耐受和敏感小麦幼苗对全身和局部施用玉米赤霉烯酮的保护反应。电子顺磁共振研究

背景

真菌毒素是环境压力源之一，其氧化作用目前被广泛研究。本文研究了耐敏小麦品种对玉米赤霉烯酮(ZEA)直接施于叶片和间接施于籽粒的反应。

结果

对叶绿体进行了抗氧化活性的生化分析，结果表明，无论植物的敏感性和ZEA的施用方式如何，这种活性都有类似的下降。另一方面，在ZEA溶液中培养的谷物和敏感品种中生长的植物叶片中产生了更高数量的超氧自由基(显微观察)。电子顺磁共振(EPR)研究表明，经ZEA处理后，耐药小麦叶片中Mn -水络合物的数量比敏感小麦叶片中Mn -水络合物的数量多，而铁蛋白络合物的降解与品种敏感性无关。

结论

通过稳定生物化学大分子上的活性氧而形成的稳定有机自由基数量的变化，表明叶片组织在ZEA处理下更有可能产生这些自由基。这表明这些自由基物种在主要对抗直接毒素作用的保护机制中具有重要作用。防御机制被激活的方式取决于使用毒素的方法。

在环境胁迫下维持植物细胞氧化还原稳态对植物正常发育和产量至关重要。体内平衡紊乱是由于产生过多的活性氧(ROS)，超过了细胞的还原能力[1］．剩余ROS的失活是通过酶促和非酶促抗氧化剂的激活/合成发生的，其有效性取决于植物对胁迫的耐受性/敏感性[2］．因此，认识同一品种间抗逆性激发机制的差异，有助于获得对环境条件变化更耐受的新基因型。由于叶绿体是产生ROS的细胞器，可能是光合作用的一个步骤，而正确的光合作用过程对植物的正常功能是必要的，因此这些细胞器在胁迫下发生的变化尤为重要。

还原铁氧还蛋白直接电子转移的干扰₂激发了顺磁性金属离子(主要是Mn、Fe、Cu)氧化态的变化，这些离子在光系统中参与电子转移的蛋白质中构成氧化还原中心[3.］．光合作用的研究，其氧化还原反应，包括金属离子氧化状态的变化或自由基的形成，是通过不同的方法进行的。其中之一是电子顺磁共振波谱(EPR)，它可以识别顺磁中心，包括Fe (III)， Mn (II)， Cu (II)和各种自由基。铁蛋白中含有大量的铁(III)和铁(II)离子，铁蛋白是一种基本功能是储存铁的蛋白质。缺铁时，铁蛋白是铁的供体，缺铁时，铁蛋白是铁的蓄能器[4］．铁蛋白的这种保护特性尤其重要，因为高浓度的铁离子会引起氧化应激，导致蛋白质和膜脂的氧化损伤。在我们早期的研究中，用EPR法在标准条件下测定Fe (III)种的Fe离子的形式，是根据它们在不同温度下记录的信号的特征的差异来分析的。基于EPR光谱，还研究了氧化应激时锰离子含量和性质的变化[5］．在氧化环境中，Mn(II)的无机化合物的光谱中可见锰信号的特征超精细结构，例如在[Mn(H₂O)₆］^{2 +}水配合物允许将这些物种与含有相互作用的锰离子的有机结构区分开来[6，7］．此外，这些锰水配合物的信号强度在每个基因型的光谱中是不同的，这使我们能够将它们彼此区分开来[5］．

除了来自顺磁性金属离子的信号外，EPR技术还允许对自由基光谱进行配准。对活性自由基种类的测量需要使用捕集技术，但是可以毫不费力地记录稳定的有机自由基，即所谓的“长寿自由基”。对这些物种的研究在氧化应激机制的研究中特别重要，因为研究表明，它们是在有机分子(主要是多糖和蛋白质)上形成的，是在应激下“俘获”过量产生的电子的结果[8］．

玉米赤霉烯酮是一种较为普遍的镰刀菌毒素[9］．它们在植物细胞中的积累会引发氧化应激，从而扰乱氧化还原稳态，从而导致作物数量和质量的损失。此外，与植物性食物一起服用的真菌毒素会刺激人类和动物细胞的疾病反应。在我们早期的研究中，我们发现玉米赤霉烯酮(ZEA)可能定位于叶绿体中，并可能与这些细胞器相互作用[10，11］．ZEA在叶绿体中的积累降低了小麦细胞中叶绿素的总含量，特别是在敏感品种中，这表明光合系统处于半破坏状态[12］．在本研究中，观察到的对叶片叶绿体的影响是由该毒素从受感染的种子中长距离转运引起的。另一种同样可能的ZEA感染方式是定植后的叶吸收镰刀菌素，导致重要农艺植物的严重减产。科尔纳赫维奇等人。[13]报告了直接用ZEA处理后谷物叶片叶绿体结构的改变。这些变化可能是ZEA介导的叶绿体膜损伤的结果，其原因是ROS与脂质的相互作用和/或与毒素位置相关的膜亲疏水结构的变化[14］．含有大量半乳糖脂组分(MGDG和DGDG)的叶绿体膜的特定组织可以提供一个环境，其中ROS和自由电子可能被困在这些脂质的糖基上，产生长寿命的自由基[5］．

本研究的目的是查明ZEA的施用方式是否决定了叶绿体的氧化变化，以及这些潜在的变化在多大程度上取决于植物对胁迫条件的抗性。采用生物化学方法检测耐敏小麦品种叶绿体的氧化潜力，并利用EPR技术验证了细胞内和细胞外ZEA处理后叶片顺磁中心的变化。EPR研究是直接在叶片上进行的，以防止在样品制备过程中任何额外的压力源的影响，从而掩盖ZEA作用的机制。选择小麦品种进行研究，因为小麦是欧洲最受欢迎的谷物，其对真菌毒素的保护机制仍未完全认识。

生化分析

对用ZEA浸泡的种子生长的植物的叶绿体中的抗氧化酶的研究表明，对照植物的酶活性相似(SODs, CAT和POX)，这取决于所测试的基因型(表2)1)．一般来说，在cv中。“抛物线”中所有酶的活性均高于cv。“Raweta”。当用ZEA处理种子时，两个研究品种的所有酶活性(与对照相比)都下降了，但在cv中变化更剧烈。“Raweta”。在叶片ZEA处理的植株中，各酶活性均下降。“Raweta”，而简历。“抛物线”显示sod和CAT活性增强。

以清除DPPH自由基的百分数表示的叶绿体抗氧化性能表明，在对照条件下，cv的抗氧化活性较高。“抛物线”叶绿体比cv。' Raweta '(图。1A)。施用ZEA的两种方法都降低了该参数的值，然而，从受ZEA感染的颗粒生长的植株中获得的叶绿体比直接从受感染的叶片中分离的叶绿体更明显。在cv中变化更为明显。“Raweta”。

抗氧化活性，以抗坏血酸浓度表示，对照的cv叶绿体更强。'抛物线'比cv的抛物线要高。“Raweta”(图。1B). ZEA处理后，cv。“抛物线”显示出类似的抗氧化活性下降，与应用方法无关。的简历。' Raweta '，当谷物被真菌毒素感染时获得的值比直接被叶片吸收时低。

在基于系统失活电子能力(Fe (III)/Fe (II)变化)计算还原力时，cv.;“抛物线”的特征是对照条件下Fe (III)含量高于cv。“Raweta”。这意味着抛物线细胞含有更少的自由电子(被抗氧化系统更有效地中和)，能够还原Fe (III)离子。施用ZEA通常会降低Fe (III)水平，在直接用该真菌毒素处理的植物的叶绿体中效果更显著(图2)。1C)。

ROS的可视化

显微观察显示，在被测叶绿体中存在超氧自由基，在对照样品中更明显。'抛物线'比cv的抛物线要高。“Raweta”，表明这些自由基在耐受品种中浓度较高(图。2)．ZEA处理增加了叶绿体中自由基的数量，并且从受感染的颗粒生长的植物中获得的细胞器比从直接处理的叶片中获得的细胞器增加得更多。变化在cv中更为明显。“Raweta”。

电子顺磁共振分析

EPR测量显示，无论配准温度如何，在两种小麦基因型的对照叶样品的光谱中，都观察到特征的六条超细结构(HFS)线，在g = 2.00时在更宽的信号上重叠(图2)。3.A”，D).在室温下记录的光谱中，这些信号没有受到干扰，并且cv的强度略高。“Raweta”。在超精细结构的第三和第四行之间，在g = 2.00处观察到一个狭窄的信号R，两个基因型的强度相似。在室温下，g = 2.25时的谱线在cv的光谱中更为明显。“抛物线”(图。3.一个,”)。配准温度下降到77 K时，g = 2.6和g = 2.4处出现了宽谱线，成为光谱的主要信号。此外，在HFS的主要光场之间可见低强度线(图2)。3.D, D’)，在g = 4.26处均出现低强度信号。信号R的特征发生变化，线变宽，强度增加(信号R′)(图2)。3.D,4D)。

玉米籽粒经ZEA处理后生长的小麦植株叶片光谱表现出更显著的变化。“Raweta”。在g值2.2 ~ 2.5范围内，室温下记录的频谱中出现了新的信号(图2)。3.在77 K时，该范围内的信号消失，g = 2.4和2.6处的线可见，与对照样品相似(图2)。3.E).同时，信号R变为R '，与对照样本相同。

直接用ZEA处理的叶片的光谱与从感染了这种真菌毒素的谷物中生长出来的植物的光谱不同。3.C, F). cv谱的主要变化。在室温下记录的“Raweta”在g = 2.06时出现一条强线，在g = 2.4时出现四条线，强度小而相等。在简历。“抛物线”谱在g = 2.25处的信号消失，而在g = 2.5处的另一个信号被注意到(图2)。3.C”)。在简历。77 K时记录的' Raweta '谱，g = 2.6处的信号减弱，g = 2.4处的线主要可见(图2)。3.F)，而在cv。“抛物线”谱的宽信号在g = 2.6处仅略有下降(图。3.F”)。为了仔细检查窄线R，在5 mT范围内记录了光谱。

对对照植物光谱中g = 2.00时R线的模拟表明，R线由信号A和B两部分组成(图2)。4A).信号A约占频谱的70%，各向异性较小，参数为:g₁= 2.0064, g₂= 2.0042, g_3.= 2.0037, g_av= 2.0048, a_av= 0.2 mT，而信号B为各向同性，g = 2.0050, A = 0.7 mT。4B)由g值增加到g的信号A和B组成_av= 2.0054, g = 2.0058。信号A的各向异性减小，而中心B的超精细常数增加到1.1 mT。同时，在g = 2.0035处的弱信号(信号C)分裂为四条几乎等距离的线(A₁= 0.8 mT, A₂= 1.6 mT)为了与实验谱线拟合良好，需要在模拟谱中加入相似强度的谱线。叶面ZEA处理的结果是光谱(图。4C)包含信号A，信号B随HFS常数(A₁= 1.6 mT)，信号C的贡献大于ZEA处理后植株叶谱的贡献。温度的降低使信号R变成了一个新的信号，明显比R宽，标记为R '。其控制样本参数为:g₁= 2.0081, g₂= 2.0045, g_3.= 2.0013, g_av= 2.0045, a₂^β= 1.7 mT(图;4D)在直接处理ZEA的叶片光谱中观察到的信号略有变化(图。4E、F)。

从所研究的幼苗中分离出的叶绿体的生化分析显示，这些细胞器在保护植物免受ZEA积累引起的氧化胁迫的能力上存在差异，这取决于小麦品种的抗胁迫能力和真菌毒素的施用方式。在用ZEA浸泡过的种子培育的植物中，抗氧化系统的效率较低，这可以通过测试酶的活性下降来证明。简历中有较大变更。“Raweta”证实了它对这种应激源的抵抗力较低。与对照相比，酶活性的这种下降可能表明这些酶的蛋白质结构受到了部分损伤[15，在cv中更为明显。“Raweta”。cv电阻更大。在叶表面直接施用ZEA后，SOD和CAT活性的增加也可能表明了“抛物线”。这表明刺激了保护植物免受氧化自由基形成的机制。从用ZEA处理过的种子生长出来的植株中，叶绿体中产生了更多的自由基，这证实了抗氧化系统在该处理期间的效率较低。敏感品种叶绿体中过量的超氧自由基可能表明其抗氧化系统的效率较低。有趣的是，这与ZEA的施用方法及其随后向叶绿体的转运无关。所有测试指标(DPPH、AA、Fe (III)/Fe (II))均较高(在对照条件下)，表明耐药品种叶绿体具有较高的抗氧化潜力。

DPPH以非自由基形式出现在供氢抗氧化剂的存在下[15］．在ZEA处理后，清除活性的降低可能是由于抗氧化剂参与了应激下产生的ROS的清除。长期ZEA胁迫(施用于谷物)导致的更大的降低可能是由于抗氧化剂的合成比与ZEA短期相互作用(叶面处理)更有效，类似于在超氧化物显微观察中发现的情况。

抗坏血酸(AA)参与氧化还原反应，其中一种活性物质以另一种活性物质的氧化为代价而减少[16］．此外，“还原力”(将Fe (III)离子还原为Fe (II)的能力)的值表明，在ZEA作用下，叶绿体中的氧化还原反应在防御过程中发挥了重要作用。对照样品中较高的Fe (III)离子含量与较低的自由电子水平有关，可能会将这些离子还原为Fe (II)，这表明该品种抗氧化系统具有更有效的作用。施用ZEA引起的Fe (III)积累的下降(叶面处理比籽粒处理更大)表明在胁迫条件下产生的自由电子水平增加。来自敏感小麦基因型的样品还原力下降更大，证实其抗氧化系统效率较低。

虽然没有直接在叶绿体中进行测量，但EPR信号的研究允许描述顺磁性金属离子，其主要位置和功能与这些细胞器有关。此外，可以监测金属离子在ZEA处理后氧化还原状态的变化。结合文献数据对谱中出现的EPR信号进行分析，可以将观测到的信号归属于特定的顺磁种。6条超细线重叠的宽线信号被认为是Mn种的信号。在室温下观察到的高分辨超精细结构源于Mn (II)的自由旋转水络合物，常出现在各种植物的EPR光谱中[6，10]，而这条宽线主要是偶极-偶极相互作用的Mn (II)离子，主要位于蛋白质基质中[17］．在g 2.2和2.5范围内观察到的信号归因于形成Fe- o -Fe簇的无机反铁磁耦合顺磁Fe (III)离子、铁氧化物、氢氧化物和/或积聚在铁蛋白“铁芯”中的磷酸盐[18，19]，而在g = 2.4和2.6时，在77 K时出现的宽信号则归因于铁蛋白蛋白壳中与蛋白质基质结合的Fe (III)离子，其中含有铁离子和亚铁离子[20.，21］．在77 K记录的所有光谱中观察到g = 4.26的小线，归因于具有菱形对称的非下摆高自旋Fe (III) [6］．

在室温条件下，对特定信号强度的计算表明，在控制条件下，Mn (II)离子的信号对光谱有显著的贡献，特别是cv。“抛物线”，其强度约为Fe (III)的四倍，而对于cv。“Raweta”的强度只有2.5倍(图2)。5“,”)。ZEA处理后，cv的积分谱强度显著增加。'抛物线'叶(图。5A)在室温下主要由锰信号的变化引起，而cv。' Raweta '是由g在2.2-2.5范围内Fe (III)信号的增长引起的。3.B,5一个”)。锰水配合物的信号强度随cv的增大而增大。抛物线，而不是cv。' Raweta '，用ZEA以两种不同的方式处理(图。5A’，A”)，提示耐药基因型组织中水分积累较好。植物组织中水分子的结合可能被认为是通过确保参与光合作用的蛋白质的适当的第四结构来提供抗胁迫保护的因素之一。在敏感基因型中，Fe (III)信号的生长强度可能是由于ZEA作用过程中产生的ROS氧化Fe (II)物种所致(图2)。3.B,5“,”)。在EPR测量条件下，Fe (II)离子在光谱中不可见。在cv谱中观察到g = 2.06处的强线和g = 2.4附近的四条线，位于Fe (III)信号的位置。直接用ZEA处理的‘Raweta’叶片，在蛋白质的方形复合物中被认为是Cu (II)离子[6(图。3.因此，可以认为，在EPR中沉默的Cu(I)种可能存在于未经处理的植物材料中，并在ROS存在时氧化为Cu(II)，这与观察到的Fe种相似。

与室温相反，在77 K的对照植物光谱中，g = 2.4和2.6的Fe (III)离子的信号占主导地位(图2)。5B″)和两倍于cv的光谱。“抛物线”。经ZEA处理后，两个品种的上述信号强度均降低，而Mn (II)信号强度均升高。Fe (III)信号的变化在cv中更为明显。ZEA处理籽粒呈抛物线状，而cv处理籽粒呈抛物线状。' Raweta '这些变化较小。在后一个品种中，ZEA处理叶片光谱中的Fe (III)信号(g = 2.4)与Cu (II)信号重叠(图2)。3.F,5B”)，因此谱线强度为源自Fe和Cu的谱线强度之和。

ZEA处理降低了Fe (III)物种的数量(图。5B’，B″)可能是由于Fe (III) -蛋白复合物的降解引起的，并且在所有用ZEA处理的植物中都能观察到，无论采用何种方式(直接或间接)引入ZEA，这证实了ZEA对植物有负面影响。在接受ZEA处理的植物中存在的Fe (III)离子的数量是两个过程的结果:铁蛋白复合物的降解(这一过程在77 K记录的光谱中可见)和亚铁离子可能由ZEA胁迫产生的ROS氧化(在293 K测量的光谱中观察到)。这一现象表明，ZEA的施用方式影响植株结构损伤的机理。

来自自由基种的信号的变化可以为ZEA对小麦植株的影响提供进一步的数据。两个重叠的信号A和B，在对照光谱中给出室温下记录的R线，是位于碳水化合物分子中的碳中心自由基的特征[5，21］．在ZEA处理后，这些信号强度的变化与R信号的修改有关，因为R线周围对称地出现了额外的线(图2)。4B, C)，在直接处理叶片的光谱中表现得更为强烈。信号C的g因子值较低，说明当ZEA直接与叶片相互作用时，自由基形成在分子量较低的碳水化合物分子上，而从受感染的籽粒生长出来的植株中形成的具有较高g因子信号的物种位于分子量较高的碳水化合物上，如淀粉。

在室温下测量的信号R强度在cv下略低。‘Raweta’比cv控制植株。“抛物线”的。籽粒ZEA处理降低了该值，而叶片ZEA处理提高了该值，在cv中表现得更为明显。“Raweta”(图。6A).稳定碳水化合物自由基的形成是由于自由电子从ZEA作用形成的ROS转移到碳水化合物分子上的结果。这样的电子稳定，在cv中更有效。“Raweta”是植物对抗胁迫的防御机制之一，正如我们之前的假设所假设的那样，短暂的直接胁迫主要在敏感基因型中增加稳定碳水化合物自由基的数量，而在耐受基因型中其他机制被激活[5］．

一个新的信号R '，记录在77 K(图。4D-F)，并在许多植物系统中观察到，被认为是一种稳定的酪氨酸自由基[22]，在生化氧化还原过程中起电子转移作用[23］．在直接接触ZEA的叶片中，随着g的增加，其含量显著增加₁参数为2.0091，表明ZEA处理干扰了酪氨酸自由基的几何结构。这可能是由于从酪氨酸分子的羟基中除去了氢原子[19，22在ZEA胁迫下形成活性氧。这表明有机基质的破坏，如金属物种生化环境的紊乱所示，在敏感基因型中更为明显。经ZEA处理后的植株中酪氨酸自由基浓度没有显著变化，这与碳水化合物自由基量的微小变化是一致的，这可能表明，如果从接触ZEA的那一时刻开始，经过更长的时间，植物组织中的氧化还原平衡就会重新建立，而直接胁迫则会引起自由基转化。

EPR研究表明，用ZEA处理植物会导致铁蛋白复合物的破坏和作为抗氧化系统重要组成部分的金属离子氧化还原状态的改变。此外，我们还发现ZEA与生物化学结构相互作用的机制取决于ZEA的应用方式。在直接处理的叶片中，主要在敏感基因型中启动了基于稳定有机自由基产生的防御机制，而由ZEA处理的籽粒生长出的植物可能通过增加水和淀粉的积累来适应被扰乱的组织平衡。这些观察结果表明，植物防御机制的激活模式取决于ZEA的应用方法。

化学物质

所有试剂(包括玉米赤霉烯酮)均购自Sigma-Aldrich公司(德国，慕尼黑)。

植物材料

两个品种的春小麦:‘抛物线’和‘Raweta’从波兰植物育种站(Radzików和波兰Strzelce)获得。春小麦品种对氧化应激的耐受性不同(在我们早期的实验中证实了这一点[10])，即简历。“抛物线”是耐受性，而cv。“罗维塔”是个敏感的名字。此外，与ZEA处理相比，罗威塔植物鲜重下降幅度更大[13］．在蒸馏水和ZEA (30 μmol)溶液中萌发2 d^．dm⁻³)，温度20°C，在黑暗中。然后，在温室条件下，20/17°C(白天/夜晚)，光周期16 h, 800 μmol的条件下，在珍珠岩中培养幼苗，获得3叶植株(第2叶发育良好)^．dm⁻³(光子)米^2。年代⁻¹光。然后，将未施ZEA处理的植物池分为两组。其中一片叶子为对照(0)，另一片叶子为实验对象，在第二片叶子上涂上ZEA溶液(10 μmol)^．dm⁻³)刷牙。在处理24 h后进行测量。叶片ZEA浓度低于籽粒处理ZEA浓度，是在kornaovic等人的基础上选择的[13]的研究结果表明，从暴露于ZEA内(颗粒)和细胞外(叶片)处理的样品中获得的叶绿体结构没有显著差异。每个处理包括10个花盆，12株植物，分为3个独立的重复。所有实验均在幼苗的第二叶上进行。

叶绿体隔离

从植物上采集的新鲜叶片立即在含50 mmol的缓冲液中均质^．dm⁻³Tris-HCl, 5mmol^．dm⁻³EDTA, 0.33 mol^．dm⁻³山梨醇(CIB)，在直径为1000 μm的尼龙网上预过滤，离心(400 × g)，上清液以1000 × g离心，含叶绿体的污泥悬浮在CIB中，按照前面描述的程序在Percol(40%/80%)梯度中纯化，得到纯净的细胞器[24］．整个实验在4℃进行。在新鲜制备的叶绿体上观察超氧自由基。为了进行生化分析，将叶绿体冷冻在液氮中，并在- 80°C的黑暗环境中保存。

抗氧化活性测定

酶活性(超氧化物歧化酶，SOD;过氧化氢酶,猫;和过氧化物酶(POX)根据kornaovic等人详细描述的方法进行分析。[13］．所有酶的活性都用KINLAB软件进行分光光度法(UV-Vis Evolution 220, Thermo Scientific, Waltham, USA)测试，以确定反应动力学。

将叶绿体在甲醇中均质，在1000 x g下离心10分钟。上清用于进一步研究。用分光光度法(Thermo Scientific Evolution 200)分析2,2-二苯基-1-苦酰肼(DPPH)在λ = 517 nm下的失活情况，在黑暗中，用3 ml 0.004% DPPH溶液的混合物孵育30分钟后[25］．

抗氧化活性的测定由Prieto等人描述。[26]，并且是基于将Mo(VI)还原为Mo(V)并在酸性ph下形成绿色磷酸盐/Mo(V)配合物。植物提取物与含300 mol的溶液孵育(95°C, 90 min)^．dm⁻³硫酸，28 mmol^．dm⁻³磷酸钠和4mmol^．dm⁻³在λ = 695 nm处用分光光度法测定钼酸铵。抗氧化活性以每g FW含有mg抗坏血酸(AA)计算。

Fe还原力分析(III)。

该参数是在100 μl提取液与2.5 ml磷酸盐缓冲液(pH 6.6)和2.5 ml 1%亚铁氰化钾混合，在50℃下孵卵20分钟，在1000 x g下离心10分钟的样品中测定的。然后是0.1%的FeCl_3.加入上清液，再次离心。样品在λ = 700 nm处用分光光度法测量。

细胞超氧自由基测定

超氧自由基检测使用细胞超氧检测试剂盒(Abcam, Cambridge, UK)。分离的叶绿体在37℃下与超氧化物检测混合物孵育30分钟。阳性对照用0.2 ml/l花青素孵育。清洗后，用Canon EOS 60D相机(日本东京)和Delta IB-10光学显微镜组(波兰)观察超氧阳性叶绿体(红色)，并使用过滤荧光组(× 400倍放大)。

电子顺磁共振波谱学

用x波段Bruker Elexsys 500光谱仪(Karlsruhe, Germany)， 100 kHz场调制，记录新鲜采集的叶片(样品重量0.02 ~ 0.03 g)中的EPR信号。微波功率分别为3 mW和10 mW，微波功率分别为293 K和77 K，微波功率分别为5 mT和500 mT。以DPPH(2,2-二苯基-1-苦酰肼)为g因子标准。利用SIM 32软件模拟得到了特定自由基信号的超细分裂参数g和常数。27］．测定了整个光谱和自由基的积分强度，以及特定顺磁性金属离子信号的强度。对于自由基信号，g因子的精度为±0.0005和±0.1 mT;对于过渡金属离子信号，g因子和A因子的精度分别为±0.05和±0.5 mT。

统计分析

所有数据均以均数±SE和差异显著性(atP< 0.05)采用SAS, version 10.0 (SAS/STAT软件)，通过Duncan 's multiple range检验和Student 's t检验计算。

支持这项研究结果的数据包含在这篇发表的文章中。

AA:

抗坏血酸

HFS中:

超精细结构

CIB:

叶绿体隔离缓冲液

铜:

铜

DPPH:

2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EPR:

电子顺磁共振

菲:

铁

MGDG:

Monogalactosyldiacylglycerol

DGDG:

Digalactosyldiacylglycerol

米歇尔。内格罗蓬特:

锰

SOD:

超氧化物歧化酶

ROS:

活性氧

玉蜀黍属:

玉米烯酮

不适用。

该研究由波兰国家科学中心(NCN)资助，批准号为2014/15/B/NZ9/02192。资助机构为研究提供了资金支持，但没有参与研究的设计、数据收集、数据分析或手稿的撰写。

从属关系

1. 美国师范大学生物研究所。podchorivzych 2,30 -084, Kraków，波兰

   siprawska Apolonia, Filek Maria, Skórka Magdalena & Barbasz Anna

2. 雅盖隆大学化学系，ul。Gronostajowa 2,30 -387, Kraków，波兰

   Łabanowska Maria & Kurdziel Magdalena

贡献

SA和FM构想并设计了实验;SA， ŁM, KM, SM和BA进行实验;SA、ŁA、KM、FM对数据进行了分析，并撰写了主要稿件。所有作者都阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应到Sieprawska Apolonia．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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