NAC转录因子对猕猴桃创伤乙烯生物合成的调控

背景

植物激素乙烯在植物发育过程中控制着许多过程，并作为响应生物和非生物胁迫的关键信号分子:它在洪水、伤害、干旱和病原体攻击以及脱落和果实成熟过程中迅速诱导。猕猴桃(猕猴桃(Spp .)，果实成熟的特征是两个不同的阶段:系统-1乙烯生物合成的早期阶段，以缺乏自催化乙烯为特征，随后是自催化(系统-2)乙烯的晚期爆发，伴随着香气的产生和进一步的成熟。猕猴桃果实成熟的转录调控已经取得了进展，但系统-1乙烯生物合成的调控仍不清楚。这项工作的目的是更好地了解猕猴桃器官中乙烯生物合成两个系统的转录调控:果实和叶子。

结果

猕猴桃的分子生物学研究(答:对)显示机械损伤后叶片和果实中乙烯生物合成的调控不同。在水果中，乙烯生物合成伴随着1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合酶(ACS)、ACC氧化酶(ACO)和NAC类转录因子(tf)成员的转录增加。然而，在猕猴桃叶片中，伤口特异性的转录增加基本不存在，尽管与水果相比，猕猴桃叶片诱导乙烯产生的速度更快，这表明猕猴桃叶片中的转录后控制机制更为重要。一位ACS成员，AcACS1，似乎发挥了主要的双重作用;控制果实缠绕(系统1)和自催化成熟(系统2)乙烯生物合成。在猕猴桃中，果实中system-1和-2乙烯的转录调控似乎是由四个NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2) tf (AcNAC1-4)，导致AcACS1表达式直接绑定到AcACS1启动子显示使用凝胶位移(EMSA)和激活AcACS1启动子在足底基因激活试验与启动子缺失分析相结合。

结论

研究结果表明，猕猴桃中NAC转录因子AcNAC2-4通过调控猕猴桃损伤和成熟过程中乙烯系统-1和-2的生物合成AcACS1表达水平，但不是在叶片转录后/翻译调节机制可能占上风。

植物激素乙烯控制植物发育中的许多过程，并作为响应生物和非生物胁迫的关键信号分子:它被洪水、伤害、干旱和病原体攻击等胁迫信号迅速诱导[1，2，3.]，以及其他重要的生理过程，如脱落、生殖生物学和果实成熟[4，5，6，7，8］．乙烯通过正负反馈循环调节自身的生物合成[9，10，11，12]从而提出了两套乙烯调控体系[13］．System-1乙烯具有自抑制作用，与少量乙烯有关。当乙烯被伤害或病原体诱导时，它会迅速下调。系统2是自催化的，在某些物种的果实成熟和花瓣衰老过程中发生[14，15]，并且通常伴随着呼吸的增加(“更年期上升”)。

乙烯是由氨基酸蛋氨酸合成的，它被转化为年代-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶。SAM经ACC合成酶(ACS)转化为1-氨基环丙烷羧酸(ACC)和5 ' -甲基硫代腺苷(MTA) [16］．最后一步是ACC氧化酶(ACO)将ACC转化为乙烯[17］．向植物中添加基质ACC会产生乙烯[18，19，20.]，表明乙烯生物合成的关键调控步骤由ACS控制[12，17，21］．ACS在植物中受到转录和转录后水平的调控。相比之下，ACO一般在系统-1中组成型表达，但在系统-2中强烈诱导，因此可能只在成熟后期起限制作用[22，23，24，25，26］．

乙烯调控研究最深入的领域之一是番茄(茄属植物lycopersicum)果实的发育和成熟(图;1)．番茄果实经过明确的生长阶段，从成熟的绿色、浅红色、橙色到红色，逐渐成熟[28］．成熟的绿色到破碎阶段与乙烯从系统-1到系统-2的转换有关，在此期间果实迅速软化，经历颜色变化和香气挥发性增加。奇异果(猕猴桃)的果实发育也有很好的特征，通过德国生物实验室、德国生物实验室和工业化学实验室(BBCH， [29])果实生长发育的规模[27，30.］．果实成熟发生在BBCH 80。在与淀粉分解相关的系统-1成熟初期(阶段1)之后，随后是软化和颜色变化，随后是系统-2(阶段2)成熟时期(BBCH 90)，与香气挥发物的产生和进一步软化有关。在BBCH 80时，外源乙烯或丙烯使其逐渐成熟。然而，内源乙烯的产生在第一阶段成熟时受到抑制。的AcACS1基因与system-1和system -2的成熟有关，在第1期成熟过程中，外源丙烯处理只能短暂地诱导其表达。一旦第二阶段成熟开始，AcACS1不再压抑[30.］．

植物叶片和果实的损伤与一些信号有关，这些信号随着时间和空间的推移平行地、顺序地发生。在茄科中，受伤时，小肽系统在[31]作为早期的局部和全身信号，而活性氧(ROS) [32]和寡糖，如寡半乳糖醛酸酯，也被确定为几种植物的早期创伤信号，与某些可能检测细胞壁完整性的受体信号通路结合[33，34］．其他快速信号包括电子信号[35]，离子通量[36]和MAP激酶信号通路[37，38］．除了植物激素茉莉酸(JA)和脱落酸(ABA)外，乙烯还作为局部和系统信号参与损伤过程[16，39，40]并参与各种伤口信号通路之间的交叉对话[41］．在成熟的绿番茄果实中，乙烯和乙烯的诱导作用迅速SlACS1A而且630分钟内。在受伤的叶子上，SlACS1A而且6可在10分钟内检测到感应[42]， 4 h后，两种基因的表达均恢复到基线水平。在猕猴桃中，很少有人知道伤口产生乙烯。对刷刷猕猴桃去除果实毛状体的效果以及机械冲击损伤对果实成熟行为的影响的研究表明，这两种处理都加速了果实在随后贮藏期间的成熟，并伴随着乙烯产量的增加、可溶性固形物浓度的增加和硬度的降低[43，44］．在这两种情况下，由果皮产生的缠绕乙烯可能是加速成熟的原因。AcACO1RNAi沉默的猕猴桃系在叶片中没有产生缠绕乙烯，在果实中也没有检测到明显水平的乙烯[45),建议AcACO1是果实和叶子乙烯产生的主要基因。

多种转录因子家族参与果实和叶片的成熟调控和乙烯转录调控。在番茄中发现了由RIN、TAGL1和ACS2组成的以MADS为中心的更年期乙烯正反馈环(system-2)，而在其他更年期果实中发现了NAC或混合MADS/NAC正反馈环;所有这些回路包括乙烯稳定的EIN3(乙烯不敏感3)TF [46]但MYB转录因子也参与调控乙烯生物合成[47，48］．最近对CRISPR基因敲除系的研究重新定义了野生型RIN、NAC-NOR和SBP-CNR在番茄成熟过程中的作用[49，50，51]因为这些突变系表现出更微妙的表型。在猕猴桃(答:对/答:arguta)，多个家族成员的NAC TF表达在果实成熟后期被高度诱导，与乙烯的自催化生成一致，并诱导成熟相关的萜烯合酶[52]也与微RNA 164 (miR164)控制下的乙烯生产有关[53]及/或低温诱导成熟[54］．一个SEP4/ rin样的MADS盒基因也与成熟水果中乙烯生物合成的调节有关[30.］．在答:deliciosa除了乙烯单独处理外，茉莉酸甲酯处理可以刺激果实产生乙烯，两种NAC转录因子与成熟果实中ACS诱导增加有关[55］．

虽然NAC tf参与调节果实成熟/系统-2乙烯在某些物种中已得到很好的证实，但对果实和叶片中系统-1损伤相关乙烯的产生和控制知之甚少。本研究以猕猴桃(答:对)和四个NAC tf参与乙烯生物合成基因启动子相互作用的基因调控。我们的目的是研究乙烯生产是如何被调节的，并确定不同器官和乙烯系统之间潜在的控制机制守恒。

机械损伤猕猴桃未成熟果实后乙烯的产生

不成熟的答:对var。对' Hort16A '猕猴桃(BBCH 78]29]，约占最终重量的80%，种子即将开始变黑)在开花后110天收获(DAFB) [27]，并展示了系统-1乙烯反应[30.]进行外源性乙烯处理后，在两到四个切口上受伤，之后监测48小时内乙烯的产生情况，并与食用成熟水果进行比较。所有的受伤都导致了短暂的乙烯爆发，在受伤后12小时左右达到峰值(图2)。2A)有四个切口的水果比有两个切口的水果产生的乙烯大约是预期的两倍，因为伤口表面增加了。在受伤24小时后，乙烯水平迅速下降到接近基线水平，这是系统1乙烯产生的特征。在切开的水果中，可溶性糖和硬度在120小时内没有显著变化(图2)。2B) 24小时后未产生可检测到的乙烯。相比之下，吃成熟的水果更软，SSC含量高，产生的(自催化)乙烯含量要比受伤的水果高100倍。

番茄和猕猴桃ACS基因的比较

15个猕猴桃和14个番茄的ACS基因先前已描述[7，56]，以确定那些参与乙烯生物合成的分子(图。3.)．猕猴桃的四个acs样基因(AcACS3-5 7)和两个番茄基因(SlACS11 12)与转氨酶聚集在一起[58]，因此不太可能参与乙烯的生物合成。基于c端序列，4个猕猴桃基因与I型ACS蛋白聚在一起(AcACS2, 8,10,11)，其中3个为II型(AcACS1, 6, 9)和4个III型ACS蛋白(两对谬误序列:AcACS12/12R而且13/13R)(有关c端对齐，请参见补充图S1)．在番茄中，8个acs蛋白与I型聚集在一起(图。3.，SlACS1A，1 b，2，4，6，13 - 15)．四(SlACS3，5，7，8)，包括第II类及两个(SlACS9而且10)III型，显示特征性c端(图;3.，补充图S1)．SlACS15(类型I)可能是截断蛋白(长度333 AA)，而SlACS4而且14(101 AA，截断)缺失特征I型c端残基(补充图S1)．

未成熟果实机械损伤后乙烯生物合成基因的表达

采用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术，测定猕猴桃伤后0、1、2、6、12、24、48 h提取的RNA在48 h内ACS基因的表达情况(不包括4个AT成员)。AcACS1显示在损伤期间(system-1)表达诱导最高，表达先于伤口乙烯释放，远低于成熟水果(图1)。4)．AcACS2在损伤阶段表现出快速诱导，但总体峰值转录水平估计为>比AcACS1（补充表S1-比率)在缠绕乙烯生产阶段。其他8个ACS基因在实验过程中表现出较低的整体转录水平(补充表S1)．

猕猴桃基因组中9个ACO基因的表达[56]也在机械损伤成熟水果后进行监测。的表达AcACO1而且AcACO3在整个时间过程中密切反映乙烯水平，在受伤后12小时达到峰值(系统1)，总体上在成熟果实中表达最高(系统2)。与对照组相比，其他7个ACO基因在时间过程中表现出较低的表达水平或无表达AcACO1而且AcACO3（补充表S1)．

猕猴桃NAC转录因子参与system-1和-2乙烯生物合成

对猕猴桃基因组的分析在猕猴桃基因组中确定了147个假定的NAC家族成员。5；补充表S2)．与猕猴桃的成熟有关AcNAC1-3先前描述的基因[52紧紧地聚集在一起SlNOR（LeNOR)而且SlNAC3(无花果。5)，并显示了整个蛋白质长度的保守性，包括c端“WYS”尾巴，该尾巴也存在于拟南芥NARS1和NARS2 (NAM)蛋白质中[60参与胚胎发生。另外两个猕猴桃基因与SlNOR(无花果。5) (Acc17357和Acc09579，以下简称AcNAC5而且6但没有保守的c端(而分别是WNL/WNS)。AcNAC4集群与SlNAC12(Solyc01g009860.1/SGN-U563196)在另一组长度更短(< 300个氨基酸)且没有保守的c端的蛋白质中，而SlNAC2［61]位于两组之间(图;5)．

AcNAC2-4表达量在伤后6 h达到峰值，随后迅速下降。的表达式AcNAC2-4紧密地反映了感应AcACS1伤口处理后(图;4B)。AcNAC1在未受伤/受伤水果中基本呈高水平的构成性表达，仅在2小时时间点表达量下降。AcNAC5而且AcNAC6在损伤过程中也有一定的诱导作用，在损伤后6小时达到峰值，在成熟果实中再次出现诱导作用(补充表S1-比率)，但转录水平较低。果实表达高峰AcNAC2-6乙烯含量均在成熟果实中最高。4A / B)。

猕猴桃叶片损伤后乙烯生成及基因表达分析

AcACO1RNAi沉默的猕猴桃系在叶片中不产生损伤(系统-1)乙烯，在成熟果实中也没有检测到系统-2乙烯[45］．这些结果表明水果和叶子产生乙烯之间存在联系，两者都依赖于AcACO1表达式。为了研究猕猴桃叶片中system-1乙烯的产生规律，利用96孔“针孔工具”对膨胀的叶片进行机械穿透。与水果相比，乙烯释放在受伤后3小时达到峰值，6小时后恢复到接近基线(图2)。6A). qRT-PCR分析表明，叶片损伤后ACS、ACO或NAC基因表达均无明显上调(图;6B和补充表S1)，表明猕猴桃叶片中乙烯的诱导不涉及乙烯生物合成基因或上游NAC tf的转录增加，而更有可能是由上游的其他步骤或转录后或翻译水平控制。与水果相比，AcACO1而且3.表达水平较低AcACO4而且5在叶片(补充表S1,比)。

NAC转录因子答:对激活ACS启动子

两者之间有很强的相关性AcNAC2-4而且AcACS1基因在猕猴桃中的表达提示NAC tf可能直接激活AcACS1促进子在受伤的果实(系统1)和成熟的猕猴桃(系统2)。的1kb片段AcACS1上游区域由答:对使用萤火虫荧光素酶报告基因系统分析' Hort16A '基因组DNA和启动子缺失系列[62］．显著激活AcACS1AcNAC1、2、3和4个tf分别检测启动子，以及4个AcEIL1-4 (AcEIN3-like) tf使用1000、500、436和389 bp的启动子片段观察启动子(图2)。7)的上游。与GUS对照结构相比，AcNAC1-3与378、350、300、250或200 bp的较短启动子片段结合时未观察到激活。相反，激活AcACS1AcNAC4和AcEIL1-4启动子池与所有这些小片段进行了观察。这些数据表明，AcNAC1-3的结合位点存在于上游384 bp左右，AcNAC4和AcEIL的结合位点可能存在于近端。

NAC转录因子直接与猕猴桃AcACS1启动子结合

的猕猴桃AcACS1活化研究表明，在ATG上游389 ~ 378 bp之间可能存在一个NAC DNA结合位点。为了进一步研究这个潜在的结合位点，使用野生型(Wt)和突变(Mut)启动子片段(假定的回文NAC结合位点TATACGTATA是随机突变的)围绕该位点进行EMSA(电泳迁移率漂移测定)/凝胶漂移(图2)。8，补充图S2)．双链野生型和突变生物素标记探针在缺乏NAC蛋白的凝胶基质中快速迁移(图2)。8Wt探针在与纯化的NAC1、NAC2、NAC3和NAC4蛋白(结合探针，3、5、7、9通道)孵育时显著延迟，而与Mut探针(4、6、8、10通道)孵育时则没有延迟。这些数据表明，AcNAC1-4转录因子根据启动子缺失结果特异性结合到该区域的野生型版本(27 bp)，并需要TATACGTATA回文序列进行结合。启动子激活和EMSA结果共同支持NAC直接激活AcACS1在ATG上游389 - 378 bp之间的结合位点上发现了启动子，而启动子激活数据表明，AcNAC4和AcEIL在近端区域存在更多的结合位点。

系统-1和-2调节

比较猕猴桃的两个不同器官，提供了乙烯系统-1和系统-2生物合成转录调控的对比。在猕猴桃未成熟果实损伤(system-1)和乙烯自催化成熟(system-2)过程中，ACS活性似乎主要由单个基因的转录诱导控制，AcACS1在自催化乙烯生产过程中，成熟水果中也高度诱导产生乙烯(图2)。4)．在猕猴桃叶片损伤中，乙烯也会产生，但速度要快得多，在3小时达到峰值，令人惊讶的是，任何ACS基因的表达都没有相关的增加。6而且补充表S1)．AcACS1而且AcACS2是在未受伤/受伤叶片中唯一表达的两个基因，这表明这两个基因参与了叶片乙烯的产生，但在受伤时都没有显示出转录的增加(图。6，补充表S1)．受伤猕猴桃叶片中乙烯生物合成的快速增加似乎主要是在转录后水平上受到调控。ACO或NAC基因的表达在叶片损伤过程中变化不大(图2)。6而且补充表S1)．在番茄中，SlACS2在受伤后的转录后调控已被证明[63］．在果实成熟后期(系统-2乙烯生物合成)，转录上调AcACS1在猕猴桃，和SlACS2而且4是重要的调节步骤，但蛋白质的磷酸化可能是实现自催化阶段所需的高水平ACS酶活性的重要附加机制，也可能涉及伤口反应。

基于c端CDPK磷酸化位点的存在或不存在以及ETO1相互作用特征，至少有三种不同类型的ACS蛋白已经被鉴定出来[57(图。3.；S1)．而SlACS1A，2而且6还有AcACS2均属于I型(CDPK磷酸化)，表达为主AcACS1猕猴桃中的II型基因与eto1依赖活性抑制和26S蛋白酶体降解的翻译后控制相关。而SlACS4也与I型聚类，它缺少关键的c端特征残基(补充图S1- RLSF/SLSF motif)，因此可能像III型ACS。研究AtACS7调控(III型)发现了一种环型E3连接酶XBAT32，它通过靶向26S蛋白酶体途径在调节III型和II型ACS蛋白稳定性中发挥作用[64］．

系统-1和-2乙烯产生的调节可能与其他激素有关。分析AcNAC1-4而且AcACS1 2启动子的答:对确定了上游几个推定的MYC结合位点(补充图S3)，可能在JA信号传导中发挥作用[65］．在答:deliciosa甲基ja处理增强乙烯诱导的成熟，与诱导的增加相关AdNAC2，3.和下游AdACS1,−2［66在植物中，JA在几分钟内快速致伤已被广泛报道。一个推测的NAC结合位点在硅晶片/体外检测中被鉴定为在dna上游约2.2 kb处AdACS1启动子，但未被启动子缺失分析证实在足底［66］．有进一步的报道称JA中间体顺式opda可能也有其自身独特的信号活性[67，68］．在番茄,SlAREB1转录激活SlNOR在番茄果实成熟过程中参与脱落酸调节的乙烯生物合成，并可能在损伤和NAC表达之间提供另一种早期激素联系[69］．

ACS的转录控制

在猕猴桃中，几种NAC tf在果实成熟过程中强烈上调，并诱导萜烯合成[52］．我们已经证明过了AcNAC2-4在果实损伤过程中诱导的水平较低，而AcNAC2-4诱导与AcACS1在果实损伤(低峰值表达)和成熟(最高表达)时均有较高的表达量，而未诱导NAC TFs和AcACS1在叶片损伤过程中观察到。6而且补充表S2)．这并不是调节猕猴桃成熟的唯一机制。在答:deliciosa，AdNAC6而且7已经被证明可以调节AdACS1而且AdACO1启动子。当这些NAC基因3 '端存在的miRNA结合位点被烧蚀时，它们能够诱导启动子活性，这表明miRNA水平可能通过影响NAC mRNA功能来影响成熟[70］．

在番茄中，在果实成熟和system-2乙烯生成过程中，ACS和ACO转录受到转录因子的复杂控制，如SlHB1，它可以结合到番茄的同型盒顺式元素上SlACO1果实发育启动子及调控基因表达[71］．转录因子成熟抑制因子(RIN的表达SlACS2在果实成熟过程中与CArG基序结合[72的启动子区域相互作用SlACS4［73］．马特尔等人(2011)[74的相关性显著SlRIN表达，SlRIN丰度，和SlACS2表达式。然而，最近的研究表明，SlRIN可能与其他sep样基因冗余作用，激活ACS基因，其作用已被重新评估[49，75］．SlERF2 / TERF2是另一类tf的代表(ERF/AP2域)，具体与NtACS3烟草促进剂在体内及体外的研究[76］．

在番茄中，几种NAC转录因子也与乙烯生物合成的调控有关。番茄NAC TF突变体也不是由突变引起的SlNOR基因(74，77，78]，但野生型NOR的影响可能不那么明显[50］．一个密切相关基因的敲除SlNAC3（NOR-like1)亦会延迟果实成熟及影响种子发育[79，80］．第三个NAC TF过表达SlNAC1通过与乙烯生物合成基因启动子中的调控区域相互作用抑制果实成熟(SlACS2而且SlACO1)，由酵母单杂交显示[81］．番茄NAC基因SlNAC4也与调控成熟有关。在SlNAC4RNAi果实，表达SlACS2而且4还有SlACO1而且3.在成熟过程中被抑制，尽管没有证据表明直接启动子相互作用[82］．

在猕猴桃和番茄中，与呼吸更年期相关的乙烯产生似乎受到不同机制的控制。1)．在猕猴桃中，只有一个ACS基因(AcACS1)似乎与水果系统1和系统2的乙烯产生最相关。这表明AcACS1在果实中，不同的复合物控制着系统-1和系统-2的反应，但其他ACS基因可能参与了其他类型的乙烯生物合成，例如在不同的胁迫和花瓣场景中。例如，在拟南芥中，所有12个ACS基因在整个生长发育过程中以及在各种胁迫条件下都表现出不同的表达模式，而在番茄中，9个ACS基因中只有4个在水果中表达[83，84］．在猕猴桃中，缓慢的成熟进程导致了乙烯的发生。1)可能指出在生产自催化乙烯之前需要克服系统-1反应。在番茄中，两组ACS基因(SlACS4而且2)与更年期有关。SlACS2在染色质水平通过可达性、DNA甲基化和组蛋白修饰进行调控[46，85),而SlACS1A而且6都与系统-1相连。

机械损伤后，一系列复杂的快速局部和远端信号事件，以及激素和细胞反应被诱导。通过比较猕猴桃果实和叶片的损伤反应，本工作揭示了NAC在果实中损伤诱导的系统-1和自催化成熟的系统-2乙烯生物合成中的关键转录调控机制。在猕猴桃中，NAC和TF (AcNAC2-4),AcACS1果实中的转录水平，而在叶片中，转录后/ -翻译机制更可能参与以更快速的方式诱导损伤乙烯。

植物材料和缠绕乙烯测量

不成熟的答:对var。对“Hort16A”果实采自新西兰植物和食品研究有限公司(PFR)的果园，在约110 DAFB/BBCH 78或最终果实重量的80%，然后在室温下保存。答:对“Hort16A”叶片材料(约10厘米长的幼叶)于11月在新西兰奥克兰阿尔伯特山研究中心的PFR温室中在常温和光照下种植的盆栽植物中获得。吃熟的答:对“Hort16A”水果也从新西兰里瓦卡的PFR获得。BBCH量表[29]，开花时间为BBCH 60，果实发育时间为BBCH 70，果实成熟和成熟时间为BBCH 80。

答:对“Hort16A”果实用美工刀从果实的远端到近端(花梗)切出两个或四个相反的5毫米深的纵向切口。伤后48小时(伤后0、1、2、6、12、24、48小时)对果实取样，提取乙烯和RNA。分别对四切组和两切组进行方差分析(ANOVA)，以确定时间点和时间零点之间乙烯产量的显著差异。乙烯测量在建模之前进行对数转换，以调整不同时间点之间的不平等方差。R 3.5.1版本[86]，使用R包nlme(3.1-137版本)和emmeans(1.3.4版本)构建对比[87，88］．

在所示时间采集切口周围1厘米宽的楔形物，包括皮肤，并在液氮中快速冷冻以提取RNA。对于叶片损伤，分离的叶片(不包括叶柄)在分离后立即用96孔销钉工具(含有直径2.5 mm、长度3 cm的扁钢销钉)穿孔，并在6小时内采样。乙烯测量使用ETD-300乙烯探测器与阀门控制箱(Sensor Sense，荷兰)。测量在0.75 L或1.5 L密封罐中进行，连续流速为2 L h⁻¹过滤(干燥和CO₂空气擦洗)。水果硬度(kgF)使用Effegi手持穿透仪(Facchini, Alfonsine, Italy)和7.9 mm探针测量，而SSC (% brix)使用电子Atago PAL-1折光仪(Tokyo, Japan)测量。在伤后120 h测定可溶性固形物浓度(SSC)和硬度变化。

蛋白质鉴定、比对及系统发育分析

猕猴桃ACS、ACO和NAC tf经BLASTP搜索(截断e⁻¹)的答:对“Red5”基因组[56］．氨基酸校准使用genous Muscle校准工具，使用默认参数和25次最大迭代(www.geneious.com)，然后手动策划。系统发育关系评估使用遗传树生成器(www.geneious.com)与Jukes-Cantor遗传距离模型[89]， UPGMA树构建方法[90]和1000个bootstrap重新采样，使用至少50%的支持阈值。

定量反转录PCR (qRT-PCR)分析

总RNA采用“松树”法组合提取[91]和Spectrum Plant Total RNA试剂盒(Sigma-Aldrich, USA)。简言之，将100 mg冷冻和研磨的组织与650 μl“Pine Tree”提取缓冲液混合，在65℃下摇匀孵育5 min。然后用等体积的氯仿:异戊醇24:1提取液体一次。将水相转移到Spectrum RNA试剂盒的过滤柱中，然后根据制造商的说明进行RNA纯化。DNaseI处理总RNA后，用基因特异性引物合成第一链cDNA并进行表达分析(补充表S3)在LightCycler 480平台(Roche, USA)上使用SYBR Green Master Mix(如前所述)进行[52]使用转录子第一链cDNA合成试剂盒(Roche, USA)。在对四个内参基因(EF1α、UBC9、PP2A和Actin)进行评价后，对样品进行PP2A归一化[92，93，94，95使用GeNorm [96]及BestKeeper [97]基于水果和叶子的组合数据集。（补充表S4)．表达式计算包含引物效率(E)，这是基于模板的连续稀释(见补充表S3参考引物)。使用LightCycler®480软件1.5计算的目标/参考比分析数据，(补充表S1)，使用以下公式:Ratio = E (_裁判）^Cq样本/ e (_目标）^Cq样本，校准比率(CAL) =比率÷ (E (_裁判）^Cq校准器/ e (_目标）^Cq校准器)．在本研究中，给定目标的校准器定义为在果叶联合数据集中具有最高目标基因表达(最低目标Cq)的生物复制。为了进行统计分析，基因表达数据进行对数转换，以调整处理组之间的不平等方差，然后将数据拟合到混合模型中。治疗拟合为固定效应，复制拟合为随机效应。在每个时间点，对比非损伤和损伤样本，以确定显著差异。所有分析均采用R 3.5.1版本[86］．分别使用R包nlme(3.1-137版本)和emmeans(1.3.4版本)进行混合模型和对比[87，88］．

荧光素酶瞬时表达启动子分析

1kb启动子和更小的片段AcACS1包括5 ' -未翻译区(5 ' -UTR)中国羊草Hort16A '进入NcoI/ATG起始点pGII0800-LUC [62]使用中列出的引物补充表S3．NAC和EIL完整的TF开放阅读框(orf)是从成熟果实的cDNA中克隆出来的中国羊草Hort16A '使用引物列出补充表S3进入CaMV 35s启动子驱动的pHEX2载体[62］．启动子激活是通过比较萤火虫(Photinus pyralis)萤光素酶:renilla (Renilla reniformis) 3-4 d后荧光素酶发光比(LUC/REN)测定n benthamiana渗透(62］．启动子与TF的比例为1:4，如所述[52］．

电泳迁移率漂移测定

DNA结合域(来自每个NAC TF的182个n端氨基酸)在载体pMAL-c2x (New England Biolabs, USA)的麦芽糖结合蛋白纯化标签(MBP)后面的框架中被钝化克隆XmnI网站和BamHI限制性位点(引物参见补充表S3)．蛋白表达于DH5α大肠杆菌根据制造商说明书(New England Biolabs, USA)使用直链淀粉树脂纯化细胞，并在柱状缓冲液中洗脱[20mm Tris-HCl pH 7.4, 0.2 M NaCl, 1mm EDTA和10mm麦芽糖]。将~ 2.5 μg重组NAC蛋白与0.9 pmol双链3 ' -生物素化DNA探针(EMSA探针;补充表S3)，在20 μL的室温下反应15 min，制备结合缓冲液[0.2 mM二硫苏糖醇，0.02 mM EDTA, 5 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 30 mM氯化钠，0.8 μg鲑鱼精子DNA(剪切后)，0.2 μg poly (dI-dC)]。在含5% (v/v)甘油的0.5% (w/v)三硼酸EDTA缓冲液中，pH 8.3, 200 v, 4℃，25 min，电泳分离4% (w/v)聚丙烯酰胺凝胶。凝胶被电印迹到带正电荷的Hybond N+膜上(GE Healthcare;25 V/15分钟)，并使用120 mJ cm的UVC500 (Hoefer)交联⁻²．印迹在1倍酪蛋白阻断溶液(Sigma Aldrich, USA， #B6429)中被阻断30分钟，并与1:2000链蛋白- hrp (Bio-Rad, USA)在阻断缓冲液中孵育1小时，并根据制造商的说明清洗(Sigma Aldrich, USA)。使用ChemiDoc MP成像仪(Bio-Rad)在ECL Select衬底(GE Healthcare)上进行成像。

在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本文及其补充信息文件中。

阿坝:

脱落酸

ACC:

1-Aminocyclopropane-1-carboxylic酸

ACS:

ACC合酶

华:

ACC氧化酶

:

转氨酶

BBCH:

德国生物研究所，德国农业和化学工业研究所

DAFB:

盛开后的日子

EIN3:

Ethylene-insensitive3

EMSA:

电泳迁移率漂移测定

是:

茉莉酸

MTA:

5 ' -Methylthioadenosine

南京:

Nam ataf1/2 cuc2

也没有:

Non-ripening

存在:

定量逆转录聚合酶链反应

RIN:

成熟抑制剂

ROS:

活性氧

山姆:

S-adenosylmethionine

TF:

转录因子

我们感谢Monica Dragulescu和她的团队的植物护理，Peter McAtee在乙烯探测器上的帮助，Richard Espley和Erika Varkonyi-Gasic对手稿的严格审查，以及湖北省农业科学院科学家基金会(L2018023)对张雷的支持。我们也感谢Johanna John和Minna Pesonen在图形方面的帮助。

这项工作由新西兰商业、创新和就业部(C11X1602)资助，内部PFR资金部分来自猕猴桃特许权使用费投资计划。

从属关系

1. 新西兰植物和食品研究有限公司(PFR)，私人包92169，奥克兰，1142，新西兰

   Niels J. Nieuwenhuizen，陈秀寅，Mickaël Pellan，张磊，郭林迪，Ross G. Atkinson和Andrew C. Allan

2. 奥克兰大学生物科学学院，Private Bag 92019，奥克兰，1142，新西兰

   Niels J. Nieuwenhuizen, Robert J. Schaffer, Andrew C. Allan

3. 湖北省农业科学院果茶研究所，湖北武汉430064

   Lei张

4. PFR，私人包11600，帕默斯顿北，4442，新西兰

   威廉·a·莱恩

5. PFR, 55 Old Mill Road, RD 3, Motueka, 7198，新西兰

   罗伯特·j·谢弗

贡献

N.J.N.;a.c.a构想了最初的研究计划;w.a.l.， r.j.s.， A.C.A, r.g.a监督实验;n.j.n.， X.C, M.P, L.Z.进行了实验工作;L.G.进行统计分析;n.j.n.， a.c.a.， r.g.a.设计了实验并分析了数据，并在R.J.S.的进一步贡献下撰写了这篇文章;N.J.N.同意作为作者负责联系并确保沟通;所有作者都同意作者名单和这些作者的贡献。作者阅读并批准最终的手稿。

相应的作者

对应到Niels J. Nieuwenhuizen．

伦理批准并同意参与

不适用。本手稿没有报道或涉及任何动物或人体数据或组织的使用。作者确认，对植物的实验研究，包括植物材料的收集，符合机构、国家或国际准则。

发表同意书

不适用。本手稿不包含任何形式的任何个人数据(包括任何个人细节、图像或视频)。”

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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