清的千粒重2019年为16.2±0.8 g, 2020年为16.5±0.7 g，陇东的千粒重2019年为18.2±0.9 g, 2020年为18.5±0.8 g。 The average of the 1000 grain weight of the CNDH 120 line was 20.8 ± 4.5 g in 2019 and 21.0 ± 4.6 g in 2020. The 1000 grain weights of Cheongcheong, Nagdong, and CNDH 120 lines all decreased under high-temperature conditions for 2 consecutive years, and these decreases were significant with a probability at the 1% level. When the Cheongcheong, Nagdong, and CNDH 120 lines were subjected to normal and high-temperature treatment conditions, the frequency distribution of the spikelet fertility and 1000 grain weight showed a continuous variation almost similar to the normal distribution. Therefore, the spikelet fertility and 1000 grain weight were related to more than one gene. This implies that the genes related to spikelet fertility and 1000 grain weight are a quantitative trait (Fig.5）.

高温下与小穗育性和千粒重相关的qtl分析

利用788个SSR标记生成了CNDH系的遗传图谱。根据清清和那洞的多态性分析结果，423个SSR标记具有多态性。在多态性分析筛选出的423个SSR标记中，选取共显性标记143个，在清清和陇东均有PCR扩增的SSR标记，构建CNDH系遗传图谱。CNDH系关联图谱总长度为2121.7 cM，用于生成遗传图谱的标记间平均距离为10.6 cM。CNDH系遗传图谱中每条染色体有19 ~ 50个SSR标记，这些SSR标记均匀分布在水稻的12条染色体上。在灌浆期对清清、那洞和CNDH 120系进行高温处理，利用Windows QTL制图器2.5的CIM方法对高温处理后出现的小穗育性、千粒重和基因型信息进行QTL作图分析(图2)。6）.通过对籽粒灌浆期高温处理与小穗育性和千粒重有关的QTL定位，2019年在3号染色体上检测到qSf3，在4号染色体上检测到qSf4，在8号染色体上检测到qTgw8。2020年，在3号染色体上检测到qSf3-1，在7号染色体上检测到qTgw7，在8号染色体上检测到qSf8和qTgw8-1。其中，qSf3、qSf3 - 1、qSf4和qSf8是与灌浆期高温处理下肥力相关的qtl, qTgw7、qTgw8和qTgw8 - 1是与灌浆期高温处理下千粒重相关的qtl。2019年，对灌浆期高温处理下与小穗育性相关的qtl qSf3和qSf4进行了探索。qSf3在3号染色体RM15749-RM2334区域检测到，LOD评分为3.2。可以解释的表型变异为20%，来源于清清的等位基因。qSf4在4号染色体RM1205-RM3330区检测到，LOD评分为2.8。可解释表型变异为40%，来自清清等位基因。2020年，对灌浆期高温处理下与小穗育性相关的qtl qSf3-1和qSf8进行了探索。 qSf3–1 was detected in the RM6266-RM15689 region of chromosome 3, and the LOD score was 5.4. The phenotypic variation that can be explained was 10%, derived from the Cheongcheong allele. qSf8 was detected in the RM264-RM23581 region of chromosome 8, and the LOD score was 3.1. The descriptive phenotypic variation was 30%, derived from the Cheongcheong allele. RM15749-RM15689 of chromosome 3 was commonly detected in 2019 and 2020 when QTL mapping was performed on the spikelet fertility under high-temperature treatment during the grain filling stage of rice, all of which had an LOD score of ≥3.0 and were derived from the Cheongcheong allele. In 2019, qTgw8 was detected for QTL related to the 1000 grain weight under high-temperature treatment during the grain filling stage. qTgw8 was detected in the RM23178-RM23191 region of chromosome 8, and the LOD score was 3.1. The phenotypic variation that can be explained was 20%, derived from the allele of Nagdong. In 2020, qTgw7 and qTgw8–1 were detected for QTLs related to the 1000 grain weight under high-temperature treatment during the grain filling stage. qTgw7 was detected in the RM248-RM1134 region of chromosome 7, and the LOD score was 2.7. The phenotypic variation that can be explained was 20%, derived from the allele of Cheongcheong. qTgw8–1 was detected in the RM149-RM23191 region of chromosome 8, and the LOD score was 3.4. The phenotypic variation that can be explained was 10%, derived from the allele of Nagdong. RM149-RM23191 of chromosome 8 was commonly detected in 2019 and 2020 during QTL mapping related to the 1000 grain weight under high-temperature treatment during the grain filling stage, and the LOD scores of this region were 3.1 and 3.4, respectively. It was derived from the Nagdong allele (see Additional file1表1、图17）.

基于QTL定位寻找与籽粒品质和小穗育性相关的候选基因

2019年和2020年，水稻灌浆期高温处理下小穗育性和千粒重相关QTL定位结果显示，3号染色体上有2个QTL, 4号染色体上有1个QTL, 7号染色体上有1个QTL, 8号染色体上有3个QTL。其中，3号染色体RM15749-RM15689是与小穗育性相关的2年常检区域，8号染色体RM149-RM23191也是2019年和2020年常检区域。3号染色体rm15749 ~ rm15689的标记间隔为7.1 cM, 8号染色体rm149 ~ rm23191的标记间隔为7.0 cM。利用NCBI对这些SSR标记进行分析，共检索到34个高温相关候选基因。它们是按功能分类的。3号染色体上的RM15749-RM15689和8号染色体上的RM149-RM23191包括参与生物过程的orf，参与分子功能的orf和参与细胞成分的orf(见附加文件)1表2)。参与生物过程的候选基因包括mRNA加工、蛋白质转运和转录因子活性dna结合蛋白(图2)。8）.参与分子功能的候选基因包括锌离子结合、锌序列特异性结合、葡萄糖基转移酶、tRNA/rRNA甲基转移酶、金属离子dna结合和序列特异性dna结合蛋白。参与细胞成分的候选基因包括核、膜、叶绿体、染色体和核糖体蛋白的结构成分。其中,LOC_Os03g48170位于第3号染色体上，是一种糖苷水解酶，家族13，含n端结构域蛋白LOC_Os03g49600和LOC_Os03g49610是与-葡萄糖苷酶序列相似的基因。LOC_Os08g35110位于8号染色体上，是一个生长素反应性SAUR蛋白家族蛋白。所有这些基因都与淀粉的合成和分解以及糖的能量转移有关。因此,LOC_Os03g48170，LOC_Os03g49600，LOC_Os03g49610,LOC_Os08g35110被筛选为灌浆期高温处理下与小穗育性和籽粒品质相关的候选基因。

高温处理下灌浆期候选基因表达水平

比较了水稻成熟过程中参与种子淀粉合成和分解的GBSSI、GBSSII、SSI、SSIIa、SSIIIa、SBEI、SBEIIa、SBEIIb、Amy1A、Amy3D与本研究高温筛选的与小穗生育相关的候选基因LOC_Os03g48170、LOC_Os03g49600、LOC_Os03g49610、LOC_Os08g35110的相对表达量(图2)。9）.在开花初期进行高温处理，每5天取样一次。这些谷物在开花后45天收获，共取样9次。在无高温胁迫的正常条件下，淀粉降解和合成相关基因的相对表达量无显著差异，包括LOC_Os03g48170，LOC_Os03g49600，LOC_Os03g49610,LOC_Os08g35110在CNDH11和CNDH75。所有与淀粉合成有关的基因在开花后第10天和第15天表达量最高。而灌浆期开始高温处理后，CNDH11和CNDH75中淀粉合成和降解相关基因的相对表达量存在差异。直链淀粉合成基因的相对表达量GBSSI和GBSSII在CNDH11和CNDH75中，淀粉的组成成分均减少。然而，具有高温敏感性的CNDH11与具有高温耐受性的CNDH75相比，其下降率较高，且在1%水平下下降显著。SSI、SSIIa、SSIIIa、SBEI、SBEIIa和SBEIIb是支链淀粉合成基因，是淀粉的组成成分。SSI、SSIIa、SBEIIa和SBEIIb在高温处理下的相对基因表达量与对照没有显著差异。高温处理后，siiia在CNDH11和CNDH75中的表达均增加。然而，CNDH11的增加速率更高，在开花后第10、15和20天，这种差异在1%的水平上显著。高温处理后，SBEI在CNDH11和CNDH75中的相对表达量均增加。然而，CNDH11的增加速率更高，在开花后10天达到1%，在开花后15天达到5%。灌浆期高温处理后，测定了直链淀粉分解酶Amy1A和Amy3D的相对表达量。高温处理后，这些酶的相对表达量均较对照增加，且CNDH11的表达量增幅高于CNDH75。 Moreover, Amy1A expression level increased with a significant difference at the 1% level after 10 days of flowering and further increased with a significant difference at the 5% level on the 15th day after flowering. Amy3D expression level also increased with a significant difference at the 1% level on the 5th and 10th days after flowering. The relative expression levels of genes related to spikelet fertility and grain quality under high-temperature treatment, viz.,LOC_Os03g48170，LOC_Os03g49600，LOC_Os03g49610,LOC_Os08g35110通过QTL定位筛选，进行校核。在籽粒灌浆阶段高温处理下，与对照相比，LOC_Os03g48170在开花10天后以1%的水平显著提高。的相对表达量差异无统计学意义LOC_Os03g49600在高温和控制条件下。当LOC_Os03g49610经高温处理后，其相对表达量在开花后10、15、20和25 d较对照显著降低，差异达1%。与对照组相比，LOC_Os08g35110在开花后第5天，在5%水平上呈显著差异增加;在开花后第15天，在1%水平上呈显著差异增加。

系统发育树及同源序列分析

候选基因LOC_Os03g48170，LOC_Os03g49600，LOC_Os03g49610,LOC_Os08g35110筛选了水稻灌浆期高温处理对小穗育性和籽粒品质的影响。此外，在分析候选基因的相对表达水平时，发现了LOC_Os03g48170与淀粉降解酶Amy1A和Amy3D相似。的相对表达量LOC_Os03g48170在高温处理下，花后10天以1%的水平显著提高。NCBI BLAST分析结果显示，LOC_Os03g48170与flour胚乳6蛋白的序列非常相似(图3)。8）.LOC_Os03g48170与flour胚乳6存在遗传相似性黍hallii，Brachypodium distachyon，玉米,Setaria冬青系统发育树分析证实该植物属禾本科。LOC_Os03g48170与的flour胚乳6蛋白属于同一组b . distachyon表现出最相似的遗传相似性(同源性74%，相似性80%)。此外，该蛋白与玉米胚乳6蛋白具有遗传相似性z梅斯差异最大(相同57%，相似69%)。此外，利用LOC_Os03g48170结构域预测功能伙伴，发现LOC_Os03g48170与10种不同的蛋白(OS08T0529200-00、OsJ_12316、OS10T0499400-01、OS05T0533600-01、DPE1、OS01T0720600-01、P0453H11.4、OS03T0607500-01、OS01T0180300-01、OsJ_36662)相互作用(图2)。8）.

高温胁迫是水稻籽粒发育过程中影响籽粒品质和产量的主要环境胁迫之一[37]。据报道，它通过糖和能量信号传导过程有效地维持能量稳态，从而抵抗各种生物和非生物胁迫[38]。这一过程已被发现在赋予抗病能力方面起着重要作用[39]。在水稻生育期，籽粒发育和灌浆阶段过程对温度变化极为敏感，高温胁迫使籽粒品质严重恶化，产量降低[j]。40]。因此，本研究筛选了参与糖能信号转导过程的基因，并选择了与小穗育性和籽粒品质相关的基因来评估籽粒灌浆期的高温胁迫耐受性。在CNDH系灌浆期进行高温处理，利用高温处理后的小穗育性和千粒重对QTL定位、候选基因筛选和基因功能进行预测和鉴定。从2010年至今，在庆北大学领域，CNDH系列每年都在进步。41]，目前，由于几代的进展，每个系的特定性状是固定的，它是一个桥接亲本，显示各种各样的性状。因此，由于该基因的表达非常稳定，并且构建了代表多种性状的每条线，因此可以稳定地确定特定性状所涉及的基因的表达量[42]。为了确定灌浆期高温处理下的小穗和籽粒品质相关基因的QTL定位，我们分析了小穗育性和籽粒品质成分(蛋白质、直链淀粉和水分)的含量[43，44，45]。灌浆期高温处理后表型确定，形成垩白粒，籽粒中部变白[46]，完美粒比例下降，与正常条件下收获的水稻相比差异显著。灌浆期高温胁迫下，籽粒蛋白质含量以1%的水平显著升高。此外，直链淀粉含量在1%水平下显著降低，而水分含量在正常和高温胁迫下均无显著差异。此外，开花后的高温处理也会影响花粉的活力[47]。高温处理下，花粉活力降低，直接影响小穗的育性。其中，高温敏感系和耐高温系的花粉活力下降幅度较大，但高温敏感系花粉活力下降幅度较大。花期高温会抑制花粉管伸长，减少花粉数量，并通过减少花粉数量来降低小穗的育性。此外，即使在籽粒灌浆时，籽粒的重量也会减少，淀粉的一种成分直链淀粉的含量也会减少。与小穗育性相关的qtl在第3染色体rm15749 ~ rm15689上连续2年的LOD得分均≥3.0，是常用的搜索区域。8号染色体rm149 ~ rm23191与千粒重相关的LOD值连续2年≥3.0。在QTL定位分析中，LOD评分≥2.5，判断基因型与环境存在一定关系[48，49]，但在本研究中，LOD得分在3.0或更高的区域。3号染色体上的RM15749-RM15689和8号染色体上的RM149-RM23191分别含有43个与高温处理下小穗育性和千粒重相关的候选基因，这些基因均与生物过程、分子功能和细胞组分有关。其中四个候选基因(LOC_Os03g48170，LOC_Os03g49600，LOC_Os03g49610，LOC_Os08g35110)参与糖代谢相关功能，因此，它们被筛选为水稻灌浆期与小穗育性和籽粒品质相关的候选基因。灌浆期高温胁迫通过影响活性氧(ROS)对花药和糖稳态的响应而导致小穗育性降低[j]。50]。在对照组中，LOC_Os03g48170，LOC_Os03g49600，LOC_Os03g49610,LOC_Os08g35110花后45 d CNDH11和CNDH75的相对表达量无显著差异。然而，在高温处理下，CNDH11和CNDH75的基因表达水平存在显著差异。特别是,LOC_Os03g48170在花期后立即高温处理10 d后，CNDH11和CNDH75的表达量差异达到1%。为了确定灌浆期高温处理对候选基因及直链淀粉和支链淀粉合酶表达水平的影响，还分析了这些基因的表达水平。直链淀粉合成基因GBSSI的表达水平[51]和GBSSII在CNDH11和CNDH75中均有所降低，但高温敏感的CNDH11基因表达量的下降幅度大于耐高温的CNDH75。支链淀粉SSI链伸长合成基因[52]和SSIIa在CNDH11和CNDH75中未表现出显著差异，而SSIIa在CNDH11和CNDH75中表现出显著差异，且在对高温敏感的CNDH11中表达量更高。此外，当SBEI、SBE11a和SBEIIb基因的表达水平[53在高温处理下，SBEI在花后10天表现出1%水平的显著差异，并在CNDH11中高表达。而高温处理SBE11a和SBE11b时，其表达量高于对照，而CNDH11和CNDH75之间无显著差异。此外，当直链淀粉降解酶Amy1A [54]和Amy3D经过高温处理后，与CNDH75相比，CNDH11中的基因表达水平表现出显著差异和升高。花期后高温处理10 d后，Amy1A和Amy3D在CNDH75和CNDH11中的表达量均达到1%，差异显著;15 d后，Amy1A在CNDH11中的表达量达到5%，而Amy3D在CNDH11中的表达量为1。表达式级别增加到% level。淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，淀粉的绝对含量不变，但直链淀粉和支链淀粉比例的变化会影响籽粒品质[55]。如表所示1高温处理下，高温敏感系直链淀粉含量下降幅度大于耐高温系。这些结果表明，当确定支链淀粉合成基因、直链淀粉合成基因和直链淀粉降解酶基因的表达量时，支链淀粉合成基因的表达量减少，支链淀粉合成基因的表达量增加，直链淀粉降解酶基因的表达量增加。这支持了表达增加的实验结果。在四个候选基因中，我们重点关注LOC_Os03g48170结果表明，高温处理下初始反应的增幅最大，耐高温和高温敏感品系增幅最大。的BLAST分析LOC_Os03g48170NCBI分析显示，该基因的核苷酸序列与FLOURY胚乳6蛋白相似。LOC_Os03g48170与小麦的flour胚乳6相似度最高。FLOURY胚乳6也参与种子大小、胚乳储存物质积累和淀粉合成[56]。此外，有报道称，FLOURY胚乳6参与灌浆期的耐热性[57]。当用它们的蛋白质序列进行同源性分析时，如果它们表现出高度的相似性，就可以预测它们具有相似的功能。此外，LOC_Os03g48170与OS08T0529200-00、OsJ_12316、OS10T0499400-01、OS05T0533600-01、DPE1、OS01T0720600-01、P0453H11.4、OS03T0607500-01、OS01T0180300-01和OsJ_36662蛋白相互作用。其中，os08t052920 - 00和OS10T0499400-01是含CBS结构域的蛋白。它们作为硫氧还蛋白(一种抗氧化蛋白)的调节因子，在去除活性氧和调节植物发育过程中发挥重要作用[58]。OsJ_12316通过胞间连丝产生谷氨酸，改变钙离子的产生，在细胞间信号传递中发挥重要作用[j]。59]。OS05T0533600-01和OS01T0720600-01是糖基转移酶1家族的蛋白。糖基转移酶诱导植物糖基化，在储存次生代谢产物和保护植物免受外界胁迫中起作用[j]。60]。此外，糖基转移酶是花粉构建和花粉成熟所必需的，在雄性生殖发育中起着至关重要的作用[61]。DPE1是一种编码4- α -葡聚糖转移酶的蛋白质，它不能水解淀粉，但它能重塑直链淀粉和支链淀粉分子[62]。P0453H11.4、OS03T0607500-01、OS01T0180300-01为MAR (matrix attachment region)结合蛋白。这些都是通过染色质和细胞核相互作用调控基因表达的重要因素。OsJ_36662是一种作用于种子成熟的蛋白质[63]。

本研究对灌浆期高温处理对水稻籽粒品质和小穗育性影响的基因进行了QTL定位LOC_Os03g48170最终从3号染色体RM15749-RM15689的几个候选基因中筛选出。高温处理后大米的白垩外观与直链淀粉含量、凝胶稠度和蛋白质储存有关[64]。此外，在高温条件下降低垩白粒率的QTL定位，垩白QTL定位在3号染色体上[65]。此外，Ye et al.， (2015) [66在水稻开花期通过高温处理定位了与小穗育性相关的QTL，并利用高温敏感品种IR64和耐热品种Giza178在3号染色体上进行了定位。然而，Xiao et al.， (2011) [67]报道在水稻开花期高温处理下，在4号和6号染色体上检测到与小穗育性相关的QTL。我们之所以在不同的染色体上检测到QTL，推测是由于遗传因素和环境差异以及研究中使用的群体不同[68]。在水稻的生殖阶段，高温通过诱导活性氧和糖稳态诱导不育[69，70]。灌浆期高温处理后，在与本研究相同的染色体上相似位置分析了与小穗育性、垩白粒比和蔗糖含量相关的qtl。与小穗育性和千粒重相关的qtl及主要候选基因OsSFq3本研究鉴定的灌浆期高温处理分析，可用于在当前气候快速变化的时代选育既能提高籽粒品质又能抵抗高温的水稻新品种。此外，利用QTL定位的连锁标记可以有效地用于水稻优质耐高温品种的标记辅助选择。

一般来说，高温会破坏水稻的糖信号系统，造成严重的损害。由于直链淀粉含量的减少和蛋白质含量的增加，水稻暴露在高温下会使籽粒品质恶化。此外，高温还会导致小穗受精率严重下降，从而导致产量下降。本研究筛选出4个在高温条件下也能稳定维持粮食品质和产量的潜在候选基因。其中，水稻开花期高温处理10 d后，OsSFq3的表达量以抗性品系1%的水平显著高于感病品系。水稻开花后早期抗高温非常重要，灌浆期的高温严重影响籽粒品质。它改变了谷物中的直链淀粉含量和蛋白质含量，降低了所有由这些谷物制成的食品的质量水平。今后，拟利用本研究检测到的OsSFq3和qtl，培育近等基因系，选育耐高温、品质优良的水稻新品种。因此，OsSFq3将有效地利用在灌浆期抵御高温，以适应气候变化时代，培育出口感优良的水稻。

植物材料和田间设计

在本研究中，Cheongcheong (IT228761, IT号是韩国国家农业科学院农村发展厅管理的资源号)/Nagdong (IT006182)双单倍体系，CNDH，通过Cheongcheong (选用sativespp。籼稻简历。清清)和那洞(选用sativespp。粳稻简历。以那东(Nagdong)为实验材料，进行了高温水稻小穗育性和籽粒品质基因的QTL定位[41]。Cheongcheong, Nagdong和120个CNDH系来自韩国庆北大学植物分子育种实验室的Kyung-Min Kim教授。在F区₁通过清清和南洞杂交形成的组合，在庆北大学大田(36°6′41.54″N, 128°38′26.17″E)培育了120个由另一种培养得到的CNDH，并于2019年和2020年培养了120个CNDH。在进行研究时，根据韩国农村发展局(RDA)提供的国际准则和立法，使用了120 CNDH系。此外，水稻也按照当地的正常做法种植。这项研究符合《濒危野生动植物种贸易公约》(https://www.cites.org/）.播种前用种子消毒剂对种子进行消毒，25℃暗浸处理4天。2018年4月23日和2019年4月25日，分别于2019年5月23日和2020年5月25日在韩国军威的庆北国立大学大田播种，播种后30天进行移栽。种植距离为30 × 15 cm。施氮量为氮磷₂O₅- k₂O = 9-4.5-5.7 kg/10a，按RDA农业科技研究调查标准执行。在庆北大学大田种植到花期，白天平均温度为28℃，夜间平均温度为22℃。开花后1天，将植株移入生长室(Vision, VS-8407-1300，大田，韩国)，进行高温胁迫。在保持在42℃的生长室中施加高温应力。光照周期为13/11 h(亮/暗)，白天发光强度维持在40000 lx，相对湿度为70%。120个CNDH品系中的每一个品系都具有多种农业性状和不同的开花时间，因此每天检查开花时间开始的品系，并在不同的时间移入生长室。对于高温处理，生长室的温度随时间的变化被彻底控制。逐渐上升到6:30-7:00维持在27℃，7:00-7:30维持在30℃，7:30-8:00维持在35℃，8:00-8:30维持在38℃。从8:30到14:30,42℃共维持6 h。14:30 ~ 15:30 35℃，15:30 ~ 16:30 30℃，16:30 ~ 17:30 27℃。 Finally, it was maintained at 25 °C from 17:30 to 6:30. Panicles were sampled immediately after flowering during the process of grain filling and at 5, 10, 15, 20, 35, 30, 35, 40, and 45 days after seeding. Samples were rapidly cooled using liquid nitrogen until they were used in the experiment and then stored at − 80 °C.

淀粉体结构的扫描电镜分析

选取100粒在高温和正常条件下生长的精米，对籽粒胚乳进行观察。采用无叶片部分切割选定的晶粒，并使用离子溅射装置(JFC-1100E, JEOL, Tokyo, Japan)在真空中对切割截面表面镀上金。在1.0 KV电压下用扫描电镜观察。

花粉存活率

采集所有花药，评估高温胁迫后花粉的活力。Gunawardena et al. (2003) [30.]。在花期高温处理后，从尚未开花的小穗上采集成熟花粉。花药用1%碘化钾溶液染色。显微镜下观察，将染色后的溶液置于载玻片上，通过染色状态和花药形态确认花粉活力[71]。在显微镜下观察，黑色、圆形的花粉染色为有活力或有生命，黄色或浅红色的花粉染色为无活性或死亡。在显微镜下对9个地区的每个样品进行3次生物重复，并对花粉活力进行评价。

灌浆期高温处理对小穗育性和千粒重的影响

为评价高温处理后水稻的育性，在开花后第45天计算育性。为了确定卵巢发育情况(是否充满)，逐个按压每个小穗进行生育力试验。所有在压榨时被完全掏空的穗被归类为不育。小穗的育性以饱满的小穗占总小穗的百分比计算。此外，以1000粒为单位测量重量，计算稻米的粒重。使用自动谷物计数器(Multi auto counter, WAVER, Japan)检查谷物数量，使用电子秤测量1000粒的重量(OHAUS, ARD120)。为了确定高温条件下影响籽粒品质的因素，采用近红外光谱法测定了籽粒直链淀粉、蛋白质和水分含量(Kett, AN-820，日本)。

水稻耐热性遗传图谱的构建及QTL分析

Windows QTL制图师2.5 [72]用于QTL定位。使用Mapmaker 3.0版本[73用222个SSR标记构建了平均标记距离为10.6 cM的遗传图谱。在Kosambi函数中对CNDH 120系的值采用复合区间作图(CIM)方法，阈值LOD≥3.0提高了QTL作图的准确性[74，75]。对于QTL命名，McCouch，(2008)提出的方法[76]被使用。

基因信息分析

QTL映射后，Rapdb (https://rapdb.dna.affrc.go.jp/) [77]及RiceXpro (https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/) [78]用于筛选QTL区域特定性状的候选基因。这些程序显示存在于SSR标记之间的所有orf(开放阅读帧)。根据orf的功能对其进行分类，并筛选出与小穗育性和高温千粒重相关的基因。筛选后的候选基因使用Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)，http://smart.embl-heidelberg.de/) [79]和ExPASy (https://www.expasy.org) [80]用于预测序列分析和蛋白相互作用。它还使用NCBI (http://www.ncbi.nim.nih.gov) [81]和BioEdit 7.0 (https://bioedit.software.informer.com/7.0/) [82]，因此同源多序列可以分析和比较其他同源基因。

RNA提取和PCR方案

使用RNeasy植物迷你试剂盒(QIAGEN，德国)从Cheongcheong, Nagdong和CNDH系中提取RNA。RNA提取前，用DEPC清洗所有实验设备，所有实验步骤均在4℃下进行，以提高RNA的质量和浓度。将新鲜的稻穗放在一个碗里，研磨，同时用液氮冷冻样品。然后，用100 mg碾碎的稻穗粉提取RNA。取100 mg粉末，取2 ml电子管，加入450 μl RLT缓冲液，旋涡充分混合。将涡流溶液加入QIAshredder旋转柱中，13000 rpm离心2分钟。将柱下过滤的溶液转移到新的1.5 ml电子管中，加入0.5 ml 100%乙醇混合。将整个混合溶液置于RNeasy迷你柱中，以13000 rpm离心15 s。然后加入700 μl RW1缓冲液，13000 rpm离心15 s，再加入500 μl RPE缓冲液，13000 rpm离心。然后，再次加入500 μl RPE缓冲液，使色谱柱完全洗涤，13000 rpm离心2 min。 Next, to completely dry the column, it was centrifuged at 13,000 rpm for 2 min without adding any reagent. Finally, 50 μl of RNase-free water was added and centrifuged at 13,000 rpm for 2 min to dissolve the RNA in the column. To assess the quality and concentration of the extracted RNA, it was quantified using an ultramicrospectrophotometer ND-2000 (Nanodrop, USA). cDNA was synthesized using the qPCRBIO cDNA Synthesis Kit (PCRBIOSYSTEMS, USA) according to the manual instructions. RNA 80 ng, 5× cDNA synthesis mix 4 μl, and 20× RTase 1 μl were added, and a final volume of 20 μl was adjusted using RNase-free water. Then, 80 ng of the synthesized cDNA was used as a template for PCR. The PCR solution composition was cDNA 80 ng, 20 pmol forward and reverse primers, 2.5 mM dNTP mixture, Ex Taq polymerase (Inclone Biotech Co., IN5001) 1.0 U, and 3.0 μl of 10× Ex buffer (50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl₂)在无核酸酶的水中(QIAGEN, Cat;No. 129114)，制得总容积为30 μl。PCR (C1000, BioRad, USA)条件为94°C预变性5 min, 94°C变性30 s, 55°C退火30 s, 72°C延伸30 s，变性、退火和延伸过程重复35个循环。之后，在72°C下进行最后一步延伸5分钟，PCR完成后，将产物保存在4°C下。PCR扩增产物测序由SOLGENT公司进行测序分析，测序结果使用NCBI BLAST程序(http://www.ncbi.nim.nih.gov)数据库。

候选基因表达水平分析

在水稻开花期，对清清、陇东、120 CNDH品系施用了42℃的高温。此外，在水稻开花后每隔5天取样一次，检测淀粉合酶和高温反应候选基因的相对表达量。采用RNeasy plant mini kit (QIAGEN, Germany)从水稻穗部提取总RNA，提取1 μg的总RNA作为实时荧光定量PCR模板，进行cDNA合成和基因表达分析。以cDNA为模板，采用Eco real-time PCR系统进行实时荧光定量PCR。用于实时荧光定量PCR的反应溶液为:2x qRCRBIO SyGreen Blue Mix 10 μl, cDNA 1 μl，正向引物0.5 μl (20 pmol/μl)，反向引物0.5 μl (20 pmol/μl)，用ddH配制至终体积20 μl₂O(参见附加文件)1表S3)。OsActin以内务基因为对照，每个反应进行三次，计算平均值和标准差。

统计分析

所有对照组和实验组每个样品进行5次重复实验。利用5次重复实验的结果计算均值和标准差，使用SPSS软件(IMMSPSS Statistics, version 22, IBMSPSS Statistics, version 22, Redmond, WC, USA)进行统计分析。

支持本文结论的所有数据集都包含在本文和补充文件中。

原始数据可以从NCBI序列读取档案(SRA)平台访问，登录号为It2455092 LOC_Os03g48170.1 MZ054167 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）.

本研究由韩国政府国家研究基金资助(NRF-2017R1D1A3B04028676)。

不适用。

从属关系

1. 庆北大学农业与生命科学学院应用生命科学学院植物生物科学部，大邱，41566

   朴在亮、金恩敬、张允熙、金敬民

2. 庆北大学沿海农业研究所，韩国大邱41566

   朴在亮，金敬民

贡献

JRP实验概念化。JRP和EGK方法和研究计划。JRP形式化分析。JRP和YHJ的实验调查。JRP、EGK、YHJ和KMK参与了水稻材料的收集并进行了表型分析。JRP撰写原始草稿。JRP和KMK的编写、审核和编辑。KMK项目管理。所有作者都阅读并认可了最终的文章。

相应的作者

对应到Kyung-Min金。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

出版商的注意

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