外源性褪黑素通过消除活性氧和保护光合器官提高棉花的耐盐性

背景

由于生态环境的损害继续增加，在不合理的灌溉量的情况下，土壤盐渍化已成为农业发展的重大挑战。褪黑激素（MT）是一种磷酸术信号分子和吲哚激素，减轻了非生物胁迫对植物的损害。已经证实MT通过改善抗氧化系统并降低逆境降低氧化损伤来消除活性氧物质（ROS）。然而，通过调节棉花幼苗的光合容量和离子平衡仍然未知，外源MT介导耐盐性的机制仍然未知。在该研究中，MT对光合体系，渗透调节剂，叶绿体和棉花幼苗的解剖结构的调节作用在0-500μmMT处理下测定通过用150mM NaCl处理诱导的盐胁迫。

结果

盐胁迫降低叶绿素含量，净光合速率，气孔电导，细胞间有限公司₂浓缩，蒸腾速率，PSII光化学效率，PSII实际光化学量子产量，表观电子转移效率，气孔开口和生物质。此外，它增加了非光化学淬火。通过与MT的外源性处理有效地减轻了所有这些反应。外源性MT通过减少盐诱导的ROS来减少氧化损伤和脂质过氧化，并保护血浆膜免受氧化毒性。MT还通过减少盐诱导的Na积累来减少渗透压⁺并增加K的内容⁺和脯氨酸。外源性MT可以促进气孔开口和保护棉花叶片薄膜结构和线粒体在盐胁迫下的完整性，保护植物的光合体系，改善它们的生物质。叶片和茎的解剖学分析表明，MT可以在水，无机盐和有机物质的运输中改善木质和韧皮肌和其他性质和助手。因此，MT的应用衰减对植物的盐引起的应力损伤。通过提高其光合作用，气孔特征，离子平衡，渗透物质生物合成途径和解剖结构（木质血管和韧皮血管），通过改善它们的光合作用，气孔特性，离子平衡，渗透物质（木质血管和韧皮血管）来阳性增加棉花苗的耐受性耐受性。

结论

我们的研究属性有助于保护光合器官的结构稳定性并增加材料积累量，从而减少盐引起的二次应力。MT诱导的植物耐受对盐胁迫的机制提供了使用MT来缓解由不合理的灌溉，施肥和气候变化引起的盐胁迫的理论依据。

光合作用是植物生长发育不可缺少的生理活动。它与叶绿素含量、叶绿体结构和渗透调节物质密切相关，极易受外界环境的影响[1］．盐胁迫是影响植物光合作用的主要逆境之一。随着生态环境的不断变化，世界上盐碱地的面积每年都在增加，土壤盐碱化已成为农业发展的主要障碍[2］．目前，中国盐碱地面积约为1.0 × 10^8.嗯²其发展趋势是总体恶化，面积增加。它已成为影响我国农业生产和生态环境可持续发展的重要因素之一[3.］．当植物在中高盐环境中时，它们将遭受三种应激，包括离子不平衡，渗透胁迫和氧化损伤。

盐胁迫对棉花的第一阶段是渗透胁迫[2]，植物吸收水分的能力降低，导致细胞脱水和气孔部分关闭，减少茎和幼叶细胞膨胀[4.那5.］．在盐胁迫条件下，盐离子通过蒸腾过滤过旧叶片，导致细胞毒性和离子稳态的变化，导致离子应激[6.］．此外，渗透胁迫和离子胁迫会影响植物形态和生理生化过程，从而影响植物生长甚至死亡的抑制作用[7.］．盐胁迫直接影响气孔和基因表达，导致气孔关闭，减少二氧化碳的摄入，从而降低净光合速率[7.那8.那9.］．植物可以积累过量的反应性氧（ROS），包括过氧化氢（H.₂O.₂）和超氧化物阴离子（\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）），在渗透和离子胁迫的组合作用下。过量的RO可以导致细胞损伤和氧化应激对植物[5.[因此，影响植物生长和发育的DNA，酶和生物膜对DNA，酶和生物膜损伤[10.］．光合作用是负责生产更高能源植物的重要身体和化学过程，这可能受到ROS的影响，导致植物生产的损失[11.］．叶蛋白细胞中的叶绿体是对盐胁迫最敏感的有机细胞素[12.］．随着盐浓度的增加，叶绿体的结构开始受到不同程度的破坏[13.］．相关研究发现，盐应激导致含有无序和扩大的类囊型排列，麦克纳和基质薄片之间的模糊边界，膜的损伤或消失，甚至崩解[14.那15.那16.］．

棉花是棉和柴的大田作物，在我国国民经济和世界国民经济中占有重要地位[17.］．幼苗阶段是一种脆弱和临界的棉花的生长和临界时期，含有生物和非生物胁迫的棉花，并且受到盐胁迫的大大影响。因此，探讨盐胁迫对棉花幼苗光合作用的影响非常重要。

褪黑激素（N-乙酰-5-甲氧基霉菌，MT），也称为松植素，是一种亲水性和亲脂生理调节剂，其在对清除自由基的反应中起重要作用，膜完整性和预防叶绿素降解 [18.］．1995年首次在血管植物中发现了MT，其中迪布尔斯等人。[19.]采用气相色谱-质谱技术确定番茄、香蕉、黄瓜和烟草的叶片组织都含有褪黑激素。Hattori等人[20.使用放射免疫测定技术确定12个家庭二坐子和单子叶植物中24个可食用植物的褪黑激素含量。该植物测试了所有含有的褪黑激素。随后的研究发现，线粒体和叶绿体，植物中的半自治细胞素是MT的合成遗址[21.］．研究表明，MT几乎广泛存在于几乎所有植物种类中，并在高等植物的各种器官中存在[22.那23.]，浓度随植物组织，发育期，光和环境差异而变化[24.]. 随后的研究表明，MT在植物生长发育过程中起着重要的调控作用[25.那26.那27.那28.那29.]，并减轻非生物胁迫[30.那31.那32.那33.那34.］．

褪黑素可以直接中和ROS，也可以刺激抗氧化系统提高其效率;因此，它被称为内源性自由基清除剂[35.那36.]. 研究发现褪黑素调节植物的多种生物学反应，提高植物对逆境的耐受性。褪黑素保护光合能力[37.，降低渗透压力和离子毒性[38.那39.那40那41]提高气孔的特征[38.]保护叶绿体结构，麦芽体薄膜，更完整的叶肉细胞和更多的叶绿体[42那43]改善了植物的解剖结构[44那45] 在压力下。玉米研究（Zea Mays.）[46],油菜籽[47]，大豆[48]和茶[49]表明MT减轻了对由压力引起的植物的损害。已显示MT的应用促进棉花抗氧化酶活性的增加，并增加棉花幼苗的植物高度和叶面积[50]这可能是由于适当浓度的MT提高了盐胁迫下叶片的叶绿素含量和光合能力，减轻了盐胁迫引起的氧化抑制，促进了植物的生长。然而，外源MT如何减轻盐胁迫对棉花幼苗光合作用的损害尚不清楚。本试验以棉花幼苗为材料，在无盐（150 mM）和含盐（150 mM）的水培液中进行了MT喷施试验，旨在（1）阐明MT对棉花幼苗光合特性和荧光特性的作用机理，（2）阐明MT对活性氧、脯氨酸和离子的调节作用，探讨MT对棉花幼苗茎、叶和叶绿体结构的调控作用。本试验结果为促进外源褪黑素在盐碱棉上的应用，促进作物生长，提高产品质量提供了理论支持。

褪黑素在盐胁迫下改善了棉花幼苗中的生物质和叶绿素含量

在盐处理下，幼苗的芽和根部的芽和干重（DW）显着降低（表1)．与CK处理相比，盐处理下地上部和根部的FW分别降低了约37%和36%，地上部和根部的DW分别降低了约40%和35%。外源MT处理降低了盐胁迫对棉花幼苗生长的抑制作用。200 μM MT处理棉花苗的地上部和根部的FW分别提高了36%和48%。DW分别增加了约40%和49%。与CK处理相比，盐处理下总株(TDW)的DW降低了39%;200 μM MT处理的棉花幼苗TDW提高了41%，且棉花幼苗生长更加明显。

土壤和植物分析仪的发展(SPAD)值随着时间的推移逐渐增加2)．盐处理的SPAD值显著降低，在3、6、9、12 d的SPAD值分别比CK处理降低了12%、16%、15%、18%。50 μM MT处理下，SPAD值在整个处理期间均高于S株，但差异不显著。100和500 μM MT处理的SPAD值在3和6 d显著高于S植株，其中200 μM MT处理的SPAD值增加最为明显。3、6、9、12 d的SPAD值较S处理分别提高了10%、14%、9%、16%。这些差异均显著，说明200 μM MT处理能有效缓解叶绿素降解，促进叶绿素合成。

外源褪黑素调控盐胁迫下棉花幼苗的光合特性

数字1A-D表示净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和胞间CO的变化趋势₂叶片浓度(Ci)明显相似，并随时间逐渐增加。

在S处理下的PN显着降低，与CK植物相比，Pn分别在3,6,9和12d下降40％，36％，37％和46％（图。1200 μM MT处理棉花叶片Pn增加最显著，第3、6、9和12 d Pn分别增加了44%、44%、35%和58%。

与CK处理相比，S治疗下的GS，Tr和CI显着降低（图。1罪犯)。MT处理显著高于S处理，其中200 μM MT对光合参数的促进作用最大。12 d时Gs、Tr和Ci分别比S处理提高了58%、71%、19%和27%。

总之，200μmMT的治疗有效地减轻了棉花叶绿素的降解并提高了光合容量。

外源褪黑激素调节盐胁迫下棉花幼苗的荧光特性

psii的最大光化学效率（阵线/ Fm)表示PSII在光系统中的原始最大荧光效率，可以反映光反应中心PSII将光能转化为化学能的效率。这阵线/ Fm在S处理下显著降低，且阵线/ Fm与CK植物相比，在3,6,9和12d中分别降低8％，8％，8％和11％（图。2一种）。当用mt处理时，阵线/ Fm显着高于S植物。这阵线/ Fm棉花叶子在200μmmt的治疗后最显着增加，阵线/ Fm在3,6,9和12d中，分别增加了8％，9％，8％和12％。

与CK处理相比，PSII实际光化学量子产率（φPSII）和表观电子转移效率（ETR）下降显着下降（图。2MT处理显著高于S处理。200 μM MT处理下，ΦPS II、ETR在12 d显著高于S处理，分别比S处理提高了12%、81%和57%。

非光化学猝灭(Non-photochemical淬灭，NPQ)是由散热引起的荧光猝灭，它反映了植物将多余的光能耗散为热能的能力，称为光保护能力。与CK处理相比，S处理的NPQ显著增加(图5)。2d）。当用MT处理时，NPQ显着低于S处理。棉叶的NPQ在200μmmt处理后最显着地降低，3,6,9和12 d的NPQ分别降低了26％，19％，25％和25％。

该数据表明，200μmMT的处理可以有效地增加阵线/ Fm，ΦPSII和ETR，降低NPQ，缓解盐胁迫对棉花叶PSII的破坏性效果。

褪黑素在盐胁迫下提高了棉幼苗脯氨酸的含量

随着胁迫时间的延长，CK和S处理棉花叶片的脯氨酸(pro)含量均呈上升趋势。与CK处理相比，S处理后第3、6、9和12 d，脯氨酸含量显著增加，分别增加了23%、24%、35%和36%。3.)．当用MT处理时，脯氨酸含量明显高于S处理。用200μmmt处理后，棉花叶片的脯氨酸含量最显着增加，3,6,9和12 d的脯氨酸含量分别增加了19％，22％，26％和25％。

外源褪黑素改善盐胁迫下离子稳态

植物将积累na⁺在盐压力下，这导致它们损坏。数字4.A、B表示Na含量的变化趋势⁺和Cl^-叶片明显，随着时间的推移逐渐增多。而K⁺和K的比值⁺/不适用⁺随着时间的推移逐渐减少，在12d时达到最小值(图4)。4.C、 （D）。

与CK治疗相比，NA的含量⁺在S治疗中，分别在3,6,9和12d中显着增加32％，36％，37％和37％（图。4.一种）。当用MT治疗处理时，NA的含量⁺显着低于S植物的植物。Na⁺棉叶含量下降，用200μmmt处理和Na的含量下降⁺在3,6,9和12d下分别下降24％，25％，21％和17％。CL的变化趋势^-和na⁺基本相同（图。4.B).这些结果表明，200 μM MT在一定程度上阻止有害离子进入细胞，从而有效保护细胞结构。

与CK处理相比，K⁺S处理在第3、6、9和12 d时，含量分别显著降低了37%、19%、33%和24%。4.C）。用Mt，K⁺含量显著高于S株。K⁺棉花含量最显着地在200μmmt处理后增加，k⁺第3、6、9、12 d含量分别增加31%、23%、40%、27%。同样，K的变化趋势⁺/不适用⁺和K.⁺(图是相一致的。4.结果表明，200 μM MT对提高钾含量的影响最为显著⁺和K.⁺/不适用⁺棉花叶的比例。

棉花叶片ROS含量的组织化学分析及荧光显微镜观察

数字5.A、B为过氧化氢(H₂O.₂）和超氧化物阴离子（\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\））在棉花植物的叶子中。在盐压力下，h₂O.₂用DAB检测棕色斑点的形成，以及\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）用NBT染色法检测其形成蓝色，分别分布于几乎所有的叶面积。从组织化学染色可以看出，盐胁迫下MT处理显著降低了H₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）。其中，用mt处理的棕色斑和蓝色区域是最低的。与CK治疗相比，H的内容物₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）在S处理下分别显著增加了58%和47%（图。5.C、 （D）。h的内容₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）200 μM MT处理显著降低了棉花叶片H₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）分别减少了31％和27％，表明200μmMT对从棉花叶中除去ROS的效果最明显。这些结果表明，200μm的MT能够缓解盐胁迫下棉花幼苗中ROS的积累。

为了进一步观察MT对ROS积累的影响，我们观察了3种处理(CK、S、S + MT200)下的气孔保卫细胞结构。数字6.A，B示出了防护细胞中的两个RO的内容物的荧光检测。与CK治疗相比，H的含量₂O.₂（绿色荧光）和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）在防护细胞中检测的（红色荧光）在盐胁迫下显着增加。但是，h的内容₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）外源200 μM MT处理后的棉花保护细胞中有显著降低。

外源褪黑激素有助于气孔开口

气孔是植物叶片中水蒸气和空气交换的重要通道，对有机材料的积累非常重要。与CK治疗相比，盐胁迫显着降低气孔长度（17％），宽度（22％），宽度（22％），孔径（42％），并增加93％）（表3.;如图。7.然而，与盐处理相比，MT处理的气孔长度、宽度和孔径分别增加了10%、16%和96%，气孔数量(SN)减少了23%(表1)3.;如图。7.b，c）。

褪黑素对盐胁迫下棉花叶肉细胞和叶绿体超微结构变化的影响

在检查用盐处理12天的全叶蛋白的超微结构和200μmMT处理的植物的全叶蛋白的超微结构和叶绿体的超微结构的检查时，细胞和叶绿体结构的不同尺寸是显而易见的（图。8.)．CK处理的叶绿体呈椭圆形，排列整齐，紧贴细胞壁。8.广告）。与CK处理相比，植物叶片在盐胁迫下的叶片细胞的形状没有显着变形，但破坏了叶片细胞结构（图。8.B)此外，与对照相比，盐胁迫下叶片叶绿体长度减小;宽度增加;长径比减小;叶绿体基粒数量减少，片层结构紊乱。8.另外，200 μM MT处理植株叶片的透射电镜图显示，叶片叶肉细胞没有细胞壁分离现象;叶绿体形态规则，靠近细胞壁;片层结构完整;图层清晰，排列整齐(图。8.C，F）。此外，线粒体将部分地分解盐胁迫，但与盐胁迫下的MT处理的棉的线粒体结构与CK相比没有显着变化（图。8.H-J)。因此，与盐胁迫植株相比，200 μM MT处理显著缓解了盐胁迫诱导的氧化损伤，修复了完整的细胞和叶绿体结构。

褪黑激素治疗改善了木质血管的运输系统

正常对照、盐胁迫和盐胁迫对棉花幼苗茎叶的影响 + 200μM MT（秒 + 解剖观察12天的MT200细胞。如表所示4.，叶片的厚度，俯仰（pt）和海绵状（st），木质血管（leax）的面积，韧皮血管（膝盖）的面积，并且上下表面厚度响应于盐胁迫而增加。与S治疗相比，叶片，俯仰和海绵状实质的厚度和上下表面厚度随MT处理而降低。然而，MT治疗对叶片Xylem和韧皮血管的面积具有高影响，如图2所示。9.得了。200 μM MT处理的幼苗在盐胁迫下这些特征均发生了积极的变化，保持了植物能够克服盐胁迫状态下的叶片解剖特征。

与对照相比，盐胁迫下的茎粗显著降低(表1)5.;如图。9.D–F）。这主要是由于木髓直径、木质部导管（SXT）和韧皮部导管（SPT）的厚度分别减少了12%、7%和13%。200μM MT处理显著改善了茎的解剖特征，如髓径、木质部导管厚度和韧皮部导管厚度分别增加8%、6%和7%。

地上性状相关和变异

为了更有效地识别这些特征之间的相关性，对18个代表性特征进行了矛盾的相关分析。如图1中所示。10.，TDW与PN显着呈正相关，两者与所述侧面显着呈正相关，阵线/ Fm，sa，sxt和spt但与sn，pt，na显着呈负相关⁺, NPQ H₂O.₂那\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）和st。tdw，pn，spad，阵线/ Fm，SA显着与sn，pt，na显着呈负相关⁺，npq和st。H₂O.₂显着呈正相关\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\），与Pn、SPAD、TDW均呈负相关。

随后，对18个代表性特征进行了主要成分分析。tdw，pn，spad和pt，na⁺, NPQ H₂O.₂， 和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）在PCA轴1上几乎完全装载，但在相反的方向上（图。11.)．第一个维度解释了总变异的70.49%。将LAX、LAP和pro加载到PCA轴2上。第二个维度解释了19.76%的总变异。这两个维度解释了18个地上性状总变异量的90.25%。

在该实验中，通过水培培养幼苗的棉花幼苗生物量，光合荧光，渗透物质的积累，气孔特征，超微结构和解剖结构变化，试图说明盐胁迫下棉花对棉花治疗的调节。这项研究发现，盐胁迫降低了芽和棉花幼苗根的干燥和新鲜重量。用MT治疗可以显着增加芽和根部的生物量，促进棉花幼苗的生长（表1)．类似的研究证实，MT可以促进番茄和黄瓜的植物生长[51那52］．

叶绿素叶绿素参与光合作用期间光能的吸收和传输。它是植物光合作用以捕获光能的重要物质，其内容不仅是植物生理特性的重要指标，而且是光合作用的基础[1］．叶绿素易于降解，在盐胁迫下其合成受到抑制[53］．MT处理显著提高了幼苗在非生物胁迫条件下的Pn，缓解了叶绿素的降解，提高了幼苗的抗旱性[54那55］．本研究发现，盐胁迫降低了棉花幼苗的叶绿素含量，pn，gs和ci（表2;如图。1），表明棉花幼苗叶片的降低主要是气孔限制的结果。外源MT可以显着增强棉的PN并增加PN和CI。此外，在增强效果和MT的浓度之间存在一定程度的剂量关系。用200μmol/ l mt处理后，效果是最明显的。这与Huang等人的结果一致。[37.玉米玉米的光合容量在山水中减轻了玉米。这表明MT可以在一定程度上保护光合器官的叶绿体结构和稳定性，保持高水平的叶绿素，增强叶子的能力，以捕获光能，促进光合作用，并有效缓解盐胁迫下叶片光合作用的抑制作用。

植物光合作用的反应中心是照相系统II和光系统I.光系统II对逆境压力敏感。叶绿素荧光参数是一种有效指标，反映了反应中心PS II的光合电子传递速率和光能利用率[56］．研究发现了阵线/ Fm植物幼苗在盐胁迫下减少，随着MT的外源性治疗增加了阵线/ Fm在幼苗和改善番茄，小麦和茶的耐盐性[46那57那58］．盐胁迫下苹果幼苗NPQ增加，而外源MT处理显著降低了NPQ [29.］．这项研究发现盐的压力会降低阵线/ Fm，ETR和PS II的棉花幼苗，增加了NPQ。外源MT可以显着增强阵线/ Fm处理效果以降低NPQ和200 μM MT处理效果最好。2），与Hu等人的那些一致。[59百慕大草地对百慕大草的光合作用缓解低温。这是因为MT的外部施用可以有效地抑制盐胁迫下PS II活性的潜在下降，并在一定程度上保护光合体系。这种效果使得叶片吸收的光能可用于最大程度的光合电子转移，从而减轻盐胁迫对电子传递速率和光能转换效率的抑制作用。

植物将在逆变应力下增加渗透调整物质（脯氨酸，可溶性蛋白质，可溶性糖和甜菜碱）的合成和积累，以及对逆境压力的反应[60］．其中脯氨酸是调节细胞渗透含量的小分子物质。该化合物可以稳定大分子和细胞壁，保护疏水酶。脯氨酸含量在逆境胁迫下会显著增加[32.］．用MT治疗显着增加脯氨酸，多胺和蔗糖的含量，上调脯氨酸生物合成基因的表达（P5CS）在温度胁迫下的番茄幼苗中，缓解番茄植物的温度胁迫损伤[51那61］．在该实验中，随着治疗时间的延伸，在对照和NaCl治疗中，棉叶中脯氨酸的含量继续增加。在盐胁迫下，棉花叶中的脯氨酸含量显着增加，但在喷洒外源MT后，棉花叶中的脯氨酸含量显着增加（图。3.)．这与Meng等人的结果一致。[44]，MT在水胁迫下缓解葡萄的渗透胁迫，这表明该化合物通过增加脯氨酸含量来增强棉的耐盐性。

离子稳态被认为是对盐胁迫的植物反应最重要的机制之一[62]. 在盐胁迫下，离子稳态的基本特征是通过调节离子通量来调节活细胞，这对K等必需离子的积累至关重要⁺并且维持低浓度的毒性离子，如na⁺[63那64］．细胞内离子稳态不仅对细胞质中的酶很重要，而且对膜电位的维持和细胞体积的调节也很重要[63］．在盐胁迫下，na的含量⁺会在植株中积累，降低K⁺和K.⁺/不适用⁺比率;用mt治疗增加了k⁺crabapple和油菜籽的内容并增加了k⁺/不适用⁺比(65那66那67[从而提高植物的耐盐性。在该实验中，对照和NaCl治疗中的治疗时间的延伸导致NA含量持续增加⁺棉花叶片中钾含量持续下降⁺在棉花的叶子里。在盐胁迫下，Na⁺棉花叶片中钾含量显著增加，而钾含量增加⁺棉花叶片含水量显著下降。喷施外源MT后，Na⁺棉花叶片中钾含量显著降低，而钾含量降低⁺内容和K.⁺/不适用⁺显着增加（图。4.），与Castanares等人的结果一致。[68[resourcy]王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹，王莹这表明MT通过减少NA的积累来增强棉的耐盐性⁺增加K的吸收⁺保持K值⁺/不适用⁺比率。本研究还证实200μmMT有助于在盐胁迫下保持离子平衡。

已经发现，在逆变的条件下产生的过量的RO可以导致大分子（蛋白质，脂质，叶绿素和核苷酸）的氧化损伤，导致细胞死亡[69]. 因此，它会引起某些特定指标的含量变化，如ROS（H）₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\））和丙二醛，可用作植物氧化胁迫的指标。本研究的结果表明，具有不同浓度的MT的治疗可以减少H的内容物₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）在盐胁迫下棉花幼苗的叶子变化变化（图。5.和6.)，喷施200 μM MT能更有效地降低盐胁迫引起的氧化损伤。说明外源MT可以通过促进抗氧化酶的活性消除过量ROS，缓解盐胁迫引起的氧化应激[50］．在其他植物物种中证明了MT胁迫下植物氧化应激的减轻，例如燕麦[48]， 茶 [46]， 橡胶 [70,番茄57那71]和西瓜[68］．

气孔是植物与外界环境进行水、气交换的通道，气孔的大小、数量和调节功能与蒸腾等生理过程有关[72］．气孔受多种环境因子的影响，盐胁迫降低了CO的含量₂通过引起叶片光化学和碳代谢的变化，直接影响植物的光合作用的叶片[8.那73]. 盐胁迫下，植物气孔长度、宽度和孔径宽度减小，气孔密度增大[65］．MT引发，喷雾处理和预处理与MT显着改善了两种的干旱耐受性马鲁斯增加了气孔的长度、宽度和开度，提高了气孔的功能[60那74那75］．这项研究表明，在盐胁迫处理下，棉花气孔较小，数量增加（图。7.），这可能是由于盐胁迫对叶面积膨胀的限制。小而致密的气孔也具有更高的灵活性。MT治疗可以增加大孔的尺寸和开口并降低气孔密度。可能是MT促进棉花叶的延伸并降低气孔密度。这与Meng等人的结果一致。[44[含Mt治疗后水分胁迫下葡萄光合能力的减轻。

叶绿体是植物光合作用发生的地方，它也是植物细胞产生ROS并且对非生物胁迫最敏感的主要位置[76那77］．线粒体是细胞进行呼吸作用的主要场所，通过能量代谢参与细胞的生长和分裂，也是植物对外部环境最敏感的细胞器之一。外部环境的变化会引起线粒体功能障碍，增加ROS，影响抗氧化酶的活性和关键蛋白的表达变化[78］．以前的研究也报道了MT减缓了番茄的生长[79]，玉米[80那81)、小麦(42葡萄[44]在不良条件下，叶绿体损伤较少，叶片较厚，光合作用的改善。在该研究中，盐胁迫下棉花叶片的叶片细胞和叶绿体显着变形，但用MT的处理可以降低盐应激引起的损伤（图。8.），这可能是由于细胞内脯氨酸的增加和抗氧化系统消除过量的RO，从而减少了ROS对植物细胞膜系统的损伤。

木质和韧皮植物是植物中水和营养转运的主要结构，小孔开口和小蛋白酶和韧带韧带的韧带条件下可以显着降低水和养分的输送到枝条中的水和营养素[45那82］．对盐胁迫下西葫芦叶片解剖结构的研究发现，盐胁迫增加了西葫芦叶片、栅栏组织、海绵组织和细胞间隙的厚度[83］．MT治疗可以改善油菜籽的气孔特征和叶片茎的解剖结构在逆境条件下，保护叶绿体的超微结构，并增加植物对压力的耐受性[45那74］．在本研究中，在盐胁迫下，茎的直径和血管束的面积显着降低，并且叶厚度显着增加，这可能是由于细胞膨胀和伸长率的抑制（图。9.和10.;桌子4.和5.)．此外，在盐胁迫下喷洒MT在棉花幼苗上可以改善叶子和茎的解剖学特征，特别是茎直径和木质和韧皮柱的面积，从而提高水和养分运输的效率并促进生长和发育棉花幼苗。

对18个具有代表性的指标进行相关分析，发现Pn与TDW、SPAD、阵线/ Fm与SN、PT、Na呈显著负相关⁺, NPQ H₂O.₂那\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）和st。这与Mohamed等人的结果一致。[45[含Mt治疗后盐胁迫下油菜籽抑制的抑制作用。有趣的是，PN与PT和ST呈负相关（图。11.)．我们假设这种相关性可能与叶绿体的数量和位置有关，其优异的进一步研究。

为了确定MT如何减轻盐胁迫对棉花幼苗的不利影响，我们描述了一种可能的机制（图。12.). 本研究证实盐胁迫降低了植物的光合能力，抑制了植物的生长和生物量的产生。盐胁迫下棉花气孔变小，数量增加，但气孔开度变小，限制了单位时间单位面积的气体交换量，减少了物质积累量。外源MT降低ROS（H）的产生₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）），Na.⁺和Cl^-，增加K.⁺K⁺/不适用⁺比例和脯氨酸，并减轻由盐胁迫引起的氧化损伤，离子毒性和渗透胁迫，以改善棉花幼苗的耐盐性。MT增加了叶片和茎和叶子斑叶的厚度和面积的厚度和面积，促进了从地下到地下的物质的运输，并保持水和营养物质的生长植物。MT可以保护棉花叶片薄膜薄片结构和线粒体在盐胁迫下的完整性，保护植物的光合体系，改善PN，增强棉花幼苗的耐盐性。200μmMT治疗是在该实验中促进棉花幼苗和耐盐性的最有效。结果为MT减轻盐胁迫提供了理论依据。需要进行进一步的研究，以探讨盐胁迫下棉花幼苗调节的分子机制。

植物材料及生长条件

一种常规的广泛种植的转基因抗虫棉（陆地棉L.）栽培品种“Guoxin No.9”在本研究中使用，由Guoxin Rural Technology Service Association协会（中国河北省）提供。将棉籽用70％乙醇灭菌30分钟，然后用无菌蒸馏水洗涤三次，以除去种子表面上的乙醇。将灭菌的棉籽在黑暗中萌发在25℃的培养箱中，持续24小时，然后在蛭石中播种并在温室中培养（河北农业大学，河北省保定市）。幼苗在28/25℃（日/夜）培养，相对湿度为45±5％，在光周期（600μmolm^-2S.^-1光强度为16 h / 8 h。在双真叶阶段，将幼苗转移到PVC鼓中，该PVC鼓包含1.8L的1/4强度完全营养溶液，用于水培培养物。2天后，用1/2强度完全营养溶液代替，孵育2天，然后将幼苗转移到全强度营养溶液中，以继续培养，直至实验结束（Wang等，2020）。改性的Hoagland溶液是棉蒙特尔等人的实验中使用的完全营养溶液。[84]由Macronuriver（1毫米KH）组成₂宝_4.，2 mm mgso_4.h·7₂O, 4.5 mM NH_4.H₂宝_4.和5毫米的kno_3.），微量营养素（0.02μm（nh_4.）_6.莫_7.O._24.h·4₂O, 0.3 μM CuSO_4.h·5₂O, 0.8 μM ZnSO_4.h·7₂o，5μmh_3.博_3.和7μmmnso_4.· H₂o）和其他营养素（0.1 mm EDTA-NA₂， 0.1 mM FeSO_4.h·7₂o和5 mm ca（没有_3.）_4.h·4₂O).棉花幼苗每天用小型气泵充气1小时，以确保营养液中有足够的氧气。为保持营养液中离子成分和pH的稳定，各处理营养液每2 d更新一次。当棉花幼苗达到三真叶期时，进行以下处理:

用外源MT以各种浓度（50,100,200和500μmmT）处理幼苗，并进行盐应激处理。具体地，用不同浓度的MT溶液喷洒棉幼苗，直至叶片滴落一次，每24小时持续12天。将以下实验组安排成随机完全嵌段设计，30重复，如下处理：[1] No Mt +无盐处理（对照，CK）;[2] NO MT + 150mM NaCl处理（150mM NaCl，通过预测试筛选测定）;[3]50μmmt-喷涂+ 150mM NaCl处理（S + MT50）;[4]100μmmt-喷涂+ 150mM NaCl处理（S + MT100）;[5]200μmmt-喷涂+ 150mM NaCl处理（S + MT200）;[6]500μmmt-喷涂+ 150mM NaCl处理（S + MT500）。每种处理使用30个PVC水培滚筒。在处理后，使用第三官能叶（从植物顶部）测量棉植物的生理指标和微观结构在治疗后在0,3,6,9和12d中测量。

衡量增长指标

通过电气平衡测量确定射击和根的新重量。将样品置于封套中，然后将植物在105℃下淬灭30分钟并在80℃下烘箱干燥72小时，以恒定重量，称重为干重。

测量叶绿素含量、气体交换参数和叶绿素荧光

叶绿素含量：用Spad-502测量第三功能叶片，避免在测量时棉静脉的位置。在棉花叶的五个不同位置测量值，并计算平均值。

光合特性：在9:00-11:00和13:00-15:00晴天，净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）和细胞间CO₂采用LI-6400型光合仪（LI-COR，Lincoln，NE，USA）对棉花叶片浓度（Ci）进行了测定₂浓度为400μmolmol^-1，光强度为600μmolm^-2S.^-1。

叶绿素荧光参数:阵线/ Fm使用PAM-2500便携式叶绿素荧光计（Heinz Walz GmbH，德国）测量PS II（φPSII），非光化学淬火（NPQ）和表观电子转移效率（ETR）的实际光化学量子产率，非光化学淬火（NPQ）和表观电子转移效率（ETR）。。

叶片中Pro含量的检测

使用Pro测定套件（Pro-1-Y，苏州Comin Biotechnology Co.，Ltd。，苏州）测定脯氨酸（Pro）的含量。

离子含量的测定

Na⁺和K.⁺采用原子吸收法(ZA3000, Hitachi, Ltd, Tokyo, Japan)测定。氯的含量^-使用cl确定^-分析套件（南京江城生物工程研究所，南京，中国）。

H₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）在叶子中（组织化学分析）

H₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）分别用1mg /mL DAB(3,3-二氨基联苯胺)和1mg /mL NBT(硝基蓝四唑)染色，对棉花叶片进行组织化学检测，如Chen等[85］．

检测H的内容物₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）在树叶里

过氧化氢的含量（h₂O.₂）使用H确定₂O.₂测定套件（A064，南京江城生物工程研究所，南京，中国）。超氧化物阴离子的含量（\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\））使用一个确定\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）测定套件（SA-1-G，苏州Comin生物科技有限公司，中国苏州）。

H的荧光显微镜分析₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）

H₂O.₂和\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）用10μm2'，7'-二氯荧光蛋白酸（DCF-DA）和10μM二氢丙酮（DHE）检测。通过将它们溶解在10mM Tris-HCl（pH7.4）中来制备两种荧光探针。剥离叶片表皮后，将它们立即在25℃下在黑暗中与相应的荧光探针孵育1小时。将每个样品在10mM Tris-HCl（pH7.4）中快速洗涤三次，并固定在载玻片上，用于用荧光显微镜（Eclipse Ni-U，Nikon，Tokyo，Japan）进行观察。基于这些实验，选择200μmMT施用的处理是最有效的。因此，可以在以下实验中使用三种处理：（1）CK（NO /不含盐处理，对照）;（2）S（150mM NaCl）（NO / 150mM NaCl处理）;（3）S + MT200（施加200μm施用/ 150mM NaCl处理）。

气孔结构、密度和孔径

用日本尼康显微镜观察气孔。将第三片功能叶的棉花表皮撕下，贴在无盖玻璃的载玻片上。每片叶片随机选取5个视野，在40倍放大镜下观察气孔数目和气孔形态特征(1） 气孔长度和宽度：测量每个视野的气孔。哑铃形保卫细胞的长度为气孔长度，垂直于哑铃形保卫细胞的最宽值为气孔宽度。通过计算气孔长宽的平均值来表示视野中气孔的长宽(2） 气孔孔径（SA）：测量每个视野中的所有气孔，并测量气孔孔径的宽度以指示气孔的开度。计算气孔开度的平均值来代表视野中的气孔开度(3） 气孔数（SN）：计算每个视场面积上的气孔数，用5个视场气孔数的平均值表示气孔数。

透射电子显微镜（TEM）

用磷酸盐缓冲液（Pb）（0.1μm，pH7.4）固定，用2.5％（v / v）戊二醛固定，然后在Pb中洗涤四次。然后将细胞在4℃下以1％（w / v）四氧化锇在pb中以1％（w / v）锇，2小时，通过梯度乙醇系列（30,50,70,80,90,100和100％，每次）脱水）进入纯丙酮（2×10分钟）。将样品在丙酮和SPI-PON812树脂的分级混合物（3：1,1：1和1：3）中渗透（北京中京京京床科技有限公司，北京，中国）（16.2克SPI-PON812,10G十二烷酰琥珀酸酐和8.9g N-甲基丙烯酰胺），改变纯树脂。最后，将细胞嵌入纯树脂中，将1.5％N，N-二甲基苄胺嵌入1.5％N，N-二甲基苄胺中，并在45℃下聚合12小时，在60℃下聚合48小时。用醋酸铀（Leica EM UC6）段，用醋酸铀酰分离，并用柠檬酸盐进行双染色，并使用透射电子显微镜（Fei Tecnai Spirit 120kv，Fei Company，Hillsborough或美国）进行检查。

解剖学性状和分析

为了观察叶和茎的解剖结构，我们在盐处理12天后取样，并使用Mohamed等人描述的石蜡切片进行观察[45］．第三个功能叶和茎在福尔马林 - 乙酸 - 醇（FAA）（10ml甲醛+ 170ml 70％（v / v）乙醇+ 10ml冰醋酸+ 10ml甘油）中固定在福尔马林 - 乙酸 - 醇（FAA）（10ml甲醛+ 170ml 70％（v / v））中进行72小时在真空下。将叶子和干燥样品脱水并嵌入石蜡中。旋转式切片机（浙江金华基迪仪器设备有限公司，金华，中国）用于切割8μm厚的切片。将切片用脱氨基化并用Safranin染色24小时，然后用乙醇溶液洗涤以除去多余的染料。在脱色切片后，将它们置于固体绿色染色溶液中40秒然后脱色。尼康显微镜用于观察叶片和茎之间的不同处理之间的微观结构变化。

统计分析

所有实验数据采用SPSS 21.0 (IBM, Inc, Armonk, NY, USA)进行分析，并以均数±SD(标准差)值报道。采用主成分分析(PCA)方法对各性状间的关系进行分析，并以特征值>1为基础求得主成分。为了分析单因素方差分析结果，有统计学意义的阈值P.本研究采用< 0.05。

在当前研究期间生成和分析的数据集可用于合理请求的相应作者。

CI：

外细胞CO.₂浓度

林后:

皮质

DW：

净重

ETR：

电子运输速率

FV / FM：

光照系统II的最大潜在量子效率

弗兰克-威廉姆斯:

鲜重

通用条款：

乐形电导

H₂O.₂：

过氧化氢

圈数：

韧皮部导管的面积

LAX：

木质船面积

地蜡:

低表皮

MT:

褪黑激素

NPQ:

non-photochemical淬火

\（{\mathrm{O}}}u2^{\cdotp-}\）：

超氧化物阴离子

PHV：

普洛姆船只

Pi:

髓

PP：

质体实质

亲：

脯氨酸

ROS:

活性氧物种

PT:

塔拉德组织厚度

PN：

净光合速率

SA：

气孔孔

SN:

气孔数量

Spad：

土壤和植物分析仪研制

Sp:

海绵薄壁妇女

SPT：

茎韧皮厚度

英石：

海绵组织厚度

SXT：

茎木质部厚度

透射电镜:

透射电子显微镜

Tr:

蒸腾率

UEP：

上表皮

十五：

木质部的船只

该研究由华北作物改善和监管国家重点实验室（No.Nccir20202018），河北省重点研发项目（No.20326409D）和中国国家自然科学基金（No.31871569）。资助机构在研究的设计中没有作用;在收集，分析或解释数据;在写作稿件;或在决定上发布结果。

作者笔记

1. 丹江，斌陆和刘刘同等促进了这项研究工作，应该被认为是共同的作者。

隶属关系

1. 河北农业大学北京作物改善与规例国家重点实验室，保定，河北071001

   丹江，文晶段，延君萌，金莉＆志英白

2. 河北省河北省农业大学农村农业大学作物生长调控国家重点实验室/作物生长调节重点实验室，河北省河北省071001

   丹江，刘刘，文京段，燕君萌，柯章，红春孙，永江张，围ying佰勇李

3. 河北农业大学景观与旅游学院，保定，071001

   本卢

4. 山东农业科学院，山东省农业部农业部棉花研究中心/棉养殖与栽培重点实验室，山东省250100

   贺忠东

贡献

DJ进行了所有的实验，分析数据，解读结果，并撰写稿件。BL和LL设计了实验，指导了研究的执行和论文的撰写。WD和YM协助进行数据分析。JL、KZ、HS、YZ、HD进行技术指导。ZB和CL改进了数据分析，修改了稿件。所有作者已阅读并批准最终稿件。

相应的作者

对应到Zhiing Bai.或者CENDONG LI.。

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

作者声明了该研究在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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