大豆RCC1家族基因增强植物耐寒性的研究GmTCF1a

背景

低温严重限制了大豆的生长、产量和地理分布。大豆植物通过重新编程一系列冷响应基因的表达来应对冷胁迫。然而，大豆耐冷胁迫的内在机制尚不清楚。答:芥耐冷冻1 (AtTCF1)是染色体凝聚1 (RCC1)家族蛋白的调节因子，通过独立的C-repeat结合转录因子(CBF)信号通路调控其耐冻性。

结果

在这项研究中，我们鉴定了一个同源基因AtTCF1大豆(命名为GmTCF1a)，介导植物对低温的耐受性。与AtTCF1一样，GmTCF1a也含有5个RCC1结构域，位于细胞核中。GmTCF1a是由冷应激引起的。有趣的是，异位过表达GmTCF1a在拟南芥大大提高植物成活率，减少冰冻胁迫下电解质泄漏。一个冷反应基因，COR15a，是高度诱导的GmTCF1a-过表达转基因系。

结论

GmTCF1a对冷胁迫有特异性反应，并异位表达GmTCF1a增强的耐寒性和上调COR15a的水平。这些结果表明GmTCF1a正调控大豆的耐寒性，可能为作物耐寒性的遗传改良提供新的见解。

作为重要的经济作物，大豆(g·马克斯)不仅为我们提供了丰富的蛋白质，而且还提供了食用油。大豆是温带豆科植物，植物特别容易受到低温胁迫，这严重限制了大豆的生长，从而严重降低了产量[1]。大豆种子和发芽的幼苗对低温极为敏感。在种子萌发阶段，低温通过干扰种子吸胀过程中正常的膜重组，影响大豆种子在寒冷土壤中的萌发，降低出苗率[qh]2]。大约10°C或更低的低温持续较长时间会损害绿色的茎和叶[3.]。在繁殖阶段，种子成熟的最佳温度为19 ~ 20℃。在这一阶段，严重的低温胁迫主要通过减小种子大小和延迟成熟来降低大豆产量[4，5，6]。因此，揭示植物如何避免低温伤害的机制可以为农业生产中的大豆育种和提高产量提供有价值的信息。

植物进化出了复杂的机制来应对不断变化的环境。在低温(非冰冻温度)下暴露一段时间后，植物对冰冻温度表现出更大的耐受性，这被称为冷驯化[7，8]。冷驯化包括生理、生化和分子的综合作用[9]。在生理水平上，合成了脯氨酸、可溶性糖、抗寒蛋白等大量保护性物质[10]。在分子水平上，冷信号首先被细胞膜流动性、离子通道(即钙离子通道)感知^{2 +}通道)和电生理，然后诱导质膜硬化并激活Ca^{2 +}通道，导致钙的流入^{2 +}进入细胞质。在拟南芥例如，冷信号激活受体样细胞质激酶冷响应蛋白激酶1 (CRPK1)，其中CRPK1磷酸化并促进14-3-3蛋白在细胞核中的积累。14-3-3蛋白质参与植物的许多生理过程，包括对非生物胁迫的反应[11]。在细胞核中，磷酸化14-3-3蛋白通过26S蛋白酶体促进CBFs的降解[12]。

CBFs作为细胞核中的关键转录因子，调控复杂的冷信号转导网络[j]。13]。冷诱发有三种CBF的基因,CBF1-3（CBF1 / DREB1B，CBF2 / DREB1C和CBF3 / DREB1A)，沿着染色体串联排列拟南芥。的表达式cbf受到几个上游监管机构的严格监管[14]。ICE1 (Inducer of CBF Expression 1)属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族蛋白，直接结合于CBF3启动子和激活的表达CBF3在冷应力下[15]。的突变ICE1块CBF3降低抗冻能力[15，16，17]。CBFs调节下游10-20%的冷调节(天哪基因拟南芥对冷处理有反应的[18，19，20.]。天哪基因含有一个脱水反应元件/ c -重复序列(DRE/CRT)独联体-元素在它们的启动子区域的共同特征。cbf与DRE/CRT结合独联体-元素和激活天哪赋予植物抗寒性和抗冻性的基因[21，22，23，24]。COR15a是最独特的COR蛋白，定位于膜上，在冷胁迫下维持细胞膜的完整性[25]。除了脑血流依赖通路拟南芥，天哪基因也被几个脑血流无关的调节因子所调节。例如，BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZR1)是油菜素内酯(brassino类固醇)信号转导通路中的转录因子，通过其他途径调控植物对低温的耐受性天哪基因(PYR1-LIKE 6（PYL6),co1过表达抑制因子（SOC1)与cbf不耦合[26];HOS9编码同源结构域转录因子，通过脑血流无关的途径调节冷信号拟南芥(27]。因此，植物对低温的反应是一个复杂的过程拟南芥。

在大豆中，对植物抗寒性的认识和提高已经取得了很大的进展。蛋白质组学分析也显示耐寒大豆产生更多的保护物质[3.]。转录组分析已经鉴定出大豆的许多冷响应基因，包括CBF基因(28，29]。确实，大豆的异位表达cbf通过提高抗冻能力AtCOR47和AtRD29a记录在拟南芥(30.]。的GmDREB3基因是DREB a -5亚家族的成员，在冷胁迫下被特异性诱导，其过表达GmDREB3在拟南芥提高植物的耐寒性[30.，31]。一些大豆天哪基因也被确定为植物耐寒性的积极调节因子[32，33，34，35]。比如大豆SCOF-1，MYB，WRKY，bZIP和锌指型转录因子基因已被证明介导植物的耐寒性[32，33，34，35]。这些初步结果表明，大豆具有多种应对低温胁迫的机制。然而，大豆耐低温胁迫的具体机制在很大程度上仍然未知。

之前，我们确定了AtTCF1（耐寒耐冻)作为…天哪基因拟南芥。AtTCF1编码一种rcc1样蛋白，并通过转录和蛋白积累对冷胁迫做出特异性反应拟南芥(36]。的损失AtTCF1导致减少BCB（蓝色的copper-binding)水平和木质素含量，导致耐寒性。这些结果揭示了低温胁迫下attcf1介导的细胞壁重塑的重要作用。在这项研究中，我们确定了一个假定的同源物AtTCF1在大豆,GmTCF1a这是对冷应激的特殊调节。有趣的是，异位表达GmTCF1a在拟南芥导致高水平的COR15a增强了植物对冰冻胁迫的耐受性。这些结果表明GmTCF1a正向调节大豆的耐寒性。

的识别GmTCF1s在大豆

鉴别…的同系物拟南芥TCF1 (AtTCF1)在大豆中，我们检索了含有RCC1结构域的蛋白序列拟南芥使用隐马尔可夫模型(HMM)搜索(PF00415和PF13540)，得到55个非冗余大豆基因和25个非冗余大豆基因拟南芥这些基因被确认为AtTCF1的同源基因。构建了一个系统发育树来检查这些rcc1样蛋白的分类和进化历史(图2)。1）.所有这些RCC1样蛋白被清楚地划分为9个主要分支。将AtTCF1和4个蛋白(Glyma.02G250700、Glyma.14G066000、Glyma.11G223000和Glyma.18G034600)分组在进化枝V中(图2)。1）.这一结果表明，AtTCF1与这四种蛋白的关系比其他蛋白更为密切。根据与AtTCF1的进化关系，分别将Glyma.02G250700命名为GmTCF1a、Glyma.14G066000命名为GmTCF1b、Glyma.11G223000命名为GmTCF1c、Glyma.18G034600命名为GmTCF1d。

此外，我们还研究了TCF1同源基因在大豆和拟南芥基因组。通过对植物基因组重复数据库(PGDD)的检索，我们发现AtTCF1显示与4共线性GmTCF1s基因(GmTCF1a，GmTCF1b，GmTCF1b和GmTCF1d)(补充图2)S1）.，然后执行synteny分析AtTCF1McScanX在豆科植物中的编码序列。同样的四个GmTCF1s在大豆中发现(图2)。2a).然而，只有一个共线基因AtTCF1发现于Medicago和莲花，分别为(图2)。2a).这些共线性结果表明AtTCF1这四个GmTCF1s基因可以追溯到一个共同的祖先，整个基因组的两次复制产生了更多的副本AtTCF1大豆的同源基因。为探索不同物种间TCF1同源基因的进化关系，构建了13个物种21个TCF1同源基因的系统发育树。如图所示。2b, 21个TCF1同源物可划分为3个分支。进化枝I包含一个拟南芥4种豆科双子叶植物，II枝属非豆科双子叶植物，其余TCF1同源物来自单子叶植物(玉米，栽培稻，b . distachyon和高粱二色的)按枝型iii分组(图3)。2b).将AtTCF1与GmTCF1a和GmTCF1b分组在进化枝I中，说明AtTCF1与豆科植物基因的同源性非常高，与单子叶植物基因的同源性很低(图2)。2b).综合来看，GmTCF1a和GmTCF1b与AtTCF1的亲缘关系比与单子房的亲缘关系更密切，这可能部分是由于大豆和拟南芥是双子叶植物。

考虑GmTCF1a作为一个假定的同源基因AtTCF1

探讨这些基因的器官特异性表达模式GmTCF1s的RNA测序表达数据TCF1来自公开资料的同系物(http://bar.utoronto.ca/)，并安排制作热图。如图所示。3.一个,AtTCF1表示强烈，而GmTCF1s在花中表达得很低。的GmTCF1a基因主要在植物的地上部分(叶片、茎尖分生组织和豆荚)表达，在花、根瘤和根中表达量较少。其余同系物的表达(GmTCF1b，GmTCF1c和GmTCF1d)的结节率也较高GmTCF1a(无花果。3.A，暗示GmTCF1b，GmTCF1c和GmTCF1d可能在大豆的地下部分获得新的功能。进一步的相关分析发现AtTCF1与?的表达模式相关性较低GmTCF1a,而AtTCF1与其他基因有很强的负相关，除了GmTCF1a(无花果。S2）.从系统发育树来看，GmTCF1a和GmTCF1b最同源的基因是AtTCF1(无花果。2b).然而，我们发现了与低温相关的顺式作用元素[37]存在于GmTCF1a推动者，却不在GmTCF1b启动子(无花果。S3）.因此,GmTCF1a被认为是一个假定的同源基因AtTCF1进一步研究。

的GmTCF1a基因的基因结构与…相似AtTCF1。两个基因都含有11个外显子和10个内含子GmTCF1a基因比AtTCF1因为大部分的内含子GmTCF1a比那些长得多吗AtTCF1(无花果。3.b)。GmTCF1a编码477个氨基酸的预测蛋白，分子量为50.199 kDa, PI为6.01。有趣的是，GmTCF1a包含5个rcc1样结构域，比AtTCF1多两个(图1)。3.c)，其氨基酸序列与AtTCF1具有65%的同源性(图2)。S4）.然后对GmTCF1a和AtTCF1的蛋白序列进行MEME在线分析，寻找共同的基序。在GmTCF1a和AtTCF1中发现了7个保守基序，这与基序随蛋白序列的分布一致(图2)。3.d和e)。保守基序表明GmTCF1a和AtTCF1可能在功能上发挥相同的作用。

的具体反应GmTCF1a基因变冷

的表达式GmTCF1a利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术研究了水稻对寒冷、高土壤盐分、干旱和ABA等常见不利环境条件的响应[36]。用4℃、200 mM NaCl、15% PEG和100 μM ABA处理不同时间点的大豆叶片提取总RNA。如图2所示。4一个和S5一个,GmTCF1a在正常情况下表达水平极低。经冷处理后，GmTCF1a6 h时显著诱导表达，12 h时达到最高表达水平(图2)。4一个和S5a).然而，的表达GmTCF1a在NaCl、ABA和PEG处理下均无显著变化(图2)。4B, c, d和S5b, c, d)GmTCF1a利用从大豆叶片、茎、根和根瘤中分离的总RNA进行检测。GmTCF1a在正常情况下，在所有器官中均低水平表达;形成鲜明对比的是，GmTCF1a除根瘤外，其余各器官均受冷处理诱导，在叶片中表达量最高(图2)。4e和S5综上所述，这些结果表明GmTCF1a是一个冷响应基因，可能介导植物对冷胁迫的反应。

的优先表达GmTCF1a在血管组织中

进一步检测细胞/组织特异性表达GmTCF1a,我们构造了一个包含2.0 kb的二进制向量GmTCF1a启动子驱动β葡萄糖醛酸酶（格斯)基因，然后进行转化GmTCF1apro:格斯变成大豆根毛和拟南芥。GUS组织化学染色显示GmTCF1a主要表达于大豆转化毛状根的根柱中，经冷处理后表达量显著增高(图2)。5一个)。拟南芥植物表达GmTCF1apro:格斯在正常条件下，GUS染色仅在子叶的静脉中检测到，而在暴露于冷胁迫后，整个子叶和下子叶都观察到很强的GUS染色(图2)。5b).这些结果表明GmTCF1a在芽和根都高度受冷诱导。

GmTCF1a作为核蛋白

为了检查亚细胞定位，我们制作了一个包含a的构造GFP-GmTCF1a融合基因在CaMV 35S启动子的控制下，产生转基因拟南芥植物。Seven-day-old转基因拟南芥幼苗分别在22°C和4°C下处理12 h。共聚焦显微镜显示GFP- gmtcf1a融合蛋白在正常情况下定位于细胞核中，与GFP在整个根细胞中的普遍定位形成鲜明对比(图2)。6）.冷胁迫没有改变GmTCF1a的核定位(图2)。6）.因此，GmTCF1a和AtTCF1表现出相同的亚细胞定位，并在冷胁迫下在细胞核中发挥作用[36]。

提高耐冻性拟南芥植物通过异位表达GmTCF1a

调查是否GmTCF1a作为植物对冷胁迫反应的关键调控因子，我们构建了一个二元载体载体35 s: GmTCF1a然后把它变成拟南芥植物。经过三代的筛选，我们获得了两个组成型过表达的纯合子转基因株系GmTCF1a(无花果。7a). 3周龄转基因植株和野生型植株在4℃下处理7天，然后在- 8℃下处理2.5 h。在正常生长条件下恢复7天后计算存活率。两者的存活率具有代表性35 s: GmTCF1a转基因拟南芥来自独立转基因事件的株系分别占47%(14-4号株系)和42%(17-3号株系);相比之下，野生型植株的成活率仅为15%(图2)。7b和c)。结果表明GmTCF1a极大地提高了转基因植株的低温耐受性。

冷胁迫会破坏植物细胞壁，导致细胞质渗漏。因此，较低的电解质泄漏率反映了较高的耐寒性。通过电解质泄漏试验比较了两种植物的抗冻能力GmTCF1a过表达植物(# 14-4和# 17-3)和野生型植物。如图所示。7d，在25、0、- 2和- 4°C处理0.5 h时，转基因植株与野生型植株的电解质泄漏率无显著差异;然而，电解质泄漏的百分比明显低于GmTCF1a当温度降至- 6°C和- 8°C时，过表达植株比野生型植株的表达量要高。7d).虽然17-3的电解液漏量略高于14-4，但差异不显著。综上所述，结果表明GmTCF1a能提高耐冻性吗拟南芥植物。

我们还测试了过度表达的作用AtTCF1在拟南芥。如图所示。S6，两个独立纯合子的存活率35 s: AtTCF1转基因拟南芥line 3-6和line 12-2分别约占37%和48%;相比之下，野生型植株的成活率仅为19%。结果表明AtTCF1极大地提高了转基因植株的低温耐受性。电解质泄漏试验也表明AtTCF1过表达植株在- 8°C时降低了泄漏率(图2)。S6d).综上所述，这些结果表明AtTCF1或GmTCF1a能提高耐冻性吗拟南芥植物。

COR15a的上调GmTCF1a超表达在拟南芥植物

以确定是否过表达GmTCF1a影响冷反应基因表达拟南芥，总RNA分别从转基因和野生型冷处理中提取拟南芥幼苗。由于17-3号株系和14-2号株系具有相同的耐冻表型，我们选择17-3号株系作为转基因植株的代表进行基因表达分析。6种冷反应基因CBF1，CBF2，CBF3，COR15a，COR47和RD29a被选中[21，24，30.]并进行qRT-PCR检测。因此，表达式CBF1，CBF2，CBF3，COR47和RD29a与野生型植物相比，17-3号线没有改变。然而，的表达COR15a在测试的时间点上，转基因植物的抗氧化能力远高于野生型植物(图2)。8）.这个结果表明GmTCF1a通过上调来增强植物的耐寒性COR15a表达式。我们还调查了COR15a在AtTCF1过表达转基因系(# 12-2)COR15a在转基因植物中也高于野生型植物(图2)。S7）.综上所述，耐寒性的增加是过度表达的AtTCF1或GmTCF1a植物与上调的COR15a。

低温胁迫是影响大豆生长和产量的主要非生物胁迫之一。确定大豆耐低温性的决定因素是大豆抗逆性遗传改良的关键。在这项研究中，我们确定GmTCF1a在大豆中作为推定的同源基因拟南芥TCF1该基因是由冷胁迫诱导的，并调节植物的抗冻能力拟南芥。这些发现揭示了植物对低温反应的保守机制，并为大豆抗冻性的遗传改良提供了新的见解。

GmTCF1a作为一个假定的同源基因AtTCF1

几个RCC1家族蛋白，如UVR8、TCF1、RUG3和SAB1，已经被表征并在响应非生物胁迫中表现出不同的生物学功能[qh]36，38，39，40，41，42，43]。在拟南芥， AtTCF1通过重编程细胞壁特性调节植物对冰冻胁迫的耐受性[36]。就像拟南芥在美国，大豆也是温带植物，易受低温影响。我们假设大豆可能采用类似的机制来应对低温胁迫。事实上，我们发现了四个同源基因AtTCF1在大豆。很显然,GmTCF1s大豆的进化多样性。gmtcf1含有几个类似rcc1的结构域(图1)。S8)，并具有高度的序列同一性和相似性(图2)。S4）.众所周知，全基因组复制(WGD)在大豆基因家族的扩展中起着核心作用[44]，大约在5900万年前和1300万年前发生了两次独立的复制，导致大豆中75%的基因有多个拷贝[45]。因此,四GmTCF1s可以通过WGD进化。在这四个人中GmTCF1s，GmTCF1a被认为是一个假定的同源基因AtTCF1。首先，系统发育分析表明GmTCF1a最接近的同系物是AtTCF1(无花果。2b).其次，低温相关的顺式作用元素存在于GmTCF1a启动子(无花果。S3）.最后,GmTCF1a在豆科植物特异性器官结节中几乎不表达(图2)。3.a)GmTCF1a该基因在大豆中具有高度的进化保守性。此外,GmTCF1a内含子比AtTCF1在它们的基因组序列中，有三个假定的剪接变体GmTCF1a从phytozome数据库中发现，这些变异是否对冷胁迫有反应或耐寒性需要进一步研究。

GmTCF1a的函数正交AtTCF1

事实上，我们进一步的实验证明了这一点GmTCF1a一个泛函正交是TCF1。首先,GmTCF1a和AtTCF1特别对低温有反应[36]。在正常情况下，两者都有GmTCF1a和AtTCF1在叶、茎和根中表达水平极低。冷胁迫12 h后，GmTCF1a和AtTCF1在叶片、茎和根中被强烈诱导(图2)。4e和5) [36]。最重要的是，这两个基因的表达都受到冷胁迫的特异性和高度诱导，而不受ABA、PEG和盐胁迫的诱导(图2)。4a, b, c, d) (36]。在转基因大豆根中，尽管在37°C下6 h GUS响应可能逆转冷诱导的GmTCF1apro:格斯在某些细胞中的表达，GmTCF1a冷胁迫在维管组织中高度诱导，而GmTCF1a转录主要在地上诱导拟南芥(无花果。5）.其次，GmTCF1a和AtTCF1表现出相同的亚细胞定位，它们都定位于细胞核中(图2)。6）.第三,两GmTCF1a和AtTCF1调解…的反应拟南芥到冰点的温度。我们展示了生态主题GmTCF1a或AtTCF1提高了植物对冰冻温度的耐受性(图2)。7和S6）.最后，与AtTCF1一样，GmTCF1a参与抗冻性与CBFs无关[36，因为生态的表达GmTCF1a不会改变的表达式cbf在拟南芥。这些结果表明GmTCF1a的泛函正交是否是AtTCF1大豆也可能具有保守的tcf1介导的冷冻和低温反应机制。

GmTCF1a作为抗冻性的正向调节剂

在拟南芥，我们表明了损失AtTCF1功能对冰冻温度的耐受性增强[36]。在这项研究中，我们发现AtTCF1也显著提高了转基因作物的抗冻能力拟南芥(无花果。S6)，表明AtTCF1在冷信号通路中具有复杂的机制。然而，我们发现两者的本构表达GmTCF1a或AtTCF1提高…的水平COR15a。COR15a编码叶绿体靶向多肽，并组成表达COR15a在低温驯化或非低温驯化条件下，提高其体内对叶绿体的抗冻能力拟南芥(46，47]。因此，提高叶绿体的抗冻性可能会导致转基因植物的抗冻性。GmTCF1a调控的方式COR15a水平仍不清楚。rcc1样蛋白通常与下游基因结合，通过影响基因启动子区域的组蛋白修饰来调节下游基因的表达[36，41，48，49]，我们推测GmTCF1a可能影响组蛋白修饰COR15a启动子或GmTCF1a与未知基因蛋白相互作用，进而调节COR15a的水平。此外，众所周知，严格控制细胞壁中的木质素稳态是抗冻性所必需的[50]。减少了木质素在细胞壁内的沉积tcf1低温胁迫下的突变可增加细胞壁通透性，保护细胞免受冻害[36]。过度的AtTCF1也可能提高植物的抗逆性，并将木质素含量维持在最佳水平。我们推测过度表达GmTCF1a对影响细胞木质素含量有显著作用。进一步研究木质素对冰冻温度的响应动态以及GmTCF1a在这一过程中的作用，将为植物耐冻性的机制提供新的见解。

总之，本研究报告了一个rcc1样基因，GmTCF1a这是一个与大豆冷驯化有关的新基因。GmTCF1a是专门由冷胁迫诱导并增强抗冻性的转基因拟南芥。目前仍有必要研究其确切的分子和生理机制GmTCF1a及其类似物调控大豆的抗冻性。的应用GmTCF1a在提高大豆耐寒性方面也值得探讨。

的识别GmTCF1s结构分析

AtTCF1的编码序列(CDS)从TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/）.为了鉴定大豆rcc1样蛋白，大豆和答:芥蛋白质序列和基因组注释从Phytozome数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）.首先，从PFAM数据库(http://pfam.xfam.org/大豆RCC1s (GmRCC1s)和拟南芥利用HMMER软件预测RCC1s (AtRCC1s)。其次，利用蛋白质序列构建hmm [51]。第三，将含有保守RCC1结构域的蛋白视为GmRCC1s和AtRCC1s。通过SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)和PFAM数据库。最后，利用AtRCC1s序列作为查询，搜索大豆蛋白质组(BLASTP)，保留满足BLASTP阈值条件(e值≤1e-5且同源性≥50%)的蛋白作为最终的GmRCC1s和AtRCC1s家族成员。使用Compute PI/MW工具(http://expasy.org/tools/pi_tool.html）.基因结构GmTCF1a和AtTCF1利用在线软件GSDS 2.0 (http://gsds.gao-lab.org/) [52]。的启动子序列GmTCF1s在翻译位点(ATG)上游得到了长度为2000 bp的dna片段独联体-元素在PlantCARE网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）.使用SMART工具预测GmTCF1a和AtTCF1的RCC1结构域(http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1）.使用CLUSTALW程序对GmTCF1a和AtTCF1进行序列比对(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)及MEGA 7.0软件[53]。

系统发育和生物信息学分析

GmTCF1a的同源蛋白序列答:芥，大豆，栽培稻，Medicago truncatula，菜豆，杨树trichocarpa，亚麻属植物usitatissimum，Gossypium raimondii就，玉米，b . distachyon，高粱二色的和c .巨大成功使用BLASTP程序从Phytozome中检索到Lotus对虾从Lotus数据库(https://lotus.au.dk/）.用CLUSTALW程序对序列进行比对，用MEGA 7.0软件用邻接法构建系统发育树[53]。共线性分析采用MCScanX软件(http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/MCScanX.zip)，图由TBtools (https://github.com/CJ-Chen/TBtools),分别。GmTCF1a和AtTCF1的保守基序分析采用MEME在线工具，除7个基序限制外，其他参数均为默认值(http://meme-suite.org/tools/meme) [54]。

组织表达模式分析

8例的组织特异性表达数据(规范化FPKM/TMP)AtTCF1同源物可从eFP浏览器(http://bar.utoronto.ca/),Lotus对虾表达图谱(https://lotus.au.dk/expat/）.在热图中使用了来自组织子集的这些数据的三个生物复制。以行为比例尺类型构建热图，对热图的行和列进行聚类。使用TBtools (SupCorrPlot函数)分析表达数据的相关性。

大豆的生长与处理

大豆(g·马克斯l .)经过测序的品种Williams 82(原产于美国)是澳大利亚昆士兰大学Peter M. Gresshoff实验室赠送的礼物。在16/8 h(光(6 - 22:00)/暗)光周期下，于27°C蛭石上生长3周，然后进行各种非生物胁迫。冷处理时，上午9:00将花盆暴露于4℃，分别在处理1、3、6、12和24 h后收获第一批三叶草叶片。在脱落酸(ABA)、PEG8000和盐处理下，于上午9:00将幼苗根从蛭石中拔出，分别浸入100 μM ABA、15% PEG8000和200 mM NaCl的溶液中，处理1、3、6、12和24 h后收获第一批三叶草叶片。

鉴别…的表达模式GmTCF1a用70%乙醇对大豆种子进行表面灭菌，28℃吸干3 d。然后将发芽的种子接种b .日本血吸虫USDA110 (OD = 0.08)放置30分钟，然后用含有0.03 g Ca(NO)的低营养液转移到长试管中_3.) 4 h₂0.1 g氯化钙₂2 h₂哦，0.1 g KH₂阿宝₄， 0.15 g Na₂HPO₄-12 h₂0.12 g MgSO₄7小时₂O, 0.05 g/L柠檬酸铁，加1ml微量元素H₂薄_3.2.86 mg, MnSO₄1.81 mg, ZnSO₄0.22 mg, CuSO₄0.8 mg, H₂莫₄0.02 mg / L。接种后的幼苗在27℃的光照条件下生长，光照周期为16/8 h(光(6:00-22:00)/暗)，光照强度为108.38 μmol/m²5 .上午9:00整株暴露于4°C，晚上21:00收获第一批三叶草叶、茎、根和根瘤，样品立即在液氮中冷冻，- 80°C保存，用于RNA分离。

RNA分离及实时定量PCR (qRT-PCR)

总RNA的提取使用PureLink Plant RNA Reagent (ThermoFisher Scientific, cat)。# 12322012)。利用M-MLV逆转录酶(Promega)合成第一链cDNA。在ABI PRISM 7500实时PCR系统上进行qRT-PCR。实时PCR的步骤如下。PCR反应溶液(总20 μL)含SYBR Premix Ex Taq 10 μL, cdna 50 ng，每个引物0.2 μM, ROX参考物dye 0.4 μL。PCR混合物在95℃下加热30 s，然后进行40个扩增循环(95℃5 s, 60℃34 s)。采用7500系统软件对结果进行分析^——ΔΔCT方法。的18 s rRNA吉恩作为对照。qRT-PCR引物序列见表S1。

分析GmTCF1a正方观点:格斯表达式模式

覆盖2000 bp的碎片就在上游GmTCF1a用表中所列引物扩增编码区S1。启动子被克隆到太平洋标准时间我和BampCAMBIA1391载体中GUS基因前的HI位点。目标矢量被转换成农应变GV3101。采用花浸法稳定转化拟南芥(55]。在含20 mg/L潮霉素b的MS培养基上筛选转基因植株，经过三代筛选，获得两株独立的纯合子转基因植株。在对大豆进行少量改性的基础上，对大豆毛状根进行了转化农杆菌属rizogenes-中介方法[56]。对转基因材料进行冷处理(4°C, 12 h)和不冷处理(37°C，黑暗)6 h的GUS反应。用70%乙醇多次洗涤去除叶绿素，然后拍摄有代表性的图像。

GFP-GmTCF1a亚细胞定位测定

的编码序列GmTCF1a从cDNA中扩增出的引物见表S1。将该序列克隆到pEZR(K)-LC载体上Kpn我和BamHI位点位于GFP基因之后。然后将该构造体转化为Col-0(从拟南芥生物资源中心农杆菌属-中介转化[55]。经过3代的选择，获得了纯合子转基因植株，并在共聚焦显微镜下用488 nm激光(徕卡SP8)观察亚细胞定位。

过度的GmTCF1a在拟南芥

的GmTCF1aCDS被克隆到Xba我和KpnpCAMBIA1300载体的1个位点。将重组载体通过农杆菌属-中介转化[55]。T₀代种子用卡那霉素(75 mg/mL)筛选。经过3代卡那霉素筛选获得纯合子转基因植株。获得了两个纯合子转基因株系GmTCF1a的水平。

耐冻性试验GmTCF1a超表达植株

答:芥用50%漂白剂浸泡5分钟对种子进行灭菌，用无菌蒸馏水洗涤5次，然后置于含有2%蔗糖的MS培养基上，pH调至5.7。将7日龄的转基因和野生型幼苗移栽到盆栽中(21-23℃室)再生长2周，然后在4℃下处理7天，然后在- 8℃下处理2.5 h。恢复7天后(22°C明暗期16.8 h)，计算植株成活率(活株数/总株数)。

电解液泄漏测量

根据Ristic和Ashworth的描述，对电解质泄漏试验进行了轻微修改[57]。简单地说，将三个切除的小叶放入含有100 μL dH的15 mL塑料管中₂O，然后在0°C的冷冻浴中培养。浴液温度在30分钟内降低2°C，降至- 8°C。当达到指定的温度时，将试管从浴缸中取出并立即放在冰上。然后将15 mL管中的小叶转移到含有25 mL dH的50 mL管中₂O，振荡后测量50 mL管中溶液(E1)的电导率。在小叶蒸压后再次测量溶液的电导率(E2)。电解质泄漏计算为E1/E2的百分比[27]。

低温反应基因的表达GmTCF1a超表达转基因拟南芥

3周大的转基因植株在4°C下处理，分别在0、3、6和12 h收获叶片。按上述方法提取RNA和合成cDNA。冷应答基因的特异引物见表S1。

本研究中产生或分析的所有数据均可在本文及其补充信息文件中获得。AtTCF1 (At3G55580)同源物的加入号如下:g·马克斯， GmTCF1a (Glyma.02G250700);GmTCF1b (Glyma.14G066000);GmTCF1c (Glyma.11G223000);GmTCF1d (Glyma.18G034600);栽培稻， LOC Os05g38270和LOC Os01g62810;Medicago truncatulaMedtr3g069030;菜豆phvull . 008g230700和phvull . 001g236500;杨树trichocarpa;;;;;亚麻属植物usitatissimum, Lus10004700。g和Lus10040266.g;Gossypium raimondii就;;;;;;玉米、GRMZM2G337819和GRMZM2G302245;b . distachyonBradi2g54850;高粱二色的， Sobic.003G354900和c .巨大成功, Cucsa.165020。

TCF1:

耐寒耐冻

RCC1:

染色体凝聚蛋白调控因子1

CBF:

c -重复结合转录因子

CRPK1:

冷反应蛋白激酶

ICE1:

CBF表达诱导剂

bHLH:

一个基本的螺旋-环-螺旋

林后:

冷调控基因

衣服:

Dehydration-responsive-element

CRT:

C-repeat

BCB:

Blue-Copper-Binding

不适用。

国家重点研发计划项目(2018YFD10009002)资助。资助者没有参与研究的设计、数据分析和手稿撰写。

从属关系

1. 石家庄市农林科学研究院，石家庄市胜利北大街479号，河北石家庄市050041

   上半期董

2. 华中农业大学植物科学技术学院作物遗传改良国家重点实验室，湖北武汉430070

   王辉，李霞，季洪涛

贡献

H.J.构思并设计了这个项目。z.d和H.W.进行了实验和生物信息学分析。z。d。x。l。和h。j。写了这篇论文。所有的作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Hongtao霁。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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