一种富含半胱氨酸的受体样蛋白激酶CaCKR5调节免疫反应Ralstonia solanacearum辣椒的感染

背景

富半胱氨酸受体样激酶(CRKs)是受体样激酶的一个大亚家族，在调节植物生长发育的多种生理过程中发挥着重要作用。

结果

CaCRK5对辣椒进行侵染，可诱导转录本Ralstonia solanacearum用水杨酸治疗。CaCRK5与绿色荧光蛋白的融合靶向质膜。抑制CaCRK5通过病毒诱导基因沉默(VIGS)使辣椒植株明显易受r . solanacearum感染，并伴有防御相关基因表达减少CaPR1，CaSAR8.2，CaDEF1而且CaACO1．过度的CaCRK5增强抵抗力r . solanacearum在烟草benthamiana．此外，电泳迁移率漂移试验和染色质免疫沉淀结合实时荧光定量PCR分析表明同源结构域拉链I蛋白CaHDZ27可以激活该蛋白的表达CaCRK5通过直接与启动子结合。酵母双杂交和双分子荧光互补(BiFC)分析表明，CaCRK5在质膜上与同源成员CaCRK6异二聚。

结论

我们的数据显示，CaCRK5在调节免疫反应中发挥了积极的作用r . solanacearum辣椒感染。

当植物受到病原体攻击时，植物免疫受体可以检测到病原体感染，并引发一系列防御反应。作为植物防御的第一道防线，模式识别受体(PRRs)识别病原体在感染期间释放并触发植物免疫的微生物相关分子模式(MAMPs) [1］．越来越多的证据表明，植物表面定位的PRRs要么是受体样激酶(rlk)，要么是受体样蛋白(RLPs) [2，3.］．特征明确的prr包括拟南芥富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat, LRR)受体激酶FLAGELLIN SENSING 2 (FLS2)和EF-TU receptor (EFR)可识别细菌鞭毛蛋白[4]和EF-Tu [5),分别。RLKs是一个跨膜蛋白超家族，在多种信号转导途径中起着重要作用。在高等植物中，模型植物中约有610个rlk拟南芥［6]而水稻则有近1000种[7］．典型的RLK包含一个细胞外受体、一个跨膜结构域和一个细胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域[6］．虽然大多数RLKs的作用尚不清楚，但据报道，许多RLKs可调节植物的生理过程，包括发育、激素感知和防御反应[8］．

富含半胱氨酸的rlk (CRKs)的特征是在n端胞外受体区域存在1到4个未知功能域26 (DUF26)副本和C-X8-C-X2-C基体[9］．保守的Cys残基可能需要通过二硫键形成蛋白质的三维结构[10]，可介导蛋白质-蛋白质相互作用[11］．据报道，CRKs参与了免疫反应的调节[12，13，14］．大部分CRKs都在拟南芥在转录水平上由病原菌攻击和SA应用诱导[15，16］．一些CRKs在对病原体感染的反应中具有功能特征。例如，CRK45在拟南芥抗病性。CRK45过度表达增强了抵抗力两，而crk45突变体更容易p .两［16］．LecRK-VI。2，一个positive regulator of pattern-triggered immunity (PTI), induces the expression of 7 CRK genes (CRK4/6/7/13/23/36/37)拟南芥．其中，过度表达CRK4，CRK6而且CRK36增强对细菌病原体的抗病能力太平洋标准时间DC3000通过正向调节PTI反应[17］．此外，最近的研究表明，一些CRKs可以与RLKs形成受体复合物，并在植物中发挥转导PTI信号的作用。据报道，增加表达CRK28在拟南芥增强ROS爆发和抗病能力两页。CRK28与FLS2/油菜素类固醇不敏感的1-相关激酶1 (FLS2/BAK1)免疫复合物相关，并与密切相关的CRK29在拟南芥［18］．然而，CRKs如何调节辣椒的防御反应仍不清楚。

青枯病是世界上最具破坏性的细菌性疾病之一，主要由土壤传播细菌引起r . solanacearu米(19，20.］．病原体感染广泛的经济作物，但特别具有毁灭性Solanace植物，如番茄、烟草和胡椒[21］．在这里，我们报告了一种CRK蛋白CaCRK5的鉴定，它在辣椒反应中起积极的调节作用r . solanacearum感染。抑制CaCRK5通过病毒诱导基因沉默(VIGS)在辣椒植株中增加了对病原体的易感性。相比之下，过度表达CaCRK5在n benthamiana增强对病原体的抵抗力。此外，电泳迁移率转移试验(EMSA)和染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR分析显示，转录因子CaHDZ27上调了细胞的表达CaCRK5通过与启动子结合。此外，酵母双杂交和双分子荧光互补(BiFC)分析的数据表明，CaCRK5与其同源物CaCRK6在质膜上相互作用。这些结果揭示了CaCRK5在调控辣椒反应的调控网络中起着至关重要的作用R.solanacearum表明CaCRK5是提高辣椒枯萎病抗性的有效靶点。

CaCRK5编码一种病原体诱导的精氨酸天门冬氨酸(RD)家族受体激酶

在cDNA扩增片段长度多态性(cDNA amplification fragment length polymorphism, cDNA- aflp)实验中，设计分离出与辣椒抗侵染有关的基因r . solanacearum的部分cDNA片段CaCRK5得到[22］．接种后其表达显著上调r . solanacearum，我们决定进一步研究该基因的功能。CaCRK5从cDNA文库中分离得到cDNA克隆r . solanacearum辣椒自交系CM334接种叶片。从CaCRK5的cDNA克隆中得到的蛋白质含有669个残基。聪明的(http://smart.embl-heidelberg.de/)对结构域结构的分析预测，cacr5由两个富半胱氨酸DUF26结构域(PFAM01657, Stress-antifung结构域)、一个跨膜区域和一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(PFAM07714)组成，因此CaCRK5属于富半胱氨酸激酶家族[10］．此外，CaCRK5在蛋白激酶结构域含有一个保守的精氨酸-天冬氨酸(RD)基序(附加文件)1)．对于大多数RD激酶，激活环中的磷酸化对于触发激酶活性至关重要，通常显示出磷酸化/自磷酸化能力。非rd激酶通常表现出较低的激酶活性，因为缺乏激活环自磷酸化。RD激酶和非RD激酶通常合作控制植物的先天免疫信号[23，24，25，26］．

辣椒CRK家族的全基因组鉴定

为了获得更多关于辣椒CRK的信息，我们对辣椒基因组中的CRK基因家族进行了评估，利用DUF26结构域(PFAM01657)的隐马尔可夫模型(HMM)谱图对辣椒品种CM334蛋白质数据库(http://cab.pepper.snu.ac.kr/)．的拟南芥CRK基因家族序列[10]作为查询序列，对PGP (Pepper Genome Platform)和NCBI数据库进行检索。使用NCBI-CDD和SMART进一步对确定的候选结构域进行分析，以确保特定CRK蛋白的三个基本结构域的存在，包括应力反峰结构域、跨膜结构域和激酶结构域。在辣椒品种CM334基因组中共鉴定出27个CRK基因(CaCRKs)，根据其在染色体上的定位，编号为CaCRK1 ~ CaCRK27。除CaCRK13/24/25只有一个DUF26域外，大多数crk都含有两个DUF26域。组成CaCRK蛋白的氨基酸数在332 ~ 1120之间，分子量在36.76 ~ 128.25 kDa之间。CaCRK的预测等电点范围为5.53 ~ 9.37(附加文件2)．

染色体物理定位分析表明，27个CaCRKs分布在辣椒基因组12条染色体中的7条上。2号染色体含有最多的CRKs，共9个基因(34.6%)，而12号染色体仅含有1个基因。基因聚类是CRK基因分布最常见的特征。22个CRKs在同一染色体上串联重复，没有或只有一个介入注释基因。(例如CaCRK1-7, CaCRK10/11, CaCRK14/15, CaCRK16-19, CaCRK20/21, CaCRK22/23和CaCRK24-26)。利用辣椒CRK蛋白全长序列，采用邻居连接法(NJ)构建无根系统发育树，进行系统发育分析。结果表明，根据系统发育关系，辣椒CRKs可分为I ~ IV个亚科。IV是最大的亚族，包含13个CRKs, III是最小的亚族，仅包含2个CRKs (CaCRK10/11)。亚家族II包含5个CRKs (CRK13-15和CRK20/21)，亚家族I包含7个CRKs (CaCRK1-7)，均位于2号染色体上。除CaCRK22/23外，系统发育树中位于串联重复序列的CRKs均聚集在同一进化支中3.)．这些结果表明，CRKs在辣椒中的扩增可能是由于串联复制。这种分布和物理聚类模式与中CRKs相一致拟南芥［18]和大豆[27］．

的表达CaCRK5的感染反应r . solanacearum外源性SA、MeJA、ETH处理

描述…的表达模式CaCRK5进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析。6周龄辣椒植株叶片接种r . solanacearum．CaCRK5在接种后随时间迅速上调r . solanacearum在接种后12 h达到最高表达水平(hpi)，约为对照的12.4倍(图2)。1a).接下来，我们确定的响应CaCRK5与防御相关的信号分子水杨酸(SA)，茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯利(ETH)。结果表明CaCRK5在SA处理后显著增加，并在48 h达到峰值。相比之下，MeJA或ETH处理时观察不到明显的变化(图2)。1b).这些结果表明CaCRK5参与了胡椒防御r . solanacearum入侵，可能是通过sa介导的防御信号。

CaCRK5的亚细胞定位

由于CaCRK5编码了一个潜在的跨膜结构域，因此被预测定位在质膜上。为了验证这一假设，在CaMV 35s启动子的控制下，CaCRK5与绿色荧光蛋白(GFP)融合。CBL1n蛋白，已知定位于质膜[28]，与红色荧光蛋白(RFP)融合。35个年代：绿色荧光蛋白，35个年代：CaCRK5-GFP和35个年代：CBL1n-RFP在叶表皮细胞中n benthamiana。如图所示。2，35 s:绿色荧光蛋白Construct作为阴性对照，绿色荧光在细胞内无所不在分布。CaCRK5-GFP的绿色荧光与质膜上的红色荧光重叠非常紧密，表明质膜在植物细胞中的定位。

沉默的CaCRK5在辣椒植物中增加易感性r . solanacearum感染

评估…的作用CaCRK5在辣椒之间的相互作用和龙葵，在辣椒幼苗中进行病毒诱导基因沉默(VIGS)的功能丧失实验[29］．特定片段CaCKR5以辣椒植物烯去饱和酶(CaPDS)构建物为阳性对照，进行标准的VIGS程序。如附加文件所示4时，植物新生真叶发生光漂白农杆菌属携带李，说明VIGS系统的工作效率很高。

CaCRK5以沉默(TRV:CaCRK5)和空病媒控制(TRV:00)辣椒植株为对照r . solanacearum挑战。qRT-PCR分析显示CaCRK5期间，辣椒叶片中的含量显著下调r . solanacearumVIGS植物的感染(图;3.A)，表明CaCRK5都被有效地压制住了。表型分析表明CaCRK5沉默的辣椒植株表现出比对照植株更严重的病害症状r . solanacearum感染(图。3.b).接种后6天起r . solanacearum，CRK5沉默的辣椒植株表现出更快的病害发展。疾病指数CaCRK5与对照植物相比，沉默植物显著增加。3.c).解决是否静音CaCRK5影响生长r . solanacearum，测定细菌数量。如图所示。3.D，成长r . solanacearum显著增强了CaCRK5沉默植株接种叶后3天，与对照植株比较。基于这些观察，我们认为CaCRK5参与辣椒的防御反应。

接下来，我们研究了细胞死亡和氧化爆发CaCRK5静音，控制组离开。台盼蓝及DAB染色证实超敏细胞死亡及H₂O₂的积累明显减少CaCRK5接种48 h后叶片沉默r . solanacearum(无花果。3.E)，表明CaCRK5在与过敏反应细胞死亡相关的早期防御反应中起关键作用r . solanacearum感染。我们进一步确定了CaCRK5辣椒防御相关基因表达的沉默研究r . solanacearum感染。qRT-PCR分析显示CaCRK5辣椒叶片的沉默显著减弱了防御相关基因的表达，包括CaNPR1［30.]，CaSAR8.2［31]，CaDEF1［32),CaACO1［33),在r . solanacearum感染(图。3.f)。

过度的CaCRK5在n benthamiana降低对r . solanacearum感染

函数增益法也被用于研究的函数CaCRK5在辩护反应中。由于辣椒遗传转化的再生植株难以获得，我们选择了n benthamiana植物，这也是宿主r . solanacearum．至少10个转基因n benthamiana通过卡那霉素耐药分析，获得了菌株。两个T_3.CaCRK5过表达线表现出本构表达式(图;4a和附加文件5)，并用于后续实验。

4周龄野生型和转基因植株(L3和L7)接种r . solanacearum．的影响CaCRK5对青枯病的发展进行了过表达研究。如图所示。4b,CaCRK5与野生型相比，过表达植株在接种后12 d表现出较弱的症状。野生型植株在接种6 d后出现枯萎症状，接种14 d后完全死亡r . solanacearum．的CaCRK5与野生型植物相比，过表达植物表现出明显的延迟枯萎症状(图2)。4C)，表明过度表达CaCRK5增强对疾病的耐受性r . solanacearum在n benthamiana．此外，防御相关基因的表达，包括NtPR2，NtPR3，NtHSR201和NtHSR505，经qRT-PCR检测。分析表明，这些测试的防御相关基因的表达增加CaCRK5与野生型植物相比，在接种期间过表达的植物r . solanacearum(无花果。4d).总的来说，这些数据表明CaCRK5过度表达增强了防御反应r . solanacearum感染n benthamiana．

的表达式CaCRK5是由转录因子CaHDZ27

更好地理解的调控机制CaCRK5的上游有一个2000 bp的启动子区CaCRK5识别编码序列。使用PlantCARE数据库进行序列分析(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)建议独联体的启动子中的元素CaCRK5包括2个参与水杨酸反应的tca元素，5个MYB转录因子结合位点，1个MYC结合位点。此外，HD-Zip亚族I成员CaHDZ27的已知结合位点(CAATTATTG)位于−625和−617之间。CaHDZ27也调节辣椒的防御r . solanacearum感染(34，我们推测CaCRK5可能是CaHDZ27的目标。

电泳迁移率变化分析(EMSA)研究了CaHDZ27与dna的相互作用CaCKR5启动子，发现CaHDZ27与cy5标记的结合CaCKR5启动子探针。此外，随着未标记探针浓度的增加，结合逐渐减弱，这表明CaHDZ27特异性地与CAATTATTG结合CaCKR5启动子在体外(无花果。5a和附加文件5)．通过染色质免疫沉淀(ChIP -qPCR)检测CaHDZ27与dna的相互作用CaCKR5启动子在活的有机体内．浸润后2天用农杆菌属采集含有35s:HA- cahdz27或35s:HA的菌株GV3101，辣椒叶进行ChIP检测。用抗ha抗体免疫沉淀辣椒叶片染色质，用qRT-PCR检测DNA样品的富集。结果表明，CaHDZ27在黄芩中富集显著CaCKR5启动子，且接种后富集显著增强r . solanacearum(无花果。5b和c)，表明CaHDZ27可以与CAATTATTG结合CaCKR5启动子在体外方法增强了绑定r . solanacearum感染。

为了进一步研究CaCKR5在转录水平上被CaHDZ27调控，我们瞬时表达35个年代：CaHDZ27-GFP以35s:GFP渗透叶片为阴性对照。qRT-PCR分析表明CaCKR5与对照相比，35s:CaHDZ27-GFP浸润叶片的含量增加。6a).用抗gfp抗体免疫印迹证实了CaHDZ27在辣椒叶片中的存在(图。6b和附加文件5)．当CaHDZ27被VIGS沉默，转录水平r . solanacearum全身的CaCKR5会显著减少CaHDZ27-沉默植株与TRV:00渗透植株的比较(图;6c和d).这些数据表明CaCKR5CaHDZ27正向调控。

CaCRK5与CaCRK6相互作用

先前的研究表明，植物利用免疫受体复合物来感知MAMPs和效应物，从而触发诱导免疫防御[35，36，37，38]，而一些crk之间也有相互作用的报道，如AtCRK28/AtCRK29 [18]及AtCRK39/AtCRK40 [39］．根据这些报道，我们推测CaCRK5可能与包括CaCRK6在内的其他同源物形成了络合物。因此，我们研究了CaCRK5是否能与与CaCRK5有77.4%氨基酸序列相同的CaCRK6异二聚。

dnaCaCRK5而且CaCRK6分别克隆到pGBKT7和pGADT7载体上，得到dna结合域(BD)和激活域(AD)融合体。BD-CaCRK5/AD-CaCRK6、BD-CaCRK6/AD-CaCRK5和pGBKT7-53/pGADT7-T(阳性对照)转化酵母细胞可在SD/- trp - leu - he - ade培养基上生长。相反，阴性对照组没有观察到生长。结果表明，CaCRK5与CaCRK6在酵母细胞中相互作用(图2)。7a).为了进一步确认CaCRK5和CaCRK6之间的相互作用，我们进行了双分子荧光互补(BiFC)实验。将CaCRK5和CaCRK6融合到黄色荧光蛋白(YFP)的N端和c端，分别生成CaCRK5- nyfp /CaCRK6- cyfp和CaCRK5- cyfp /CaCRK6- nyfp。然后，这些结构瞬时共表达n benthamiana叶子。浸润48 h后，用共聚焦显微镜检测YFP荧光信号。如图所示。7b，在质膜上观察到YFP荧光n benthamiana叶子。这些结果表明，在植物细胞的质膜上，CaCRK5与CaCRK6异质二聚。

串联重复序列促进了CaCRK家族在辣椒中的扩展

CRKs是植物RLKs的一个亚科。本研究从辣椒基因组中鉴定出27个CaCRKs;22个CRKs串联重复出现，在染色体的特定位置形成物理簇。以往的研究表明，很大一部分RLK基因存在于串联重复序列中[40，41，42］．串联重复序列往往参与植物的胁迫反应[43，44，45］．串联重复序列的扩增和程度与RLK基因的应激反应性显著相关[43］．辣椒CaCRKs序列重复可能促进胁迫适应进化。

CaCRK5对辣椒的抵抗起到了积极作用r . solanacearum

先前的研究表明，一些CRK成员包括AtCRK29在拟南芥对病原体、SA和flg22的治疗产生了反应[18，46，47]，表明这些CRKs在植物免疫中起作用。CaCRK5最接近的同源物拟南芥AtCRK29蛋白与CaCRK5蛋白的同源性为41.6%。在研究中，表达CaCRK5随着时间的推移而增加r . solanacearum在感染的早期，基因表达水平较高。CaCRK5在SA治疗后明显上调，而CRK5观察MeJA和ETH处理的效果。SA、JA或ET介导的信号通路参与植物对不同病原体的防御反应[48，49，50］．SA通常在植物对生物营养性病原体的反应中起积极作用[51]，而JA和ET通常被认为是植物对坏死性病原体反应的主要调节因子[52］．作为CaCRK5是由感染引起的r . solanacearum和SA，而不是MeJA和ETH，我们推测CaCRK5在辣椒反应早期起积极的调节作用r . solanacearum,当r . solanacearum处于生物营养阶段。

基于GFP融合的亚细胞定位，CaCRK5很可能定位在质膜上。其他几个CRKs也被报道定位在质膜上，包括CRK4, CRK6和CRK36拟南芥［17]和GbCRK18 [53］．以trv为基础的VIGS系统研究CaCRK5在回应r . solanacearum感染。的表达CaCRK5显著降低了CaCRK5-使辣椒植株沉默r . solanacearum感染。CaCRK5-沉默的辣椒植株导致对r . solanacearum辣椒叶显著降低H .₂O₂积累和细胞死亡。这些发现表明CaCRK5可能在辣椒抗性中起积极调节作用r . solanacearum感染。一致地,CaCRK5超表达n benthamiana植物表现出增强的抗侵染能力r . solanacearum．

CaCRK5是由CaHDZ27

HD-Zip转录因子根据序列相似性分为四个亚家族(HD-Zip I-IV) [54]，而HD-Zip I被报道在生物和非生物应激反应中发挥作用[55］．HD-Zip I成员CaHDZ27在辣椒胁迫反应中起正向调节作用r . solanacearum感染(34］．在这里，我们证明了CaHDZ27作为一个积极的调节CaCRK5， CaHDZ27结合9 bp的CAATTATTG基序CaCRK5EMSA和ChIP-qPCR检测启动子。在CaHDZ27瞬时表达的辣椒叶片中，CaCRK5的表达增加，而在CaHDZ27瞬时表达的辣椒叶片中CaCRK5的表达减少CaHDZ27用接种剂使辣椒植株沉默r . solanacearum．CaCRK5在辣椒抗性中发挥积极作用r . solanacearum感染，与CaHDZ27的作用一致。这些结果表明，CaCRK5和CaHDZ27协同调节辣椒的防御r . solanacearum感染。

CaCRK5与CaCRK6异二聚

CRK可与密切相关的同源物形成异源二聚体[18，39］．酵母双杂交和双分子荧光互补分析表明，在酵母和植物细胞中，CaCRK5与CaCRK6在体内异二聚。最近的证据表明，模式识别受体(PRRs)能够快速招募其他rlk，包括CRKs，以增强PRR信号强度[18，46］．CaCRK5可能与CaCRK6和其他rlk在辣椒防御中协同作用r . solanacearum感染。

总之，我们的数据表明CaCRK5显著有助于免疫防御r . solanacearum胡椒和n benthamiana．辣椒植物中VIGS及其功能获得性分析CaCRK5在n benthamiana透露,CaCRK5正向调节植物免疫反应。此外，CaHDZ27促进蛋白的表达CaCRK5直接与启动子结合。我们认为CaHDZ27可能会增强由CaCRK5介导的辣椒防御反应。CaCRK5基因参与了辣椒的先天免疫反应，有望成为提高辣椒枯萎病抗性的基因工程靶点。

植物材料和病原接种

胡椒(甜椒栽培品种Fj8)来自福建农林大学辣椒育种组，表现为中等抗性r . solanacearum中国法福大学何水林教授发现的感染。辣椒和n benthamiana植物生长在含有蒸汽灭菌土壤的塑料盆中，26°C，长日光周期(光照16小时/黑暗8小时)，相对湿度为60%。

的强毒株FJC100301r . solanacearum在本研究中使用。r . solanacearum菌株在含三苯四唑氯化铵(台州学院)的casamino蛋白胨琼脂(CPG)平板上培养，单菌落在PSA(马铃薯蔗糖琼脂)培养基中28℃培养2天。用无菌的10 mM MgCl收集细菌细胞溶液₂，将悬架调整为1.0 × 10⁸CFU /毫升。采用根灌法接种细菌。切断植物根系后，每盆土壤中加入30 mL菌液。接种植物叶片，10µL菌液悬浮液r . solanacearum用无针注射器渗透到6周龄辣椒植株叶片中，对MgCl₂溶液在模拟处理的植物中浸润。如前所述，对每一种植物，计算0至4级的疾病指数[22］．

菌株生长

的成长r . solanacearum通过定量测定辣椒叶片中细菌的增殖情况。为此，每个样品在接种后3天收集4个直径为0.5 cm的叶盘，并在1ml无菌水中研磨。稀释液镀于台州学院固体培养基上，28°C孵育48小时。计数菌落，以每平方厘米叶组织cfu为单位。病原体生长试验重复3次，每个基因型至少包含3株植物。

亚细胞定位

亚细胞定位检测以cDNA为模板扩增CaCRK5编码区(5-ATGCCTATTCAGAAGTGGC-3和5-TCATGCCTGAATACGTGATG-3)，克隆到pMDC83载体中，得到35 S:CaCRK5- gfp构建物，并将其导入根癌土壤杆菌冻融法分离GV3101。农携带35S: CaCRK5-GFP/35S:CBL1n-RFP(质膜标记物)或35S: GFP/35S:CBL1n-RFP(1:1比例;OD600 = 0.8)重悬在缓冲液[10 mM 2-(N-morpholino)-乙烷磺酸，10 mM MgCl₂和200µM乙酰丁香酮，pH5.7]，并渗透到叶片中n benthamiana(4周大)使用注射器[22］．农渗透n benthamiana植株在26℃光照16 h /暗8 h的循环条件下生长。对于每个结构组合，三个幼苗n benthamiana每株幼苗用农文化。利用共聚焦激光扫描显微镜(TCSSP8;徕卡，索姆，德国)。

病毒引起的基因沉默

以烟草摇铃病毒(TRV)为基础的病毒诱导基因沉默系统用于辣椒基因沉默。为了实现CaCRK5或CaHDZ27特异性沉默，DNA片段在3 ' -非翻译区CaCRK5(5- actattctcacagcacc -3和5-GAATTCGAACAAATAACA-3)和CaHDZ27(5-TTCCACAAGAGAATAGTG-3和5-GGAACAAAGCTAATAAA-3) PCR扩增，克隆到含有烟草摇鼓病毒(TRV)部分基因组的pTRV2载体上，得到TRV2:CaCRK5或TRV2:CaHDZ27。这些质粒被引入农冻融法分离GV3101。植物素去饱和酶(PDS)被用作指示基因，其表达被充分减少，以产生光漂白表型。农GV3101携带TRV1和pTRV2:00(空载体)或TRV2:CaCRK5或TRV2:CaHDZ27共同渗透到辣椒植株完全扩张的子叶中。然后，植物在16℃下孵育56 h，在26℃下生长。每个处理至少50株，重复3次。

外源激素治疗

以4周龄辣椒植株为研究对象，分析了CaCRK5是对外源性激素应用的反应。植物喷洒1mm SA(10%蒸馏乙醇)，100µM MeJA(10%蒸馏乙醇)和100µM ETH(无菌双蒸馏H₂分别O)。用相应的溶剂或ddH喷洒模拟植株₂O。

RNA提取和实时定量RT-PCR

叶子来自三种不同的辣椒或n benthamiana收集植物，使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取总RNA。RNA浓度用Nanodrop 2000(赛默飞世尔科学公司)测定，完整性用琼脂糖凝胶电泳检测。使用HiScript®Q RT supermix for qPCR reagent Kit with gDNA wiper，按照制造商说明书(Vazyme)进行反转录，采用非模板阴性对照检测引物二聚。实时RT-PCR分析使用Bio-Rad实时PCR系统(Foster City, CA, USA.)和SYBR Premix ExTaq II系统(Takara)进行。的相对表达式CaCRK5防御相关基因用2^−ΔΔCt方法。为了描述防御相关基因的表达(CaNPR1，CaSAR8.2，CaDEF1而且CaACO1)CaCRK5沉默辣椒，相对转录水平归一化到对照(TRV:00)使用CaActin而且Ca18S rRNA基因作为内部参考。评估防御相关基因的表达(NtPR2，NtPR3，NtHSR201和NtHSR505)CaCRK5转基因n benthamiana植物，相对转录水平归一化到野生型使用NtActin而且NtEF1α基因作为内部参考。引物列在附加文件中6，熔化曲线列于附加文件7．

酵母双杂交分析

pGADT7载体用于GAL4 AD, pGBKT7载体用于GAL4 BD，将CaCRK5和CaCRK6的orf扩增并克隆到pGADT7中，生成AD-CaCRK5和AD-CaCRK6结构体。将CaCRK5和CaCRK6的cdna扩增并克隆到pGBKT7中，生成BD-CaCRK5和BD-CaCRK6结构。相应的AD和BD质粒共转化为Y2H金酵母菌株。将含有所示质粒的转化子置于SD (Synthetic Dextrose)筛选培养基上，在30°C下孵育至菌落形成。在SD/-Trp-Leu培养基上进行筛选后，将酵母细胞转移到SD/-Trp-Leu- his - ade培养基上进行相互作用评价。

双分子荧光互补法

为了生成BiFC结构，将CaCRK5和CaCRK6全长cdna克隆到puck - spyne中^吉瓦(CaCRK5-YFP^N和CaCRK6-YFP^N)和pucs - spyce^吉瓦(CaCRK5-YFP^C和CaCRK6-YFP^C)，其中包含YFP的n端或c端片段(分别为nYFP或cYFP)。由于CabZIP63作为转录因子，CabZIP63- yfp^N和CabZIP63-YFP^C以CaCRK6-YFP^N和CaCRK6-YFP^C,分别。这些结构被引入农冻融法分离GV3101。为瞬时表达，细胞混合农菌株GV3101转染4周龄叶片n benthamiana植物。显微分析用共聚焦激光扫描显微镜观察下表皮细胞。

n benthamiana转换

转基因n benthamiana植物是通过使用而产生的农介导的n benthamiana叶盘转化[56］．将CaCRK5编码区克隆到pK7WG2载体中得到35个年代：CaCRK5构造，然后它被引入农GV3101，用于变换n benthamiana．新鲜的叶片被切下来N.benthamiana，在GV3101细胞悬液(OD = 0.6)中浸泡7-10分钟。无菌纸上干燥后，将叶盘转移到基础Murashige和Skoog (MS)琼脂培养基中，28°C在黑暗中孵育2-3天。用无菌水清洗叶片后，将叶片置于含有卡那霉素的选择培养基上。至少10家独立公司n benthamiana获得转基因株系，并检测其表达CaCRK5通过rt - pcr。选择的转基因株系为自花授粉的T_3.获得种子并将其种植在每毫升含有50µg卡那霉素的MS琼脂板上用于研究。

组织化学染色

组织化学染色如前所述[22］．用台盼蓝染色观察细胞死亡反应，用DAB溶液观察H₂O₂检测。

电泳迁移率漂移测定(EMSA)

转化诱导CaHDZ27-GST融合蛋白的表达大肠杆菌通过添加IPTG(异丙基β- d -1-硫半乳糖yranoside, 0.05 mM)，在37℃下4 h，从细胞中提取重组蛋白，并使用BeaverBeads™GSH蛋白纯化试剂盒根据制造商的说明进行纯化。

EMSA按上文所述进行[57］．合成cy5标记的DNA片段并用作探针，而相同序列的未标记DNA则用作竞争对手。

染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR分析

采用前面所述的方法进行ChIP检测[22］．用35 S:HA-CaHDZ27浸渍后2天提取辣椒叶片染色质，用1%甲醛(v/v)交联。用探针超声器将染色质分解成平均长度为300 ~ 500 bps的片段。用抗ha抗体免疫沉淀DNA片段。采用实时荧光定量PCR技术对DNA样品进行富集分析。数值以相对富集比表示，阴性对照(35 S:HA，模拟处理)的值设为“1”。用于ChIP-qPCR的引物在附加文件中列出6．

生物信息学工具

从CM334 (v1.55)蛋白质数据库(http://cab.pepper.snu.ac.kr/)．用NCBI-CDD分析ckr的结构域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) [58]及SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) [59］．利用DNAMAN 6.0软件将推导出的CaCRK5激酶结构域与AtCRK28和AtBAK1进行比对[60］．功能预测独联体-使用PlantCARE执行CaCRK5启动子中的调控元件[61］．

利用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)．采用MEGA version 7.0软件构建无根系统发育树[62]，采用近邻加入法，进行1000次自举试验。利用CM334 (v1.55)蛋白数据库验证了辣椒CRK基因家族成员的染色体定位，采用MapInspect 1.0软件(https://mapinspect.software.informer.com/)．

本研究所述的测序数据可在辣椒基因组数据库(http://cab.pepper.snu.ac.kr/)在附加文件中列出的注册编号下2．在当前研究期间生成和/或分析的数据集包括在本文及其附加文件中。任何合理的要求都可以从通讯作者那里得到。

CRK:

富半胱氨酸受体样激酶

中收取:

病毒引起的基因沉默

PRR:

模式识别受体

MAMP:

微生物相关分子模式

PTI:

Pattern-triggered免疫力

嗯:

隐马尔可夫模型

r . solanacearum：

Ralstonia solanacearum

n benthamiana：

烟草benthamiana

现病史:

接种后小时

山:

水杨酸

惩罚:

甲基jasmonate

乙:

乙烯利

菌落:

克隆形成单位

DUF26:

未知函数域26

RLK:

受体激酶

RLP:

受体蛋白

远程雷达:

富亮氨酸重复

FLS2:

鞭毛蛋白感应2

EFR声码器作为:

EF-TU受体

EMSA:

电泳迁移率漂移测定

芯片:

染色质免疫沉淀反应

BiFC:

双分子荧光互补

cDNA-AFLP:

cDNA扩增片段长度多态性

PGP:

辣椒基因组平台

我们感谢Mark D. Curtis提供Gateway目的地向量和s.p. Dinesh-Kumar博士(耶鲁大学)提供pTRV1和pTRV2向量。

国家自然科学基金(31301254,31372061,31601761,31401312,31260482)，福建省自然科学基金(2018J01616)，福建农林大学科技创新专项基金(CXZX2016079)资助。资助机构在研究设计、数据分析和手稿准备中没有任何作用。

从属关系

1. 福建农林大学生命科学学院，福建福州350002

   牟绍良，钱倩孟，高峰，张婷婷，何卫红

2. 福建农林大学福建省高校应用遗传学重点实验室，福建，福州，350002

   牟绍良，何倩倩孟，高峰，张婷婷，何卫红，关德义，何水林

3. 植物遗传改良教育部重点实验室，综合利用福建农林大学，福建，福州350002

   牟绍良，何倩倩孟，高峰，张婷婷，何卫红，关德义，何水林

4. 福建农林大学农学院，福建，福州，350002

   关德义，何水林

贡献

SM和SH构思并设计了这项研究。SM、FG、QM、TZ和WH组织并进行了实验。SM和FG分析了数据。SM和SH撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Shuilin他．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者没有利益冲突需要声明。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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