大豆侵染病毒ALSV基因编辑用csy4加工的引导RNA传递系统的研制

背景

实现CRISPR-Cas9基因组编辑用于植物性状改良和基因功能分析的关键问题是如何有效地将包括gRNAs和Cas9在内的成分传递到植物体内。基于植物病毒的gRNA传递策略已被证明是基因组编辑的重要工具。但其在重要作物大豆上的应用尚未见报道。ALSV (苹果潜伏球形病毒)是一种传染性很强的病毒，可以探索为基因组编辑提供元素。

结果

为了开发一种基于alsv的gRNA传递系统Cas9-basedCsy4-processed一个LSVC研制了CCAC系统。在这个系统中，我们设计了侵染大豆的ALSV来携带和传递gRNA。核糖核酸内切酶Csy4有效释放在cas9介导的基因组编辑中有效发挥作用的grna。内源性植物烯去饱和酶的基因组编辑(PDS)位点和外源性5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)序列烟草。benthamiana（n benthamiana)通过CCAC进行Sanger测序。此外，ccac诱导的两种大豆内源诱变GW2检测到类似物。

结论

在CCAC系统的帮助下，目标特异性gRNA可以很容易地被操纵，并通过病毒感染有效地传递到大豆植物细胞中。这是首个基于病毒的大豆基因组编辑gRNA传递系统，可用于基因功能研究和性状改良。

CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9)系统是一种用于植物基因功能研究和作物性状改良的强大基因组编辑工具。该系统最初在细菌免疫系统中进化，并已用于包括大豆在内的许多植物的位点特异性修饰(Cai等)。5];曹等。[6];Chilcoat等。[8];孙等。[33])。一般有两种成分:Cas9核酸酶和gRNA (guide RNA)。为了实现靶向修饰，需要将这两种成分传递到植物细胞中。Cas9的靶向特异性是通过gRNA的20 bp (bp)间隔序列实现的(Jinek等)。18])。

在大多数情况下，Cas9和gRNA被克隆到一个或两个独立的二元载体中，随后被转移到植物细胞中，通常由农杆菌属(Feng等。)12])。这种方法的一个缺点是，每个二元结构都是特定于目标的，因此，如果改变目标，则需要一个新的结构和一个新的植物转换。然而，这种转换通常是耗时且耗费人力的。此外，许多植物物种还没有开发出有效的转化。这些因素抑制了基于CRISPR/Cas9的基因组编辑在大豆等许多作物中的应用。

由于其通过病毒感染传递而不是传统的转化，最近开发的病毒传递gRNA系统为促进CRISPR/Cas9在植物中的应用提供了一种很有前途的方法(Ali等)。2，3.];Cody等。[9];Hu等。[14];Jiang等。[17];Yin等。[43])。一些植物病毒可以发展成以病毒为基础的载体，将外源核苷酸传递到植物细胞中进行蛋白质表达或病毒诱导的基因沉默(VIGS) (Zhang和Ghabrial [45])。一般来说，外源核苷酸的大尺寸会影响病毒的复制和移动，限制病毒载体的载货能力(Thomas等)。[35])。虽然植物病毒载体可能难以耐受插入Cas9 ORF(约4,100 bp)，但据报道它们可以携带并将gRNA序列(约100 bp)传递到表达Cas9的植物中。利用该方法，Cas9和gRNA可以通过两种独立的方法导入植物:将Cas9克隆成二进制载体，通过传统方法导入植物细胞农杆菌属而gRNA则是通过病毒感染传递到植物体内。迄今为止，已经报道了几种病毒通过在小麦和玉米等作物中全身感染来传递gRNA大麦条纹花叶病毒(BSMV) [Hu et al.]14])，以及使用甜菜甜菜坏死黄静脉病毒[BNYVV] (Jiang等。]17])。然而，每种病毒都有特定的宿主范围和不同宿主的感染效率。对于特定的植物物种，必须选择特定的高传染性病毒来开发相应的gRNA传递系统。这种病毒诱导的gRNA递送以前尚未应用于具有重要经济意义的大豆作物。

虽然许多病毒已被证明可以感染大豆，但ALSV (苹果潜伏球形病毒)具有高度传染性，以前曾在大豆中用作诱导VIGS(病毒诱导的基因沉默)和表达蛋白的载体(Yamagishi和Yoshikawa [40，41])。本研究以ALSV为研究对象，开发了一种名为CCAC (Cas9基础Csy4-processed一个LSVC进行系统)。我们通过以下方式对CCAC系统进行了测试:(1)将gRNA送入烟草benthamiana植物;(2) CCAC释放gRNA，指导cas9介导的基因组编辑;(3)带CCAC的多重靶向n benthamiana和大豆。我们的研究结果表明，CCAC在cas9介导的植物基因组编辑中发挥了有效的作用。这为CRISPR/Cas9在大豆中的应用提供了一种途径，这种靶向性gRNA可以很容易地进行编程和重编程，并将其传递到植物中进行有效的病毒感染。

CCAC的成立

为了提供一种基于病毒的大豆gRNA传递系统，我们利用大豆高侵染病毒ALSV开发了一种gRNA传递系统，命名为CCAC系统。在gRNA支架序列中，帧分析表明，在三个阅读帧中，每个帧都有两个停止密码子(图2)。1A).由于ALSV-RNA2在单个开放阅读框中编码多蛋白，为避免干扰其翻译，在CCAC系统中选择了ALSV-RNA2中Vp24蛋白翻译停止密码子的下游插入gRNA。采用Csy4识别序列(C4位点)，Csy4从病毒基因组中释放成熟的gRNA(图2)。1B)。

由于CCAC中的序列是由天然ALSV病毒rna修饰的，这可能导致病毒失去其生物活性，因此我们首先测试了植物被VIGS感染的能力。部分PDS（八氢番茄红素desaturase)基因序列插入CCAC的MCS位点(图2)。2A)，然后渗透进n benthamiana植物。在新生叶片上观察到光漂白表型，表明接种植株中CCAC衍生的病毒rna全身性感染(图2)。2B).结果表明，CCAC能够系统地侵染植物，并可用于农杆菌属介导的病毒接种。接下来，我们进一步研究了立即整合在Vp24终止密码子下游的gRNA是否会破坏病毒的生物活性。一个PDS-靶向gRNA片段两侧有两个C4位点，构建了一个PDS片段(作为VIGS引起的可见指标)含有CCAC，然后agro浸润到n benthamiana植物。侵染植物的上部新生叶片被光漂白(图2)。2B)，显示出系统性的植物感染。采用RT-PCR方法证实病毒感染(图2)。2C、附加文件2图S1)。这些结果表明，CCAC可以有效地携带和递送具有C4位点的gRNA。

cas9诱导的CCAC基因组编辑

我们进一步测试了CCAC携带的gRNA的生物活性。我们构建了Cas9和Csy4共表达的构建体(Cas9-Csy4构建体)，其中利用自裂2a肽(P2A)将Cas9和Csy4分离到一个ORF中(图2)。3.一个,3.B).为了研究植物内源靶标是否被Cas9编辑过n benthamiana被携带gPDS的CCAC系统感染的植株被Cas9-Csy4构建体农渗。PCR- re分析结果显示，Cas9-Csy4侵染植物的部分PCR扩增子(8.9%)为阳性我I-resistant(无花果。3.C、附加文件2图S2)，表明PDS基因被Cas9核酸酶编辑。Sanger测序结果进一步证实了indel(插入-删除多态性)的存在PDS基因靶位(图2)3.D、附加文件3.）.此外，使用限制性内切酶位点损失法检测了gPDS的12个潜在脱靶位点(Nekrasov等)。[28])。在12个基因座中，9个显示了预期的PCR条带(附加文件)1图S1)。九个扩增子都没有显示出我观察到的I位点损失PDS目标序列。结果表明，在cas9介导的基因组编辑过程中，系统叶片中ALSV病毒基因组中Csy4核酸酶释放的gRNA具有生物活性。

cas9诱导的CCAC多重靶向

利用Cas9一次编辑多个基因座的能力可以极大地帮助基因功能分析。为了扩大CCAC的应用范围，对CCAC的多靶向编辑潜力进行了测试。我们设计了两个grna (g1EPS和g2EPS;无花果。4一)目标EPSPS（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate合酶)基因序列并串联组装成CCAC。EPSPS赋予对草甘膦除草剂的抗性，并被报道为cas9介导的多重靶向基因(Zhang等)。[46])。C4位点位于CCAC中g1EPS和g2EPS的两侧，以释放病毒中的grna。我们agroinfiltratedn benthamiana叶子上有grna和aPDS片段(作为由VIGS触发的可见指示器)包含CCAC结构。入渗3周后，上部新生叶片明显被光漂白PDS中收取。这表明植物被携带g1EPS和g1EPS片段的ALSV系统感染。光漂白后的叶片被含有EPSPS靶序列和Cas9-Csy4构建。使用限制性内切酶位点丢失法检测cas9诱导的两个gRNA靶标之间的序列缺失(Shan等)。[30.])。BsrDI位点存在于两个靶标之间EPSPS序列(图。4E)，因此，我们用Bsr为了减少未改变的野生型DNA，并丰富携带缺失的DNA分子Bsr迪的网站。利用消化的基因组DNA扩增目标片段，检测到两条PCR条带(图2)。4C、附加文件2图S3)。测序结果显示，小条带是g1EPS和g2EPS靶位点之间携带序列缺失的DNA分子的PCR扩增子(图2)。4E).这些结果表明，在cas9诱导的基因组编辑中，CCAC可用于grna的多重递送。

大豆CCAC基因编辑

为了验证CCAC在大豆细胞中的应用，我们用它来携带靶向大豆内源的gRNAGW2基因。GW2是一种控制种子宽度和重量的重要农艺性状基因，最初是从水稻中克隆出来的(Liang等)。[25];Song等。[32])，并被报道为Cas9提高水稻作物产量的靶点。根据序列分析，我们确定了两个GW2大豆中的类似物:Glyma.15G249000和Glyma.13G259100。它们在氨基酸序列上有94.2%的相似性。gRNA (gGW2)被设计为同时靶向这两个大豆GW2类似物。为了提高gRNA的丰度，在CCAC中串联组装了两个位于C4位点两侧的gGW2s(图2)。4B)，并通过Cas9-Csy4构建转移到大豆毛状根培养中农杆菌属rhizogenes（答:rhizogenes)菌株K599。PCR- re分析表明，从毛状根基因组DNA中提取的引物中，有一部分(45.3%)扩增物对GW2同源物均具有抗性Fnu4嗨(无花果。4D、附加文件2图S4)，表明GW2在转化的大豆根中进行了基因编辑。的Fnu对4hi抗性带进行了进一步的Sanger测序，结果显示在两个GW2类似物中确实发生了核苷酸突变(图2)。4F和G，附加文件3.)，提示含有Cas9的CCAC可作为大豆基因组编辑工具。

病毒和寄主植物种类

利用病毒携带和传递gRNA是一种有效的策略，通过减少转化次数，促进CRISPR-Cas9在植物特别是低转化率植物中的应用。然而，对于某些植物物种，这种方法的应用受到其病毒病原体知识的数量的阻碍。许多植物缺乏适当的病毒作为它们的传递工具载体(Alexander等。)1])。该病毒可以感染植物的茎尖分生组织(SAM)，同时与受感染植物的一些无病毒种子保持生育能力，是gRNA传递系统发育的理想载体。针对特定作物的gRNA传递系统需要根据其特定的病毒-病原体相互作用的特点进行研究和开发。

目前，植物病毒应用于CRISPR-Cas9的目的大致可分为两类。第一类包括使用基于双病毒的复制子来提高CRISPR-Cas9组分(包括Cas9、gRNA和/或DNA修复模板)的丰度，以提高基因靶向频率。迄今为止，至少有两种双病毒，烟草中的beyedv(豆黄矮病毒)(Baltes等人)。[4])和小麦和水稻中的WDV(小麦矮病毒)(Wang等。[38])，被报道为表达Cas9、gRNA和DNA修复模板的DNA复制子。第二类利用病毒运动，通过全身感染将gRNA携带和传递到新发育的组织中(Ali等)。2，3.];Cody等。[9];Hu等。[14];Jiang等。[17];Yin等。[43])。在我们使用CCAC的策略中，gRNA通过病毒运动携带和传递。虽然在植物中表达Cas9仍然需要基因转化，但它可以减少不同基因功能研究所需的转化次数。

大豆高传染性RNA病毒(ASLV) [Li et al.]24];山石和吉川[40])，由于几种有效特性，被选为建立CCAC体系的原料。首先，ALSV可以感染包括SAM在内的植物组织(Nakamura等)。27];山石和吉川[41])。在SAM中由ALSV介导的基因组编辑提供了在种子中产生同质细胞而不是马赛克细胞的能力。其次，感染了ALSV的大豆植株是可育的，可以从中收获种子(Yamagishi和Yoshikawa [40])。最后，被alsv感染的植物80%的种子是无病毒的(Yamagishi和Yoshikawa [41])，从病毒生物安全的角度考虑，这将是有用的育种材料。

gRNA在病毒基因组中的整合位置是考虑高效传递系统的重要因素。ALSV有两个基因组RNA分子:ALSV- rna1和ALSV- rna2 (Igarashi等)。[15];李等。[24])。在ALSV-RNA2序列中有两个可能克隆外源片段的位置。第一个位置位于两个人工Q/G蛋白酶切割位点之间，Vp25蛋白序列的上游(图2)。1B, MCS站点)。第二个位置位于Vp24蛋白翻译终止密码子的下游。将gRNA克隆到第一个位置将破坏ALSV-RNA2多蛋白的翻译。因此选择第二个位置插入gRNA。

病毒释放gRNA

gRNA末端的附加碱基或其他修饰会影响cas9介导的诱变效率(Haurwitz等)。[13])。在病毒传递gRNA的过程中，gRNA被整合到病毒基因组中，并随着病毒基因组RNA进行复制和移动。为了从病毒基因组中释放gRNA，不同的病毒采用了不同的策略。在DNA病毒载体CaLCuV中，将DNA启动子U6插入到CaLCuV基因组中以驱动gRNA的表达(Yin等)。43])。在RNA病毒载体TRV中，RNA病毒PEBV(豌豆早褐变病毒)启动子被整合到TRV基因组中以控制gRNA的表达(Ali等)。2])。BSMV本身的启动子用于BSMV sgRNA的转录(Hu等)。[14])。从RNA病毒ALSV衍生的CCAC中，DNA启动子U6在RNA病毒中不起作用。我们没有在CCAC中采用RNA病毒PEBV启动子，因为之前没有研究描述PEBV感染大豆细胞。此外，PEBV启动子的大小相对较大(192 bp)，特别是用于通过金门方法串联组装多个grna。在本研究中，使用Csy4核酸酶从CCAC中释放gRNA(图2)。3.A). Csy4核酸酶是细菌CRISPR- cas系统的一员，它将CRISPR RNA加工成小RNA，并被设计为Cas9核酸酶加工gRNA (Haurwitz等)。[13];蔡等。[36])。在这里，我们证明了Csy4-RNA加工系统在植物病毒中有效地起作用。使用Csy4核酸酶从病毒载体中释放gRNA有几个优点。首先，C4位点非常小(20 bp)，这对病毒的载货能力很重要，特别是在多个gRNA组装中。其次，无论何种植物，Csy4核酸酶的表达都可以由组成型强启动子(如35s启动子)驱动，而植物特异性的U6启动子或RNA病毒PEBV启动子在某些植物中可能不起作用(Mueller等)。26];Tang等。[34])。第三，与单个rna表达的gRNAs相比，经Csy4核酸酶处理的gRNAs发生的cas9诱导突变明显更高(Čermák等)。[7])。令人惊讶的是，据报道，TMV可以在cas9介导的DNA切割中传递gRNA，而不需要任何额外的RNA加工元件，其机制未知，其中gRNA由TMV的亚基因组启动子驱动(Cody等)。9])。为了确定这种新机制是否能在CCAC-gRNA加工中起作用，还需要进行额外的实验，在CCAC-gRNA加工中，gRNA集成在ALSV长单个开放阅读框的下游。

cas9诱导的CCAC基因组编辑

在CCAC系统中，为了不影响病毒蛋白的翻译，我们在ALSV-RNA2 108k多蛋白终止密码子的下游插入gRNA(s)。1B)。先前有报道称，终止密码子后的修饰可能会减少ALSV在初始感染阶段的积累，导致感染效率低(Kon和Yoshikawa [22])。因此，病毒RNA沉默抑制因子P19 (Kon和Yoshikawa [22];Zhang等。[44])共同浸润以改善初始CCAC感染。此外，我们克隆了一个102 bpPDS片段进入CCAC的MCS位点诱导VIGS(图2)。2A). PDS - VIGS的光漂白表型(Velásquez等。[37])作为病毒感染的可见指标(图2)。2B).因此，我们可以很容易地区分和选择感染的植物进行进一步的实验。

在本研究中，我们针对一个内源性基因座PDS(图2)。3.)和外源性EPSPS DNA片段n benthamiana，以及大豆中两种内源GW2类似物(图2)。4）.CCAC系统对所有检测的基因座进行了有效的编辑。Cas9和Csy4核酸酶在这些靶标上短暂表达。我们假设核酸酶的稳定表达将提高编辑效率(Ali等。)2];Yin等。[43])，因此，为优化和扩展CCAC在大豆中的应用，进一步开发稳定转化系统的实验正在进行中。我们还通过先前描述的方法测试了脱靶活性(Nekrasov等)。[28])。结果表明，CCAC(附加文件)的gPDS没有脱靶活性1图S1)。虽然需要更多的分析来评估全面的脱靶切割，但我们认为CCAC和传统U6驱动的gRNA所指导的脱靶活性可能是相同的，因为CCAC释放的gRNA序列和U6表达的gRNA序列是相同的。小模型(图1)3.D和4F和G)和更大的缺失(图2)。4E)由CCAC生成。我们没有测试hdr介导的核苷酸替代，其中通常需要DNA修复模板。尽管包括CCAC在内的RNA病毒载体不能用于携带DNA序列，但一些报道表明，RNA也可以作为DNA双链断裂修复的模板(Keskin等)。[20.];沈等。[31];阳和气[42])。因此，CCAC和其他植物RNA病毒可以携带RNA修复模板，用于cas9诱导的植物核苷酸替代。这是今后工作的一个非常重要的课题。

CCAC可以通过以下策略促进CRISPR-Cas9在大豆基因功能研究中的应用。首先，将Cas9-Csy4构建体常规送入大豆农杆菌属获得稳定的转基因品系。然后将目标特异性gRNA克隆到CCAC中，通过病毒感染传递到转基因系中进行基因组编辑。这样，Cas9和Csy4只进行一次稳定的转化。一旦制备出稳定表达Cas9和Csy4的转基因系，就可以通过病毒感染将靶向gRNA大规模、高效地传递到大豆中。这避免了由于目标的变化而不得不重复耗时和低效率的稳定转换。

综上所述，CCAC不仅可以用于短序列突变的单靶向，也可以用于大片段缺失的多靶向。它为cas9诱变提供了一种快速高效的gRNA传递方法，在大豆基因分析和通过CRISPR-Cas9基因组编辑进行性状改良中具有重要的实用价值。

质粒构建

所使用的引物在附加文件中列出1图S3。为了构建基于ALSV-RNA1的载体，从pEALSR1中扩增了包含35 S启动子、ALSV-RNA1序列和无终止子的ALSV-RNA1表达盒(Igarashi等)。15])使用引物M13-attB1-F0和M13-attB2-R0(附加文件1图S2A)。将PCR产物通过BP反应插入pDONR207中生成p207ALR1，然后将其转移到二元载体pEarleyGate301上生成二元质粒p301ALR1。

为了构建基于alsv - rna2的载体，采用重叠PCR技术引入了两个BsaI个站点和一个C4站点(附加文件)1图开通)。在第一轮PCR中，使用引物ALR2-扩增片段1XhoI-F和ALR2-Bsa以pEALSR2L5R5为模板的I-R;片段2用引物ALR2-扩增Bsa20-F和ALR2-SpeI-R2与pEALSR2L5R5作为模板。在第二轮PCR中，使用引物ALR2-进行重叠PCRXhoI-F和ALR2-SpeI-R2，以凝胶纯化片段1和片段2为模板。PCR产物经Xho我和SpeI，然后插入同样消化的pEALSR2L5R5 (Igarashi et al.) [15])，产生pEALSR2-BsaI-C4。其中之一BsapDONR207中的1个位点通过引物207-的定点诱变被去除BsaImut-F和207-BsaImut-R，生产p207m。从pEALSR2-中扩增出包含35 S启动子、ALSV-RNA2和no终止子的ALSV-RNA2表达盒BsaI-C4使用引物M13-attB1-F0和M13-attB2-R0。将生成的PCR产物通过BP反应插入到p207m中生成p207ALR2，然后通过LR反应转移到pEarleyGate301中生成二元质粒p301ALR2。

基于alsv - rna2衍生物的构建，包括p301ALR2-vPDS(用于PDS VIGS)、p301ALR2-vPDS- gpds(用于PDS基因组编辑)、p301ALR2-vPDS- geps1 - geps2(用于EPSPS基因组编辑)和p301ALR2-2gGW2(用于GW2基因组编辑)，在Additional file中进行了描述1图S2与附加文件中提供的序列1图S4。质粒pEG104-Cas9-P2A-Csy4 (Cas9-Csy4 construct)由6个模块质粒通过金门组装(Golden Gate assembly)构建1图S5)。结构和序列的细节在附加文件中描述1图S6和S7。为构建含有EPSPS序列的靶向质粒，从普通蚕豆(菜豆)引物EPSPS-F和EPSPS-R。PCR产物通过BP反应插入pDONR207中，然后通过LR反应转移到pEarleyGate301中生成p301-EPSPS(附加文件)1图S2C)。为了表达RNA沉默抑制因子，P19通过pBPMV-P19引物P19- f和P19- r扩增(Zhang等)。44astemplate])。PCR产物通过BP反应插入pDONR207，通过LR反应转移到pEarleyGate201，生成p201-P19。根据岩手大学与加拿大农业和农业食品部之间的材料转让协议以及加拿大食品检验局颁发的进口许可证(P-2013-02404)获得了ALSV分离株。所有研究材料均按照《植物有害生物处理设施控制标准》(工厂合规编号:PC-2013-032)中描述的植物有害生物控制1级要求进行管理。

金门组装和网关转移

金门组装时，将gRNA片段的PCR产物插入基于p207alr2的载体中，构建携带ALSV质粒的gRNA，将6模块质粒插入受体载体pGGZ001中，构建pEG104-Cas9-P2A-Csy4。金门克隆反应按照前面的描述进行(Lampropoulos等人)。[23])，并做了一些修改。简单地说，将0.5µl凝胶纯化的PCR产物(s)或每个模块0.5µl(每个150 ng/µl)与0.5µl载体(150 ng/µl)、0.5µl T4连接酶缓冲液(0.3µl)混合BsaI-HF (NEB, R3535L)， 0.3µl T4连接酶(NEB, M0202M)， 0.5µl T4连接酶缓冲液，总容积为5µl。反应进行了50个循环，分别为37°C 5 min和16°C 5 min，然后是50°C 5 min和80°C 10 min。对于携带ALSV质粒的gRNA, 0.5µlBsa加入I-HF, 37℃孵育1 h，切割未组装的p207alr2基载体。然后将反应转移到DH5α感受态细胞中进行克隆和筛选。将组装成p207alr2或pGGZ001的DNA片段通过LR重组反应转移到二元载体上。LR反应遵循LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen, 11791-020)的说明书。

序列分析

利用水稻GW2 (GenBank: EF447275)的氨基酸序列Blast大豆数据库进行同源性分析大豆Wm82.a2。v1在Phytozome v12.1。GW2同源物的同源性分析是基于Phytozome v12.1 (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）.

病毒侵袭与基因表达浸润n benthamiana

将二元质粒引入农在GV3101中电穿孔表达n benthamiana。如前所述进行了农业渗透(Kon和Yoshikawa [22])，并做了一些修改。简单地说,农培养物在30℃LB液体培养基中培养。细胞成球，并用浸润缓冲液(10 mM MgCl)洗涤两次₂， 100µM乙酰丁香酮)，然后在浸润缓冲液中重悬至最终OD₆₀₀= 0.5。病毒RNA沉默抑制因子P19总是与病毒构建体共农浸润。农携带p201-P19、p301ALR1、p301ALR2或其衍生物，按1:1的比例混合，孵育2h，然后用1ml注射器浸润到叶背面。对于病毒接种，n benthamiana有症状的叶片用接种缓冲液(0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl)匀浆₂)在研钵和杵中，然后机械接种到叶子上n benthamiana如前所述(Igarashi等。[15])。对于Cas9-Csy4构建体，农含有pEG104-Cas9-P2A-Csy4的基因浸润到植物叶片表面，其中三分之一的区域被vigs介导的PDS沉默光漂白。采用徕卡共聚焦显微镜TCS SP2 2 dpi成像观察荧光信号。

大豆毛状根转化

质粒被引入答:rhizogenesK599电穿孔转化大豆毛状根。毛状根变换按照前面描述的方法进行(Jian等。[16];Kereszt等。[19])，并做了一些修改。简单地说，一个答:rhizogenes将菌落悬浮于5 ml LB液体培养基中，30℃下培养过夜，20µl培养物在200 ml LB液体培养基中继代，30℃下培养16 h。将细胞制成颗粒，用液体LB重悬至OD₆₀₀= 0.5。威廉姆斯82大豆(大豆)品种用于答:rhizogenes介导的转换。在三个独立的实验中，每个结构共测试了45个种子。种子是根据Khandual和Reddy [21])，在Gamborg B5基础培养基(PhytoTechnology Laboratories, G398)上黑暗培养10天，或直到发芽或胚根出现。用无菌手术刀片切除出的根，剩余的完整种子作为外植体答:rhizogenes介导的转换。将外植体浸没在培养基中答:rhizogenes文化(OD₆₀₀= 0.5)在室温下培养30分钟，然后在无菌滤纸上干燥约30分钟。然后将干燥的外植体转移到½MS (Murashige & Skoog Modified Basal Medium with Gamborg维生素[PhytoTechnology Laboratories, M404])培养基中，其中含有2%蔗糖和0.8%琼脂(pH 5.4)。用滤纸覆盖培养皿，在黑暗中共同培养。共培养3天后，外植体用含有300µg/L丁香苷的无菌水洗涤3次，转移到含有2%蔗糖、0.8%琼脂和250 mg/L头孢氨苄(pH 5.7)的½MS固体培养基中诱导毛状根。在转移到新的½MS板之前，用镊子除去种皮。毛状根在室温下的光照条件下在密封的培养皿中生长。25天后收集毛状根，用于立即提取DNA或冷冻在液氮中，并在-80°C保存以备将来使用。

RNA和DNA分析

使用植物/真菌总RNA纯化试剂盒(Norgen, 31,350)从植物中提取总RNA。cDNA的合成使用5X iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, 1,708,890)。使用dnasy Plant Mini Kit (Qiagen, 69,106)提取DNA。标准PCR采用2X PCR Taq MasterMix加染料(abm, G013-dye)，高保真PCR采用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB, M0530S)。

基因组DNA突变检测

如前所述，用PCR-RE检测cas9诱导的DNA突变(Nekrasov等)。[28])，并做了一些修改。简而言之，高保真PCR是使用基因组DNA与或不限制酶切作为模板进行的。靶位点两侧的PCR引物如附加文件所示1图S3。PCR扩增产物用相应的限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳分析。预期的条带经凝胶纯化并通过金门组装插入pGGZ001中。引物Z001-F和Z001-R进行Sanger测序，检测插入DNA片段的潜在突变。通过ImageJ测量突变率，用未剪切条带的强度除以所有条带的强度计算突变率。所有的基因组编辑试验都使用不同的植物独立重复了至少三次。脱靶试验按先前描述的方法进行(Nekrasov等)。[28])。9个潜在的偏离目标(附加文件1图S1)，使用我我消化的基因组DNA，在这个项目中进行了测试。

本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章及其补充信息文件中。本研究中使用和/或分析的数据集可根据通讯作者的合理要求提供。

CRISPR / Cas9:

聚集规则间隔短回文重复序列/ crispr相关

gRNAs:

指导rna。

ALSV:

苹果潜伏球形病毒。

PDS:

八氢番茄红素desaturase。

中收取:

病毒诱导的基因沉默。

CCAC:

基于Cas9的csy4处理ALSV进位系统。

我们感谢Nobuyuki Yoshikawa博士(岩手大学)提供pEALSR1和pEALSR2L5R5, Steven A. Whitham博士(爱荷华州立大学)提供pBPMV-P19，我们感谢Addgene提供质粒PGK1p-Csy4-Pa [29]， pGGB003 [23]， pGGZ001 [23]和pHSN6A01 [39]。质粒pEarleyGate101 [11]， pEarleyGate201 [11]和pMDC32 [10]从拟南芥生物资源中心获取。我们也感谢熊如意博士和李芳芳博士的有益讨论。

本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会(NSERC)、中国国家自然科学基金(31400266和31501625)、中国国家重点研发计划(2018YFD1000705)和河北省自然科学基金(C2019301077和C2020301040)资助。资助机构在本研究的设计、数据的收集、分析和解释以及撰写手稿中没有任何作用。

从属关系

1. 加拿大农业和农业食品伦敦研究与发展中心，N5V 4T3，伦敦，ON，加拿大

   罗艳杰，Julia S. Nowak，陆青石，fracei Marsolais，田立宁

2. 河北省农林科学院粮油作物研究所，河北石家庄050031

   任娜和杨春燕

3. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081

   杨邱

贡献

L. T.制定了这项研究。Y.L.和L.T.设计实验;杨立良、王立南、王立南、杨志强、祁立林进行实验;F.M.为Y.L.和J.N. Y.L.提供研究资源、获得资金并共同监督Y.L.， R.N.和C.Y.撰写手稿并分析数据;所有作者审阅并参与修改稿件。

相应的作者

对应到衬里田。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

#目前地址:河北省农林科学院谷子研究所，河北石家庄050031

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