植物细胞壁蛋白的研究c . sinensis结合细胞壁蛋白质组学和n -糖蛋白组学

背景

c . sinensis是一种重要的经济作物，其叶片中氟化物过度富集，因其叶片作为茶叶消费而对人类健康构成严重威胁。近年来，我们的研究表明，细胞壁蛋白(CWPs)可能在氟的积累/解毒中起着至关重要的作用c . sinensis．然而，目前对CWP的识别和表征还缺乏研究。本研究的目的是研究植物细胞壁蛋白质组的特征c . sinensis并产生更多与应激反应相关的CWPs。采用细胞壁蛋白质组学和n -糖蛋白组学相结合的策略研究CWPs。CWPs用序贯盐缓冲液提取，n -糖蛋白用亲水性相互作用层析法富集c . sinensis树叶作为材料．然后对所有蛋白进行UPLC-MS/MS分析。

结果

通过细胞壁蛋白质组学和n -糖蛋白组学分析，分别鉴定出501个CWPs和195个CWPs，共有118个CWPs。值得注意的是，n -糖蛋白组学是一种可行的CWP鉴定方法，可以提高CWP的覆盖率。在已鉴定的CWPs中，作用于细胞壁多糖的蛋白质是最大的功能类，其中大部分可能参与细胞壁结构重塑。第二大功能类主要包括各种与CWP周转和成熟相关的蛋白酶。氧化还原酶是第三大功能类，其中大部分(尤其是III类过氧化物酶)参与防御反应。正如预期的那样，所鉴定的CWPs主要与植物细胞壁的形成和防御反应有关。

结论

这是香港首次大规模调查化学污水处理厂c . sinensis通过细胞壁蛋白质组学和n -糖蛋白组学。我们的研究结果不仅为进一步研究CWPs提供了一个数据库，而且对细胞壁的形成和防御反应也有了深入的了解c . sinensis．

植物细胞壁是一种主要的亚细胞结构，位于细胞的外部。它们为组织提供骨架框架，并在保护、细胞间粘附和通信中发挥重要作用。细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成的复杂多糖网络组成，其中含有少量的细胞壁蛋白(CWPs)、木质素和脂质[1］．其中，CWPs约占细胞壁干重的10% [2，3.，4]，但在细胞壁代谢、细胞壁组成与修饰、细胞增大、信号转导、生物与非生物应激反应等多种生理过程中发挥重要作用[5，6，7，8，9，10］．

鉴于CWP功能的重要性，在拟南芥等植物中，CWPs的鉴定和表征已得到广泛研究[11，12，13，14，15，16，17，18，19),b . distachyon［20.，21，22]，亚麻[23，24]，甘蔗[10，25，26]，大米[27，28，29]等人近几十年来通过细胞壁蛋白质组学策略采用破坏性和非破坏性提取方法。这些研究极大地促进了对冷凝污水处理厂的广泛认识。然而，据我们所知，由于细胞内蛋白的提取困难和高污染，对CWPs的认识仍然不足。n -糖基化是真核生物蛋白质翻译后修饰的一种常见形式，大多数植物蛋白通过传统的内质网(ER)-高尔基体(GA)分泌途径进行n -糖基化[30.，31］．因此，植物CWPs的n -糖基化尤其普遍和广泛。相反，n -糖蛋白的大规模和详细的表征有很大的潜力来增加我们对CWPs的理解，因此n -糖蛋白组学可以用于研究CWPs [32，33，34，35，36］．基于这些发现，本研究结合n -糖蛋白组学和细胞壁蛋白质组学对CWPs进行研究。

c . sinensis是一种重要的木质经济作物，广泛种植于热带至温带地区，其叶子通常用于制茶。据报道，叶子c . sinensis可累积比大多数其他植物高得多的氟化物(F)，而在正常土壤条件下不会表现出任何中毒症状[37，38，39，40]，表明可能有一种特殊的机制负责F的积累/解毒。先前的研究表明，细胞壁固定和液泡分隔有助于F的积累/解毒[40，41]，最近我们通过比较蛋白质组学分析发现CWPs在F积累/解毒中的重要作用[42］．然而，CWP的鉴定和表征在国内研究甚少c . sinensis到现在为止。

本文旨在拓宽对CWPs的认识，为揭示F积累/解毒相关CWPs的分子机制、细胞壁蛋白质组学和n-糖蛋白组学分析提供基础c . sinensis叶子被执行。在本研究中，CaCl₂依次用EGTA、LiCl、EGTA提取CWPs，用亲水性相互作用层析(HILIC)富集n -糖蛋白。用超高高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)对所得到的蛋白质进行多肽分析。然后对所有鉴定出的蛋白进行多重生物信息学分析。结合细胞壁蛋白质组学和n -糖蛋白组学，共鉴定出578个CWPs。本研究首次尝试研究细胞壁蛋白组和n -糖蛋白组制成。我们的研究结果将扩大对CWPs的认识，揭示与植物生长、发育和防御反应相关的机制。

抽水站的识别

为了鉴定出更多的CWPs，本研究采用细胞壁蛋白质组学和糖蛋白组学相结合的策略，如图所示。1．经UPLC-MS/MS分析和数据库检索，共鉴定出3618个目标CWPs (TCWPs)和262个n -糖蛋白c . sinensis叶子(附加文件1，2:表S1, S2)。为了挑选出CWPs，所有鉴定出的蛋白(3880个)都首先对WallProtDB数据库进行检索。其中，627个TCWPs和187个n -糖蛋白被鉴定为潜在的CWPs。

根据以往的报道，只有那些(i)具有预测信号肽(SP)， (ii)缺乏ER保留信号(KDEL或HDEL)和(iii)不超过一个跨膜结构域(TMD)的蛋白质被定义为CWPs [11，12，25］．为了获得尽可能多的CWP并提高CWP的覆盖率，所有鉴定出的蛋白质都进行了多种生物信息学分析，包括SP、TMD、ER保留信号和亚细胞定位。根据上述CWPs的定义及Day等人的报告。[24]，共鉴定出501个TCWPs和195个n -糖蛋白为CWPs。其中，在WallProtDB数据库中也检索到484个TCWPs和187个n -糖蛋白，缺失17个TCWPs和8个n -糖蛋白，因此首先确定为CWPs(表1；额外的文件3.:表S3)。至于其余的蛋白质，38个TCWPs被指定为质膜蛋白(附加文件4:表S4)，其他包括3079个TCWPs和67个n -糖蛋白被定义为胞内蛋白。通过细胞壁蛋白质组学和n -糖蛋白组学分别鉴定了501个和195个CWPs，两种方法共鉴定了118个CWPs(表2)1；无花果。2一个;额外的文件3.:表S3)。

CWPs的功能分类

为了更好地理解CWPs的生物学功能，Jamet等人根据其功能域对CWPs进行了分类。[6］．578只CWPs(501 + 195 ~ 118)被分为9组。2B).其中作用于多糖的蛋白质(PACs;147)是数量最多的功能性组别，占总抽水站的25.4%。蛋白酶(Ps;94)是第二大类别，占总数的16.3%。Oxido-reductases(口服补液盐;62)是第三大类，占已鉴定CWPs的10.7%，其次是参与信号传导的蛋白质(PSs;56)，脂代谢相关蛋白(PLMs;43)和具有相互作用结构域的蛋白(pid;34)，分别占已鉴定CWPs的9.7、7.4和5.9%。结构蛋白(SPs;5, 0.9%)丰度最低，仅含5个成员。 The remaining CWPs related to various functions were categorized as miscellaneous proteins (MPs; 75, 13.0%), and CWPs with previously uncharacterized domains were referred to as proteins of unknown function (PUFs; 62, 10.7%).

CWP比较c . sinensis另外两个物种

不出所料，CWPs的功能分布从c . sinensis树叶和那棵树的颜色很一致答:芥花结和b . distachyon叶子(附加文件5:图s1)，其中pac、Ps、or代表前三个功能等级。值得注意的是，ps的百分比c . sinensis(9.7%)叶片明显高于对照组答:芥莲座(3.7%)和b . distachyon(4.0%)叶片，分别[12，20.］．这种差异可能是由于常绿木本叶片的生命周期较长制成。

函数类的主要代表

在PAC类中，GHs是主要代表(表1)．本研究共鉴定出110个GHs，占PAC类的74.8%，按照基于序列同源性的CAZy命名法，分为GH1、GH3、GH5、GH9、GH10、GH13、GH16、GH17、GH18、GH19、GH20、GH27、GH28、GH29、GH31、GH32、GH35、GH37、GH38、GH51、GH65、GH79、GH127等23个科(图。3.)．如前所述，最具代表性的家族是GH3和GH17 [12，20.，26］．此外，GH1、GH5、GH16、GH18、GH19、GH27、GH28、GH31、GH35和GH38也是很有代表性的家系，每个家系至少有5个成员(图2)。3.)．此外，还鉴定出作用于多糖的代表性较低的CWPs，包括碳水化合物酯酶[11个果胶酯酶(称为果胶甲基酯酶(PMEs))和3个果胶酯酶抑制剂(PMEIs)]， 4个糖基转移酶(GTs，包括GT2、GT31、GT48和GT68)， 6个膨胀酶，4个PNGase A, 3个果胶乙酰酯酶(PAEs)， 2个果胶裂解酶(PLs)和4个碳水化合物酰化(毛状体双折射样蛋白)。

Ps类以Asp蛋白酶(28)、丝氨酸羧肽酶(28)、丝氨酸蛋白酶(19)、Cys蛋白酶(14)为主要家族，占Ps的94.7%。ORs功能类主要由III类过氧化物酶(PODs, 29)、多铜氧化酶(13)、BBE(小檗碱桥酶)(S)网状蛋白(6)和漆酶(5)组成。其他与氧化还原过程相关的CWPs包括单铜氧化酶样蛋白(SKU5和SKS1)、蓝铜蛋白和抗坏血酸氧化酶。

PSs类主要包含束素样阿拉伯半乳聚糖蛋白(FLAs, 9)和受体样蛋白激酶(RLKs)超家族蛋白(38)。其中，RLKs包括21个LRR-RLKs, 6个富半胱氨酸受体样蛋白激酶，3个s位点受体激酶亚家族蛋白，2个壁相关受体激酶，6个凝集素受体激酶亚家族蛋白。PLMs类主要由脂质转移蛋白(LTPs, 10)和GDSL酯酶/脂肪酶(GDSLs, 16)组成。在SPs类中，本研究仅鉴定出5个CWPs，包括3个富亮氨酸重复伸展蛋白样蛋白(lrr - ext)、1个非经典阿拉伯半乳聚糖蛋白31样蛋白(AGP)和1个富羟脯氨酸糖蛋白(HPRG)。鉴定出的MPs主要包括紫色酸性磷酸酶(PAPs, 17)、蓝色铜结合蛋白(BCPs, 9)、硬质蛋白(DIRs, 8)、发芽样蛋白(GLPs, 5)、thaumatins(7)和具有cupin结构域的蛋白(5)。

识别已识别的抽水站，并将其功能分类

共鉴定出3618个TCWPsc . sinensis连续盐提取和UPLC-MS/MS对叶片进行分析。其中，627个TCWPs与WallProtDB数据库中的CWPs同源，501个TCWPs与多项生物信息学分析定义的CWPs一致。除首次定义的CWPs外，WallProtDB数据库与生物信息学分析存在识别差异，这可能是由于两者的CWPs同源性较低c . sinensis以及WallProtDB中索引的其他植物物种。

最后，501个TCWPs和3079个TCWPs被指定为CWPs和细胞内蛋白，表明TCWPs在制备TCWPs过程中受到了污染。在甘蔗中也发现了类似的细胞内蛋白质的高污染[25]和米[29]，分别占81.6和80.5%。目前细胞壁蛋白质组学研究较少，CWP提取有待改进。尽管细胞内蛋白受到高度污染，但本研究采用细胞壁蛋白质组学方法来提高CWP的覆盖率c . sinensis．

同时，大多数n -糖蛋白(195,74.4%)靶向于细胞壁/细胞外/质膜c . sinensis，因此它们被指定为化学处理厂。我们的研究结果与番茄果实的研究结果非常一致。35),b . distachyon叶(43]，其中有65%和60%的n -糖蛋白分别位于外质体/细胞壁/质膜上，说明n -糖蛋白组学是一种可行的鉴定和表征CWPs的方法。

值得注意的是，在本研究中有25个CWPs是新发现的(附加文件3.:表S3)，通过细胞壁蛋白质组(501个CWPs)识别出的CWP比n -糖蛋白组(195个CWPs)更多，说明细胞壁蛋白质组在CWP识别方面比n -糖蛋白组更有效。而使用n -糖蛋白组作为补充可以进一步增强CWP的鉴定效果。因此，我们建议将细胞壁蛋白质组学和n -糖蛋白组学结合起来进行CWP的鉴定和表征。

已确定的抽水站的可能功能

鉴定出作用于细胞壁多糖的CWPs

糖苷水解酶

在已确定的化学冷凝污水处理厂中，GHs占绝大多数，占19.0%。大多数生长激素家族的可能底物是半纤维素(木葡聚糖、木聚糖、葡甘露聚糖)和果胶(半乳聚糖、均半乳糖醛酸)。在本研究中确定的GHs中，GH16、GH29、GH31和GH65可能作用于木葡聚糖;GH10和GH51可能对木聚糖有作用;GH28和GH35分别水解均半乳糖醛酸和半乳聚糖[23，44，45](附加文件6:表S5)。此外，GH1、GH3和GH5具有广泛的底物范围，据报道，其酶参与了细胞壁半纤维素和果胶的修饰和/或分解[46，47]，并参与木质化和次生代谢[48］．这些GH家族的鉴定表明，半纤维素和果胶可能在叶片中发生重要的结构变化c . sinensis．此外，GH127(也称为DUF1680结构域蛋白)，最近被鉴定为一种新的β- l -阿拉伯呋喃糖苷酶，可能参与细胞壁多糖和富羟脯氨酸糖蛋白的降解[49]，已知GH9催化纤维素的内水解。

一些已鉴定的GHs可能参与抵御病原体和各种应激。甲壳素和β-1,3-或β-1,6-葡聚糖是多种真菌细胞壁的主要成分。GH17作为β-1,3-葡聚糖酶;GH18和GH19作为几丁质酶;GH20是甲壳素的关键水解酶，这4种GHs具有抗真菌活性，可降解真菌细胞壁，参与对病原体的防御[45，50］．几丁质酶已被报道对非生物胁迫有反应[42，51］．GH37是一种非还原糖，在本研究中被确定为一种新的CWP，它被发现是一种通用的蛋白质构象稳定剂，可能有助于各种应激防御[52］．

包括GH13、GH27和GH32在内的几个已确定的GHs可能与存储储备的动员、分配和分区有关。GH13参与淀粉和糖原水解生成葡萄糖和麦芽糖[53］．GH27是半乳甘露聚糖(细胞壁储存多糖)的三种水解酶之一[54]，而GH32作为一种转化酶，参与长距离的营养分配和碳水化合物分配[55，56］．此外，一些生长激素酶包括GH3、GH18、GH19、GH35、GH38和GH79参与糖蛋白的翻译后修饰(PTMs) [32，45］．在本研究中，GH3、GH35、GH38、GH79被验证为n -糖蛋白。

综上所述，本研究发现了大量与细胞壁代谢和防御相关的GHs，这与之前关于甘蔗茎叶的报道一致[26),b . distachyon谷物(21),美国officinarum细胞悬液[25］．我们的数据揭示了所鉴定的GHs的潜在功能，如复杂的细胞壁碳水化合物重塑、病原体和应激反应、储存储备的动员和分配以及糖蛋白PTMs。研究结果可能与植物生长发育过程中的可持续重塑和植物的陆生习性有关。

作用于多糖的其他CWPs

PMEs, PAEs和PLs是果胶修饰酶。PMEs催化果胶中均半乳糖醛酸结构域的去甲基酯化[57］．果胶甲基化/去甲基化程度影响细胞壁硬化和酶的获取[58］．去甲基酯化果胶有利于GH28和PLs对酸性聚半乳糖醛酸链的裂解。同样，PAEs可以通过裂解果胶的乙酰莱斯特键来调节果胶的脱乙酰[59］．总的来说，这些酶通过影响果胶代谢在控制细胞壁可塑性/流变性方面发挥着重要作用[60］．

毛状体双折射样蛋白和PNGase A也是细胞壁上的两个修饰酶家族。前者以木聚糖乙酰转移酶为特征，与木聚糖o -乙酰化介导、二次壁沉积和病原体抗性有关[61］．后者是一种去糖基化酶，参与变性糖蛋白的蛋白水解产生的糖肽释放n -聚糖[62］．

膨胀素被称为非酶蛋白，是最重要的结构蛋白，通过其在纤维素-半纤维素网络中的作用在细胞壁延伸中起着核心作用，这表明在植物生长发育相关过程中，膨胀素对初生细胞壁结构至关重要[63］．此外，4个细胞壁GT家族可能与细胞壁聚合物的生物合成有关。

鉴定出CWPs具有蛋白酶的功能

蛋白酶是蛋白质转化、酶成熟和抵御病原体所必需的[45，64］．因此，定位于细胞壁的植物蛋白酶可能是CWP降解或成熟的原因，而且它们可能在植物生长和分枝、花期调节和防御反应等多种生物过程中发挥重要作用。

确定了参与氧化还原的CWPs

III类pod是一个庞大的多基因家族，占OR功能类的一半。III类pod通过催化单木质素的氧化聚合参与木质素代谢[65]，应激反应，以及通过消耗过氧化氢和产生活性氧的信号转导[66］．III类pod可介导细胞壁化合物的交联，如结构蛋白、单木榄醇和含有多糖的芳香族氨基酸[67，68，69］．与III类pod一样，漆酶是将单木质素单元聚合成木质素的候选者，这表明漆酶是细胞壁木质化所必需的[70，71］．bbe样蛋白作为单木酚氧化还原酶，可参与聚合过程所需的单木酚的动员和氧化[72］．总的来说，氧化还原类中三个极具代表性的酶家族被认为参与了木质素的产生以及随后细胞壁强度和刚性的增强，这支持了植物对不利环境因素的防御。

此外，单铜氧化酶样蛋白(SKU5和SKS1)、蓝铜蛋白和抗坏血酸氧化酶被发现，它们可能在细胞壁松动、扩张和网状过程中发挥作用[24，73］．

确定了参与信号转导的CWPs

本研究中鉴定的信号转导相关CWPs主要由FLAs和RLKs超家族蛋白组成。FLAs，大量o糖基化的CWPs，已被发现与细胞壁形成相关[74]，细胞间黏附及通讯[75]，以及非生物应激反应[76］．RLKs作为主要的细胞壁“传感器”，负责控制各种信号事件[77］．RLKs在多种与发育和防御相关的过程中具有重要功能，例如，它们可以识别细胞外配体以激活细胞内激酶结构域，从而导致下游信号转导[78］．

确定了与脂质代谢相关的CWPs

功能性类的CWPs已被报道与脂质代谢有关[79，80，81，82，83］．LTPs是脂质输出到细胞表面所必需的，它们与角质和蜡的形成密切相关[79］．一种LTP已被发现通过与纤维素/木葡聚糖网络相互作用而参与细胞壁扩展[80］．GDSLs是一种新近发现的脂肪酶亚类，具有多种功能，不仅在表皮角质和表皮蜡的形成中发挥重要作用[81]，以及对生物和非生物胁迫的耐受性[82，83］．综上所述，在生长发育过程中，大量LTPs和GDSLs可能在角质层组装中发挥重要作用c . sinensis叶子。与PLMs相关的CWPs的鉴定有助于我们对革皮叶片的认识c . sinensis．

结构蛋白

由于结构蛋白仍耐盐萃取，迄今为止难以洗脱。本研究鉴定了5种结构蛋白。据报道，lrr - ext通过与细胞壁组分形成不溶的共价交联来影响细胞壁的力学性能[84]，它们能感知细胞外信号，并间接传递到细胞质中，调节植物生长和耐盐性，因此它们对细胞壁发育、植物生长和耐胁迫具有重要作用[85］．非经典agp同时具有富脯氨酸结构域和非富脯氨酸结构域，可参与金属离子结合、防御反应，并可与果胶相互作用[86，87］．HPRG是植物细胞壁的重要结构成分，与结构完整性、细胞-细胞相互作用和细胞间通讯有关[88］．

识别与其他功能相关的CWPs

对于几种mps相关的CWPs, pap可能与通过去磷酸化CWPs降解木葡聚糖和低聚糖有关，如α -木葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶[89］．DIRs与木质素聚合有关[90，91]，在细胞壁完整性维护过程中，它们在各种应力响应和细胞壁修饰/加固中发挥重要作用[92］．BCPs、GLPs、cupins和Thaumatins先前已被报道与植物的应激反应有关[93，94，95，96］．

本研究还检测到CWP抑制剂的几种酶，包括PMEIs、PGIPs (polygalacturonase inhibitor-like)和Cys蛋白酶抑制剂。PMEIs可以部分抑制PMEs的活性，调节果胶甲基酯化程度。PGIPs与聚半乳糖醛酸酶(GH28)特异性结合，抑制果胶水解，调节果胶降解，最终触发对微生物和昆虫的防御反应[97］．综上所述，PMEIs和PME、PGIPs和PG这两对偶偶巧合发生，它们对果胶代谢有精确的调节作用。Cys蛋白酶抑制剂对特定的Cys蛋白酶具有抑制活性，可能具有防止昆虫捕食的作用[98］．

不同CWPs在植物细胞壁形成和防御反应中的作用

在动态环境条件下，植物不断生长发育，总会遇到各种压力和昆虫、微生物的有害攻击。植物细胞壁作为第一道屏障，不断变化以适应环境压力。毫无疑问，CWPs在改变细胞壁特性方面起着核心作用。基于我们的研究结果，我们提出了一个主要与植物细胞壁形成和防御反应相关的CWPs工作模型(图2)。4)．

为了满足正常生长发育的需要，大量的CWPs被激活来调节细胞壁结构。在本研究中发现了许多与PACs相关的CWPs，主要包括GH1、GH3、GH5、GH9、GH10、GH16、GH28、GH29、GH31、GH35、GH51和GH65，它们可能有助于细胞壁结构的重排，而expansin可能导致细胞壁的延伸。与次生细胞壁形成和代谢相关的几种CWPs，如III类PODs、BBEs、漆酶、LTPs、GDSLs和DIRs，可能有利于细胞壁的强化/修饰(图2)。4)．

面对不利的环境，c . sinensis这种陆生植物没有逃脱的能力。因此，它进化出了一些防御反应机制，如改变细胞壁特性。本研究中发现的许多CWPs可能涉及各种防御。据报道，GH17、GH18、GH19和GH20主要通过水解几丁质参与应对病原体胁迫和非生物胁迫。III类pod、单铜氧化酶样蛋白、蓝铜蛋白和抗坏血酸氧化酶通过氧化还原反应参与对各种生物和非生物胁迫的响应。LTPs、GDSLs和DIRs也通过调控次级细胞壁与防御反应相关。PGIPs和Cys蛋白酶抑制剂可能在提高对昆虫和病原体的保护作用[99]通过抑制入侵者降解酶的活性。同样，BCPs、GLPs、cupins和thaumatins也在防御反应中起作用(图2)。4)．

为了感知动态环境和复杂细胞壁结构的变化，植物发育了细胞壁完整性感知通路，将信号转导到细胞质中。本研究发现了质膜上的许多传感器，包括RLKs和FLAs，它们可以介导细胞壁与细胞质之间的交叉信号c . sinensis(无花果。4)．

本研究结合细胞壁蛋白质组学和n -糖蛋白组学，鉴定了细胞中的CWPsc . sinensis．通过序贯盐萃取和UPLC-MS/MS共鉴定出3880个蛋白。通过HILIC富集+ UPLC-MS/MS共鉴定出262个n -糖蛋白。随后，通过多重生物信息学分析，3880个蛋白中的501个和262个n -糖蛋白中的195个被指定为CWPs。在这些指定的化学处理厂中，有118个是共用的。共鉴定出578个化学冷凝污水处理厂c . sinensis叶片，其中25个确定为新鉴定的CWPs。本研究是我国首次尝试用细胞壁蛋白质组学和n -糖蛋白组学对CWPs进行大规模研究制成。这为利用细胞壁蛋白质组学和n -糖蛋白组学的联合策略提高CWP的鉴定和表征提供了参考。我们的发现促进了对细胞壁形成和防御反应的理解c . sinensis．

植物材料

从树顶，从20株2岁左右的Echa 1号扦插苗(c . sinensis简历。位于中国湖北省武汉市的茶叶种质资源库中的“鄂茶1号”。采集的叶片用milliq水清洗3次，立即在液氮中研磨成细粉，最后保存于−80℃备用。

细胞壁富集

从叶片中获得细胞壁部分c . sinensis使用Printz等人所描述的连续清洗。[One hundred.稍加修改。简单地说，将5 g细粉叶片与3倍体积的0.4 M蔗糖缓冲液均质10分钟，涡旋2分钟，在4°C下以250转/分的速度摇匀过夜，然后离心。随后，在沉淀物中加入0.6 M蔗糖缓冲液，在4°C下250 rpm震动30 min，离心。再将1 M蔗糖缓冲液加入沉淀液中，悬浮，离心。最后，用5mm的醋酸钠缓冲液洗涤两次沉淀。最终沉淀为细胞壁组分(颗粒)。蔗糖缓冲液含有5 mM醋酸钠和1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(ApexBio)。所有缓冲液(pH 4.6)在4°C下预冷却，在4°C下以1000 rpm离心15 min。

细胞壁蛋白提取

采用CaCl法依次提取CWPs₂， EGTA, LiCl，根据Printz等报道的方法[One hundred.］．简单地说，0.2 M CaCl₂首先在细胞壁颗粒中加入缓冲液，在4°C下以200 rpm的转速震动30 min，然后离心。然后收集上清液。此过程重复一次，上清液作为氯化钙池₂分数。然后，将细胞壁颗粒与50 mM EGTA缓冲液混合，在37°C下以300 rpm的转速震动1小时，离心并收集上清液。此过程重复两次，收集所有上清液作为EGTA馏分。最后将细胞壁颗粒重新悬浮在3m LiCl缓冲液中，在250 rpm, 4°C下均质过夜。离心后，再次收集上清液。再次用3 M LiCl缓冲液从细胞壁颗粒中提取CWPs，以250 rpm, 4°C震动6小时。将获得的上清液汇集并作为LiCl馏分储存。最后,CaCl₂EGTA和LiCl组分组合为目标CWPs (TCWPs)组分。所有萃取缓冲液在4℃下预冷，在4℃下以10000 rpm离心15 min。

全蛋白提取

提取全蛋白(WPs)c . sinensis根据以前的几份报告的叶子[42，101，102］．简单地说，先用5 ml预冷均质缓冲液[含20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、250 mM蔗糖、10 mM EGTA、1 mM PMSF、1 mM DTT和1% (v/v) Triton]均质约0.5 g细粉，然后在4℃下以12000 g离心20 min。将得到的上清液汇总并作为完整的蛋白质片段存储。

蛋白沉淀和清洗

根据我们之前的研究[42]，三酚(pH≥8.0)和乙酸铵分别沉淀WP和TCWP组分。简而言之，将馏分与等体积的三酚混合，进行涡流搅拌，然后在4°C下以12000 g离心20 min。然后，将苯酚相小心地转移到其他管中，与5体积0.1 M醋酸铵在100%甲醇中充分混合，并在−80°C下孵卵过夜。沉淀蛋白分别用0.1 M醋酸铵和丙酮洗涤两次。将蛋白质颗粒冻干，然后溶解到裂解缓冲液中[含有7 M尿素，2 M硫脲，4% CHAPS, 250 mM DTT和0.2% (v/v) Bio-Lyte]。按照厂家说明书用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

蛋白质消化

在胰蛋白酶消化前，用5 mM二硫苏糖醇在56℃下还原WPs和TCWPs 30 min，用11 mM碘乙酰胺在室温黑暗中烷基化15 min，然后通过加入100 mM碳酸氢铵三乙胺将尿素稀释至浓度< 2 M。然后，WPs和TCWPs先用胰蛋白酶(1:50胰蛋白酶/蛋白质)在37℃下消化过夜，然后用胰蛋白酶(1:100胰蛋白酶/蛋白质)消化4小时。最后，采用Strata X C18固相萃取柱(Phenomenex, USA)对胰蛋白酶肽进行脱盐，离心浓缩。

高效液相色谱分离

经tryptic消化后，采用Agilent 300 Extend C18高pH反相高效液相色谱法(5 μm颗粒，4.6 mm内径，250 mm长)对WPs和TCWPs中的肽进行分离。简单地说，首先将消化的肽分离成60个馏分，梯度为8 - 32%乙腈(pH 9.0)，分离时间超过60分钟。随后，将多肽汇集成4个部分，并通过真空离心干燥以供进一步使用。

n -糖肽的亲和富集

为了富集n-糖基化多肽，首先将干燥的WPs多肽溶解在40 μL富集缓冲液(含80%乙腈和1%三氟乙酸)中，然后装入HILIC微柱，以4000 g离心15 min分离糖肽和非糖肽。为了去除非特异性吸附的肽，HILIC微柱用富集缓冲液洗涤三次。然后，用10%乙腈从微柱中洗脱结合肽，然后真空干燥。在50 μL NH中重组n -糖肽₄有限公司_3.缓冲液(50mm)加入重氧水中，加入2 μL PNGase F, 37℃孵育过夜。最后，根据制造商的说明，用C18 ZipTips (Millipore)脱盐生成的n -糖肽，并冻干用于LC-MS/MS分析。

UPLC-MS / MS分析

LC-MS/MS分析首先将多肽溶解在含有0.1% (v/v)甲酸和2%乙腈的溶剂A中，然后在EASY-nLC 1000 UPLC系统中梯度洗脱。采用自制的反相色谱柱(长度25 cm, ID 100 μm)进行多肽分离。TCWP肽按恒定流量450 nL/min梯度洗脱;先用7% ~ 25%的溶剂B(含0.1%甲酸，90%乙腈)浸泡0 ~ 40 min，再用25% ~ 35%的溶剂B浸泡40 ~ 52 min, 35% ~ 80%的溶剂B浸泡52 ~ 56 min, 80%的溶剂B浸泡56 ~ 60 min。用以下程序梯度洗脱去糖基化肽:500 nL/min恒定流量，从4 - 20%溶剂B开始0-24分钟，20 - 32%溶剂B 24-32分钟，32 - 80%溶剂B 32 - 36分钟，最后在80%溶剂B中维持36-40分钟。

随后，分离的TCWP多肽和去糖基化多肽分别注射到纳米电喷雾离子源中，然后在Q Exactive™和Orbitrap聚变质谱仪(Thermo Fisher scientific)中进行MS/MS分析。简单地说，电喷雾电压为2.0 kV，用Orbitrap检测和分析完整的多肽及其二次片段，数据依赖采集模式在MS扫描和MS/MS扫描之间自动切换。

TCWP多肽扫描分辨率为70000,m/s扫描范围为350-1800。然后，选择每次扫描强度最高的前10个母离子，在28%的碰撞能量下进行更高能量的碰撞解离破碎(HCD)。在固定第一质量为100 m/z的条件下，以17,500的分辨率对生成的碎片进行进一步分析。为提高质谱的有效利用率，相关参数设置为:5E4自动增益控制，动态排除30 s，最大注入100 ms，信号阈值为20000离子/s。同样地，去糖基化肽以60,000的分辨率进行完全扫描，m/s扫描范围为350-1550。在35%的碰撞能量下选择每次扫描强度最高的前20个母离子进行HCD，然后以固定的第一质量为100 m/z，在15,000的分辨率下分析所得碎片。同样，MS相关参数设置如下:5E4自动增益控制，动态排除15 s，最大注入200 MS，信号阈值5000 ions/s。

数据库搜索

使用MaxQuant搜索引擎(v.1.5.2.8)对得到的原始MS/MS数据进行处理，查询参数如下:(i)茶树基因组数据库(camelllia_sinensis_4442, 53,512条序列[103];)连接反向诱饵数据库和质谱污染物数据库进行质谱/质谱检索;(ii)胰蛋白酶/P用于酶裂解和2个缺失裂解;(iii)首次搜索和主要研究的肽离子质量耐受性分别为20 ppm和5 ppm，片段离子质量耐受性为0.02 Da;(iv)最小肽段长度为7个氨基酸残基，最大修饰数为5个;(v)半胱氨酸烷基化作为固定修饰;(vi)可变修饰:TCWPs的蛋氨酸氧化和n端乙酰化，以及蛋氨酸氧化和脱酰胺(NQ)，天冬酰胺脱酰胺(¹⁸N-glycoproteins O);(vii) FDR≤1%用于蛋白质鉴定和肽谱匹配鉴定。

多种生物信息学分析

使用WallProtDB数据库对CWPs进行预测和功能分类[104］．糖苷水解酶和碳水化合物酯酶根据CAZy数据库进行分组[105］．利用SignalP预测识别蛋白的n端信号肽[106］．通过TMHMM服务器评估跨膜结构域[107］．使用TargetP进行亚细胞定位预测[108]， WoLF PSORT [109]， Loctree 3 [110]，和Plant-mPLoc [111］．使用Prosite检查ER保留信号[112］．

所有生成或分析的数据都包含在这篇发表的文章中，所有相关的原始数据都保存在ProteomeXchange Consortium中，数据集标识符为PXD026772。

cwp:

细胞壁蛋白

TCWPs:

靶细胞壁蛋白

WPs:

整个蛋白质

“大酒店”:

糖苷水解酶

政治行动委员会:

蛋白质作用于多糖

Ps:

蛋白酶

口服补液盐:

Oxido-reductases。

PSs:

参与信号传递的蛋白质。

plm:

与脂质代谢相关的蛋白质。

pid:

具有相互作用域的蛋白质。

豆荚:

氧化物酶。

感谢京杰PTM生物实验室(杭州)有限公司的MS/MS分析。感谢刘萍女士(华中农业大学)对稿件的审稿和语言的完善给予全面的帮助。

湖北省自然科学基金项目(2019CFB600)、湖北省重点研发计划项目(2020BBA038)资助。资助机构在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有发挥任何作用。

从属关系

1. 湖北省农业科学院水果茶叶研究所，湖北省武汉市南湖路10号，430064

   刘艳丽，马林龙，曹丹，龚子明，范静，胡红菊，金晓芳

贡献

YLL和XFJ构思并设计了实验;YLL进行实验，起草手稿，并不断修改手稿。LLM和DC协助完成实验和数据采集部分;JF和HJH协助数据分析。ZMG帮助对稿件进行了检查和修改。所有作者都已阅读并批准了手稿的最终版本。

相应的作者

对应到小芳金．

伦理批准并同意参与

本研究植物材料的采集符合中华人民共和国农业农村部的指导方针(证书编号:GPD茶树(2019)420015)。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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