番茄耐热新基因来源的鉴定:从对照试验到田间

背景

由于全球变暖，寻找耐热性的新来源和识别参与这一过程的基因已成为当今的重要挑战。本研究的主要目的是验证在温室控制试验中测定的耐热性是否可以很好地预测气候高温胁迫下大田栽培的农艺性能。

结果

以番茄为材料，在控制(T1)、中等(T2)和极端热胁迫(T3) 3种温度条件下进行温室栽培。生殖性状(花果数和坐果数)是耐热性的指标。在第一次筛选中，对219份番茄材料进行了耐热性评价。共有51个材料被确定为潜在的耐热性。选取田间耐热性较好的28份材料，以及来自意大利(7份)和保加利亚(3份)的10份材料，在3种温度处理下进行再评价。16份番茄材料在T3表现出显著的耐热性，包括5个野生品种、2个传统品种和4个商品品种，1个保加利亚品种和4个意大利品种。在意大利和保加利亚的田间试验中，对15个最有希望的耐热性材料进行了分析，证实了其中大多数在高温下的良好表现。

最后，对不同基因型(传统组和现代组)在热胁迫下花前(子房)和花后(果实)的差异基因表达进行了分析，结果表明，主要的差异反应发生在花后果实。敏感基因型的反应包括HSP基因的诱导，而耐受基因型的反应包括参与激素或酶(如脱落酸和转移酶)调控的基因的诱导。

结论

在温室对照试验中观察到的15份番茄材料的耐高温性在农艺田间试验中得到证实，为育种提供了新的耐热性来源。

DEG分析显示了番茄对热的复杂响应，并破译了热胁迫下敏感和耐热番茄材料中激活的不同机制。

在目前的全球变暖情况下，预计到二十一世纪末气温将上升2至5°C。这些温度将影响热带和亚热带温带地区，并将造成与产量增加成正比的农业产量损失[1，2]。需要种子品种和管理方法适应较暖的温度，以保持作物生产力[3.］^。此外，极端天气事件将更加频繁，对作物生产力造成更严重的威胁[4]。许多作物，如小麦、水稻、大麦、高粱、玉米、鹰嘴豆、油菜籽等，已经报道了温度升高对植物生长和产量的负面影响。5，6，7]和番茄，产量损失高达28% [7]。高温应力由两个主要因素决定:持续时间和强度[8]。四种主要的耐热性反应被描述[9:短期获得性耐热性、长期获得性耐热性、基础耐热性和中高温耐热性。

番茄(茄属植物lycopersicum是世界上最重要的园艺作物之一。此外，番茄是在不同的气候区域种植的，无论是在温室里还是在田间种植，都经常受到高温胁迫。番茄生长的最佳温度为白天25°C至30°C，夜间20°C [10]。然而，这些数值升高几度，例如白天超过35°C，晚上超过30°C，由于花粉活力、营养生长抑制、花朵数量下降或花朵坐果能力等不同因素，坐果量减少，产量相应降低[11]。由于热胁迫，花的数量也减少了[12，13，14]。定义番茄耐受性最常用的标准是植物在高温下结实的能力。该性状相当复杂，涉及生理、生化和基因调控途径[15]，从花粉活力[16，17，18]，维持光合作用和呼吸作用[19]，基因的激活或沉默[20.，21]。另外，坐果与最终的农艺产量直接相关。因此，高温坐果被认为是番茄耐热性的一个很好的指标，在以往的工作中得到了广泛的研究[13，14，18，22]。

对自然变异的探索可以提供对抗逆性遗传学的见解，并可以提供对育种有用的遗传多样性[23]。大规模基因组资源可用于深入了解复杂的非生物胁迫(如热胁迫)的控制[7]。然而，番茄耐热性的筛选只使用了少量的材料[22]。然而，番茄的野生近缘种已被开发为抗非生物胁迫和疾病的来源。于是，入库自野茄属植物例如美国pimpinellifolium、L。美国pennelliil美国habrochaitesl美国chmielewskiil .,美国cheesmaniaeL.已发现耐高温[17，18，24，25，26，27]。此外，大多数实验都是在温室的受控条件下进行的。生理测量，如叶绿素荧光，已被提出作为筛选番茄耐热性的快速工具。28，29，30.]。在某些情况下，在受控温室中的叶绿素荧光测量与高温下的田间性能研究之间发现了有趣和良好的相关性[28，29]，尽管在所有的研究中并没有发现这些相关性与作物产量[28]。然而，经过测试的加入和试验的数量仍然太少，无法得出一般性结论。因此，尽管受控条件下的番茄种质筛选可能有助于确定候选的耐受性材料，但它们在田间的反应可能不同，因为热胁迫可能是高度可变的，并且可以发现其他因素(土壤、天气、疾病)，这些因素在温室中无法模仿，而且也可能影响植株的性能。因此，温室和田间的综合分析为全面研究番茄对高温的反应提供了更现实的方法。

此外，为了解决全球变暖问题，最近越来越重要的一种方法是分析表型可塑性，即植物根据环境条件表达不同表型的能力[31]。育种者可以利用可塑性，根据不同环境下的产量来选择品种，以最大限度地提高生产力[32]。这种方法已被用于研究不同作物(如玉米)对生物和非生物胁迫的耐受性[32]，向日葵[33]，或蕃茄[34]。为了准确估计基因型的可塑性，需要对多个试验进行分析。

对耐高温机理的进一步了解将有助于培育新的耐热品种。RNA测序(RNA- seq)技术是一种强大的基因发现工具，已被用于在不同非生物胁迫下生长的植物的差异表达基因(DEG)分析。35]，揭示了一些负责高温反应的候选基因[36]。

基因型适应压力条件的能力需要激活不同的反应机制。植物对热胁迫的反应被描述为一种复杂的特性，它影响形态、生理或分子水平的过程[8，25]。因此，转录组水平对热应激的反应将受到受影响过程的制约。在植物中，热胁迫诱导热休克蛋白(HSPs)的表达[37]、压力相关蛋白和对活性氧的保护[8]，以及植物激素和活性氧[38]。热休克蛋白通过其作为伴侣的活性来防止细胞损伤，而在非应激条件下，它们的作用是协助其他蛋白质的合成和运输[39]。尽管对热应激的第一个反应是热敏感蛋白的激活，但在植物的耐热反应中也描述了其他基因在各种生物合成途径、次级代谢物或渗透保护剂(脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、多胺、ABA)的转导中的作用[5，8，40]。在番茄中，已经描述了几个与耐热性有关的基因[41，42，43]，尽管由于这种压力的复杂性，关于这种耐受性的机制的知识尚未完全破译。

本研究的主要目的是在温室控制试验中测试由特定生理性状(高温下坐果能力)决定的耐热性是否可以很好地预测高温胁迫下大田栽培的农艺性能。

耐热性是在迄今为止最大的种质资源中筛选出来的。种质资源包括来自非常广泛来源的番茄材料或品种:野生品种、早期驯化品种、传统品种和现代品种。通过评价单株花、果数和坐果率等生殖性状来确定其耐热性响应。在不同的控制温度条件和最炎热季节的自然田间条件下对材料进行了分析，验证了耐热性响应的稳定性。此外，通过使用来自现代品种和“de penjar”/“da serbo”群体的两种对比基因型，进行RNA-Seq分析，以确定不同群体番茄克服高温胁迫机制所涉及的基因，以揭示热胁迫耐受机制。

对番茄耐热品种和材料进行了鉴定，并对耐热分子机理进行了初步探讨。这些实验的方案和它们之间的关系如图所示。1。

番茄种质耐热性的大规模筛选

我们的主要目标是找到番茄耐热性的来源，以便将其引入育种计划。我们筛选了大量不同群体(野生、美国lycopersicumvar。cerasiforme例如，传统品种包括“de penjar”或“da serbo”西红柿，现代品种和商业杂交品种)，以覆盖该物种可用种质的最大数量的番茄类型(图2)。1)。同时，用5个番茄品种作为对照。

采用FCCV_16试验研究了219份番茄材料对热胁迫的响应(补充表)1)，以五个番茄品种(‘MoneyMaker’、TRVA2360、‘Docet’、‘Monterrey’和‘JAG8810’)作为对照。筛选在三种不同的温度条件下进行，T1(25°C/20°C，无热应激)，T2(30°C/25°C，中度热应激)和T3(35°C/30°C，极端热应激)。使用和增强设计意味着根据对照的五个结果调整值(补充表)2)。

数字2显示了控制器对温度升高的响应趋势。双向方差分析显示，基因型、温度效应及其交互作用极显著(p< 0.001)。总的来说，基因型在温度范围内的响应是FLN(花数)的减少(图2)。2A)、FRN(果数)(图2)2B)和FRS(坐果率)(图2)。2C)伴随温度升高，“JAG8810”除外。在T2和T3阶段，‘Monterrey’的FLN、FRN和FRS均显著高于‘Moneymaker’、‘DOCET’和TRVA2360，显示了其耐热性。对于‘JAG8810’，在T2阶段FLN、FRN和FRS均出现了严重的下降(与‘MoneyMaker’和TRVA2360相似)，但在T3阶段FLN、FRN和FRS均有所增加，且在该温度状态下的行为与‘Monterrey’相似。因此，我们发现了三种模式(图1)。2):一个敏感模式(在“MoneyMaker”、“DOCET”和TRVA2360中观察到急剧减少)，一个耐受模式(在“Monterrey”中观察到轻微减少)和一个适应模式(在“JAG8810″”中最初减少，但后来恢复)。

219份供试材料的FLN、FRN和FRS在三种温度下也存在差异。在FLN方面，T1和T2的差异很小，高相关性(r = 0.74)证实了这一点。1)在这两种温度状态之间观察到这种特性。事实上，在较高的T2温度下，FLN仅略有下降。然而，在T3时，大多数植株的FLN急剧下降。1)。就FRN而言，在T2已经观察到大幅度下降，其中63%的材料不结果(补充图2)。1)。在这种下降趋势下，只有22%的品种在T3结实(补充图)。1)。总体而言，大部分材料在T1表现出较高的FRS，但在T2和T3表现出不同的反应。在所有材料中，分别有37%和22%的材料在T2和T3不结实，而5%的材料在两种高温处理下均表现出高FRS(> 70%)(图2)。3.)。因此，51和47个品种在T2和T3时的FRS高于敏感对照，其中22个品种在两种温度下均高于敏感对照(图2)。3.、补充表3.)。值得注意的是，12个和13个材料分别在T2和T3表现出显著高于耐受对照‘Monterrey’和‘JAG8810’的FRS(图2)。3.C)。

为了使实验性别组的分析均匀化，将“MoneyMaker”和“Monterrey”分别定义为敏感对照和耐受对照。76个品种(35%)在T2或T3的FRS高于“MoneyMaker”。其中野生种质12个(占分析野生种质总数的15%)美国lycopersicumvar。cerasiforme(25%)， 12个传统的“de penjar”或“da serbo”品种(33%)，2个其他传统品种(17%)，8个现代品种(42%)和38个商业杂交品种(68%)1)。

在至少一个高温条件下FRS显著高于‘MoneyMaker’的76个品种被认为是耐高温候选品种，因为它们在中等和极端温度条件下(T2和T3)表现出不同的响应趋势(图2)。4)，与之前在对照组中观察到的结果相同。这些添加物在高温下遵循三种不同的行为，因此可以分为三种不同的组。大多数在T2时FRS较高的材料，FRS随温度的升高几乎呈线性下降(图2)。4A)，虽然FRS降低低于“MoneyMaker”，即，这些被归类为耐中度热应激。22个品种在T2和T3的FRS均显著高于“MoneyMaker”(图2)。4B)，但观察到两种不同的模式:15份材料在T2和T3均表现出下降，但明显低于“MoneyMaker”;7份材料在T2表现出FRS下降，然后是T3增加。(无花果。4B).这一组被归类为耐广泛温度应力的候选者。最后，其余的耐受性品种(25个)在T2时FRS严重下降，但在T3时FRS(恢复)很高(图2)。4C)，遵循在耐受对照“JAG8810”的性能中已经观察到的相同模式，并被归类为能够充分应对热应激的候选物。

受控生长条件下温室番茄材料耐热性的确认

为了确认从之前的大规模筛选中选择的基因型的耐热性，对每个基因型进行了5个生物重复的试验，并进行了相同的热处理。1FCCV_2017)。共有41份材料在高温条件下进行了分析，其中31份来自FCCV_2016试验中选择的76个候选耐药基因型(8个野生材料，5个野生材料)美国lycopersicumvar。cerasiforme， 12个传统品种，包括7个“de penjar”或“da serbo”西红柿，6个现代品种和商业杂交品种)，7个耐热意大利地方品种[44，45]，属于那不勒斯费德里科二世大学农业科学系的一个收藏，在平行的田间实验中显示出耐热性(详细信息在LabArchive存储库托管)http://dx.doi.org/10.6070/H4TT4NXN)和来自MVCRI的三个耐热保加利亚现代近交系(详情将在其他地方公布)。后面两个小组的加入是作为TOMGEM项目中协调工作的一部分完成的。

FLN值与T2保持一致，与T1结果相比仅略有下降。然而，在极端T3状态下，FLN明显下降。对于FRN，这种减少发生在T2，果实数量在T3急剧下降。果实结实率方面，所有品种的果实结实率在T1均较高，结实率在50% ~ 100%之间。在T2中，观察到FRS的高变异性，从没有坐果的基因型到100% FRS的基因型。然而，在T3中，几乎所有基因型的FRS都下降了(补充图2)。2)。

FLN和FRN在T1和T2与之前的FCCV_2016实验有很高的相关性(分别为0.93和0.91)。然而，T3的相关性非常低;FLN和FRN的r分别为0.22和0.30。两个实验的FRS相关性较低，仅在T1时具有显著性(表1)2)。

对野生材料进行了分离分析美国lycopersicum由于植物物候的不同，物种的基因型也不同。在野生材料的情况下，所有材料的FRS都很高，T1在100 - 97%之间，与对照相比没有显著差异。在T2中，只有BGV007947野生品种的FRS低于蒙特雷，证实了所选野生品种的耐热性。此外，有5个品种的FRS显著高于MoneyMaker。在T3阶段，各树种间的差异更为明显。3个基因型表现出与‘Monterrey’相同的反应，4个品种对FRS的反应明显优于‘MoneyMaker’(表1)3.一个)。

为美国lycopersicum品种和材料T1的FRS在100 ~ 70%之间，与两个对照基本无差异。在T2中，23个基因型对耐药对照‘Monterrey’表现出类似的反应:6个传统品种，5个cerasiforme五种现代杂交品种，一种来自保加利亚的现代近交系品种和六种意大利本土品种，从而证实了它们对高温的耐受性。在T2温度条件下，有7份材料显著优于“摇钱树”。在极端高温条件下，T3, 5个材料的FRS与耐高温对照‘蒙特雷’相同，而3个材料的FRS显著高于敏感对照‘造钱者’(表1)3.B)。

根据41种基因型在不同温度条件下的结实能力对其进行排名。采用Tukey’s检验法比较各基因型的FRS。野生种在T1和T2的FRS值相近，不同种群间无显著差异。T2时，BG007111的FRS为75%，BGV007947为48%。T3时，所有品种的FRS均在20%以上，其中4个品种的FRS > 50%。T3值较高的两个野生种质(BGV007109和LA0480)和最低的两个野生种质(LA2147和LA2148)在T3值上存在显著差异，见表3.33 .答案A美国lycopersicum不同品种间T1的FRS无显著差异。18个基因型的FRS值在50%以上，只有2个基因型在T2时FRS < 20%(表2)3.B). Tukey检验定义了五组，表明不同加入国对T2制度的反应存在重要差异。此外，在极端温度条件下T3, 21个(65%)基因型的FRS > 20%， 4个高于50%(表5)3.B). Tukey试验定义了四组，尽管大多数入组之间没有显着差异。FRS值较高的3个品种(BGV006071、‘Durinta’和‘Manadi’)与FRS值最低的3个品种(BGV004573、bg223 /15和BG617/14)之间存在显著差异(表1)3.B)。

23个基因型在T2阶段与耐高温对照差异不显著，表明它们对中等高温胁迫具有耐受能力。另外，3个材料在T3极端温度条件下的FRS表现明显优于‘MoneyMaker’，5个材料与‘Monterrey’相似，总共有5个材料具有假定的极端温度耐受性。

受控生长条件下温室番茄品种耐热性的验证

在另一个温室设施中进行了进一步的耐热性验证(图2)。1(ENZA_2018)，包括现代商业杂交品种、野生品种、意大利地方品种、传统的“de penjar”/da serbo”西红柿和一个美国lycopersicumvar。cerasiforme登记入册。温度制度与FCCV_2017相似，但果实保持到最佳成熟阶段(即在温度制度变化后不修剪)，遵循类似于商业生产的农艺管理。在所有温度条件下，所有植物的FRN值均低于FCCV_2017中记录的FRN值。3.)，随后的FRS较低，可能是由于不同的农艺管理(表1)4)。此外，由于“MoneyMaker”种子批次出现了意想不到的问题，只有耐受性强的“蒙特雷”可以作为对照。Dunnett’s检验显示，在T2和T3处理中，被试品种与‘Monterrey’之间没有显著差异(表1)4)。T2期E8的FRS为40%，BGV006071为7%，Durinta为27%;E7和BGV006071在T3期均未结实。

Tukey对14个品种进行的试验显示，T2所有品种的FRS值相似，两组在T3有显著差异，只有“Durinta”(FRS = 27%)与BGV006071、E7和TRVA0030有显著差异(表1)4)。

除两个试验的农艺管理差异外，FCCV-2017与ENZA-2018试验的FLN和FRN相关性极显著。FRS的相关系数低于其他两个性状，但同样显著(表2)5一个)。

此外，对基因型与环境相互作用的分析表明，这些差异是由基因型和实验条件引起的，而不是由高温条件下各因素之间的相互作用引起的(表1)4B、补充图4)。

因此，在一般情况下，所选材料和品种之间的行为非常相似，并且与耐热对照“蒙特雷”非常相似，这加强了先前实验中观察到的耐热性假设。

现场耐热性验证

为了评估基于温室控制试验的选择对大田种植番茄的可转移性，一组耐热候选材料和品种(包括现代商业杂交种和自交系，意大利地方品种和一个美国lycopersicumvar。cerasiforme在两个开放的试验田中也对从先前的实验中选择的文献进行了测试。(保加利亚，MVCRI_2018，意大利，UNINA_2018，图1)1)，在温暖的季节有不同的天气情况。

在MVCRI_2018试验中，记录了4个桁架的FLN、FRN和FRS，对应于每个植株的第2 ~ 5个桁架。从桁架出现到收获的平均温度为:truss2，白天26°C /晚上20°C;truss3，白天24°C /夜晚19°C;truss4，白天26°C /夜晚20°C;5、28°C白天/21°C夜晚。因此，桁架2、3和4没有受到热应力，而桁架5受到中等热应力。总的来说，FLN和FRN的测试基因型和“MoneyMaker”之间没有发现显著差异。只有BG1923/15的FLN和FRN高于‘MoneyMaker’，而BG617/14的FLN和FRN在所有桁架中都低于‘MoneyMaker’(补充表)4)。在财务报表评分方面，所有品种的财务报表评分均较好，普遍高于50%，与“造钱者”无显著差异(表1)6A).使用Tukey检验的不同品种之间的比较显示，在trus4中有两个统计上显著的组，其中意大利地方品种E17的值最低(FRS的50%)。这些结果表明，所选耐热品种在无或中度热胁迫下均未表现出产量损失。

在UNINA_2018大田试验中，白天最高温度达到37°C，夜间最高温度降至17°C，平均温度为29.7°C，这对应于白天高热胁迫，夜间温和的温度，可能有助于植物从白天的热胁迫中恢复。本试验以热敏型‘MoneyMaker’和耐热型‘Monterrey’分别作为阴性对照和阳性对照。对照组间FLN无显著差异。不过，“蒙特雷”的FRN和FRS确实明显高于“造钱者”(见表)6B).在“MoneyMaker”和FLN的测试品种之间也没有发现差异。另一方面，5个品种与‘蒙特雷’相比差异不显著。在FRN方面，发现了更显著的差异:4个品种的FRN高于' MoneyMaker '， 7个品种与' Monterrey '没有差异。在FRS方面，有7个品种的FRS显著高于‘MoneyMaker’，没有一个品种的FRS显著低于‘Monterrey’。值得注意的是，有四个品种的FRS高于“蒙特雷”(表)6B)。除了两个意大利长白种(E53和E76)外，所有情况下的FRS值都高于50%(表1)6B).因此，与对照相比，大多数品种的行为证实了它们在田间条件下的耐热性。用Tukey’s试验比较，3个品种的FLN存在差异，其中E53的花数最高，而‘拍打’和E8的花数最低。FRN以BG1923/15处理最高，E76和E53处理最低。最后，在FRS方面，E76和E53的FRS最低，而“拍拍”的FRS最高。

RNA-Seq实验与分析

为了进一步了解耐热性的分子机制，利用NA分析研究了不同耐热基因型间基因的差异表达。根据之前的结果，我们选择了4个基因型(图2)。1)。其中两个属于传统的“de penjar/da serbo”，在地中海地区广泛种植，但在热应激反应方面存在差异:TRVI0040(耐受)和TRBA0160(敏感)。由于这两种材料在物候、果实类型和营养生长方面的相似性，使其基因表达两两比较适用于鉴定因其对高温反应不同而导致的差异表达，而不是其他生物学方面的差异表达。另外2个选育自高温条件下表现不同的现代品种组:LA2661(耐高温品种)和LA2660(敏感品种)。之所以选择la2661，是因为它在以往的研究中被广泛用作耐热性来源[12，18，46]，尽管在我们最初的筛选中，它只有适度的耐受性。TRVI0040和TRBA0160在T1和T2时FLN有差异(表1)7A)，尽管这两个品种在T3均降低了FRN，但在该温度下，TRVI0040的FRN显著高于TRBA0160。TRVI0040在T3时FRS显著提高，证实了其耐热性(表1)7一个)。

另外2个品种中，LA2660在T1和T2的FLN显著高于LA2661，这主要是由于该品种的繁殖活力更高。T3时，两种材料FLN值相近。LA2661在不同温度条件下均能保持花的数量，而LA2660的花的数量明显减少。对于FRN，不同品种间T1差异显著。然而，在高温和极端温度下，T2和T3，两种材料的FRN值相似，LA2660的FRN值下降幅度较大。最后，两种材料的FRS均随温度升高而降低，但LA2661在所有温度下的FRS均高于LA2660。LA2660的FRS随温度升高而降低，T3急剧降低(表2)7B).这些结果证实了前人报道的LA2661的耐热性[46]和LA2660的缺失。

不同基因型和组织在高温下的差异基因表达

根据我们之前的结果(Gonzalo et al. 2019)，高温下的果实取决于子房容量，而不是像目前的实验群体和实验设置那样取决于花粉活力(我们不排除花粉活力在其他情况下可能很重要)。在我们的实验设置中，在修剪桁架之前，果实只达到了非常早期的发育阶段，这发生在温度变化之前。我们还决定将早期发育果实(开花后5天)纳入差异表达分析，以扩大工作范围，并确定在早期发育中可能重要的候选基因。因此，本研究在两个不同发育阶段(花前(子房)和花后(果实发育))和两个不同温度制度(T2和T3)的组织中研究了高温下的差异表达;各组间FRS的差异在T3时更为明显。由于主要在敏感基因型中收集的组织数量较少，RNA必须进行等分子聚合以获得足够的高质量RNA，用于某些温度/基因型组合的测序。RNA测序后，共鉴定出34075个基因。第一种方法是通过主成分分析(PCA)获得温度和基因型之间基因表达的总体情况。在四个基因型中，在两个发育阶段和两个温度下表达的共有17588个基因被用来实施PCA(图2)。5)。可分为两组:一组包括所有果实样本，另一组包括卵巢样本，不受温度和基因型的影响。在卵巢样本中观察到基因表达的微小差异。

发育果实样品被PC1和PC2分离，分别占总基因方差的23.5%和20.2%。T2采集的果实样本被放置在果实空间的左侧区域(PC1为负值，PC2为正值)，而T3采集的大部分果实样本位于右侧区域(PC1为正值，PC2为负值)，反映了不同温度条件下基因表达的差异(图2)。5)。另一方面，在该分析中，耐受性基因型和敏感性基因型之间没有明显差异。

这些结果表明，对热胁迫的响应在果实发育早期诱导的基因表达差异大于子房。

1. 一)

   现代栽培品种LA2661与LA2660的差异表达分析

   为了更深入地了解耐和敏感番茄品种对热胁迫的反应，对每个番茄品种组进行了单独的分析。主成分分析结果表明，不同品种间的基因表达差异较大。因此，随后的分析集中在这些样本上。

   以现代品种LA2661和LA2660、T2和T3条件下LA2661和LA2660、T3条件下LA2661和LA2660的差异表达基因(DEG)值为|log2 (fold-change)|≥2;p值< 0.01。

   热敏感LA2660在T2和T3之间共有904个基因差异表达，其中301个基因下调，603个基因上调。氧化石墨烯项富集分析表明，在与应激反应相关的生物过程中，包括对热的反应和对温度刺激的反应，氧化石墨烯项富集显著，分别富集了15.42倍和13.21倍(补充图2)。5一个)。

   以耐热LA2661的DEG为例，在T2和T3之间，共鉴定出1411个DEG，其中下调基因645个，上调基因766个。氧化石墨烯项分析表明，在主要与调控和光合作用相关的生物过程中富集显著。此外，对非生物刺激的反应显示出3.28倍的富集(补充图2)。5B)。

   为了更好地了解这一群体对热的共同和特定反应，我们在T3中对LA2660和LA2661进行了DEG分析。两种基因型共有1652个基因表达差异;其中下调927个，上调725个。GO术语类别对热的反应和对温度刺激的反应显著丰富了7.72倍和7.73倍，分别意味着11个和14个基因(表1)8，补充图6)。这些品种对热胁迫的反应包括热休克蛋白(LA2660敏感基因型过表达)和3个激素编码基因:Solyc02g062390(脱落酸和环境胁迫诱导蛋白)和酶:Solyc06g059990(alkyl-transferase)和Solyc08g00568(dimethylallylcistransferase叶绿素)。

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2. B)

   “de penjar/da serbo”基因型TRVI0040和TRBA0160的差异表达分析

   对发育果实样品中TRVI0040和TRBA0160在T2和T3之间以及在T3中两者之间的差异表达基因进行了分析。

   TRBA0160在T2和T3之间共有773个基因差异表达，其中592个基因下调，181个基因上调。氧化石墨烯项分析表明，主要与代谢相关的生物过程显著富集(补充图2)。7A)。耐热性TRVI0040的差异表达基因中，3364个下调，931个上调。该基因型富集的生物过程更加多样化，涉及与光合作用、调控和对不同胁迫的响应相关的基因:对胁迫的响应(3.08倍)、对非生物刺激的响应(2.32倍)、对胁迫的响应(1.76倍)和对刺激的响应(1.81倍)。7B)。

   T3中TRVI0040与TRBA0160的差异表达基因为1821个，其中709个表达下调，1112个表达上调。生物过程的GO项分析主要显示了与代谢过程相关的基因的富集，而不包括与高温胁迫直接相关的基因的富集(补充图2)。8)。

   对生物过程中不同类别的过表达基因进行分析，发现有81个基因参与刺激反应。在这一类中，有28个基因属于与应激反应直接或间接相关的家族。其中，6个基因与热反应有关，其中3个基因与现代番茄品种群共同(表2)9)。

   全尺寸工作台

   因此，“de penjar”/“da serbo”番茄对热的反应激活了29个参与不同生物过程的基因，其中只有5个属于HSP家族Solyc06g036290(在热敏TRBA160中过表达)，Solyc09g009100,Solyc11g020330(均在TRVI0040耐热型中过表达)在这些番茄组基因型中与现代品种相比特异性富集。

3. C)

   不同组间基因表达的比较

上述分析表明，不同番茄类群的高温响应机制不同。发育果实的DEG分析显示，基因型之间激活的基因存在差异，与它们分配到一个品种组无关。LA2660和TRBA160两种热敏基因型在T2和T3之间的DEG比较显示，在两种温度下，主要参与代谢过程的基因都富集了(补充图2)。5一个和7另一方面，LA2660的DEG参与酶的调节以及对热和温度刺激的反应(补充图2)。5A)。在耐受性基因型的情况下，DEG的差异也很明显，LA2661显示参与生理过程的基因富集(补充图2)。5B)和TRVI0040对应力的响应(补充图2)。7B). T3各组内对比基因型的比较证实了不同的反应，LA2660中响应应激的基因丰富，包括热和温度vsLA2661对比(附图)6)，以及TRVI0040和TRBA160对激素和内源刺激反应相关基因的富集(补充图2)。8)。此外，三个基因在两个比较(LA2660)中存在差异表达vsT3处为LA2661, T3处为TRBA160和TRVI0040)。Solyc03g007890和Solyc06g062960在热敏LA2660和TRBA160中过表达，Solyc07g040680在LA2660 (HS)和TRVI0040 (HT)中均过表达。

最后，为了找出在两个番茄组中对高温反应起作用的共同基因，对耐高温基因型T3的反应进行了比较。T3期LA2661与TRVI0040之间共观察到1354度。其中，825个在LA2661中表达较高，其余529个在TRVI0040中表达较高。这些差异表达基因中有16个与耐热性有关(表1)10)。

此外，氧化石墨烯项分析显示，仅在与热应激反应相关的生物过程中富集:对非生物刺激的反应(3.95倍)、对热的反应(7.18倍)和对温度刺激的反应(8.38倍)。9A)。在24个富集于生物过程的基因中，9个参与了对热的反应(Solyc01g102960.3，Solyc03g007890.3，Solyc03g113930.3，Solyc03g115230.3，Solyc06g036290.3，Solyc08g062340.3，Solyc08g062960.4，Solyc11g020330.1，Solyc12g007070.2)，对应于两种基因型在T3中的差异表达基因(表2)10)。氧化石墨烯在分子功能上的富集表现为两种功能:水解酶活性，水解o -糖基化合物富集3.96倍，几丁质酶活性富集1.47倍(补充图)。9B)。

比较各品种组内对品种间的DEG，发现某些DEG在某一品种组内是唯一观察到的(表2)11)。在现代品种中，LA2661和LA2660在T3的DEG中包含了三个在这两个品种之间特异性表达的差异基因(Solyc02g062390，Solyc06g059990,Solyc08g005680)。关于“de penjar/ da serbo”品种之间的deg，Solyc09g009100在这组中完全差异表达。最后将两组耐热基因型进行比较，发现LA2661和TRVI0040在T3 (Solyc01g102960.3，Solyc03g113930.3，Solyc03g115230.3,Solyc08g062340.3)。另一方面，在三个比较中发现了两个共同的基因，在至少两个比较中发现了四个共同的基因(表2)11)。

11个deg属于HSPs家族。其中,Solyc03g007890和Solyc08062960在两组的T2和T3温度下表达差异:在热敏基因型中过表达，在LA2661与TRVI0040的比较中LA2661过表达。Solyc06g059990，编码烷基转移酶，和Solyc08g005680LA2661与LA2660、LA2661与TRVI0040在T3中均有差异表达。此外，T3中，与TRVI0040相比，Solyc02g062390在TRBA160中过表达。

这些结果表明，在每一组中，对高温胁迫的共同反应与对热的不同反应结合在一起。所有基因型均诱导与热应激、热休克蛋白或热转录因子相关的基因。此外，随着热休克蛋白的激活，还发现了调节激素或酶(如脱落酸和转移酶)的基因的差异表达。

对来自不同遗传材料的大量番茄材料的耐热性进行了测试，以寻找耐高温遗传的来源。所选材料将为培育耐热品种和了解耐热机制的遗传控制提供宝贵的资源。在温室控制条件下的表型分析和露天大田试验相结合，可以观察选定基因型在广泛的热胁迫条件下的反应。

对219份材料的初步筛选表明，中等热胁迫(T2)对FLN的影响不显著，而高热胁迫(T3)对FLN的影响较大。先前的报道也表明，在中度热应激(白天32°C /晚上28°C)下，FLN略有下降[47，48]，支持我们的观测结果，而在极端高温(白天38°C /晚上28°C)下，FLN也出现了大幅下降[49]。因此，总的来说，除了相对少数的基因型外，番茄似乎能够在中度热胁迫下开花，而在极端热胁迫下却不能开花。

就FRN而言，在目前的研究中，中度和极端热应激都导致其减少，在测试的基因型之间存在重要差异。同样，先前的研究表明热应激对FRN的影响[22，25，44，48]。

热胁迫下FRS的降低是确定温室耐热性的常用指标之一[46，48，50，51]和露天试验[29，44]。高温对番茄FRS的负面影响及其与产量的相关性[j]。18]，证实FRS是可用于评估高温耐受性的主要判别因素之一。基于FLN和FRN的计算结果，FRS的计算可以更好地估计所分析材料的容差。因此，在材料的第一次筛选(FCCV_2016)中，在热胁迫下观察到较高的FRS变异性。此外，35%的基因型在高温下的FRS显著高于敏感对照“MoneyMaker”。表现较好的基因型属于现代品种，即现代品种和商品品种，FRS优良的品种分别占42%和68%。下一组对高温表现出良好反应的品种数量较多的是传统的“de penjar/da serbo”品种，与对照的“MoneyMaker”品种相比，其中33%的品种表现出改善。我们观察到对热胁迫的不同反应:随着温度的升高逐渐减少，只在极端温度下耐受，表明对环境条件的适应。适应是一种可逆的可塑性形式，是对环境变化的响应[52]。

增强的设计使我们能够筛选大量的种质资源，从而在大规模筛选和鉴别能力之间提供了潜在的良好平衡。为了评估它，候选耐热基因型在重复试验中进行评估，以确认其耐受性反应。因此，在重复试验(FCCV_2017和ENZA_2018实验)中，所选野生物种的耐热性具有统计学显著性。在FCCV_2017中，8个被试品种在T2表现出较高的FRS值，而75%(5个品种)的FRS值优于敏感对照‘MoneyMaker’(表1)3.)。以ENZA_2018实验为例，与FCCV_2016和FCCV_2017之前的实验结果相比，所分析的三种野生材料在T2和T3的FRS均较低(表1)4)。与其他温室试验相比，“蒙特雷”对照也显示出FRS的下降，这可能是由于不同的农艺管理方式，较长的热处理时间和最佳成熟阶段的收获，这也可能影响到选定的野生材料的FRS。然而，他们对热应激的反应与“蒙特雷”相似。热胁迫对果实成熟的负面影响，导致单性生殖或低品质果实的产生[47，53]在商业试验中被丢弃，可能导致最终的FRN，从而导致FRS的减少。已经有报道使用野生西红柿作为耐热性来源[18]，尽管这些复杂性状的多基因特性使得优良品系在引入育种计划后难以恢复其农艺优势[54]。

关于23美国lycopersicum从FCCV_2017实验中选择的材料中，16个在T2或T3或在重复试验中均表现出具有统计学意义的耐热性(FCCV_2017)。因此，70%的美国lycopersicum根据增强型设计实验选择的材料在重复试验中表现出耐热性。把两个美国lycopersicum与野生材料加在一起，77%的耐热性得到了验证。在ENZA_2018试验中评估的材料也显示出与对照“蒙特雷”相似的耐受性水平。缺乏验证可能是由于增强设计的假阳性，尽管也可能发现假阴性。然而，成功率可以被认为是很高的，支持使用增强设计进行大规模筛选耐热基因型。

对于UNINA和MVCRI提供的品种，基于田间耐热性，大多数UNINA材料在FCCV_2017试验中表现出一定程度的耐热性。另一方面，MVCRI品种中只有一个(BG ALIA)表现出耐热性。这些品种适应不同的气候区(地中海，中欧)。温室热应激条件可能与地中海天气非常相似，例如高温持续时间，这可以解释它们在FCCV_2017试验中的更好表现。事实上，对热应激反应的复杂性以及对这种非生物应激耐受性的多种因素的影响都有很好的记录[55]。

在田间试验中对耐热性的验证是评估其在育种计划中的价值的进一步步骤。这种验证在自然热胁迫条件下的重要性已经在番茄[29在温室中选择的大部分材料对露天田的高温也表现出良好的响应。此外，从温室受控条件下的试验到田间试验的转变包括其他环境变量的影响，包括光或水的消耗[56这可能是导致某些基因型对热应激反应不同的原因。

8个品种在温室和田间高温条件下均表现出较高的FRS美国lycopersicumvar。cerasiforme(BGV006071)，三现代F₁混合动力车(‘Durinta’、‘PaiPai’、‘TEMPTATION’)，以及四款意大利本土车型(E7、E8、E36和E37)。E76在温室和田间试验中均不表现耐热性。BG1923/15在田间耐热性较好，但在温室试验中无耐热性。如前所述，这种差异可能归因于对热应激条件的不同适应。虽然采用了完全不同的筛选策略，但在温室和田间试验中，相似的应力响应已经获得了这种高成功率[29前者依赖于基于叶绿素荧光特性的选择，而在当前的报告中，我们依赖于FRS和更大的种质筛选。然而，这两项工作都鼓励在受控条件下进行初步筛选，以选择具有高耐热潜力的基因型。

这8个品种耐热性的生理基础还有待进一步研究。番茄品种的耐热性与光合效率有关[j]。29，57]。研究了几种番茄品种E7、E8和E37在高温胁迫下的光合效率[j]。28]，但这些品种之间的光合效率参数没有明显的模式，这可能与它们的耐热性有关。花粉活力已被发现与高温下的果实结实密切相关[47，57，58]。在目前的实验中，授粉没有被监控，所以在一个品种有更高的生存能力的情况下，这个品种的花粉可能会授粉给其他品种，并且没有观察到对比的表型。在结实方面，其他被认为是耐热性组成部分的性状包括雌性的生育能力、不同代谢物(糖、脯氨酸转运体、多胺、类黄酮等)的积累、冠层温度的控制和膜稳定性[22]。鉴于目前报告中所调查的广泛的遗传基础，不同的机制可能涉及到观察到的耐热性。

目前研究的品种和材料根据实验条件(两个温室，两个大田)显示出差异，但总的来说，所选基因型能够在所有测试的生长条件下结果。作物对多环境试验反应的可塑性为更好地理解用于克服给定胁迫的机制提供了依据[59]。不同环境下的耐热性可能是由于对不利环境的代谢反应的可塑性[j]。60]，也可能是对多重压力的一般反应的一部分[61]，如在谷类等其他物种中所报道的[32，62，63]。在番茄中，最近的研究强调了气候变化情景下表型可塑性和基因型x环境相互作用的复杂遗传基础[34]。

8个品种在田间和温室均表现出耐热性，1个品种(BG1923/15)在田间表现出耐热性。此外，8个野生物种(BGV007109、LA0480、BGV007947、BGV008114、BGV007111、BGV008030、LA2147和LA2184)美国lycopersicumvar。cerasiformeBGV012641、4个传统品种(TRVA0030、TRVIO040、BGV007932、BGV004582)、1个F₁在重复温室试验中发现，杂交品种(‘Vento’)和一种现代自交系品种(‘BG ALIA’)具有耐热性。因此，共报道了24个不同来源的番茄基因型和对热胁迫的不同耐受性。因此，本报告至少在一定程度上填补了以往报告的空白，即只在有限数量的品种中进行耐热性筛选[16，44，46，64，65，66]。

此外，对两个不同群体(现代品种和“de penjar/ da serbo”品种)耐热性基因型的基因表达分析显示，在转录水平上对高温的响应存在差异。差异主要发生在果粒期(花后)，而子房样品(花前)在温度、番茄组和敏感或耐受基因型方面表现出相似的反应。其他作者已经报道了不同组织和发育阶段的差异[8，53，67，68，69]。然而，生殖阶段被描述为对高温更敏感，并影响男性和女性的器官[70]，尽管人们发现胚珠通常不如花粉对热敏感[71]。不幸的是，由于实验条件下高温处理对花药组织的破坏，我们实验中缺少花药样本，这对我们实验中转录组信息的可用性产生了负面影响。另一方面，在DEG分析中鉴定出的基因，在水果样品中，取决于温度和基因型敏感性，而不是卵巢，表明在我们的条件下，对热的反应发生在发育的后期。

为了更深入地了解对热胁迫的反应，通过根据组和温度比较每个基因型来解剖果实的deg。果实转录组学分析揭示了不同基因型对热胁迫的响应差异。植物对高温反应的复杂性及其可变性已经被报道[38]。对于我们的基因型，DEG分析显示，在果实发育早期，HSP基因的基因表达增加，特别是现代品种组的基因型。由于热休克蛋白的积累而控制热应激是对抗这种应激的一种常见机制[39]，在不同的植物物种中也有报道拟南芥［72，73，74]，大米[75]，小麦[76]或西红柿[77，78]。在本试验中进行的不同比较中富集的所有DEG中，有两个基因的共同反应Solyc03g007890(编码为HSP 90)和Solyc08g062960(编码热应激转录因子A-2)在两个番茄组的敏感基因型中均存在。这两个基因型在热胁迫下均过表达。然而，另一个同样编码热应激转录因子(a -9)的基因，Solyc07g040680,在热敏型现代品种LA2660和耐热型“de penjar/ da serbo”组TRVI0040中均有过表达。在不同的番茄群体中，对高温反应的共同基因数量很少，这表明需要对每个基因进行更深入的分析，以破译耐热性的机制。

除了热休克蛋白的主要响应外，其他机制也被诱导为植物对热胁迫的响应。激素，如ABA、转录因子或酶，基本上有助于对高温的反应机制[74，79]。在目前的实验中，我们也观察到与这些过程相关的清晰的DEG。现代品种的敏感基因型在响应中表现出HSP基因的表达增加，而在耐受基因型中，ABA激素和烷基转移酶基因的表达被高度诱导。关键的应激反应激素ABA在几种非生物胁迫的耐受性中所起的作用，以及其他转录因子，已被描述为诱导植物胁迫反应机制的关键[80]。另一方面，在“de penjar /da serbo”组中观察到的高温反应需要比HSP基因更大比例的酶、激素和转录因子编码基因的差异表达。在这些基因型中，作为热应激反应而过度表达的基因中，我们发现了编码丝氨酸/苏氨酸激酶等酶的基因[81];来自BZip家族的转录因子参与对高温和其他胁迫的反应拟南芥［82]和番茄[83];或编码过氧化物酶的基因，通常在热应激下被激活以对抗活性氧(ROS) [84]。

从本文提出的结果可以明显看出，番茄对热胁迫反应的复杂性取决于基因型和器官的发育阶段。耐受性基因型和敏感性基因型之间的差异反应主要发生在果实发育早期，在子房期差异很小或没有差异。敏感基因型之间对热应激的共同反应是编码热休克蛋白的基因过表达，而耐受基因型之间的反应涉及来自其他生物类别的基因。阐明各番茄类群耐热性的具体机制，可以为培育适应气候变化的耐热新品种提供有用的工具。

本研究筛选了大量来自不同番茄类型的材料，并验证了它们在不同环境下对热胁迫的反应，使我们能够确定强耐热性来源，并为育种计划提供广泛的遗传材料。在温室控制条件下，共鉴定出24个不同来源和不同耐热性的番茄基因型。另外，对8个基因型的耐热性进行了田间验证。因此，控制温室高温结实试验可作为高温胁迫下田间生产性能的预测指标。

此外，基因表达分析揭示了番茄对热胁迫响应的复杂性，这取决于基因型和器官的发育阶段，主要是在开花后水平对热的响应。敏感基因型和耐受基因型的主要差异反应出现在果实发育早期，敏感基因型反应中编码热休克蛋白的基因过表达，而耐受基因型反应中涉及不同生物学类别的基因过表达。

植物材料及实验

在不同的实验中研究了235个番茄基因型。这些基因型的起源非常不同:野生物种的加入(美国pimpinellifolium和美国cheesmaniae)、早期驯养动物(美国lycopersicumssp。cerasiforme)、传统品种、地方品种、现代品种和商品杂交种(补充表)1)。

植物材料由COMAV(瓦伦西亚农业多样性保护与改良研究所)提供。瓦伦西亚，西班牙)，EELM(实验站“La Mayora”-西班牙国家研究委员会。马拉加，西班牙)，TGRC(加州大学戴维斯分校番茄遗传资源中心)。美国加州)，TRADITOM(来自欧盟地平线2020项目TRADITOM的植物材料)，ENZA (ENZA ZADEN)。种子公司。阿尔梅里亚，西班牙)，MVCRI(马里察蔬菜作物研究所)。保加利亚普罗夫迪夫)，那不勒斯费德里科二世大学。Portici，意大利)和IBMCP(植物分子和细胞生物学研究所_西班牙国家研究委员会)。瓦伦西亚西班牙)。各机构对实验的贡献详见补充表1。作者声明，在本研究中进行的所有实验都符合机构、国家和国际准则和立法。

对上述基因型进行了6次不同组合实验(见图2)。1所有实验方案及补充表1有关每个试验中所包括的材料/品种的详细信息):

FCCV_2016

共分析了219个基因型:80个野生种(79茄属植物pimpinellifolium， 1美国cheesmaniae), 16美国lycopersicumvar。cerasiforme48个传统品种(其中36个分别属于来自西班牙和意大利的传统品种“de penjar”和“da serbo”，传统上在干燥和炎热条件下种植)和75个现代品种和商业杂交品种。还包括五个对照:西班牙传统品种“MoneyMaker”(TRVA2360)和现代杂交品种“Docet”、“Monterrey”和“JAG8810”。这些植株在滴灌施肥的惰性基质袋上，于春夏两季在卡哈玛经验中心(西班牙，Paiporta, FCCV)控制温度的温室内栽培。按照扩增设计将基因型与温室行相对应的6个区块进行分布，每个测试基因型为1个重复，“MoneyMaker”、“Monterrey”和TRVA2360为6个重复，“Docet”为4个重复，“JAG8810”为2个重复(由于植物材料的限制，重复数较低)。重复由在一个袋子中栽培的三株植物组成。植物在逐步升高的温度下生长，确保每个状态下的最低温度(T1: 25°C白天/20°C夜晚;T2:白天30℃/夜晚25℃;T3:白天35°C /夜间30°C)，如前所述[14]。每个温度状态设定为4周。

FCCV_2017

本试验对41个候选耐热材料和品种进行了研究。植物在FCCV设施中种植，遵循与之前FCCV_2016实验相同的农艺管理和温度制度。由于野生种和栽培种的物候特征不同，将温室划分为两个区。每个加入/栽培品种随机分配5个重复(在一个袋中种植3株植株)，对照‘MoneyMaker’和‘Monterrey’有8个重复。

ENZA_2018

该实验在Enza Zaden Centro de Investigación S.L. (Almería，西班牙)的设施中进行。选择14个耐热候选品种，在温室内逐步升温(T1: 30°C昼/18°C夜;T2:白天35℃/夜间25℃;T3:白天40°C /晚上28°C)在半控制温度条件下(即在整个温度方案中可以控制和维持最低温度，但根据外部气候条件，最高温度偶尔会更高)，每个温度方案持续五周。植株按照标准的商业农艺管理种植，即在试验期间不修剪果实，在完全成熟时收获。与FCCV实验一样，在每个温度条件下使用相同的植株，每次添加4个重复，对照“蒙特雷”。

MVCRI_2018

该试验在Maritsa蔬菜作物研究所(保加利亚普罗夫迪夫)的试验田进行。16个耐热候选品种采用完全随机设计，每个品种2个重复。以‘MoneyMaker’作为热敏对照，设2个重复。

UNINA_2018

采用随机设计，每次加入3个重复，每个重复3株植株，培养了11个耐热候选品种。这些植株生长在坎帕尼亚(意大利)地区的一块试验田，在那不勒斯费迪科二世大学的设施中，分别使用' MoneyMaker '和' Monterrey '作为热敏和耐热对照，每次加入3个重复，每个重复3株植株。

RNASeq_2019

2019年，选取对热胁迫有不同反应(TRBA0160和LA2660敏感，TRVI0040和LA2661耐受性)的2对同属园艺组的TRBA0160和TRVI0040(传统番茄' de penjar '或' da serbo ')、LA2661和LA2660(现代番茄品种)进行差异基因表达分析。培养管理与FCCV_2016和FCCV_2017实验相似，温度逐步升高(T1:白天25°C /晚上20°C;T2:白天30℃/夜晚25℃;T3:白天35°C /晚上30°C)。重复由三个植株在一个袋子中培养组成，每次增加三个重复。

表现型

FCCV_2016和FCCV_2017

在每个温度条件的第三周，记录第二和第三个桁架的花数。第4周对同一株果架的果实数进行记录。坐果比计算公式为:坐果比= 100*FRN/FLN。在每次温度变化之前，为了避免先前果实负荷对新花序的生理影响，从每株植株上修剪花和果实。通过将大黄蜂作为温室的外部传粉者来确保授粉。

ENZA_2018

在每个温度处理的第5周，记录相应温度下产生的所有桁架的花数(FLN)。桁架被贴上标签，以表明它们是在什么温度下生产的，并记录下每个温度下对应的FRN。根据标准的商业采收准则，在最佳成熟阶段采收水果。FRS的计算与之前一样。通过每周三次震动植物来促进授粉。MVCRI_2018:从第2个桁架到第5个桁架(桁架2、3、4和5)开始记录花的数量。每周记录白天和黑夜的温度，并为每个桁架分配平均温度。在最佳成熟期采收后记录果实数量。用收获的果实计算FRN和FRS。

UNINA_2018

番茄植株是按照当地的标准文化种植的。对第2 ~ 5个桁架上产生的花序进行FLN和FRN的评价。在最佳商业阶段采收后计算FRS。在整个生长季节测量温度。

RNASeq_2019

在每个温度处理下，按照前面FCVV实验的描述计算花和果的数量。分别于治疗第3周和第4周记录FLN和FRN。此外，取花前子房和发育中的果实(约1cm大小)进行RNA提取。

统计分析

在FCCV_2016实验中实现了增强设计。每个块的调整因子(R)用公式计算

B_j为block j中所有控件的值之和;c是对照组的数量，M是所有对照组的均值之和。使用校正因子重新计算各基因型的FLN、FRN和FRS值。

最小显著性差异(MSD)由对照方差差异(S)计算，公式如下:

其中CME为对照均方误差，b为块数，c为对照数。在MSD方程中，t对应于[(b-1)/(c-1)]自由度的t值。

根据这些方程调整对照组和基因型值，并根据调整值计算显著性阈值。

对所有实验计算基本统计量(均值、标准差、最大值、最小值)和Pearson相关。

在所有实验中，除FCCV_2016外，检测基因型的FRS均值与各自的对照组进行Dunnett检验p< 0.05。采用多均值比较Tukey检验对基因型进行排序p< 0.05。

采用双因素方差分析研究FCCV_2016对照品种的基因型、温度效应及其交互作用。同样，FCCV_2017和ENZA_2018中评估的常见基因型，基因型x环境相互作用也采用双向方差分析:

在Y_ijk为第i个基因型(G)在第j个环境(E)中的第k次复制值，GxE为相互作用值，E_ijk这个错误。

对于FCCV_2016, G_我对应4个对照品种和E_j对T1、T2和T3三种温度状态的影响。关于FCCV_2017和ENZA_2018, G_我与常见基因型和E_j不同的实验。

采用JMP 12.1.0软件进行统计分析[85]。

RNASeq_2019

选择T2和T3植株的花前(子房)和花后(钮扣期果实)两个不同发育阶段的器官组织进行RNASeq分析。每个样品使用NucleoSpin RNA II试剂盒(machery - nagel, Germany)进行RNA分离。RNA的量用NanoDrop™2000/2000c分光光度计(Thermo Scientific™，USA)测定。将总RNA浓度至少为50 ng/uL的三个独立样本(每个重复一个)送到Macrogen, Inc(大韩民国)进行RNA- seq分析。

转录组分析

从总RNA中，使用TruSeq搁浅技术(Ilumina, USA)生成mRNA文库。RNA测序采用NovaSeq平台，150 bp对端reads, 6 Gb/sample (Ilumina, USA)。LA2660、LA2661、TRVI0040、TRBA160在T2、LA2660、TRBA160在T2、LA2661、LA2660、TRVI0040、TRBA160在T3、LA2661、LA2660、TRVI0040、TRBA160的果实样品获得了RIN (RNA完整性数)> = 7.5的高质量RNA。这些样品分别为每个重复进行测序。对于其他实验样品，由于获得的RNA数量不足以测序，因此将其合并。因此，对T2发育果实样品LA2661与LA2660、T2 LA2661与T3 LA2661、T2 LA2660与T3 LA2660、T2 TRVI0040与TRBA160、T2 TRBA160与T3 TRBA160进行了重复对照。其余的比较是用合并样本的序列进行的。这些序列与SL 4.0番茄基因组进行比对。用htseq-count (https://htseq.readthedocs.io/en/release_0.11.1/count.html)。采用DESeq2 (http://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html)。结果显示为RPKM (Reads Per Kilobase Million)和LFC比率(log2倍变化)。鉴别差异表达基因的阈值设定为LFC≥|2|和p-value < 0.01。当一个基因在至少一个样本中获得RPKM大于零时，该基因被定义为表达。主成分分析使用ClustVis web工具(http://biit.cs.ut.ee/clustvis/)。

基因本体(GO)分类和差异表达基因的富集分析使用在线“基因本体资源”(http://geneontology.org/)。使用PANTHER分类系统(http://pantherdb.org/webservices/go/overrep.jsp)， FDR < 0.05，倍数富集> = 2。

在本研究中生成和/或分析的数据集可在Sequence Read Archive (SRA)存储库中获得，登录号为PRJNA678620， (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA678620)。LA2660、LA2661、TRVI0040和TRBA160在T2和T3两个温度下的32个子房和果实样本被上传至库中。本研究过程中产生或分析的所有数据均包含在本文及其补充表格和图表中。

我们感谢Soledad Casal、Sara Gimeno、Clara Pons、Mar Garcia和所有FCCV员工的技术支持。SG得到了欧盟和西班牙经济与竞争力部“青年就业倡议”项目的支持。IBMCP生物信息学服务中心的Javier Forment为RNA-Seq分析提供支持。番茄遗传资源中心(TGRC)和巴伦西亚农业多样性保护与改良研究所(COMAV)。

这项工作由欧盟委员会H2020研究与创新计划通过TomGEM项目(资助协议号679796)和HARNESSTOM(资助协议号101000716)支持。

从属关系

1. Biología植物分子细胞研究所，瓦伦西亚政治大学-高等调查委员会Científicas，福斯托·埃利奥工程师学院，46022，西班牙瓦伦西亚

   María约瑟夫·贡萨洛，安东尼奥·格兰内尔和安东尼奥·约瑟夫·蒙福特

2. 西班牙，瓦伦西亚，卡哈玛体验中心

   Inmaculada Nájera和Carlos Baixauli

3. Enza Zaden Centro de Investigación S.L, Almería，西班牙

   大卫·吉尔，特蕾莎·蒙托罗和维姬·索里亚诺

4. 意大利那不勒斯费德里科二世大学农业科学系

   Fabrizio Olivieri, Maria Manuela Rigano和Amalia Barone

5. 保加利亚普罗夫迪夫Maritsa蔬菜作物研究所

   Daniela Ganeva, Stanislava Grozeva-Tileva & Galina Pevicharova

贡献

MJG进行实验，分析数据并撰写稿件，AG和AJM设计研究并撰写稿件。IN, CB在FCCV上进行了实验。DG (David Gil)、TM、VS对ENZA进行了实验。FO, MMR, AB在UNINA进行了实验。DG (Daniela Ganeva)、SG-T、GP在MCVRI进行了实验。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到安东尼奥·约瑟夫·蒙福特。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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