土壤上施用甜菜碱丛枝菌根真菌通过抑制三种不同基因的高粱(高粱双色l .)品种

背景

铬是对植物代谢活性和产量影响最大的有毒污染物。它通过影响抗氧化防御系统的活性来降低植物的生长。以3个高粱品种为试验材料，采用3株/罐3个重复的完全随机区组设计试验即．SSG 59-3、HJ 513(多切)和HJ 541(单切)通过在土壤中添加和不添加AMF的GB(50和100 mM)外源施用来改善铬毒性(2和4 ppm)。在两个生育阶段对其改良效果进行了试验即．植物（35 das）和谷物填充（95 das），就Cr吸收，籽粒产量，抗氧化防御系统参数（即．酶- SOD、APX、CAT、GR、POX和代谢物-脯氨酸、谷胱甘肽、抗坏血酸、β-胡萝卜素)和氧化应激指标．PPO, H₂O₂和mda）。

结果

结果表明，所有品种(hj541、HJ513和SSG 59-3)在两个生长期(35和95 DAS)的Cr吸收和氧化胁迫指标均随Cr胁迫浓度的增加而增加。在较高浓度(4 ppm) Cr胁迫下，籽粒产量较对照下降45-50%。多酚氧化酶活性、MDA和H₂O₂所有品种的增长阶段都有含量增加。然而，抗氧化酶和代谢物活性由于Cr应激而增加，但这种增加不足以抵消Cr应激根据Cr应激产生的ROS抵消，这些ROS在单独或组合（在土壤中掺入）amf和gb的应用。它降低了氧化应激的索引，并改善了CR毒性，并在所有品种中增加了籽粒产量（65-70％）。

结论

GB和AMF均提高了植物的抗氧化活性和抗逆性。在50和100 mM浓度下，甘氨酸甜菜碱显著改善了Cr毒性。然而，AMF与GB的结合进一步增强了所有品种在两个生育阶段对Cr毒性的改善行为。100 mM GB与10 g AMF的组合效果最好。品种中，SSG 59-3的铬摄入量最低，氧化应激指数最低，抗氧化系统活性最高，其次是HJ 513。因此，AMF和GB可单独或联合用于维持Cr毒害下的植物产量性状。

高粱作物(高粱双色（L.）Moench]家庭成员禾本科印度的高粱种植面积仅次于美国，居世界第二。它是一种重要的旱季谷类作物，仅次于水稻、小麦、玉米和大麦[1]．高粱是一种C4植物，在将太阳能转化为化学能力方面是高效的，而且还在水使用效率[2]．它直接或间接用于人类或动物的营养[3.]．所有这些特征都使得在全球范围内进行高粱实验，以满足越来越多的粮食需求。

如今，农业土壤中铬污染日增已成为全球关注的问题。Cr (VI)的主要来源是皮革和油漆工业。每年,大约。仅印度制革工业向环境中释放了2000至32000吨铬[4]．铬通常与氧化盐的氧合有关（CRO₄²⁻）或二聚菌素（Cr₂O₇²⁻）在土壤和水生环境中有机质[5]．它以两种稳定的形式存在即．三价Cr（iii）和六价Cr（vi）。两种形式的CR可以在通过氧化/还原，沉淀/溶解和吸附/解吸调节的动态平衡中互换和共存。两种形式可能导致植物毒性，但由于其高溶解度和更不稳定的性质，Cr（VI）被认为是最具毒性的CR形式[6]．水中的Cr允许剂量的Cr设置为8μgL⁻¹为Cr (III)和1µg L⁻¹对于Cr（vi）。这些数据建议在本实验中提供高达4ppm的范围内的六价CR应力。

铬（VI）充当强氧化剂，具有较高的氧化还原电位在1.33-1.38eV之间，导致快速的活性氧物质（ROS）生成，在植物中产生毒性作用[7]．植物铬胁迫的特征是光合作用下降，养分吸收减少，根系受损，最终导致植物死亡[8，9]．一些成熟良好的植物毒性表现包括替代酶辅因子和转录因子，抑制抗氧化酶，细胞氧化还原性失衡，离子传输不平衡，DNA损伤和蛋白质氧化[10.，11.]．

植物具有几种抗氧化剂防御系统，以保护它们的细胞免受这些应力，并且一种这样的系统是各种小有机代谢物的积累，其共同称为相容的溶质[12.]．它们充当渗透剂，保护植物细胞免受由ROS引起的渗透损坏。相容的溶质包括糖，多元醇，甘氨酸甜菜碱（GB），氨基酸（脯氨酸，组氨酸）和相关化合物[13.]．据报道，在遭受非生物胁迫的植物中，GB水平升高[14.，15.]．它用作抑制ROS的生产的渗透剂。它通过升高脯氨酸和抗氧化酶，如过氧化氢酶（猫），过氧化物酶（POX）和超氧化物歧化酶（SOD）来抵消植物中的氧化应激。这是一个非常有效的osmoregulatical物质[16.]．

甜菜碱是一种季铵盐化合物，广泛存在于植物、哺乳动物等中。17.]．它的水平在不同的植物种类之间有很大的差异。许多植物在正常或胁迫条件下都不积累GB。在一些植物中，GB的自然积累不足以保护它们免受非生物胁迫。在这种情况下，外源性施用GB可能有助于减轻各种环境应激的不利影响[18.]．它是环保，无毒，水溶性[19.]并且有很强的证据表明，GB在植物中发挥着重要作用，以抗非生物应激[20.]．此外,丛枝菌根真菌（AMF）被认为是生物制剂，其潜在地增加植物对重金属毒性的耐受性[21.]．Karagiannidis和Hadjisavva-Zinoviadi [22.]表明，AMF可以通过降低作物中铬含量的同时提高产量。然而，目前还没有报道使用GB和AMF联合剂量改善高粱六价铬毒性的报道。

因此，本实验选择GB和AMF作为改良剂，浓度(50和100 mM)是根据前人GB在植物中改良重金属毒性的研究结果确定的[23.]．在这项研究中，我们测试了关于GB和AMF的组合是否改善了CR毒性作用并提高高粱的产量。在抗氧化防御系统参数上升和氧化应激参数下降方面进行了对CR毒性改善的观察。我们的研究结果可能描绘了防止高粱Cr毒性的潜在方法。

对3个高粱品种进行了调查即．HJ 541(单切)、HJ 513和SSG 59-3(多切)测定了GB(50和100 mM)、单独施用和与AMF (10 g)联合施用对播种时土壤喷施Cr (VI)毒性(2和4 ppm)的影响。除籽粒重在成熟期分析外，其余数据均在35和95 DAS采集。记录了铬的积累情况;抗氧化防御系统酶，如SOD, APX, CAT, GR, POX和代谢物即．谷胱甘肽，脯氨酸，抗坏血酸，β-胡萝卜素;氧化应激参数的指标即．H₂O₂，MDA，PPO;和籽粒产量。研究并分析了GB和AMF对CR应力期间不同生理和生化参数的影响。

高粱植株不同部位Cr含量的变化

在高粱（HJ541，HJ 513和SSG 59-3）的两种不同的生长阶段（35至95das），在两种不同的生长阶段（35至95das）中测定根，茎和叶子的铬含量（图。1)．所有这些部件的铬含量随着Cr压力的增加而增加，在两种生长阶段的所有品种中都会增加。在所有品种中，这些部件中的铬含量随着植物年龄（35至95das）的植物年龄（35至95das）显着增加。在所有品种的生长阶段的所有零件中，在4ppm Cr应激中观察到Cr含量的最大增加。在4ppm Cr应激的根中，在95 das阶段（37.54ppm）期间，在茎（18.30ppm）和叶子（13.67ppm）中，在4ppm cr应激中以4ppm cr应激观察到最高的Cr含量。然而，在两种生长阶段的所有品种中，GB和AMF的外源性或组合，单独或组合，在所有植物零件中减少Cr含量。在在Cr应力（2和4ppm）的所有品种的生长阶段，在提供100mm GB和AMF的组合的植物中，在提供的植物中，在植物中观察到根，茎和叶片的Cr含量的最大降低。在4ppm Cr应激，根部，茎和叶子的Cr含量高达29.48,14.39和10.09ppm，含有100mm GB和AMF组合施用在95 das生长阶段。在这些品种中，HJ 541种类显示出最高的Cr含量（42.88,20.20,14.59ppm，分别为根茎茎和叶子），然后是HJ 513（37.56,18.29,14.32ppm分别在根茎茎和叶中）和最低的SSG中最低59-3种类（32.18,16.41,12.11 ppm分别为根茎茎和叶子）。

GB和AMF处理对铬中毒高粱抗氧化系统的影响

用多酚氧化酶(PPO)活性、过氧化氢(H₂O₂）和丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶和代谢物。PPO导致酚类化合物的氧化和增加的氧化应激。在所有品种中，植物年龄（35 das至95 das）增加了氧化胁迫的索引增加了Cr压力的水平（2＆4ppm）。观察GB和AMF对膜和氧化应激的生化质量的影响，响应CR应激，PPO活性和H的含量₂O₂检查MDA（图。2)．PPO活性增加，H₂O₂在所有品种中，在Cr压力下，在Cr压力下观察到MDA含量。但是，GB和AMF单独及其组合申请下降了PPO活动，H₂O₂各品种在两个生育阶段的MDA含量均与单独Cr处理相比。当Cr浓度为4ppm时，这些性状的增强最大。在这个水平下，H₂O₂MDA含量分别增加36.18,38.12和38.92％，而无需GB和AMF，与100mm GB的植物相结合在35 das生长阶段。在所有品种的95 das生长阶段的植物分析中观察到类似的趋势（图。2)．其中，HJ 541的PPO为29.27单位，H为68.80µmol, H为2.80µmol₂O₂和MDA分别），其次是HJ 513（19.73单位PPO，47.89和2.25μmolH₂O₂以PPO为13.15单位，H为37.16µmol, MDA为2.08µmol₂O₂和MDA)。GB和AMF处理均显著降低了各生育期的氧化胁迫指标。与其他处理相比，GB和AMF组合处理在两个时期内的各项指标均最低。其中，100mm GB的AMF处理降低氧化应激指标效果最好。

Cr胁迫增加了所有品种在生育两个阶段的抗氧化酶SOD、APX、CAT、GR和POX的活性。3.)．随着Cr压力的水平增加，抗氧化酶活性增加;它在4ppm的Cr压力下最大，并且之后增加增加，因为这种增加不足以保护植物免受由六价Cr的毒性引起的氧化损伤。单独的GB和AMF或其组合应用进一步增强了对照中这些酶的活性以及在两种生长阶段的所有品种中的CR强调植物中。在组合在100mm GB和AMF的植物中观察到这些抗氧化酶的活性的最大增加，在所有品种中的生长阶段。然而，在所有品种中，这些酶的活动随着植物年龄（35 das至95das）的植物年龄（35 das至95das）减少。在4 ppm的CR压力SOD，APX，CAT，GR和POX活动中分别增加到87.19,56.28,75.38,85.35和85.50％，而无需GB和AMF，而组合100 mm GB和AMF，则这些增加与35 DAS阶段相比，分别与对照相比，分别为92.92,68.9​​9,83.66,90.80和90.63％。在所有品种的95 das阶段获得类似的结果，用于酶活性的所有品种。在这些品种中，SSG 59-3品种显示出这些抗氧化酶的最高活性，其次是HJ 513和HJ 541种类中最低（图。3.)．

抗氧化防御系统包括酶促和非酶促抗氧化剂组分。除了酶促，非酶促抗氧化剂如谷胱甘肽（GSH和GSSG），抗坏血酸（ASA），脯氨酸和β-胡萝卜素对植物防御抗氧化应激是至关重要的。它们作为抗氧化缓冲液发挥关键作用。谷胱甘肽还原酶负责维持谷胱甘肽的供应。它是大多数细胞中最丰富的减少硫醇之一。GSH在ROS的蜂窝控制中发挥着关键作用。APX的主要作用在植物细胞中排毒过氧化氢通过，抗坏血酸 - 谷胱甘肽循环，其中，抗坏血物用作催化H的转化酶的APX酶的特定电子给体₂O₂在H₂O。

为了确定GB和AMF对高粱中六价Cr的改进作用，还分析了非酶促抗氧化组分。研究了非酶促抗氧化剂组分，即总谷胱甘肽，降低的谷胱甘肽（GSH），氧化谷胱甘肽（GSSG），抗坏血酸，脯氨酸和β-胡萝卜素。其中，除β-胡萝卜素外，所有其他代谢产物在所有品种中，所有其他代谢产物都随着增长阶段的CR应激浓度的浓度增加而增加（图。4和5)．β-胡萝卜素含量均随Cr (VI)浓度的增加而显著降低。5)．观察到的所有其他性质与其他抗氧化代谢物含量类似。除了β-胡萝卜素外，除了GSSG之外，在所有品种的生长阶段，观察到这些代谢物的外源施加，观察到这些代谢物的含量的进一步增加。相反，GSSG含量在所有品种的生长阶段单独或组合地减少GB和AMF申请（图。4)．

GSH，ASA，脯氨酸和β-胡萝卜素含量的最大增加（88.93,87.50,64.04,30.04，分别为90.99,60.48,62.68,20.85％，在95 das，提供的植物中，在提供100毫米的组合GB和AMF，而GSSG的含量分别在相同的治疗中最大程度地（分别为35和95das，分别为35和95das）。所有这些代谢物的水平随植物年龄的植物年龄在两种水平的CR（VI）中，但GSSG在所有品种中增加了（图。4)．品种间GSH、AsA和β-胡萝卜素含量以SSG 59-3最高，HJ 513次之，HJ 541最低，而SSG 59-3的GSH、AsA和β-胡萝卜素含量则相反。这些发现说明了GB和AMF在Cr胁迫条件下调节细胞膜稳定性和细胞中ROS的生成方面的作用。

GB和AMF治疗在铬毒性下高粱籽粒产量（100颗粒重量）的影响

在两个生育阶段，各品种的籽粒产量均随Cr (VI)浓度的增加而逐渐下降(图1)。6)．外源GB和AMF单独或组合施用均能提高各生育期的籽粒产量。100 mM GB和AMF组合的植株在两个生育阶段均增长最大。

结果表明，各品种的百粒重均随Cr (VI)浓度的增加而显著降低。而添加和不添加AMF的GB处理均显著提高了各品种的百粒重。最大增加观察与治疗的100毫米GB AMF(2.83, 2.33和2.03 g控制,2 ppm Cr & 4 ppm Cr,分别),其次是仅100毫米GB(2.55, 2.19和1.84 g控制,2 ppm Cr & 4 ppm Cr,分别),50 mM GB连同AMF(1.76, 1.29和1.18 g控制,2 ppm Cr & 4 ppm Cr,分别),只GB 50毫米(1.47,对照为1.27和1.11 g, Cr分别为2ppm和4ppm Cr)和AMF(对照为1.06,0.86和0.61 g, Cr分别为2ppm和4ppm Cr)。SSG 59-3产量最高(1.83 g)，其次是HJ 513和HJ 541。HJ 541籽粒产量最低，为1.19 g。

在世界范围内，耕地铬中毒已成为一个严重的问题[24.]．它降低了高粱作物的生长和产量[25.]．有许多关于Cr（VI）毒性的报道，导致植物中的危险作用。但是，通过使用GB和AMF在一起的铬毒性改善的报道是文献中的很少。在这项研究中，在高粱中研究了外源施用的GB和AMF（单独和组合）对抗氧化防御系统进行毒性的改进效果。在本研究期间，增加CR治疗水平导致高粱中的Cr含量增加。似乎仅在施加2和4 ppm的Cr后，根部，茎和叶片中的Cr含量增加了许多折叠，即超过4ppm的最高治疗。与土壤重量相比，这背后的原因可能是干高粱植物的较低重量（5公斤锅⁻¹）因为当在重量方面表达时，有关培养基的重量的物质变化的浓度。随着介质的重量减少，它会增加。早先报道类似的报告[26.，27.]．根中Cr含量较高，其次是茎和叶，这表明高粱植株可能具有丰富的抗Cr胁迫能力，另一位研究者在鹰嘴豆中报道[28.]．植物样品的Cr含量的降低可能是由于GB和AMF，单独或组合维持细胞膜完整性并保护细胞免受损伤的损伤，这反过来限制Cr进入细胞。GB应用植物的Cr吸收的减少也可能是由于GB朝向细胞膜的屏蔽性，从而降低了细胞的铬运动[29.，30.]．绿豆中铅和镉的含量也有类似的结果[31.)、大米(32.和小麦[33.]．

karagiannidis和hadjisavva [22.[据报道，AMF接种增加营养吸收并抑制DurAM小麦中的Cr，Mn，Fe，Co，Ni和Pb吸收。它提出了减少CR吸收的其他可能性，AMF和GB应用可能是营养素和CR进入细胞之间的竞争。关于重金属抗性微生物的许多报道表明，AMF的特殊能力促进了压力条件下宿主植物的生长[24.，34.]．此外，AMF也被认为是一种潜在的提高宿主植物对重金属胁迫耐受能力的生物制剂。

注意到CR增强了ROS这样的原因₂O₂又增加MDA水平和PPO活性的羟基化合物。据报道，Cr对于植物来说是非必需的，并且通过导致降低分子氧和产生称为RO的中间产物，如超氧化物自由基，羟基自由基和H产生毒性应力₂O₂．有趣的是，ROS的产生是任何植物细胞在应对逆境时所表现出的第一道防御反应。它们进一步诱导其他生物分子(代谢物)的合成和作为防御机制的各种途径的酶的激活。这些化合物的含量代表着应激的程度，被称为氧化应激的指标。膜脂类和膜蛋白更容易受到ROS的攻击，是植物氧化应激的可靠指标。

在本研究中，随着Cr治疗水平的增加而增加，抗氧化酶和代谢物（图。3.，4和5)．但这种增加的不足以清除Cr压力下产生的ROS，因为从增加的增加₂O₂此外，外源AMF和GB单独或联合施用均增强了高粱相同Cr处理下的抗氧化酶和代谢产物活性，并减轻了铬诱导的毒性₂O₂，GB和AMF应用的MDA和PPO活动（图。2)．GB和AMF促进抗氧化剂活动的促进作用的原因可能是抑制CR吸收和增加的营养吸收，如吉安研究所研究的等．［35.铬中毒对绿豆的影响。此外，GB本身作为兼容溶质，AMF有助于它们的积累，作为渗透保护剂，并通过提高抗氧化酶和代谢产物的水平来抵消氧化应激[36.]．Hisyam等．［37.]也有报道称，外源GB的施用可以增加水稻植株的抗氧化系统活性，以抵消水分缺乏引起的胁迫。王等．［38.]也有类似的观点，即GB作为渗透保护剂，反过来保护植物细胞免受渗透胁迫，从而在小麦GB积累过程中导致PPO活性降低。拉扎。等．［39.)和吉尔等．［7在CR毒性下，还有关于小麦和芸苔的外源GB应用的类似报道。这些报告支持本调查的调查结果。

在本实验中，我们注意到施用Cr造成的籽粒产量损失，这可能是由于对植物有毒的ROS的过量产生，并导致细胞成分的氧化损伤，从而导致生长和产量损失，Khaliq报道过等．［40他研究了镉毒害对杜兰小麦的影响。另一个原因可能是PPO活性的增加，这会导致多酚的氧化，从而降低植物在胁迫条件下的生长机会和产量[41.，42.]．除了H₂O₂也是一种非常有毒的化合物和较高的含量，它通过植物细胞中的脂质过氧化产生损伤，植物细胞又增加了植物中的MDA含量，这也可能成为压力条件期间产量降低的原因[43.，44.]．CR毒性下的籽粒产量的降低也可能是由于植物中的CR胁迫增加增加的CR吸收，导致损坏根，萎黄，坏死，矿物营养丧失和水平丧失，最终导致了降低的产量植物也建议阿里等．［45.]在大麦，鳃等．［46.]在Cr毒性和Kanwal下的油菜品种中等．［47.]在小麦下在铅毒性下。在Cr（VI）毒性下的产量降低也在文献中被广泛报道[23.，47.，48.，49.]．

本研究结果表明，GB和AMF施用的增加或组合均可增加（图。6)．这可能是由于施用GB和AMF降低了对Cr的吸收，从而通过维持适当的气孔导度、叶绿体超微结构、RuBisCo活性、光合能力和适当的养分吸收降低了胁迫水平[50.]．甘氨酸甜菜碱增加了抗氧化系统的活性，这反过来防止了由于可能导致谷物产量增强的压力条件产生的ROS引起的氧化损伤的植物[51.，52.，53.，54.]．哈桑等．［55.如在本研究期间观察到的，在CD毒性下显示了对向日葵的AMF接种的类似效果。同样，GB应用增加了CD毒性下水稻植物的生长和产量[33.]．Bharwana等．［56.]也得到了类似的结果，即叶面施用GB提高了铅毒性下生长的棉花产量。然而，GB和AMF对植物生长和产量的促进作用机制尚不清楚。在本试验中，品种SSG 59-3的籽粒产量最高，与hj513和hj541相比(图1)。6)．这可能归因于最高水平的抗氧化酶和代谢物活性(Figs。3.，4和5)， Cr积累水平和氧化应激指标均最低(图5。1和2)， hj513次之，hj541最低。

总而言之，我们的研究结果显示Cr强调显着降低了籽粒产量，抗氧化酶和代谢物活动。由于Cr毒性，氧化应激参数的指标是显性的。然而，GB和AMF的外源性施加在单独和组合中，通过改善Cr应力下的抗氧化酶和代谢物活性，通过改善抗氧化酶和代谢物活性来显着增强谷物产量并降低氧化应激参数的索引。GB和AMF应用还降低了CR积累和运输。在CR压力下，GB和AMF组合的机制没有任何报告。因此，在现场等级需要进一步的研究，以便在重金属应力下看到GB和AMF组合的作用及其对各种植物物种的作用。

高粱植物中的CR毒性（2和4ppm）导致营养和谷物灌装阶段的所有品种中的ROS水平增加。随着CR浓度的增加，有害效果增加。这可能是由于CR吸收增加，这导致氧化应激的索引增加。虽然，抗氧化防御系统的组分在CR毒性下增加，但对抗毒性应激是不足的。正如植物的高水平氧化应激参数索引所揭示的那样。然而，Gb和AMF的外源性施加改善了由于抗氧化剂防御系统的酶和代谢物的进一步增加而改善了应力耐受性，这反过来减少了氧化应激的指标。在土壤中施用50和100mm水平的GB的治疗，显着改善了CR毒性。然而，AMF（10g）伴随着GB，在50和100毫米水平，进一步改善了CR毒性在两种生长阶段的高粱植物中的影响（35＆95 das）。但是，在增长阶段，GB的AMF应用在100毫米水平上发现了更有益，并且观察到所有治疗中的最有效和最佳浓度，用于高粱植物中的Cr毒性的改善。然而，发现抗氧化效应在35 das比95 DAS上更加突出。 Based on results obtained in the present investigation, variety SSG 59–3 was observed to be more tolerant to Cr toxicity followed by HJ 513 and HJ 541. Further studies in field conditions are necessary to confirm the mechanisms and findings of this experiment.

植物材料选择

本研究是在生物化学系的筛选之家，基本科学和人文学院，Chaudhary Charan Singh Huryana农业大学，哈里亚纳（印度）。三种高粱（高粱双色l .)即．HJ-541，HJ 513和SSG 59-3从大学的牧草部分采购。这些品种被选中，因为它们是夏季旱地中唯一的牧草来源，它们在哈里亚纳地区广泛种植。此外，SSG 59-3比HJ 513（多切割）品种和HJ 541（单切割）品种更甜。此外，HJ 541适用于晶粒和饲料产量，而HJ 513更适合籽粒产率。然而，在Cr（VI）毒性下，没有关于这三种品种的敏感性的报道。

实验细节和作物的提高

高粱三个品种在两个生育阶段即．采用完全随机区组设计，分别在土壤营养期(35个)和籽粒灌浆期(95个)试验了外源GB(50和100 mM)和AMF对土壤铬毒性(2和4 ppm)的改善作用。选择大小均匀的种子，用0.01%氯化汞(HgCl)进行表面消毒₂)浸泡10分钟，然后用蒸馏水冲洗5次。这些植物生长在土盆里，内衬聚乙烯袋，袋子里装满5公斤沙壤土，酸性(5% HCL)冲洗过的土壤。消毒后的种子在2厘米深的花盆中播种。两周大的同样大小的幼苗被转移到另一个装有5公斤土壤的花盆里。土壤性质见表1．将单独的罐用于对照植物。为每种治疗和控制维持三种复制。根据推荐的实践（POP），用相等的水和营养溶液灌溉所有罐。

化学品和试剂

在这项研究工作中使用的化学药品和试剂具有很高的分析品位。所有化学品均采购自美国Sigma化学公司、思科研究实验室(SRL)、Hi-Media和E.默克有限公司。

处理和生长条件

在本研究期间，基于先前实验中的程序提供了治疗方法[7]．在表格中给出了该实验中使用的治疗的详细组成2．

铬压力治疗

重铬酸钾(K₂Cr₂O₇.7H₂O)从Sigma有限公司采购，与蒸馏水一起使用，制成两种不同水平的Cr胁迫溶液(2 ppm和4 ppm)。两种不同浓度的Cr胁迫溶液分别处理1l后，每个盆栽的土壤在种植一株幼苗后。在7天的时间间隔内，通过在不同的锅中提供不同的Cr溶液来维持各自的应激水平。

甘氨酸甜菜碱治疗

用蒸馏水制备外源GB（50和100mm）茎溶液，并在幼苗种植后，在各个盆的土壤中供应1升。通过在一周间隔内将相应的GB溶液供应在各个盆中来维持各自的GB的浓度水平。

丛枝菌根真菌（AMF）治疗

AMF是在育苗前在土壤中外源供应的。AMF的处理方法是每盆土壤中加入10 g含AMF的培养基。一般情况下，AMF可以在土壤的潮湿介质中自行生长，随着时间的推移，其含量可能会增加。因此，在盆栽育苗时只施用一次。

植物取样与分析

从对照和每种处理的植物样品在35和95das处收集。将完整的植物收集在冰冷的热箱中。它进一步分为叶，射击和根。新鲜叶用于估计抗氧化酶，代谢物和氧化应激参数的索引。拍摄样品被手动均化并立即用于估计酶活性。在70℃下在烘箱中在烘箱中干燥叶，茎和根样品，然后分别估计Cr内容物。通过使用SPSS软件中的三个阶段分析，SPSS软件中的ANOVA，CRBD设计进行了分析了数据。重大 （p≤0.05)处理间差异采用临界差值法确定。

土壤性质的测定

分析土壤以进行质地，pH，电导率，有机碳，N，P，K，Fe，Mn，Cu，Zn和Cr（表2)．纹理由国际移液管方法确定[57.]．用玻璃电极测量土壤的pH值，用1:2的土壤悬浮液(土壤:水)和上清液的电导率，见[58.]．有机碳通过伴随着的湿氧化方法和黑色测定[59.]．通过碱性高锰酸盐法测定可用的氮气（n）[60.[可以通过使用0.5M NaHCO提取土样品来确定可用的P含量_3.并用分光光度计分析[61.]通过使用中性正常乙酸铵提取可用的钾，通过吸入萃取液中的含量来确定含量[58.]．DTPA在pH7.3下通过DTPA提取可用的Fe，Mn，Cu，Zn和Cr，并使用原子吸收光谱仪测定[62.]．

铬含量的测定

通过使用原子吸收光谱技术在植物组织（叶，茎和根）样品中估计铬含量[62.]．五百毫克组织样本连同20毫升消化混合物(硝酸和高氯酸在4:1比例,分别)消化一夜之间在100毫升锥形烧瓶在室温下,随后在一个电加热器加热,直到少量和无色的混合物(2 - 3毫升)的瓶。冷却后，用蒸馏水使总体积达到25毫升。用0 - 6 mg L重铬酸钾形式的铬(VI)标准进行校准，测定了该消化混合物中的铬含量⁻¹并通过原子吸收光谱(AAS)与样品进行比较。结果以ppm表示。

酶促抗氧化剂的测定

采用酶促抗氧化剂对高粱营养期和籽粒灌浆期的各项指标进行了研究。

提取酶抗氧化剂估计的制剂

完整的提取程序在4以下进行⁰C.使用事先冷却过的研钵和研棒，将2克新鲜清洁过的叶片组织加入10毫升0.1 M磷酸钾缓冲液(pH-7.0)中均质。10000 rpm离心15 min，收集上清作为粗提物，冰箱保存，以估计总可溶性蛋白。同时用于酶活性测定。

超氧化物歧化酶（SOD）

通过测量其抑制Beauchamp和Fridovich方法的抑制硝基蓝四唑（NBT）的光化学还原的能力来测定超氧化物歧化酶[63.]．3.0mL反应混合物含有2.5ml 60mM Tris-HCl（pH7.8），0.1ml 420 mm L-蛋氨酸，1.80mm NBT，90μm核黄素，3.0mM EDTA和酶提取物。结束时加入核黄素。将管正确摇动并放置在由三个20个W-荧光灯（菲利普斯，印度）组成的光源下方30厘米。通过在光线上开启光并通过切断光而在40分钟后终止反应。在终止反应后，用黑布覆盖管以保护它们免受光线。保持非照射的反应混合物，不产生任何颜色并用作对照。每个样品分别制备空白，同时取煮熟的酶提取物。没有酶提取物的反应混合物均产生最大颜色，并且通过加入酶降低其吸光度。使用抑制量来量化酶。 The absorbance was recorded at 560 nm. The volume of enzyme extract used in 50% inhibition of the photochemical reaction was considered as one enzyme unit. One enzyme unit was the amount of enzyme required to inhibit the photo-reduction of one µmole of NBT. The enzyme activity was expressed in terms of unit g⁻¹鲜重，被转化为单位mg⁻¹通过估计样品中的总可溶性蛋白质来蛋白质。通过占ASADA的公式计算百分之规的抑制等．［64.]．

在哪里。

V =无超氧化物歧化酶(SOD)时测定反应速率。

v =在超氧化物歧化酶存在下的测定反应速率。

抗坏血酸过氧化酶活性(APX)

通过Nakano和Asada的方法测定抗坏血酸过氧化物酶[65.]．三毫升反应混合物含有2.7ml 100mM磷酸钾缓冲液（pH7.0），0.1ml L-抗坏血酸和0.15ml H.₂O₂．通过加入50μL酶提取物引发反应。将吸光度降低在分光光度法的290nm以290nm记录2分钟，抵抗合适的坯料。每个样品分别制备空白，同时取煮熟的酶提取物。计算酶活性，使用2.8mm的摩尔消光系数（吸光度）的摩尔消光系数（吸光度）⁻¹厘米⁻¹对于抗坏血酸的吸光度标准方程。一个酶单位相当于氧化一nmol抗坏血酸每分钟所需的酶量⁻¹．

吸光度的标准方程一个=ε×Ɩ×C。

在哪里一个是在给定波长的样品吸收的光量，ε摩尔消光系数是，Ɩ光通过解的距离是多少c是吸收物质的浓度。

过氧化氢酶活性(CAT)

该酶的活性是用辛哈[66.]．反应液为0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.0) 0.55 ml, 0.2 M过氧化氢0.4 ml，酶提取液50µl。充分混合，室温孵育1 min，加入3.0 ml重铬酸盐试剂。另一个反应作为对照，由0.6 ml磷酸钾缓冲液和0.4 ml过氧化氢(0.2 M)组成，不含酶提取物。在沸水浴中保存10分钟。冷却后，使用含煮沸酶提取物的合适空白试剂，在570 nm处记录吸光度。将样品的吸光度减去对照的吸光度，用标准曲线计算出过氧化氢的量。一种酶单位相当于分解一µ摩尔过氧化氢min所需的酶量⁻¹或mg⁻¹蛋白质。

谷胱甘肽还原酶活性（GR）

使用Halliwell和Voyer的程序测定谷胱甘肽还原酶[67.]．实验液(3.0 ml)含2.5 ml缓冲液、0.2 ml EDTA、0.15 ml 50 mM氧化谷胱甘肽、0.1 ml 30 mM NADPH和50µl酶提取液。最后加入NADPH起始反应。在340 nm波长下，对合适的含蒸煮酶提取物的空白样品，吸光度同时下降。用消光系数(一摩尔溶液的吸光度)为6.12 mM计算NADPH的氧化量⁻¹厘米⁻¹在吸光度的标准方程中。酶的一个单位活性对应于一nmol NADPH min的氧化所需的酶量⁻¹．

吸光度的标准方程一个=ε×Ɩ×C。

在哪里一个是在给定波长的样品吸收的光量，ε摩尔消光系数是，Ɩ光通过解的距离是多少c是吸收物质的浓度。

过氧化物酶活性（POX）

用香农法测定过氧化物酶等．［68.]．通过将3.5ml的测定缓冲液，0.3ml O-Dianisidine和0.1ml稀释的酶提取物，在5ml容量的比色谱中进行测定，测定酶。溶液混合良好。通过加入0.1ml 0.2％的过氧化氢，然后同时记录430nm波长的吸光度变化来引发测定反应。每个样品分别制备空白，同时取煮熟的酶提取物。酶活性在0.01吸光度min内变化⁻¹米⁻¹蛋白质。

多酚氧化酶(PPO)

用Taneja和Sachar[]法测定多酚氧化酶活性。69.]．玻璃试管中含1.8 ml缓冲液，2 ml邻苯二酚溶液为底物，0.2 ml酶提取物。这些试管在37°C下孵育1小时，进行分析反应，然后在紫外-可见分光光度计上在430 nm处测量吸光度。每个样品分别制备空白，同时取煮熟的酶提取物。酶活性在0.01吸光度min内变化⁻¹米⁻¹蛋白质。

抗氧化代谢物的测定

研究了不同处理高粱营养期和灌浆期的抗氧化代谢产物。

谷胱甘肽

氧化谷胱甘肽、还原性谷胱甘肽和总谷胱甘肽水平用Smith [70]．

提取准备

1 g新鲜叶片组织在10 ml 5% (w/v)磺水杨酸中均质，使用玻璃珠作为磨料，在4ºC下。3万× g离心20分钟(4ºC)，收集上清测定谷胱甘肽。

分析

总谷胱甘肽(GSSG谷胱甘肽+),决心通过添加0.1毫升的0.5米磷酸钾缓冲(pH值7.5),0.5毫升的0.1米钠磷酸盐缓冲剂(pH7.5)包含5毫米EDTA, NADPH 0.1毫升的2毫米,0.1毫升的谷胱甘肽还原酶,0.15毫升的0.6毫米DTNB和0.05毫升上层的试管。在加入上清液之前，将原料充分混合，在加入过程结束时加入上清液，引发反应。在不添加上清液的情况下，单独制备空白管。DTNB的还原速率在412 nm处监测3分钟。总谷胱甘肽含量由GSH的标准曲线(200-400 ng)与412 nm处吸光度增加速率的比值计算。此外，在试管中加入1.5 ml磷酸钾缓冲液(0.5 M, pH 7.5)和0.2 ml 4-乙烯基吡啶，测定氧化谷胱甘肽(GSSG)的含量。让混合物反应1小时以除去还原性谷胱甘肽(GSH)。GSSG含量的测定方法与总谷胱甘肽测定方法相同，但采用GSSG标准曲线(50-200 ng)。还原性谷胱甘肽(GSH)含量由总谷胱甘肽含量减去GSSG计算。

脯氨酸

采用贝茨法测定脯氨酸含量等．［71.]．

提取准备

取新鲜叶片样品1 g，加入3%磺胺水杨酸10 ml匀浆，3000 rpm离心10 min，收集上清液，估算脯氨酸含量。

分析

通过Whatman No.2滤纸过滤提取物。将两种滤液以及2ml冰醋酸和2mL酸茚三酮一起转移，然后在沸水浴中加热1小时。通过将管放入冰浴中终止反应。向反应混合物中加入四氟甲苯并搅拌20-30秒。将甲苯层分离并冷却至室温。在520nm下测量甲苯的红色染色强度。样品中存在的脯氨酸量由标准曲线测定（0.04-0.2μgml⁻¹脯氨酸。

其中115.5为脯氨酸的分子量。

抗坏血酸

通过蒸eR的略微修饰的方法测定抗坏血酸[72.]．

提取准备

将一个植物组织放入6毫升0.8 N HClO的冰水中均质₄4点离心⁰C，10,000 rpm 30分钟。收集上清液并用5米k中和₂有限公司_3.．它在同一条件下再次离心（4⁰温度10000转/分钟30分钟)。这样就得到了清晰的上清液，用于测定抗坏血酸的含量。

分析

为了估计总抗坏血酸，1 ml提取液用等体积(即1 ml)的10% TCA处理。在冰孵化为5分钟。这是进一步混合1毫升每5 M氢氧化钠,10毫米二硫苏糖醇(德勤)和0.5% (w / v) N-ethyl马来酰亚胺(NEM)和2毫升钠磷酸盐缓冲剂(pH7.4)在最后一卷7毫升1毫升2% dinitrophenyl肼和下降10%硫脲,加法。然后将试管大力摇晃，在沸水浴中保存15分钟并冷却。冷却80% H后₂所以₄在4℃并涡旋到管中。然后将吸光度在530nm处记录在没有样品提取物的合适坯料。通过使用参考曲线（0-100nmol）抗坏血酸物测定抗坏血酸的量，并表示为μmolesg⁻¹鲜重。

β-胡萝卜素

β-胡萝卜素含量的测定采用AOAC法[73.]．

分析

通过将10g在50ml水饱和的正丁醇中分散在50ml水饱和的正丁醇中（正丁醇和水以6：2（v / v）的比例混合并剧烈沉淀来制备均匀的悬浮液。然后它是允许静置，直到它分为两个相。上透明层是水饱和的正丁醇）。剧烈摇动后，在室温下允许在室温下静置（16小时）。通过Whatman过滤纸，再次被击打。滤液的总体积高达100毫升。在440nm中，在光谱-2 /分光光度计下测量透明滤液的吸光度（a），抵抗饱和正丁醇的坯料。根据以下等式计算β-胡萝卜素的量：

检测氧化应激索引

在实验分析期间，研究了在不同治疗中植被和谷物灌装阶段的氧化胁迫的氧化胁迫的索引之后。

过氧化氢(H₂O₂）

萃取

将两种G组织在5ml冰冷的0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.0）中浸渍并以8000×g离心10分钟。收集上清液并用于估计H.₂O₂内容(74.]．

分析

提取液50µl，加入0.01 M磷酸钾缓冲液(pH 7.0) 1.95 ml，重铬酸盐试剂2 ml。在沸水浴中保存10分钟，然后冷却。冷却后，在570 nm波长处对无样品提取液的试剂空白吸光度和H₂O₂由标准校准曲线（10至160μmole的H计算₂O₂)．

丙二醛（MDA）

萃取

1 g组织用5 ml TCA(0.1%三氯乙酸;w/v)， 8000 × g离心15分钟。上清采用Heath and Packer法测定MDA [74.]．

分析

通过将1mL的上清液，4mL 20％TCA（含有0.5％2-硫酰氨基甲酸（TBA）的含有0.5％的2mL）开始，开始MDA估计反应。将含量在95℃下在95℃下加热30分钟，持续搅拌。然后在冰浴中快速冷却，然后以8000×g离心10分钟。滗析上清液，将吸光度记录在532nm的蒸馏水中，作为坯料。从其中减去600nm处的非特异性吸收的值，通过使用155mm的摩尔消光系数来计算MDA的浓度⁻¹厘米⁻¹．

粮食产量的决心

籽粒产量以百粒重为基础确定。每个复制中随机选取100粒，使用实验室称重天平分别称重每个处理。计算所有重复次数的平均值，并以每百粒重克数表示产量。

统计分析

本研究以完全随机化块设计（CRBD）进行，每次治疗三种复制。通过使用IBM SPSS统计23软件为Windows进行分析所有结果[75.]．采用事后试验和Tukey试验对不同处理进行比较。在目前的研究中，价值p≤0.05时为显著性。

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发表的文章[及其补充信息文件]中。

DAS：

播种后的日子

GB：

甘氨酸甜菜碱

AMF：

丛枝菌根真菌

SOD:

超氧化物歧化酶

APX型:

抗坏血酸过氧化物酶

猫:

过氧化氢酶

gr：

谷胱甘肽还原酶

痘:

过氧化物酶

PPO:

多酚氧化酶

H₂O₂：

过氧化氢

MDA：

丙二醛

PPM：

百万分之一

ROS:

活性氧

作者谢谢CCS Haryana农业大学，Inda，India提供实验室设施和其他必要材料的执行和分析。我们还承认动物饲料科学系，Luvas，Hisar在实验期间的支持。作者还感谢Forge CCS Hau的高粱饲养员，他是在实验中提供的高粱种子。

本研究的设计和分析费用由CCS哈里亚纳农业大学Hisar生物化学系提供。对数据的解释和手稿的写作不接受资助。

从属关系

1. Chaudhary Charan Singh，基础科学和人文学院，哈里亚纳农业大学，Hisar，哈里亚纳，125004，印度

   匍匐Kumar.

贡献

P.K.进行了实验，分析了数据，起草了稿件，准备了图1-6和表1-2。之后，审核并批准最终稿件。

通讯作者

对应到匍匐Kumar.．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

作者宣布没有竞争利益。

出版商的注意

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。

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