CBL的比较系统发育分析揭示了CBL基因家族的进化和功能分化蔗糖spontaneum

背景

植物抗低钾胁迫基因的鉴定与功能分析美国spontaneum对选育高效利用钾的甘蔗品种至关重要。钙调磷酸酶b样(CBL)蛋白是一种钙传感器，在植物暴露于各种非生物胁迫时与特定的CBL相互作用蛋白激酶(CIPKs)相互作用。

结果

在这项研究中，有9个CBL基因是从美国spontaneum．113株的系统发育分析cbl从13个有代表性的植物中表现出基因扩增和较强的纯化选择CBL家庭。分析CBL表达模式显示SsCBL01是不同发育阶段各组织中最常表达的基因。的表达分析SsCBLs低钾下⁺胁迫表明缺钾适度改变了SsCBLs．亚细胞定位显示SsCBL01是一种质膜蛋白，在酵母中的异种表达表明，单独SsCBL01不能吸收K⁺，它正调节K⁺钾转运体SsHAK1介导的吸收。

结论

这项研究为人类的进化提供了新的见解CBL初步证实质膜蛋白SsCBL01参与了对低钾的响应⁺压力美国spontaneum．

甘蔗品种(糖)主要生长在世界热带和亚热带地区。这些地区普遍存在钾淋溶和土壤酸化，从而降低了甘蔗种植区土壤钾含量，特别是在种植层较低的地区。土壤缺钾对甘蔗的产量和品质有不利影响[1]。钙调神经磷酸酶B样蛋白(CBL)是一种植物钙结合蛋白，最初在拟南芥中发现，是一组小蛋白的成员，与酵母中钙调神经磷酸酶的调节B亚基高度同源[2]。当植物根系细胞感知到钾离子减少时⁺在外部环境中的浓度，Ca^{2 +}信号由CBLs产生并传递以激活K⁺通道蛋白和钾转运蛋白，促进钾的吸收和利用⁺［3.]。

随后的研究表明，大米(o .漂白亚麻纤维卷)和拟南芥(答:芥)拥有10种不同的CBL蛋白[4，5]。利用比较基因组学方法，在玉米(z梅斯L.)、高粱(美国二色的L.)、杨树(杨树)和棉花[6，7，8，9]。所有CBLs的特征是存在至少三个保守的钙结合EF(延伸因子)-手基序。EF-hand基序由其螺旋-环-螺旋二级结构以及环结合Ca的配体所定义^{2 +}离子(10]。继电器Ca^{2 +}信号，CBLs与靶蛋白，如激酶，细胞骨架相关蛋白和代谢酶相互作用，以调节基因表达[11，12]。cbl相互作用蛋白激酶(CIPKs)是cbl的重要靶蛋白[3.]。CBL-CIPK复合物在植物对盐度、缺钾、低温和干旱等非生物胁迫的响应中起着不可或缺的作用[j]。2，13]。此外，它还是调节NO生长发育、吸收和转运的重要信号网络_3.⁻,在北半球₄⁺铁是H⁺植物体内稳态和活性氧(ROS)信号转导[13，14]。

迄今为止，对CBL家族的研究主要集中在拟南芥、水稻和玉米上。在拟南芥中,AtCBL1/9首次报道了对K⁺通过形成CBL1/9-CIPK23络合物并激活向内整流器K来吸收⁺通道AKT1(拟南芥K⁺转运蛋白1)磷酸化[15，16]。AtCBL1-AtCIPK23复合体也影响脱落酸(ABA)诱导的气孔开度和ROS信号通路[17，18]。AtCBL2-AtCIPK11复合物已被认为在激活质膜H中起负作用⁺- atp酶(PMA) [19，20.]。AtCBL2/3被发现参与保护植物免受高镁的侵害^{2 +}通过调节镁的固存来调节其毒性^{2 +}拟南芥中AtCIPK3/9/23/26形成多价网络21]。定位于质质体上的AtCBL2/3-CIPK12复合物参与控制花粉粒萌发和管材生长[j]。22]。AtCBL4-CIPK6复合体是AtAKT2从内质网转移到PM的关键调节因子[23]。AtCBL4和AtCBL10都通过激活AtCIPK24参与盐胁迫反应。AtCBL4在高盐条件下主要在根组织中表达[24),而AtCBL10以叶子表示[25]。AtCBL4-AtCIPK24复合物在质膜上起驱动Na的作用⁺/小时⁺交换SOS1挤出Na⁺在细胞外提高耐盐性[24]。AtCBL10-AtCIPK24复合物在细胞质上起作用并刺激Na⁺/小时⁺交换器来隔离Na⁺在盐中毒的情况下进入液泡[25]。在水稻中，同源的OsCBL4蛋白已被发现与OsCIPK24相互作用并参与SOS信号通路以响应盐胁迫[26]。OsCBL1-OsCIPK23复合体也能增强osakt1介导的K⁺水稻根系的吸收[27]。在玉米中，ZmCBL9能与8个玉米CIPKs互作，即ZmCIPK8/9/15/23/24/31/32/39，调节脱水、盐、ABA和低钾等非生物胁迫⁺水平(8]。

甘蔗是主要的食糖和生物燃料原料作物，分别占世界食糖和乙醇产量的80%和40% [28]。甘蔗品种是种间杂交种美国officinarum（2n =8 x = 80, x = 10)和野生物种美国spontaneum具有许多非整倍体形式(2)n =5 × ~ 16 × = 40 ~ 128;X = 8)和各种细胞类型[29]。美国officinarum导致高糖含量和美国spontaneum通过回交，增加了耐寒性、抗病能力和繁殖能力美国officinarum以回收其高含糖量和高生物量[29]，这是甘蔗育种史上的重大突破。因此，甘蔗品种是种间杂交种，多倍体，非整倍体，约80%的染色体含量来源于美国officinarum， 10 ~ 15% from美国spontaneum其余5 ~ 10%来自种间重组[30.，31]。基因CBL据报道，一个家族参与调控拟南芥、水稻和玉米的低钾反应[4，5，8但是它们在甘蔗中的作用和调控机制仍然未知。这项研究围绕着最近发布的美国spontaneum基因组(32]，全面分析了CBL家庭美国spontaneum还有其他植物。的表达模式SsCBLs在发育过程中以及对低K⁺压力。SsCBL01进行进一步的功能分析。综上所述，本研究对其进化进行了系统的分析CBL家族和鉴定有些健全CBL作为低钾响应的候选基因⁺甘蔗的压力。

承认CBL基因在美国spontaneum

一共有九种SsCBLs从AP85-441四倍体中鉴定美国spontaneum基因组(32通过排除等位基因。八个SbCBLs相应的从美国二色的根据比较基因组学，甘蔗的近亲(表1)1）.为了保持一致性，这些SsCBLs都是根据CBL命名的o .漂白亚麻纤维卷［4和系统发育关系。每一个SsCBL有1到4个等位基因，平均值为3美国spontaneum基因组(表S1）.在九人中SsCBLs，SsCBL01和SsCBL03位于1号染色体上;SsCBL05，SsCBL09,和SsCBL10位于3号染色体上;SsCBL04和SsCBL06位于第7号染色体;SsCBL02位于2号染色体上，那么SsCBL08位于4号染色体上。所有SsCBLs有8个外显子，除了SsCBL09编码211到294个氨基酸残基。预测SsCBLs的亚细胞位置是质膜(PM)，这与它们作为钙传感器感知和解码细胞外信号的作用一致。此外，一些SsCBLs也可能位于细胞质或细胞质上。SsCBLs与它们的序列比对美国二色的同源物表明，同源性从78.54到100%不等，平均为95.15%(表1)1）.

sscbl4与SsCBL03/06之间的蛋白序列两两比较，相似性最低为47.2% (SsCBL04与SsCBL03/06之间)，相似性最高为92.5% (SsCBL02与SsCBL03之间)，平均为61.8%(表2)S2）.对SsCBLs蛋白序列的多次比对显示，所有9个SsCBLs都具有3个典型的保守EF-hand结构域，并且在第一个EF-hand结构域的末端存在一个保守的V-F-H-P-N基序(图2)。1）.四种SsCBLs (SsCBL01、SsCBL04、SsCBL05和SsCBL08)在其n端区域具有保守的肉豆蔻酰化和棕榈酰化位点(M-G-C-X-X-S/T)(图2)。1)，它们在蛋白质聚集、稳定和运输中起着至关重要的作用[33，34]。

的顺式元素分析CBL基因在美国spontaneum

分析独联体的上游启动子区的-元素SsCBLs被执行了。最常见的顺式元件是光响应型、植物激素响应型和假定的应激响应型，如图所示。S1．所有SsCBLs除了SsCBL05含有脱落酸反应元件(ABRE)等SsCBLs除了SsCBL01含有茉莉酸甲酯反应元件(JARE)。其他phytohormone-responsive独联体鉴定出乙烯响应元件(ERE)、生长素响应因子(ARF)、水杨酸响应元件(SARE)和赤霉素响应元件(GARE)等SsCBLs．假定的逆境应答独联体-元件，如脱水响应元件(DRE)、低温响应元件(LTR)和MYB转录因子结合位点参与干旱诱导。的礼盒独联体参与光响应的-元素在9个启动子中有5个富集SsCBLs（SsCBLs01，SsCBLs02，SsCBLs03，SsCBLs06,和SsCBLs08）.

CBLs的Ka/Ks值分析

的选择压力分析SsCBL在进化过程中，基因间的非同义与同义替换比率(Ka/Ks)SsCBLs和它们的同源基因美国二色的是估计的。结果表明:CBL基因对之间美国spontaneum和美国二色的小于1(图2)。S2)，这表明CBL基因家族在分裂后经历了强烈的净化选择美国spontaneum高粱，这些基因在功能上是保守的。

的系统发育分析CBL基因在美国spontaneum以及其他有代表性的被子植物

为了更好地了解昆虫的系统发育进化CBL吉恩家族，共有112人CBL从12种代表性被子植物(8种单子叶植物，3种双子叶植物，3种双子叶植物)中鉴定出基因Amborella trichopoda)构建系统发育树，同时选取aCBL基因c . reinhardtii作为外群(图2)2）.112年CBL基因包括9个来自美国spontaneum， 8从美国二色的， 12从z梅斯， 9从美国绿冬青， 10分美国italica， 10分o .漂白亚麻纤维卷， 9从b . distachyon， 8从答:comosus， 10分答:芥， 9从诉酿酒用葡萄， 13从美国lycopersicum5从Amborella trichopoda(无花果。3.）.结果表明，总计数CBL一个植物物种的基因与其基因组的大小不成比例。

112年CBL属于不同物种的基因可分为四个支系(I, II, III, IV)。2）.答:trichopoda，最早分化的被子植物含有5个CBL而在双子房和单子房中，基因总数为CBL基因从8个到13个不等，这表明CBL基因家族经历了基因扩展，这种基因扩展主要归因于双子叶系和单子叶系的全基因组重复(WGDs)(图2)。2和3.）.枝I, III和IV包含CBL所有12种被子植物的基因，表明这些基因的祖先早于被子植物的分裂。此外,cbl从美国spontaneum通常与禾本科植物的种子簇生在一起的，尤指美国二色的．这些结果与美国二色的与甘蔗最接近的。

外显子/内含子的组织CBL家庭美国spontaneum和其他被子植物

分析内含子-外显子结构及其演化CBL在不同物种的基因中，cDNA序列被映射到它们的基因组序列上。的外显子数CBL这些物种的科从1到12不等，大多数cbl(76 / 113, 67.3%)含有8个外显子，表明最后的共同祖先(LCA)cbl在被子植物中有8个外显子(图2)。2,无花果。S3）.CBL09并且其在进化枝II中的同源基因比其他进化枝多了一个外显子，这可能是在外显子事件后产生的，这是导致同源基因外显子-内含子结构差异的主要驱动力[35]。的CBL进化支IV的基因大小在四个进化支中变化最大。的CBL每个亚家族的基因结构相似，所检查的外显子大小cbl保持相对保守。然而，基因的大小差异很大，这主要归因于不同的内含子大小或内含子插入(图2)。2）.剪接位点的内含子相CBL根据阶段1、阶段2和阶段0进行基因分析，阶段1、阶段2和阶段0分别代表密码子第1、2和3个核苷酸之后的选择性剪接[36]。结果表明，几乎所有在相同相对位置的内含子的剪接阶段都是相同的，这表明该基因的剪接阶段是相同的CBL基因在进化过程中高度保守(图2)。2）.

的表达分析SsCBLs在不同阶段的不同组织中

转录组谱cbl在美国spontaneum基于RNA-seq数据分析所有SsCBL不同阶段不同组织中基因的表达(图2)4一、表S3）.SsCBL01其中表达量最高SsCBLs;且早熟期和成熟期表达量均高于苗期。这两个SsCBL03和SsCBL06在茎中的表达程度高于叶片。SsCBLs在进化支I和进化支II中，包括SsCBL04/05/08/09/10在被检查的组织中，它们的表达水平都很低或检测不到，这表明它们在生长和发育中的作用相当有限。

的表达分析SsCBLs在昼夜节律中

cbl据报道，拟南芥对光有反应[37]。的表达模式分析SsCBLs在昼夜周期中，成熟叶片的转录组谱美国spontaneum24 h内每隔2 h和24 h内每隔4 h进行一次调查。的表达水平SsCBLs在进化枝I和进化枝II中的含量非常低或无法检测到(图2)。4B,表S4)，进一步支持它们的有限作用，并与不同发育阶段的表达模式一致。值得注意的是，的表达SsCBL02受昼夜节律调节，上午表达量最高，中午表达量最低(图2)。4）.这可以用光对植物激素活性的影响来解释;激素周期与钙信号级联直接相关，钙信号级联在激素信号通路中起反馈作用[38]。

的表达分析SsCBLs在K⁺不足的压力

cbl在解码由环境刺激引发的信号中起着至关重要的作用，比如K⁺拟南芥、水稻和玉米的剥夺或盐胁迫[13，27，39]。因此，我们研究了这9种基因的表达模式SsCBLs在K⁺RT-qPCR检测饥饿。一般来说，低K值⁺压力适度地改变了的转录SsCBLs(无花果。5）.九个SsCBLs根据它们的表达模式可以分为两组。一组包含SsCBL01/03/04/05, 6 h表达量增加，随着低K时间的延长表达量减少⁺压力。另一组包含SsCBL02/06/08/09/10在低钾条件下表达减少的基因⁺压力。的表达水平SsCBL01在K处理6 h时显著增加，在12 h、24 h、48 h和72 h时减少⁺饥饿，这表明SsCBL01可能在对低K⁺压力美国spontaneum．这些结果也表明钙信号是应激信号通路中的早期事件[38]。

SsCBL01的亚细胞定位

SsCBL01在n端区域含有一个保守的肉豆蔻酰化位点，这是细胞膜定位的特征之一。确认是否SsCBL01定位于细胞膜上，是一种融合结构SsCBL01利用绿色荧光蛋白(GFP)在水稻原生质体中进行瞬时转化。结果表明，对照GFP在整个细胞中检测到，而对照GFP在细胞中检测到SsCBL01-GFP荧光信号仅在质膜上可见，说明SsCBL01是一种质膜蛋白(图2)。6）.这也与同源基因的亚细胞定位一致CBL1拟南芥和水稻基因[18，27]。

的功能分析SsCBL01在有缺陷的酵母突变体中

表达模式分析显示SsCBL01可能在应对低K⁺的水平。的异源表达SsCBL01在酵母菌中表明，转化后的酵母菌株生长无明显差异SsCBL01空向量(图1)7),建议SsCBL01单独不能吸收K⁺．我们之前的研究表明SsHAK1可以部分恢复K⁺K吸收⁺酵母突变体的饥饿[40]。研究的调控作用SsCBL01在SsHAK1我们构建了含这两个基因的共转化酵母，并观察了它们在SC/−ura培养基中分别添加100 mM、10 mM和0 mM KCl的生长过程。结果表明，酵母的生长在两种条件下都发生了转化SsHAK1和SsCBL01比酵母转化的更好吗SsHAK1在100mm、10mm和0mm KCl下(图3)。7）.所有这些结果表明SsCBL01单独不能吸收K⁺但它可以促进K⁺吸收SsHAK1．

就像植物中的钙传感器一样CBL在拟南芥、水稻和玉米中发现调控钾胁迫的基因家族[4，5，8]。然而,CBL基因家族美国spontaneum尚未被定性。这项工作确定了九个CBL基因美国spontaneum;这些基因一起有104个同源基因CBL利用来自12个植物物种和一个外群的基因创建了一个系统发育树来研究它们的进化。的表达模式分析SsCBLs在个体发育阶段的各种组织中，在昼夜节律中，以及暴露于低钾环境中⁺的功能发散度进行应力研究SsCBLs．揭示了酵母的异源表达SsCBL01正向调节K⁺吸收的SsHAK1．

的进化CBL基因家族美国spontaneum有代表性的被子植物

WGD或多倍体被认为是被子植物进化的关键触发因素[41，42]。对整个拟南芥基因组序列的广泛分析揭示了十字花科谱系中最近出现的两个WGDs(命名为α和β)，以及所有核心双子叶植物可能共有的三复制事件(γ)。43，44]。单子代经历了两次WGDs(分别命名为σ和ρ) [45]，最近的研究发现菠萝(答:comosus)的WGD事件(ρ)比其他禾本科(禾本科)[46]。被子植物在进化过程中经历了更早的古WGD事件(ε) [47]。答:trichopoda由于它是已知最早从其他被子植物中独立进化而来的被子植物，因此引起了人们的广泛关注。上述被子植物WGD信息，并对112种植物的系统发育进行了分析CBL基因使研究基因进化成为可能。的CBL12种被子植物的基因按重复降序可分为4个支系:支系I、支系II、支系III和支系IV。

的CBL4个进化支的基因分布不均匀CBL双子叶植物和单子叶植物的基因家族成员在所有四个分支中都聚集在不同的亚科中。这些结果表明cbl可能经历了不同的进化以适应环境的剧烈变化。进化枝I的基因结构在4个进化枝中最为保守，这与进化枝I是最古老的进化枝相一致。在进化支II中，所有被子植物除答:trichopoda包含CBL基因，表明最后的共同祖先(LCA)cbl演化枝II起源于答:trichopoda来自被子植物。I、II和IV支系的基因扩增主要归因于双子叶系的γ WGD和单子叶系的σ WGD;此外，ρ WGD也导致CBL禾本科植物中I和II枝的扩展。III级只包含一个CBL基因家族成员，CBL01，以及所有12种代表性被子植物，包括a . trichopoda有了这个基因，说明了它的重要性和保存性CBL01．在进化枝IV中CBL基因结构在四个支系中变化最大，这也与系统发育分析显示的支系IV是进化过程中最晚的分支相一致。

CBLs的基因表达及功能分化Saccharrum

表达模式分析可以揭示基因的潜在功能CBL基因家族。在我们的研究中CBL进化枝I和进化枝II的基因在不同发育阶段的组织中或不表达，或表达程度极低，并响应昼夜节律CBL进化枝III和进化枝IV的基因是主要表达的基因。根据根系进化树，进化枝I和II出现的时间早于进化枝III和IV。这些结果表明，功能冗余和分歧可能发生在CBL进化中的家庭。根据系统发育分析，SsCBL01是一个重要且保守的基因。转录组分析进一步证实了这一点SsCBL019个基因中主要表达的基因是什么SsCBL基因在不同的发育阶段，以及在昼夜节律。的表达式SsCBL02是由昼夜节律调节的。在拟南芥中,AtCBL2转录也受到光照的影响，AtCBL2通过与snf1相关的蛋白激酶AtSR1相互作用来响应光信号[37]。这些结果表明SsCBL02可能参与响应光的信号转导。

作为一个整体，K⁺饥饿对基因的表达水平有中等影响SsCBL基因。类似地,CBL棉花基因在钾胁迫下也有类似的表达模式⁺不足(6]。这些结果表明，多重SsCBL基因最有可能调节对低钾的反应⁺压力美国spontaneum．引人注目的是AtCBL1和AtCBL9在低钾条件下是稳定的[17]。因此,这些SsCBLs不是由缺钾引起的，也可能参与了对缺钾的适应美国spontaneum．的表达式AtCBL10在缺钾条件下，根系的生长有一定程度的减少[48]。这些结果表明，本构表达的一些CBL在植物低钾胁迫下，基因可能足以将钙信号传递给下游目标。在低钾胁迫下，分别于0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h测定根和茎部钾含量。值得注意的是，在低钾条件下，芽和根的钾含量变化不显著⁺72h内应力(图2)S4）.这可以用K的化简来解释⁺在外部环境中的浓度触发Ca^{2 +}信号在植物根部细胞中传递，然后被CBLs识别并传递以激活K⁺通道蛋白或钾转运蛋白，导致钾的吸收和运输增强⁺在植物的短期内[3.，16]。

基因结构SsCBL的函数SsCBL01对低K值的响应⁺压力

所有SsCBL除了基因SsCBL09有8个外显子，类似于CBL其他单子房和双子房的基因，这表明CBL不同植物物种的基因结构。此外,所有SsCBL基因包含三个典型的EF-hand保守基序，它们与Ca结合^{2 +}传导钙信号。这些特性也强烈地使人想起拟南芥和水稻[5]。的保守结构CBL不同植物中的家族成员与其靶蛋白(如CIPKs)的相互作用模式可能相似。

研究表明，cbl在拟南芥和水稻对低钾胁迫的响应中起关键作用[16，27]。在本研究中，低K⁺应激对基因的转录有中等影响SsCBLs,SsCBL01表达在K下先上调后下调⁺饥饿。的异源表达SsCBL01在酵母中显示SsCBL01单独不能调解K⁺进一步的研究发现SsCBL01可以调节SsHAK1增强K⁺介导的摄取SsHAK1在低钾和正常钾供应条件下。与拟南芥、水稻和大麦一样，CBL1已被证明与CIPK23相互作用并磷酸化AKT1，从而激活其K⁺摄取函数[16，27，49]。Lee等。[50]发现AtCBL1可以与不同的cipk相互作用，如CIPK6、CIPK16和CIPK23来激活AtAKT1。CBL1-CIPK23复合物也能磷酸化AtHAK5并上调其活性以促进K的吸收⁺在拟南芥的根部[51]。本研究发现SsCBL01可以增强K⁺SsHAK1的吸收促进活性。然而，这种增强是否由于SsCBL01和SsCIPKs之间的相互作用美国spontaneum需要进一步调查。

甘蔗品种是具有大而复杂基因组的多倍体种间杂交种。在这项研究中，有9个SsCBL基因最初是在美国spontaneum系统的进化分析表明CBL基因家族经历了基因扩增和强烈的净化选择。基因结构和蛋白序列分析表明，SsCBLs具有保守性，含有三种典型钙-结合EF-hand结构域在不同发育阶段和昼夜节律的不同组织中表达模式分析揭示了功能差异SsCBLs．酵母的功能验证表明，仅细胞膜定位的SsCBL01不能吸收K⁺但它正调节K⁺钾转运体SsHAK1的吸收综上所述，本研究提供了一个全面的观点CBL基因家族和健壮的候选人SsCBLs为进一步研究其功能机制美国spontaneum．

植物材料、生长条件和酵母菌突变株

美国spontaneumSES208 (2n =本研究使用福建农林大学张吉森实验室的8x = 64和广东省科学院生物工程研究所选育的甘蔗商业杂交种粤塘55 (YT55)。SES208是按照标准的种植程序在温室里的塑料盆里与土壤一起种植的。YT55用改良的霍格兰营养液在塑料盆中生长。

酵母突变体R5421（酿酒cervidinus)是一种缺钾菌株，主要用于识别钾转运体、钾通道或钠泵。菌株在100mm K的培养基中正常生长⁺，在含有5-10 mM K的培养基中相当缓慢⁺．然而，当K的浓度⁺在小于0.5 mM的培养基中，R5421细胞不能生长。

采集SES208组织样本，研究其在不同发育阶段和昼夜周期中不同时间点的表达模式。为了分析不同发育阶段的表达模式，采集了SES208幼苗期35日龄植株的叶片和茎，9个月(早熟期)和12个月(成熟期)植株的叶卷、叶片、上部茎(即Stem3)、中部茎(即Stem6)和下部茎(即Stem9)。的节间美国spontaneum茎从上到下编号。采用先前描述的方法收集组织[52]，每个样本采集3个生物重复。为了研究其表达模式对昼夜节律的响应，研究人员从上午6点开始，在24小时内每隔2小时采集一次SES208植物的成熟叶片。2017年3月2日。在接下来的24小时内，每隔4小时进行一次采集。组织收集方法与前面描述的相同[46]，每个样本采集3个生物重复。

为研究低钾胁迫条件下的表达规律，在温室条件下(温度26℃左右;相对湿度:60-80%;光周期:12 - 12h明暗周期)，随后转入K⁺-缺乏营养液(0.1 mM KCl)暴露于低钾⁺压力。在胁迫处理后的0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h，分别取6株植物的混合根组织(1个生物重复，共收集3个生物重复)，立即在液氮中冷冻，保存在−70°C中提取总RNA。

测定了低钾胁迫下0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h时YT55根和芽中的钾含量。采集植物根、芽组织(6株一盆为一个生物重复，共采集3个生物重复)。将样品置于105℃的烘箱中，固定2分钟，然后在70℃下干燥至恒重。植物样品在粉碎机中粉碎，然后通过20目筛。将0.2 g的样品称重，用H湿灰化法消化₂所以₄- h₂O₂在炊具上。消化后，调整体积至250 mL。使用425型火焰光度计(Sherwood, UK)测量每个处理过的甘蔗植株组织的钾含量(mg/g，干重)。

CBL家族基因的鉴定美国spontaneum和其他被子植物

的基因组序列美国spontaneum已从NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/QVOL00000000） [32]。根据先前的报告，10、10和12的蛋白质序列cbl从答:芥，z梅斯,o .漂白亚麻纤维卷［1，4，8]作为查询应用于推定搜索CBL基因组中的基因家族成员美国spontaneum以及使用BLASTp程序选择的11个被子植物基因组。11种被子植物包括7种单子叶植物(梅斯，S.双色，斜体狗尾草，草尾草，绿尾草，b . distachyon和o .漂白亚麻纤维卷)、3片双子叶(答:芥，s . lycopersicum和诉酿酒用葡萄),Amborella trichopoda，基因组序列从Phytozome V12.1 (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）.e值−1070%以上的身份被选为CBL候选人。然后，根据Pfam (https://pfam.xfam.org)和保守域数据库(CDD) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrp-sb.cgi)数据库进行保守域验证。此外，C. reinhardtii CBL被用作外组。

来自中国的CBL家族基因序列分析美国spontaneum

预测CBL蛋白的性质美国spontaneum和美国二色的（美国二色的)使用ExPASy (https://web.expasy.org/compute_pi/）.使用TBtools软件提取GFF3文件CBL基因家族成员，并通过TBtools绘制和可视化基因结构[53]。CBL蛋白的亚细胞定位通过在线工具WoLF PSORT (https://www.genscript.com/wolf-psort.html）.分析了中顺式元素的类型和分布cbl，选取其上游启动子区的2kb序列提交到在线工具Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/-webtools/plantcare/html/)用于预测启动子中的顺式元素。

系统发育和进化分析

利用ClustalW 2.0软件对来自12种被子植物及其外群的113条CBL蛋白序列进行配对比对，并使用默认参数进行多重比对[j]。54]。的系统发育树CBL基于使用MEGA7.0 [55]。采用基于JTT矩阵模型的极大似然法推断进化历史[56]。系统发育树内部分支的可靠性评估使用1000次bootstrap试验完成，并在分支旁边显示百分比。

八对的Ka(非同义取代率)，Ks(同义取代率)，以及Ka与Ks的比值CBL直接同源的美国spontaneum和高粱用Easy_KaKs计算程序(https://github.com/tangerzhang/FAFUcgb/tree/master/easy_KaKs）.

CBLs的表达谱分析美国spontaneum基于RNA-seq和RT-qPCR

为了研究不同发育阶段和昼夜节律的表达模式，通过RNA提取试剂盒从所有组织中提取RNA，并根据TruSeq™描述的协议创建cDNA文库。使用Illumina Hiseq 2500平台对末端为100 nt的RNA-seq文库进行测序。的美国spontaneum以AP85-441基因组作为参考基因组[32]。首先通过修剪适配器和低质量序列过滤原始reads，包括未知碱基超过10%的reads和q值≤5的核苷酸含量超过50%的reads。然后，将获得的clean reads映射到参考序列。RNA-seq定量分析采用Trinity (https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)，单个基因的转录表达水平通过FPKM值(每千碱基外显子每百万片段的片段数)使用Trinity [57];这些数据可以从http://sugarcane.zhangjisenlab.cn/sgd/html/index.html．

评估的表达模式cbl在YT55低K下⁺低K胁迫下，从YT55根部提取1 μg RNA⁺利用PrimeScript RT试剂盒(Monad Biotech, Suzhou, China)将胁迫逆转录为cDNA。随后，在ABI 7500实时PCR系统上使用cDNA和SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japan)进行实时定量PCR (RT-qPCR)。的特异性RT-qPCR引物cbl(表S5)，由网上工具及综合DNA技术(https://sg.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index)，利用两个组成型表达基因β肌动蛋白和真核延伸因子1a（eEF-1a)作为使基因表达水平正常化的内部控制。每个样品进行3次技术重复。各基因的相对表达水平SsCBL基因在低钾处理样品中表达⁺不同时间的应力用2^-△△Ct方法(58]。

亚细胞定位

根据CDS的顺序SsCBL01，引物(表S6)中含有酶切位点，旨在扩增SsCBL01．以YT55 RNA样品在低钾胁迫下逆转录6 h合成的cDNA为模板。将PCR产物与pBWA(V) HS-Glosgfp载体上的绿色荧光蛋白(GFP)编码区进行融合，构建SsCBL01-GFP融合构建由CaMV 35S启动子控制。将结合产物转化为大肠杆菌主管DH5α细胞。选择阳性克隆进行PCR扩增和测序确认，然后利用GFP融合构建在水稻原生质体中进行瞬时转化。跨膜蛋白OsMAC1与mCherry融合[59]。OsMAC1-mCherry构建物被用作质膜定位标记。用共聚焦激光显微镜(尼康C2-ER)观察GFP和RFP荧光信号，在MS培养基上28℃暗培养48 h后，使用发射波段为510 nm/675 nm的氩气激光器在488 nm/640 nm(激发)处进行检测。

的表达载体构建及异源表达SsCBL01在酵母

的全长cDNA克隆SsCBL01利用YT55 cDNA进行分析。PCR产物回收后，用In-Fusion酶(TaKaRa Biotechnology Co.， Ltd, Dalian, China)连接酵母表达载体pYES3/CT。将PCR产物转化为大肠杆菌主管JM109选择细胞和单克隆菌落进行PCR。质粒被确认携带SsCBL01将空载体pYES3/CT转化为酵母突变株R5421感态细胞，在SD/−trp培养基中筛选阳性菌落。阳性酵母在液体培养基中孵育过夜至饱和，然后调整酵母浓度至OD600 = 0.8。酵母株(R5421)空载体pYES3/CT和SsCBL01梯度稀释后，分别在含有0 mM、10 mM或100 mM KCl的SD/ - trp培养基中接种3-5天。

互相转化的SsCBL01和SsHAK1在酵母突变体中

在之前的研究中，我们构建了酵母表达载体pYES2.0-SsHAK1用来研究的函数SsHAK1［40]。研究的调控作用SsCBL01在SsHAK1pYES2.0 -SsHAK1和pYES3 / CT -SsCBL01共同转化为酵母突变体R5421接种于SD/−ura/−trp培养基中筛选阳性菌株。酵母菌株(R5421)转换为空向量pYES2.0, pYES2.0-SsHAK1,和pYES2.0 -SsHAK1+ pYES3 / CT -SsCBL01梯度稀释后，分别在SC/−ura培养基中接种100 mM、10 mM或0 mM KCl，接种3-5天。

所有RNA-seq相关数据可从甘蔗数据库网站(http://sugarcane.zhangjisenlab.cn/sgd/html/index.html）.的美国spontaneum基因组计划[32]存入Genbank，登记号:QVOL00000000。

感谢福建农林大学海霞科技研究所基因组学与生物技术中心为我们提供甘蔗组学数据。作者感谢南京农业大学徐国华教授提供的酵母菌突变株。

本研究由GDAS科技发展项目(2019GDASYL-0103028，用于购买本研究所用试剂及耗材)资助;广州市科技计划项目(202102020391，用于采购本研究所用试剂及耗材);国家重点研发计划项目(2018YFD1000503，用于甘蔗种植与管理人工成本研究);广东省重点领域研发专项(2019B020238001，用于广州至福州进行酵母表达实验的路费);广西重点实验室建设项目(20-065-24-K-04-01，用于本文的文章润色);国家自然科学基金(31901512，用于购买本研究所用试剂及耗材)。

作者指出

1. 冯小敏和王永军对这项工作也有同样的贡献。

从属关系

1. 广东省科学院南帆种业研究所广东省甘蔗遗传改良工程中心，广东省广州市海珠区江海大道生物工程大楼1909室，邮编510316

   冯小敏，张楠楠，高帅，吴佳云，刘睿，黄永红，齐永文

2. 福建农林大学农学院，福建省海霞应用植物系统生物学重点实验室，基因组学与生物技术研究中心，福建福州350002

   王永军，张继森

3. 广西甘蔗遗传改良重点实验室，广西南宁530007

   Yongwen气

贡献

XF, JZ和YQ构思了研究并设计了实验。XF, YW, NZ, SG和JW进行了实验并分析了数据。XF写了手稿。JZ, YQ, RL, YH对稿件进行了修改和完善。所有作者都审阅并批准了该提交。

相应的作者

对应到Yongwen气．

伦理批准并同意参与

本研究符合国家和地方有关规定。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明无利益冲突。

出版商的注意

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