镉胁迫下蓝莓不同组织转录组学及根际真菌多样性分析

蓝莓(Vaccinium是一种多年生灌木，属Ericaceae，对酸性土壤和重金属污染具有高度的耐受性。以蓝莓为研究对象，在模拟盆栽条件下进行了镉胁迫试验。分析了蓝莓的转录组学和根际真菌多样性，测定了蓝莓组织、土壤和DGT中铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)和镉(Cd)含量。并进行相关分析。在蓝莓根、茎、叶和果实组织中共鉴定出84 374个注释基因，其中3370个为deg;在茎组织中鉴定出2521个为deg。注释数据显示，这些deg主要集中在与信号转导、防御和植物-病原体反应相关的一系列代谢途径中。蓝莓将多余的Cd从根部转移到茎部储存，茎部组织中Cd含量最高，与转录组分析结果一致，而果实中Cd含量最低，Cd还抑制了蓝莓对其他金属元素的吸收。通过分析重金属含量与转录组结果的相关性，筛选了一系列与Cd调控相关的基因。蓝莓的根依靠菌根从土壤中吸收养分。Cd的存在对蓝莓根际微生物群落组成有显著影响。 The fungal family Coniochaetaceae, which is extremely extremelytolerant, has gradually become the dominant population. The results of this study increase our understanding of the plant regulation mechanism for heavy metals, and suggest potential methods of soil remediation using blueberry.

镉(Cd)是一种有毒的重金属，通过空气和水的循环在土壤中积累，并通过食物链作用于人体。镉在人体内的积累会引起严重的毒性反应[1]。镉的污染范围和毒性作用在世界范围内产生了严重影响[2]。目前，中国农业土壤镉污染十分广泛，造成了重大的环境问题[3.]。此外，镉及其化合物在酸性条件下易溶于水。然而，镉在中性至碱性土壤中的溶解速率很低[4]。因此，如何有效去除酸污染土壤中的镉是一个非常重要的课题[5，6]。利用超蓄能器修复污染土壤具有高效、保护环境的优点，越来越受到人们的重视。植物种类，例如Rorippa globulosa，龙葵，景天属植物alfredii，中提琴baoshanensis和Pteris为害能使土壤中的镉和其他重金属富集[7]。然而，利用植物进行土壤修复也与生长速度缓慢有关，造成经济损失。

蓝莓(Vaccinium是一种多年生灌木，属于Ericaceae科，生长在酸性土壤上。它在二十世纪初被成功地引进和驯化。然而，直到最近20年，由于这种作物独特的风味和高营养价值导致对其生产的需求不断增长，其种植面积在全球范围内迅速扩大，特别是在欧洲、北美、南美和亚洲，包括中国[8]。文献充分证明蓝莓富含花青素，是所有水果中抗氧化剂含量最高的[9]。适量摄入可显著降低心脑血管疾病和2型糖尿病的发病风险，并提供一定程度的神经保护作用[10]。然而，一些研究强调了这种植物的一个新的潜在应用。蓝莓是重金属污染的酸性土壤中的优势树种[11，12]，以至常被用作监测本地重金属污染的指示物种[13，14]。Kandziora-Ciupa等人研究了诉myrtillus(越橘)对重金属的影响。他们的结果表明诉myrtillus能适应被污染的土壤[15]。大量的植物诉angustifolium和诉myrtilloides在加拿大萨德伯里的矿石冶炼厂周围生长。这两个品种都能耐受重金属污染的土壤，并在土壤上生长良好。极为重要的是，这些品种的果实中重金属污染物(铜和镍)的含量不得超过国际商定的安全值，以便可供人类安全食用[16]。在中国马江蓝莓产区，Li等.测定土壤和水果重金属含量。结果表明，虽然土壤中的重金属含量超过了最大安全值，但水果中的重金属含量却没有达到最大安全值。Chen等人对在Cd污染土壤中栽培的蓝莓植株进行了研究，发现果实中Cd含量不受土壤污染的显著影响[17]，这表明该植物作为重金属污染的酸性土壤的修复物种具有潜在的新作用。

植物对重金属的吸收和解毒是一个复杂的调控过程。不必要的重金属严重损害植物的形态和结构发育，抑制生理过程，引起氧化应激反应，最终导致植物死亡[j]。18，19，20.]。棉(陆地棉)可以通过细胞壁增厚、抗氧化活性增加以及在Cd胁迫条件下与重金属形成复合物的组合来抵抗Cd毒性，并且在该物种中还有特定的信号转导途径，如油菜素内酯和乙烯信号通路[21]。在Cd胁迫下，根内ABC转运蛋白、Zrt/IRT和转录因子受到显著诱导季，主要反映谷胱甘肽代谢、苯丙素生物合成和氮代谢相关途径的活性[22]。与高Cd积累型相比，低Cd积累型对Cd的转录变化有延迟。细胞壁生物合成和谷胱甘肽代谢参与高Cd积累型细胞的Cd防御反应。此外，Cd转运基因的表达在两种大白菜中也存在差异[23]。在Kandelia obovataCd或Zn胁迫下，三种酚代谢途径参与了重金属耐受机制，叶片重金属含量与其总酚含量呈正相关[24]。

土壤中存在的重金属不仅影响在其中生长的植物，而且对土壤中的微生物也有重大影响。在以前的研究中，据报道，土壤微生物对重金属胁迫的敏感性远高于生长在同一土壤中的土壤动物或植物[25]。土壤中重金属含量过高也会导致土壤微生物的生物量和多样性发生变化[26]。植物根系分泌物和与根系有关的微生物的结合可以增强植物对重金属毒性作用的耐受性[25]。研究发现，土壤微生物可以通过生物吸附和沉淀过程降低金属的流动性和生物利用度[27]。重金属污染的严重程度也会影响微生物群落的组成。在严重污染条件下，水稻根系优势微生物种群数量与镉浓度呈正相关[j]。28]。蓝莓有一个小的纤维状未发育的根系，它与菌根真菌形成菌根联系，菌根真菌也与共生细菌相互作用，为植物提供必要的营养[29]。蓝莓的菌根可以帮助植物抵抗干旱、低温等环境因素的不利影响[30.，31]。

迄今为止，关于重金属对蓝莓栽培的生理影响的报道很少。蓝莓可以通过调节自身的抗氧化应激反应来减少重金属的毒性作用。毒性作用与重金属的类型和接触时间有关。研究还发现，蓝莓中氮、磷、钾含量与植物重金属含量呈正相关，且过度胁迫下蓝莓谷胱甘肽(GSH)含量降低[15，32]。然而，蓝莓重金属耐受的机制、与组织重分布的关系，甚至是菌根真菌的变化都尚不清楚。因此，为了探究蓝莓对重金属的响应，以及Cd胁迫下菌根真菌的变化，有必要了解该植物对重金属的内部调节机制，并探索蓝莓在重金属污染酸性土壤修复中的潜在应用价值。

试验材料及预处理

Vaccinium corymbosum以吉林农业科技大学园艺农场晚熟蓝莓品种‘蓝金’为试验材料。2017年5月，2岁大的蓝莓幼苗种植在无纺布花盆(50.0 cm × 50.0 cm × 50.0 cm)中。种植介质为泥炭土，土壤pH值加硫调节为5.0。蓝莓植株通常在盆栽中保持两个生长周期，以确保它们发育到高产期。2020年6月1日，选择生长速度相同、授粉和坐果正常的蓝莓植株进行Cd胁迫试验。为了避免氯离子的干扰^{- - - - - -}离子对植物生长的影响，处理组用CdSO水溶液处理₄给土壤Cd^{2 +}浓度为400 mg/kg(以纯金属重量计算)，对照组(CK)不装CdSO₄.每次治疗重复3次。盆栽植物经过处理后，它们都被放在温室里阳光充足的地方，以防止雨水淋湿。管理方法为每2天用3.0 L去离子水灌溉每个盆，收集盆下渗滤液回注。蓝莓果实于2020年8月25日收获，并于2020年9月30日采集了根、茎、叶和土壤样本。所有组织样品用去离子水洗涤三次，并在阴凉处干燥。然后在液氮中冷冻，并在-80℃的冰箱中储存在无菌袋中。挖出蓝莓植株的根，除去多余的土壤后，将它们放入无菌的自密封袋中摇晃，这样附着在根上的剩余土壤就会被分离出来。然后将根冷冻在液氮中，并储存在-80℃的冰箱中。

转录组数据库的构建

RNA提取

使用总RNA纯化试剂盒TRK1001 (LC Science, Houston, TX)从根、茎、叶和果实中提取总RNA，然后在测试前进行琼脂糖凝胶电泳。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent, USA)检查样品的质量和浓度。A260/280的od值在1.70 ~ 2.10之间，浓度在0.03 ~ 0.23µg/µL之间。

数据库构建、排序和注释

分别从处理组和对照组的根、茎、叶和果实中提取总RNA，进行转录组测序。测序包括3个生物重复，总共24组样本。测序工作由杭州联川生物科技有限公司承担，采用NovaSeq 6000系统(Illumina, USA)进行测序。为了最大限度地提高数据质量，对原始数据进行了过滤。过滤的内容包括:从测序reads中去除剪接序列;采用窗口法对测序reads进行扫描，默认扫描窗口为6 bp，当窗口内的平均质量值小于20时，将窗口开始至3′结束的部分reads截断;Poly-A / T被移除;去除长度小于100 bp的截断序列;去除N含量大于5%的截短序列，使用FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）.使用Trinity 2.4.0进行转录组的从头组装。所有新组装的基因序列(UniGene)与NR数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，去(http://www.geneontology.org)、SwissProt (http://www.expasy.ch/sprot/)，酒桶(http://www.genome.jp/kegg/),包含了(http://pfam.xfam.org/)及蛋奶酒(http://eggnogdb.embl.de/)对数据库进行比较和注释。

差异表达Unigene分析

通过计算TPM，三文鱼进行Unigenes的表达水平。选择log2 (fold change) > 1或log2 (fold change) < -1且差异表达的Unigenes具有统计学意义(p值< 0.05)由R包edgeR [33，34，35]。

荧光定量PCR

采用SYBR Premix Ex Taq (Tli RNase H plus, Takara)软件，采用实时荧光定量PCR (qRT - PCR)检测根、茎、叶和果实中差异表达基因(DEGs)的转录水平。以cDNA(稀释20倍)为模板进行qRT PCR。操作流程及反应条件参照厂家说明书，qRT PCR重复三次。相对基因表达量采用对比CT (^−ΔΔCT)方法。采用Primer Express Software v3.0设计qRT PCR基因特异性引物，内参基因为蓝莓甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH, NCBI登录号:AY123769.1)。qRT PCR特异性引物及内部参考引物见表1.

重金属含量的测定

采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定了根、茎、叶和果实中Cd、Mn、Cu、Fe和Zn的含量。具体操作方式见GB 5009.268-2016食品安全国家标准:食品中多种元素的测定.采用微波消解法测定土壤中Cd、Mn、Cu、Fe和Zn的含量，具体操作模式见土壤和沉积物中总金属元素的微波消解方法.

DGT(薄膜扩散梯度)技术

采用DGT技术模拟植物根系对土壤中重金属的吸收。从盆中央取200g土壤样品，85℃干燥至定重，然后通过2mm筛子去除大颗粒。加入去离子水达到最大田间容量的70%，并与土壤混合良好。用塑料膜密封土壤，置于25℃培养箱中48 h，使土壤平衡。然后将平衡的土壤均匀涂抹到DGT环的内腔中，以确保所有DGT腔中装载的土壤量相同。加载后，将土壤置于25℃培养箱中富集24 h，然后进行回收装置。用去离子水清洗土壤后，取下固定膜，将膜正面卷入含有1.8 mL 1.0 M HNO的2.0 mL离心管中_3.) 24小时[36]，提取结束时测定重金属含量。采用比色法测定亚铁(Fe)^{2 +})内容[37]，用ICP-MS测定其他重金属的含量。

根际真菌的多样性

使用Total TopTaq DNA聚合酶试剂盒(TransGen Biotech Co.， Ltd, China)从蓝莓根际提取真菌DNA，并在检测前进行琼脂糖凝胶电泳。采用NanoDrop 2000分光光度计检测DNA样品的质量和浓度。浓度大于20 ng/ L，总量大于500 ng, OD260/280在1.8 ~ 2.0范围内。DNA样本保存在-80℃的冰柜中。提取根际真菌总DNA后，根据保守区设计引物，并在引物末端加入测序接头。PCR扩增后，将单条带剪切回收，用于文库质量检查。然后使用Illumina MiSeq平台和2 × 250 bp对端测序策略对文库进行测序。操作分类单位(OTU)分析和物种注释使用QIIME2 (version 1.8.0)软件中的UCLUST [38，39]。经过滤波、去噪、剪接和去除嵌合体后，otu以97%的相似性阈值聚类，并与真菌分类数据库(UNITE，http://unite.ut.ee/index.php）.最后，在门、纲、目、科、属、种水平上进行了分类标注。采用krona、Mothur v.1.30 (http://www.mothur.org/）.

数据分析和映射

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，Excel和R软件进行数据绘制。

转录组数据库分析

基因组装数据

利用NovaSeq 6000平台对24个蓝莓cDNA文库进行测序。在对原始数据进行过滤和组装后(表1)2)，共获得84 374个基因，GC含量为42.02%。基因序列最短为201 bp，最长为15 879 bp，平均长度为491 bp, N50长度为1473 bp。说明测序质量符合要求，可用于后续分析。

基因注释数据

共注释了84 374个基因，结果见表3..

基因的差异表达

经Cd处理的蓝莓不同组织的deg如图所示。1.根、茎、叶、果组织中有3370℃(P< 0.05)，其中茎组织中存在2521个deg，其中上调基因1644个，下调基因877个，占总数的74.81%。果实中有360个(10.68%)，叶片中有305个(9.05%)，根中有184个(5.46%)。

qRT - PCR验证差异表达基因

为了验证RNA-Seq的可靠性和再现性，从蓝莓根、茎、叶和果组织中随机选取20个基因进行qRT - PCR检测，分析Cd胁迫下这些基因在不同组织中的表达情况(图2)。2）.它们包括功能基因、转运蛋白、保护酶和转录因子。除dn30310 c0g3(红色部分)外，其余20个差异基因的表达与RNA-Seq一致，说明测序结果可靠。

基因本体(GO)富集分析

在Cd^{2 +}胁迫下，氧化石墨烯在蓝莓不同组织中对DEGs的富集结果不同(图2)。3.)，而且只有前15名P-值如图所示。3..在根组织中共获得96个显著的富含氧化石墨烯的亚项，主要集中在细胞壁、细胞外区和外质。此外，共转运体、草酸代谢和草酸脱羧酶过程的富集因子较高。在茎组织中共获得226个显著的富含go的亚项，主要集中在质膜中，在防御反应、脱落酸反应、蛋白质磷酸化、木葡萄糖和信号转导途径中也有富集。在叶片组织中共获得107个显著的富含氧化石墨烯的亚项，主要集中在细胞膜、胞外区和质体中。次生代谢产物的生物合成、细胞壁组织和氧化还原酶活性也起着重要作用。在果实组织中共获得355个显著的富含氧化石墨烯的亚项，主要集中在细胞膜和细胞外区域。细胞壁和氧化还原酶活性也存在许多差异。

酒桶富集分析

Cd胁迫下，蓝莓不同组织的KEGG富集结果不同(图2)。4）.在差异基因数量方面，富集因子和P-value, KEGG通路在蓝莓根中的差异表达主要涉及鞘脂代谢、鞘脂糖生物合成和糖胺聚糖降解等与细胞膜和细胞壁相关的过程，以及乳糖、氨基糖、核苷酸糖等聚糖的降解代谢。此外，它还与苯丙类生物合成、类黄酮生物合成和RNA转运有关。在ABC转运和植物激素信号转导等代谢过程中也存在差异。蓝莓茎中KEGG通路的差异主要集中在植物-病原体互作通路上，植物激素信号转导和MAPK信号转导通路的差异也达到了显著水平。在蓝莓叶片中，KEGG途径主要在光合作用中表达，其次是植物激素信号转导和氧化磷酸化。蓝莓果实中差异表达的KEGG途径主要涉及三聚氰胺、胡椒碱和吡啶生物碱的生物合成、硫代代谢、黄酮和黄酮醇的生物合成、ABC转运和嘌呤代谢。

不同组织中重金属含量

Cd胁迫显著影响蓝莓对重金属的吸收。从图中可以看出。5锰主要在蓝莓的根和茎中积累。与对照组相比，处理组根组织Mn含量不受Cd胁迫影响，茎、叶、果组织Mn含量降低。处理组叶片和果实组织中Mn含量与对照组差异显著。茎部锰含量最高，超过土壤中锰含量。铁是土壤中最丰富的矿物元素(图2)。5B)，主要积累在蓝莓的根部。Cd胁迫下，根、茎、叶和果实铁含量降低，根组织铁含量与对照差异显著。蓝莓组织中的Cu含量远低于土壤中的Cu含量(图2)。5C)。Cd胁迫对蓝莓组织中Cu含量无显著影响。处理组根、茎、叶组织中Cu含量与对照组差异显著，但果实组织中Cu含量差异不显著。蓝莓根系对Zn有显著的富集作用(图2)。5d)，高浓度Zn可在根组织中积累。Cd胁迫下，根和叶组织Zn含量显著降低，茎组织Zn含量显著升高。处理组与对照组果实组织锌含量无显著差异。

Cd是植物体内的非必需元素，在Cd胁迫条件下，其在蓝莓根、茎、叶和果实组织中的积累程度各不相同(图2)。5e).主要在茎和根中积累，茎中含量最高，叶次之。与对照相比，处理组的根、茎、叶Cd含量差异极显著，而果实Cd含量差异小得多。根、茎、叶和果实的总镉含量均未超过土壤水平。

DGT是一种模拟植物根系被动吸收矿物元素过程的被动土壤采样技术。从图中可以看出。5DGT对Cd的吸收率最高，其次是Fe。Cd胁迫下，水稻对锰和锌的吸收较对照显著增加。Cu的被动吸收率最低，Cd破坏了DGT对Cu的吸收。

重金属含量与DEGs的相关性分析

不同组织中重金属含量与DEGs的相关性分析结果见表4(每个组织中只显示前10个基因)，以及R≥0.8和P选择≤0.05为筛选条件。从蓝莓根组织184个DEGs中筛选出Cd30(16.30%)、Cu4(2.17%)、Zn2(1.09%)和Fe1(0.54%) 37个DEGs。这37个基因中，16个呈正相关，21个呈负相关，这些基因包括TRX2和转录因子myb26等。从2521个蓝莓茎组织中筛选出1280个基因，分别为Cd1230(48.96%)、Zn13(0.52%)、Fe5(0.23%)、Mn5(0.23%)和Cu2(0.09%)。在1255个基因中，762个基因呈正相关，493个基因呈负相关。包括钙调素依赖性蛋白激酶和l -抗坏血酸氧化酶。在蓝莓叶片组织的305个DEGs中，筛选到181个DEGs，分别为Cu109(35.74%)、Cd48(15.74%)和Mn24(7.87%)。其中，类黄酮3- o -葡萄糖基转移酶和过氧化物酶为负相关，100个为正相关，81个为负相关。从蓝莓果实组织360种DEGs中筛选出120种DEGs，分别为Cu49(13.61%)、mn35(9.72%)、Zn17(4.72%)、Fe12(3.33%)和Cd7(1.94%)。其中，鼠李糖转移酶和重金属相关植物分离蛋白等82个基因呈正相关，38个基因呈负相关。

根际真菌多样性

测序数据的质量分析

治疗组(M-Cd)共获得76 848份原始资料，对照组(M-CK)共获得78 259份原始资料。经过质量滤波、降噪、剪接和去嵌合体处理，M-Cd和M-CK分别得到64 661和67 148条序列，分别占原始序列的84.28%和86.03%。M-Cd和M-CK分别有93.66%和94.82%的序列长度为245-259 bp(见表)5获取详细数据。

分类统计分析

根据分类学统计，M-Cd收录有注释的真菌，分为6门15纲31目55科69属，共190种。M-CK共有真菌141种，隶属8门14纲34目44科57属。M-Cd在科、属和种分类上强于M-CK，但在门和目分类上弱于M-CK。标记的M-Cd和M-CK样品在物种分类水平上包括67种常见物种。

相对物种丰富度

为了简化结果的表示，本文仅显示丰度水平前10位的物种，其余物种合并为其他未分类和未分配的物种，以表示未在该分类水平上进行标注的物种(图2)。6) [40]。根据Zhu等人的分类方法，优势菌群定义为相对丰度大于10%，稀有菌群定义为相对丰度小于0.01%。为了更好地筛选两组之间的物种差异，P以< 0.05为显著性差异的筛选阈值。在门水平上，M-Cd和M-CK的优势菌群为子囊菌门(Ascomycota)，丰富度指数分别为0.9080和0.8039。担子菌也是M-CK的优势菌群(图2)。6a).在纲水平上，M-Cd和M-CK的优势菌群为Eurotiomycetes, M-Cd的优势菌群为Sordariomycetes, M-CK的优势菌群为Leotiomycetes、Agaricomycetes和archaeorhizomcetes。在门水平上，虽然银耳菌不是M-Cd和M-CK的优势菌群，但M-Cd的丰富度指数与M-CK有显著差异(图2)。6）.在目水平上，M-Cd的优势菌群为Eurotiales和Coniochaetales，而M-CK的优势菌群为Eurotiales、Helotiales、archaeorhizomyetes和Sebacinales，且M-CK的archaeorhizomyetes丰富度指数显著高于M-Cd(图2)。6c).在科水平上，M-Cd和M-CK的优势菌群为曲霉科，M-Cd的优势菌群为Coniochaetaceae(图2)。6D).在属水平上，M-CK优势菌群只包括Hamigera，但主要的M-Cd菌群包括Hamigera，Coniochaeta和青霉菌(无花果。6e)在物种水平上，Coniochaeta fodinicola是M-Cd中唯一的优势菌群成员，但Talaromyces helicusM-Cd与M-CK差异显著青霉菌nepalenseM-Cd与M-CK显著不同(图2)。6F)。值得注意的是，M-Cd和M-CK在各个分类水平上，某些物种的丰富度存在显著差异，但未纳入图中。6由于丰富度水平低。

根区土壤微生物多样性

M-Cd和M-CK在97%相似度下的alpha多样性指数见表6.Chao1指数和ACE指数用于衡量物种丰度(即物种数量)，Shannon指数和Simpson指数用于衡量物种多样性[41]。可以看出，M-Cd与M-CK之间的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数差异不显著，说明M-Cd与M-CK之间的土壤微生物多样性差异不明显。

根际土壤微生物丰富度与土壤镉水平的相关性分析

土壤Cd含量与物种丰富度的相关分析结果见表7;的值R≥0.8和P选择≤0.05为筛选条件。2纲(银耳菌和壶菌)，6目(如丝状菌科)，7科(如针叶菌科)，12属(如银耳菌科)。Trichocladium)和6种(例如:Trichocladium opacum)与土壤Cd水平正相关。

Cd胁迫下蓝莓的整体转录

有研究认为，生长在酸性土壤中的植物蓝莓是重金属污染酸性土壤中的优势种，但在分子水平上对该物种重金属耐受机制的研究很少。本研究利用高通量测序技术，为植物对重金属胁迫的响应提供信息。从Cd胁迫下的蓝莓根、茎、叶和果实组织中共获得84 374个注释基因，包含3370个deg。deg主要参与植物激素信号转导、ABC转运、MAPK信号转导通路、淀粉和蔗糖代谢、核黄素代谢、卟啉和叶绿素代谢、错配修复、光合作用、类黄酮生物合成和鞘脂代谢。DEG富集的代谢途径也因其评估的特定组织而异。例如，根组织中的deg主要参与糖胺聚糖降解、鞘糖脂生物合成、鞘脂代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等与细胞壁合成和分解相关的降解途径。茎组织中的deg与多种防御反应(如对水分亏缺、过氧化氢和盐胁迫的反应)和信号转导(如MAPK信号转导途径、植物激素信号转导和ABC运输)有关。叶片组织中的DEGs主要参与光合作用、二萜类生物合成、昼夜节律、氧化磷酸化、RNA聚合酶活性、植物激素信号转导和类黄酮生物合成。果实组织中的DEGs主要与二萜生物合成、氧化磷酸化、半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、苯丙素生物合成和类胡萝卜素生物合成有关。棉花镉胁迫的研究(陆地棉)发现大多数deg与催化活性和金属离子结合有关。棉花通过增加细胞壁厚度、抗氧化活性和解毒来响应镉胁迫。据报道，参与阻止镉向稻谷转运的基因包括OsIRT1，OsNramp5，OsVIT2，OsNRT1.5a和OsABCC1［42]。植物叶和根的转录组分析构树Cd胁迫影响了47条KEGG通路，主要包括bHLH，MYB以及其他重要的转录因子、植物-病原体相互作用、苯丙素生物合成、植物激素信号转导等蛋白质合成和代谢过程[43]。在Cd胁迫下，柳枝(黍virgatum)涉及氧化还原相关代谢的激活，21种不同的休克转录因子(hsf)和22种热休克蛋白(HSPs)的差异表达[44]。这些结果与本研究的结果相似。

以往关于植物与重金属相互作用的研究大多是在草本植物的根和叶上进行的，并证实根系直接暴露于土壤中的重金属，是最先表现出重金属毒性效应的器官[22]。然而，有趣的是，本研究结果表明，蓝莓中DEGs主要集中在茎中，根组织中DEGs的数量最少(甚至低于叶和果组织)。茎组织中deg含量是根组织的13.7倍。deg在这些组织中参与不同的代谢途径，这表明每种组织对Cd胁迫的生理反应也存在差异。

重金属的积累与竞争

几乎所有植物体内都有铁、锰、铜、锌等必需重金属的积累，这些重金属对植物的生长发育也非常重要。植物对重金属的吸收和积累不仅取决于外界环境的物理和化学性质，还取决于植物自身的特性[45]。研究表明，小麦籽粒中7种重金属的含量高于玉米籽粒。此外，随着土壤重金属含量的增加，小麦和玉米籽粒重金属的生物浓度系数(BFC)呈指数下降[46]。当茄子(茄属植物melongena)在受污染的污泥中种植，据报道根的重金属含量远高于芽和果实，并且植物更容易吸收土壤中的Cd而不是Pb或Ni [47]。这些研究表明，由于植物对重金属的转移和固定方式不同，不同组织中重金属的类型和含量也不同。

在对蓝莓重金属胁迫的研究中，大多集中在叶子和果实周围[15，48]。在之前的一项研究中，蓝莓品种‘Bluecrop’的幼苗在根部积累Cd，但茎部的Cd含量也很高，两者组织间Cd水平差异无统计学意义[21]。在本研究中，Cd主要在茎中积累，这与茎组织中deg数量最多的发现一致，也证明了测序结果的可靠性。两项研究结果的差异可能是由于本研究采用了晚熟蓝莓品种“蓝金”，以延长胁迫处理期，不同蓝莓品种在不同组织中积累Cd。可以证实，蓝莓对Cd的积累主要集中在根和茎上，积累水平最低的是果实，其Cd浓度远低于土壤、根、茎和叶。同样的研究也表明葡萄在污染土壤中生长的植物果实的Cd含量低于其他任何组织[49]。然而，不同蓝莓品种间重金属积累的差异需要在未来的研究中进一步明确。

据广泛报道，Cd^{2 +}与植物和土壤中的其他金属阳离子相互作用[50]。本研究发现，Cd对蓝莓组织中Mn、Fe、Cu和Zn的含量有影响，镉对土壤中金属阳离子的扩散也有影响^{2 +}.Mn主要通过根系的主动运输被植物吸收，并对Cd的积累有拮抗作用[j]。51]。外用锰能在一定程度上减轻镉的毒性[j]。52]，而蓝莓根系锰含量不受Cd的影响，但Cd显著降低了锰向茎、叶和果实的转移。DGT的被动扩散表明，随着Cd含量的增加，Mn含量也随之增加，说明虽然Cd对蓝莓根系Mn含量没有影响，但可能会影响根系对Mn的主动吸收过程。

铁是叶绿素合成的重要元素，叶片中镉含量的增加会导致缺铁和黄化。铁的增加会抑制Cd的吸收[53]和硫酸盐(SO₄^{2 -})可以通过增加竞争来促进铁的吸收[54]。然而，在本研究中，土壤Cd浓度的增加显著降低了蓝莓根部的铁含量，并在较小程度上降低了叶和果实的铁含量，但对茎部的铁含量没有影响。铁含量的下降是由于Cd不仅占据了阳离子运输通道[55]，还能抑制铁从土壤向根组织的被动扩散。

Cu在植物多通道氧化过程中起作用，但Cu与Cd相互作用的研究很少。有报道称，在培养基中添加过量的Cd可降低木质部中Cu和Ca的含量挪威云杉［56]。在一些谷物和豆类的研究中也得到了类似的结果[57]。在本研究中，重度Cd胁迫也显著降低了蓝莓根、茎和叶的Cu含量，甚至显著降低了土壤对Cu的被动吸收。

锌^{2 +}已被证明是镉的竞争离子^{2 +}［58]。据报道，锌能抑制番茄各器官中镉的积累(Lycopersicon esculentum) [59]，但能显著提高叶柄中Cd的积累，减少根中Cd的积累蕨麻griffithii［60]。Cd对蓝莓锌含量的影响较大，显著抑制了蓝莓根和叶中锌的含量，但显著促进了茎中锌的积累，并增加了土壤对锌的被动吸收。

显然，Cd处理影响了蓝莓组织中Mn、Fe、Cu和Zn的含量，这与以往的研究结果一致[24]。Cd胁迫下蓝莓各组织Cd含量均有所增加，但增加幅度差异较大。茎组织中Cd含量最高，其次是根和茎组织(两者Cd含量几乎相同)，果实组织中Cd含量最低。由于土壤中Cd含量可高达400 mg/kg，而蓝莓向果实转移的Cd量非常少(1 mg/kg)，因此在外部污染区域的土壤中很难达到如此高的Cd污染水平，因此在一般污染水平下，果实中Cd的含量可能会更低。

重金属对根际微生物的影响

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，特别是对于蓝莓等植物，其根系吸收能力较低，利用真菌菌根提高养分吸收，支持生长。土壤微生物与土壤环境因子之间的相互作用极为复杂。在重金属污染的土壤中，一些微生物可以修饰、降解或沉淀重金属化合物，而土壤环境因子可以筛选微生物群落[61]。在本研究中，虽然施用Cd对土壤真菌的生物多样性没有显著影响，但对土壤真菌的优势种有显著影响。事实上，Cd是筛选土壤真菌的首选方法。在门水平上，两种样品主要集中在子囊菌门和担子菌门，而在纲水平上，Cd抑制了木丝菌门和古菌门的生长，但促进了Eurotiomycetes和Sordariomycetes的生长。在目和科水平上，Cd抑制了Archaeorhizomycetales (Archaeorhizomycetes)和Sebacinales (Agaricomycetes)的生长。后两个目和科已被证明是蓝莓菌根真菌群落的优势种[61]，而属于Sebacinales目的真菌具有替代蓝莓相关的ericoid菌根(ERM)的能力[29，62]。相反，Cd胁迫促进了曲霉科、毛霉菌科(Eurotiales)和Coniochaetaceae (coniochaetae)真菌的生长。这三个科的一些真菌对极端环境条件具有很强的耐受性，如高温、高盐水平和高浓度重金属。例如，据报道，从意大利撒丁岛Iglesiente露天矿区采集的污染土壤中的优势真菌属于毛霉菌科[63]，而Coniochaetaceae的成员是异养子囊菌，广泛分布于陆地生态系统中，但在极端生境中数量最多[64]。Coniochaetaceae的许多种类都是根内生真菌[65]，但它们能否接种到蓝莓根中形成内生真菌还需要进一步的研究。在属和种的分类学水平上，保存了一些对极端环境具有高度适应性的物种，如Coniochaeta fodinicola和Talaromyces helicus，它们被认为是酸性、工业和采矿污染土壤中的主要真菌，被用来去除土壤污染物[66，67，68]。

蓝莓中镉的调节机制

Cd进入蓝莓种植土壤后，反映了根系外部环境的变化。这些变化改变了土壤真菌群落的组成。蓝莓几种主要菌根真菌的生长受到抑制，而一些抗极端环境条件的真菌则表现出旺盛的生长。同时，Cd改变了根系对重金属的吸收状态，从而刺激了蓝莓植株内部的一系列反应(图2)。7）.

首先，镉和其他金属阳离子一起被根部吸收。当它通过强被动扩散渗透到根组织后，在根细胞壁和细胞膜上诱导鞘脂代谢(map00600)、氨基糖和核苷糖代谢(map00520)、其他聚糖降解(map00511)和半乳糖代谢(map00052)等反应。结果发现，bgal3、os03g0165400、at5g34940、at3g59480、几丁质酶、bxl2、xyl2和chil3上调，只有JKD下调。这些结果表明，蓝莓根的细胞壁和细胞膜是Cd信号感知的重要部位，这与以往对小麦(小麦) [69]。Cd在蓝莓体内的向上转运导致其在根和茎组织中逐渐积累。茎组织对Cd的反应最强，以表达PR-1，Xa21，PYl4和MPK16MAPK信号通路(map04016)和—ABF2，PYl4，国际宇航科学院，EBF2，XTH23和SAPK1在激素信号通路(map04075)中。在MAPK通路的所有磷酸化水平上，MAPKK和MAPKKK的变化导致WRKY33的表达上调，从而促进WRKY33的表达增加PAD3，也有报道拟南芥［70]。此外，蓝莓对Cd胁迫的响应与对盐胁迫和干旱胁迫的响应相似。在激素信号转导途径中，在Cd胁迫下，脱落酸受体(PYL)表达上调导致丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶表达上调。植物对Cd胁迫的响应也导致植物-病原体互作途径中DEGs的上调(map04626)。环核苷酸门控通道(中国兵器)在控制植物-病原体相互作用途径中起重要作用[71]。蓝莓中cnc1 /3表达上调导致钙依赖性蛋白激酶(CDPK)，影响钙调素(CaM/CML)的上调;RPM1，RPS2，一半以及一系列抗病相关基因。这些基因共同导致蓝莓过敏。此外，与苯丙素生物合成(map00940)、类黄酮生物合成(map00941)、抗坏血酸和海藻酸盐代谢(map00053)和类胡萝卜素生物合成(map00906)相关的差异基因表达也在蓝莓Cd防御反应中发挥了作用。

几个ABC转运体基因(map02010)在蓝莓茎中上调，如ABCC3和ABCG5［72]。abcg型ABC转运蛋白被证实参与植物激素的转运。当Cd转运到蓝莓叶片时，主要影响的是光合途径(map00195)，其中所有deg都下调(如PSBC，PSBA，PSBD和BVRB)，而细胞色素P450 (cyp二萜类生物合成途径map00904上调。这说明Cd向蓝莓叶片的转移对叶片的光周期有显著的影响cyp在本研究中，蓝莓果实被证明是Cd含量最低的组织。在氧化磷酸化通路(map00190)中，Mtnd2，MT-CYB,细胞色素氧化酶和Mtatp6均上调，二萜类生物合成(map00904)、氧化磷酸化(map00190)、半乳糖代谢(map00052)、淀粉和蔗糖代谢(map00500)上调。在苯丙素生物合成途径(map00940)和类胡萝卜素生物合成途径(map00906)中，大部分deg下调。然而，需要进一步的研究来证实水果组织抑制Cd进入的机制。

蓝莓是生长在酸性土壤中的多年生灌木，被认为是重金属污染的酸性土壤中的优势植物。然而，蓝莓对重金属的吸收和代谢机制尚不清楚。虽然高通量测序技术使越来越多的研究植物对重金属的调控和代谢机制，蓝莓显示出一些不寻常的特征。不同组织类型对Cd胁迫的信号转导、防御和解毒机制不同，反映了各组织的协同作用和各自的特点。本研究利用高通量测序技术，从4个蓝莓组织样本中共获得84 374个注释基因，包括3370个注释基因，其中根组织184个，茎组织2521个，叶组织360个，果组织305个。这些deg在不同组织的不同代谢途径中富集。采用ICP-MS法测定了蓝莓不同组织、土壤和DGT中Fe、Mn、Cu、Zn和Cd的含量。结果表明，Cd主要富集部位为茎部，与测序结果一致。茎组织Cd含量高于其他组织，果实组织Cd含量最低。Cd与其他金属阳离子竞争，严重影响蓝莓组织中其他金属元素的代谢。 Only through active absorption into blueberry roots, but also through a large number of passive diffusion into the roots. Cd in the soil also had a significant effect on the mycorrhizal fungi associated with blueberry. Growth of the dominant populations of mycorrhizal fungi, namely members of the Archaeorhizomycetes and Sebacinales, was inhibited, and members of the Coniochaetaceae, which can tolerate extreme environments, gradually became the dominant population. Thus, in the presence of the acid soil conditions that are necessary for growth of blueberry, Cd alters the growth environment of this plant and has toxic effects on its tissues. However, blueberry can resist the toxicity of Cd through its own metabolic regulatory mechanism.

本研究结果表明，Cd胁迫下蓝莓茎中Cd的过量积累和DEGs的丰富，为今后的研究指明了有趣的新途径。然而，目前最迫切需要研究的是提高我们对重金属在蓝莓中的长距离转运、对Cd向果实转运的抑制、Cd对蓝莓根中附着真菌和内生真菌群落组成的影响以及蓝莓根中细菌对Cd的调控。

测序数据已提交至NCBI基因表达综合数据库(GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，编号为GSE168446 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE168446）.

Cd:

镉

Zrt /红外热成像:

锌铁调节蛋白

谷胱甘肽:

谷胱甘肽

度:

差异表达基因

qRT PCR:

实时定量PCR

GAPDH:

Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶

摘要:

电感耦合等离子体质谱法

总局:

薄膜中的扩散梯度

OTU:

操作分类单位

走:

基因本体论

KEGG:

京都基因与基因组百科全书

MAPK:

丝裂原活化蛋白激酶

hsf:

休克转录因子

热休克:

热休克蛋白

均:

生物浓度系数

所有:

脱落酸受体

中国兵器：

环核苷酸门控通道

CDPK：

钙依赖性蛋白激酶

凸轮/ CML:

钙调蛋白

CYP年代：

细胞色素P450

地理:

基因表达总览

感谢沈浩宇(杭州联川生物科技有限公司)在实验中提供的帮助。

本文得到吉林省科技创新发展计划项目(20190104153)和吉林农业科技大学(济农院河子[学院20190540])博士启动基金的支持。吉林省科技创新发展计划支持本研究蓝莓栽培管理和土壤微生物多样性测量，吉林农业科技大学博士启动基金启动资金支持本研究蓝莓转录组学测量和生化试剂购买。

从属关系

1. 吉林农业科技大学农学院，吉林，132101

   陈少鹏，庄倩倩，鞠志新，董涛，马元

2. 吉林省绿化管理中心设计室，吉林，132011

   一位朱

贡献

SPC参与试验设计和稿件撰写;QQZ参与数据分析，修改稿件;XLC参与了试验过程的管理;ZXJ修改稿件;TD和YM参与试验过程管理，所有作者均通过。

相应的作者

对应到Shaopeng陈.

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

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