在野生烟草中，光主导着食草动物诱导挥发物的日排放

背景

当涉及到植物生态相互作用的适应性结果时，时间就是一切，准确的时间对于与食草动物或基于挥发性有机化合物的短暂排放的互惠生物的相互作用尤其重要。以前对野生烟草的研究n attenuata则发现了挥发性气体的日排放时间与食草动物在白天被天敌捕食之间的联系。

结果

在这里，我们研究了光在调节两种生物合成挥发物组中的作用，萜类和绿叶挥发物(GLVs)，它们主导着食草动物诱导的花束n attenuata则．光照剥夺强烈抑制了萜类化合物的排放，同时增加了GLV的排放，尽管存在时间滞后。沉默感光基因的表达不会改变萜类化合物的发射节律，但沉默光敏色素基因的表达，NaPhyB1，使GLV的发射紊乱(Z) 3-hexenyl醋酸。外源脱落酸(ABA)处理增加了气孔阻力，但没有减少萜类挥发物的释放(在顶空恢复)。然而，ABA处理增加了GLV排放和叶片内部池(从组织中恢复)，并减少了内部芳樟醇池。与白天的萜类排放和夜间GLV排放模式相反，食草动物诱导的植物挥发性(HIPV)生物合成基因转录本在白天达到峰值。这些基因的启动子区分布着不同的基因独联体参与光、压力、植物激素和昼夜节律调节的调节元件。

结论

这项研究为HIPV花束调控机制的复杂性提供了见解，这种机制的复杂性可与HIPV的功能复杂性相媲美，包括排斥食草动物、召唤保镖和吸引传粉者。

生活在一个每24小时绕其轴旋转的星球上，大多数生物的生理节律都是由昼夜周期调节的。例如，植物的生物钟在日出前为光合机制准备光线收集，并在中午关闭气孔以保持水分[1］．植物节律在协调与其他生物的相互作用方面也很重要。例如，金鱼花每天都会释放苯甲酸甲酯来吸引白天活跃的授粉蜜蜂[2]但矮牵牛花会在夜间释放苯甲醛，以吸引夜间活动的飞蛾[3.］．茉莉酸信号的昼夜节律答:芥被认为是它抵抗多面手卷心菜圈的关键，Trichoplusia倪,它们也有节奏地进食[4］．两种阻力答:芥感染葡萄孢菌根据一天中的不同时间而有所不同[5，6］．

食草动物诱导的植物挥发物(HIPVs)介导植物、食草动物和天敌之间的三营养相互作用[7，8，9］．植物利用hipv来吸引食草动物的捕食者，并间接地保护自己免受食草动物的侵害。然而，食草动物也可以利用这些挥发物来定位它们的寄主植物或避免捕食[7，8］．HIPVs通常包含两组普遍存在的代谢物:绿叶挥发物(GLVs)和萜类化合物。glv为C₆醛类、醇类和酯类，这些物质在几乎所有植物和藻类中都是通过脂氧合酶(LOX)/过氧化氢酶(HPL)途径合成的[10，11，12，13，14］．萜类化合物是由不同数量的碳合成的₅半萜(C₅)，单萜烯(C₁₀)，倍半萜烯(C₁₅)和二萜(C_20.)、主干及其衍生物[11，15］．萜类挥发物来源于高等植物中的甲戊酸酯(MVA)或2- c -甲基-d -赤藓糖醇4-磷酸/ 1-脱氧-d -木酮糖5-磷酸(MEP/DOXP)途径[16]，由萜烯合成酶直接合成[15］．glv和萜类化合物都在三营养相互作用中发挥作用，其中一些是植物的间接防御[7，8］．

已知从树叶中释放的hipv受昼夜调控，特别是萜类成分。例如，大量挥发物从挪威云杉茉莉酸甲酯诱导后的叶子，模仿食草动物诱导的排放，在白天比晚上更大[17］．报告了类似的模式菜豆由攻击引起的hipvl . huidobrensis幼虫(18］．此外,在黄花蒿的基因QH6编码(−)-α-蒎烯/(−)-β-蒎烯合成酶，其转录物丰度呈日变化规律[19］．在白天和夜间，GLV的排放都是由食草动物引起的种豆科［20.]，在夜间从烟草［21]，而在p .寻常的(芸豆)，有些成分在光照时释放，有些则在黑暗时释放[18］．

在前人对本土二倍体烟草的研究中n attenuata则，我们发现叶面HIPV成分，包括(E) -α-bergamotene (E)-β-西胺烯和芳樟醇，每日释放[22，23，24，25］．这些挥发物在n attenuata则是与昆虫的食草、防御和授粉相互作用以及相同的化合物根据释放它们的组织和时间发挥不同的作用。例如，(E)-α-佛手柑素，由NaTPS38，在夜间从花朵中释放出来，增加了探测时间，从而提高了授粉成功率m . sexta飞蛾探花。然而，当它在白天从受到攻击的树叶中释放出来时，它会吸引天敌m . sexta幼虫(24]调解有效的间接防御[26］．的发射(E)-β-西胺，由NaTPS25，与(E)-α-佛手柑素从多种释放n attenuata则而这两个基因是共定位在n attenuata则基因组(27］．相比之下，一个释放芳樟醇的QTL，由单萜产生向图书馆，被映射到与(不同的位点上。E)-α-佛手柑素和(E) - - -β-ocimene。芳樟醇还能吸引天敌，并能阻止产卵m . sexta飞蛾依环境而生[23］．glv还被发现在防御中发挥重要作用n attenuata则在自然界中反对草食[26］．早晨释放的glv会通过日活性引起更大的掠食性活动Geocoris即使这两种混合物都在冬季的窗口期实验应用于植物，也比夜间释放的GLVs混合物的效果要好Geocorissp . activity [28］．此外，参与GLV生物合成的基因转录本，包括NaHPL而且NaLOX2,是由植物的生物钟所调节的25，29］．

在这里，我们通过独立于昼夜周期控制叶片的光环境，证实了萜类挥发物的释放在光照期更大，而glv的释放在黑暗期更大。萜类化合物的释放模式不会因沉默光感受器基因表达、补充远红光或外源ABA增加气孔抗性而改变。然而，沉默改变了glv的发射模式NaPhyB1而外源ABA处理增加转录本。参与萜类化合物和GLV生物合成的基因均表现出转录物累积的日分布模式，且这些基因的启动子区域分布着不同的基因独联体参与光、应激、植物激素或昼夜调节过程的调节元件。

光剥夺减少了萜类化合物，但增加了GLV的排放

的双亲RIL种群进行捕食试验n attenuata则2017年夏天在田间种植的植物揭示了这一点m . sexta卵和幼虫早于大眼虫(Geocorisspp.)在白天(图;S1)，与先前的研究结果一致[27］．因为植物挥发物在调节这种三营养相互作用中起着重要作用[23，26]，为了更好地了解它们的昼夜调节，我们收集了头部空间的昼夜时间挥发物n attenuata则温室种植的植物的叶子受到伤害m . sexta幼虫反流剂(W + R)使用PDMS管片(Kallenbach等。[30.),无花果。1A, B).待测叶片装入塑料杯中，塑料杯中可用铝箔包裹，局部遮挡处理叶片的光线(图。1A, B).我们发现大部分萜类挥发物的释放与光周期有很强的对应关系，尤其是芳樟醇和(E) -α-bergamotene(无花果。1C).这些萜类挥发物的排放量在夜间(22:00-6:00)非常低，在上午(6:00-10:00)增加，在中午(10:00-14:00)达到峰值，然后在下午(14:00-18:00)下降，在晚上(18:00-22:00)恢复到低水平。在白天的中午(10:00-14:00)，当叶子被包裹在一个杯子里时，大多数萜类化合物的排放量立即下降到低水平，与夜间测量的水平相当。在下午和晚上拆开铝箔包装后，这些萜类挥发物的排放恢复到控制水平(图2)。1C).与白天释放的萜类化合物相比，许多glv在夜间大量释放，并在白天稳步减少，尽管一些，如(Z)-3-己烯乙酸酯和(Z)-3-丙酸己烯酯，在早上继续大量释放。白天中午的局部光照不足并不会改变GLV的排放，但会在下午上调GLV的排放，这种情况可能会持续到晚上(图2)。1C)。在W + R处理后的24 h单次收集中，进一步证实了与光剥夺相关的萜类挥发性化合物总排放量的减少和GLV总排放量的增加(图2)。1D).因此，萜类化合物和glv对局部光剥夺的反应相反。

由于包裹杯子引起的温度和湿度也可能影响挥发性物质的排放，我们在杯子外、干净的杯子和包裹杯子中监测了这两个因素(图。S2A).我们发现在包裹10:00-14:00期间，与清洁杯相比，包裹杯的温度仅下降了0.8-2.4°C(图;S2B).包裹的杯子的平均湿度比干净的杯子高9%左右，但根据包裹的叶子变化更大(图2)。S2B).在我们的实验设置中，这些温度和湿度的差异不应该显著影响挥发性气体的排放，因为它们处于植物的舒适区域。

沉默NaPhyB1表达和ABA处理改变GLV，但不影响萜类排放

我们评估了W + R处理在以下感光基因中单独沉默(通过倒置重复ir - rnai结构的稳定转化)的一系列植物中引起的挥发性释放:NaPhyB1, NaPhyB2, NaPhyB1 x NaPhyB2, NaCrypt1和NaCrypt2(先前由Oh等人描述。[31])。所有植物挥发物的排放模式基本没有变化(图2)。2无花果。S3)，但ir的除外PhyB1植物。特别是在杂交产生的植物中PhyB1与红外PhyB2为了抑制这两个光敏色素基因，(Z)-3-己烯醋酸酯的排放量在下午增加。在24小时的收集中，补充远红光并没有改变总萜类化合物或GLV的排放量(图2)。2B)或每4小时采集一次(图。S4)．

ABA对hipv的调控不通过气孔导度

我们测试了挥发物释放的昼夜模式是否受气孔阻力的变化控制，气孔阻力可能会影响植物组织挥发物的释放(图2)。3.一个,32，33])。采用外源ABA处理增加了空病媒对照(EV)和ir叶片的气孔阻力MPK4植物，如前所述[34]，气孔大部分处于开放状态，对ABA处理没有反应(图2)。3.A, B). ABA处理增加了EV植株白天的气孔阻力，但对萜类化合物、芳樟醇和(E)-α-佛手柑素，在EV和ir中均未发生改变MPK4植物(图。3.C).相比之下，(Z)-3-己烯乙酸酯在ABA处理后的采样期上调，并在一天结束时在EV和ir中恢复到对照水平MPK4植物(图。3.C).有趣的是，对叶片内部挥发物池的测量显示，ABA处理减少了在EV和ir条件下叶片中芳樟醇的积累量MPK4植物，尽管它没有减少释放到顶空间的量(图。3.C, D，内部(E)-α-佛手柑素池呈增加趋势，但ABA处理对其变化不显著，与顶空排放一致。内部(Z)-3-己烯乙酸酯池跟踪了顶空排放，ABA处理增强了电动汽车工厂的顶空排放，但ir的增强较小MPK4植物(图。3.D)。

因此，ABA处理增强了GLV的释放，尽管减少了气孔导度，但在黑暗中释放的GLV更丰富。同样，受损的红光/远红光感知也会增加GLV的发射。然而，ABA处理和植物光感知损伤对萜类化合物的排放均无显著影响。

负责萜类和GLV生物合成的基因每日转录

先前发表的微阵列数据集揭示了转录组的动态变化n attenuata则W + R处理后[35］．从这个数据集中，向图书馆转录本，编码芳樟醇合成酶23，它们在白天大量存在，而在夜间几乎无法检测到。4A). (E)-α-佛手柑素合成酶基因，NaTPS38［24］，在白天和晚上都有显著增加，但在白天，上调的速度更大。有趣的是，抄本NaHPL而且NaLOX2,两者都参与GLV的生物合成，在白天也更丰富，尽管大多数GLV的释放是在夜间。通过qRT-PCR，我们进一步证实了光剥夺的强烈下调向图书馆转录水平，以及NaGPPS1而且NaGPPS2,上游通路中负责单萜类底物生物合成的基因(图2)。4B)。

独联体在生物合成基因中鉴定出参与光、应激、植物激素和昼夜调节的作用调节元件

我们扫描2kb的启动子区域NaLIS, NaTPS38, NaHPL而且NaLOX2为独联体-作用调节元件(图;5、表1、表S2)．向图书馆有六个和NaTPS38在它们的启动子中发现了5种可能与对光的反应有关的元素，在植物的启动子中发现了8种和14种NaHPL而且NaLOX2,分别。框4 [36]存在于所有不同拷贝数的启动子中。有些元素在两到三个启动子中被发现，如AE盒[37]， G-box [38，39]， GT1-motif [40]和TCT-motif [41］．其他基因只存在于特定的启动子中，如ACE [42元素只存在于的启动子中NaLOX， ch - cma1a [43的促进者向图书馆， GA-motif [44]和I-box [45的促进者NaHPL．这些基因的启动子区还含有许多对胁迫和/或植物激素有反应的元件，包括JA、MeJA、SA和ABA，其中:7个向图书馆8分NaTPS3811分NaHPL13是NaLOX．值得注意的是，参与ABA调控的ABRE元素(ACGTG/CACGTG/AACCCGG) [46，47]在向,NaHPL而且NaLOX2启动子区域，但不是NaTPS38．这与ABA处理增强(Z)-3-己烯乙酸酯排放和内部池，减少芳樟醇内部池，但不影响(E) -α-bergamotene(无花果。3.D).单一昼夜元素(CAAAGATATC， [48])向图书馆，NaTPS38,NaLOX2,但不是为了NaHPL．

从n attenuata则植物的组成和丰度在昼夜周期中变化。挥发性花束中萜类成分的释放在白天达到峰值，并且对光线剥夺有快速反应，而glv在夜间释放更多，并且在光线剥夺下会增强。光感受器基因的本构沉默、远红光的补充或ABA处理引起的气孔关闭均未改变萜类挥发物的节律。温室气体排放，包括(Z)-3-己烯乙酸酯，由、沉默和ABA处理。参与萜类化合物和glv生物合成的基因转录丰度随昼夜周期变化，并对各种光或ja反应独联体在它们的启动子区域发现了-作用调控元件，以及一些生物钟和ABA调控元件。

HIPV排放与食草性和三营养相互作用的相关性

在自然界中，植物必须应对伴随昼夜循环的周期性变化的环境，其中除了光之外，还包括许多因素的波动:温度、湿度和无数的生物相互作用。例如，植物需要适应病原体和食草动物的攻击节奏，或有益物种的活动模式，如传粉者和食草动物的天敌[4，6，57，58］．为了应对这种环境节律性，植物进化出了内源性节律和协调应对特定环境因素变化的能力。这在很大程度上可以从它们代谢物的丰度和组成的变化中看到[59］．不同的HIPV成分n attenuata则植物与自然界中与植物相互作用的不同物种的活动有关。专家的幼虫Manduca我们知道sp每天都进食。卵和幼虫捕食率的实验测量与萜类挥发物的日排放量相关，这与Joo等先前的报道一致。[28］．如果我们了解了导致这些排放模式的机制，这些机制可以提供实验操纵模式的手段，从而提供一种方法来测试在实地研究中观察到的相关性。

萜类挥发物和glv的释放节律

食草动物诱导的单半萜或倍半萜在许多物种中被昼夜调节，如g .分子［60),黄花蒿［19),答:majus［61),菜豆［18食草动物。同样,在n attenuata则至少(E) - - -β-ocimene (E)-α-佛手柑素和芳樟醇在食草动物诱导后每天释放[22，23］．有趣的是,(E)-α-佛手柑素每日从叶子中释放n attenuata则植物及其在吸引天敌方面的作用，保护植物免受幼虫的侵害m . sexta．然而，同样的化合物在夜间从花朵中释放出来，吸引同一种昆虫的成虫，从而提供授粉服务[24］．进一步的研究表明(E)-β-西胺和(E)-α-佛手柑素在不同种类间相互相关n attenuata则基因型，但芳樟醇是独立调控的[23，27］．此外，与芳樟醇的释放不同，芳樟醇衍生的共轭物(如芳樟醇苷)的内源叶池缺乏日释放模式[23］．

在本研究中，我们确认了萜类挥发物的日释放模式，包括(E)-α-佛手柑素和芳樟醇[28]，并进一步发现这种日变化模式并没有因ABA处理导致的光受体基因沉默或气孔抗性增加而改变。有趣的是，ABA处理抑制内源性芳樟醇，但对内源性芳樟醇影响不大。E) -α-bergamotene。外源ABA处理对芳樟醇释放和内源芳樟醇影响的矛盾可能是由于外源ABA对芳樟醇生物合成或偶联作用的对立，以及释放过程的机制。

与不同物种之间萜类化合物的保守日释放相反，GLVs表现出昼夜释放和夜间释放。例如，利马豆的机械损伤(种豆科)植物在光相诱导β-西cimene和(Z)-3-己烯乙酸酯，而夜间损伤仅上调(Z)-3-己烯乙酸酯[20.］．在诱导的芸豆中，GLV (Z)-3-己烯醇在夜间大量释放，而(Z)-3-己烯乙酸酯[18］．在本研究中，我们发现glv夜间排放较高，这与之前的研究一致[28，29］．还需要做更多的工作来了解这些相反的模式对不同成分的潜在生态意义，并为这些推论提供关于土壤的基本自然历史信息n attenuata则植物及其周围生物的活动在田间起着核心作用。例如，正如已经证明的那样，夜间释放的glv可能被野外夜间活动的食草动物用作进食线索m . sexta实验室及实地研究的幼虫[62］．

光对于hipv的调控至关重要

这项研究的一个主要结论是，对于萜类和glv，光强烈和局部地调节HIPV的排放，尽管这不能直接归因于特定的光感受器。这一发现与早期报告一致，即玉米植株的HIPV排放依赖于光[63］．光至少可以从两个方面影响萜类化合物的生物合成。首先，萜烯生物合成的前体丙酮酸和甘油醛3-磷酸从卡尔文循环中得到[64，65]，这需要光合作用的直接产物。例如，β-西cimene在利马豆植物中的生物合成依赖于CO₂光合作用固定[20.］．也许这解释了在我们的研究中，光剥夺会立即减少萜类排放，因为它关闭了萜类生物合成途径的底物的主要来源。然而，在植物的下沉部分，如花组织，萜类化合物的生物合成不受光合作用的限制n attenuata则花朵绽放(E)-α-佛手柑素24］．其次，光作为信号，可以调节参与萜类生物合成的基因的表达。光是合成萜类前体的MEP/ doxp通路基因表达的必要条件[66］．在幼苗中答:芥通路中的几乎所有基因都在黑暗中受到抑制[67］．在目前的研究中，我们还发现(E)-α-佛手柑素、芳樟醇和前体GPP在夜间转录水平较低或受食草性诱导较少，在白天也因光线剥夺而下调，并与光响应调节因子相关。

令人惊讶的是，我们发现光照和ABA处理对glv也有强烈和暂时的影响n attenuata则．在对食草性的响应中，GLV排放的增加比萜类挥发物的响应更快[28，68］．在这项研究中，中午的光线剥夺增强了GLV的排放，并且在随后的几个小时中延迟了，与此相反，萜类排放立即减少。这可能是因为GLV生物合成的前体，多不饱和脂肪酸，并不是光合作用的直接产物。因此，光可能与生物钟一起，通过调节生物合成基因的表达来影响glv的生物合成，并在一定程度上延迟活性蛋白的积累。这种增强可以被视为与的效果一致NaPhyB1在GLV (Z)-3-己烯醋酸酯排放的下调中，沉默，并表明远红光可以作为调节GLV排放的信号。然而，暴露在补充远红光下的叶片的挥发性收集并不支持这一推断，这意味着这种调节可能是非常短暂的，或者只发生在昼夜周期的特定间隔。此外，我们发现转录水平NaHPL而且NaLOX2在黑暗期开始时急剧下降，与大多数glv较高的夜间发射相冲突。这些来自生理操作的往往相互矛盾的结果强调了排放受到复杂调控的推论。详细检查HIPV生物合成基因的启动子可以是一个有价值的练习，以便更好地了解有助于转录丰度模式的环境因素。

hipv的复杂调控n attenuata则

已知HIPV排放受到食草性诱导作用的影响[7]、光照条件、内源性生物钟[61]，温度[69]、水供应量[70]以及仍然神秘的发射过程[71］．许多挥发物只在诱导时释放或增加释放，例如由于食草性和机械损伤[67，72，73］．这些诱导通常由JA信号通路介导[11，29，74，75，76，77，78］．生物钟是hipv的另一个主要调节器。例如，参与萜类挥发物生物合成的基因，包括TPSS和通路上游的基因，已知受生物钟成分的调控[61，64，65］．GLV生物合成基因的转录NaHPL而且NaLOX2,也受生物钟的调节[25，29］．

的独联体在萜类化合物和glv合酶基因的启动子区域中发现的-作用调节元件为这些基因受食草性、光照和生物钟的协调调节提供了额外的证据。在萜类化合物和GLV生物合成相关基因的启动子区鉴定出多种胁迫和植物激素信号元件，并可提供一种使hipv与其他JA-、MeJA、SA和aba介导的化学防御协调的手段。在萜类和GLV基因中均发现了大量的光响应元件和昼夜节律相关元件。有趣的是，aba响应元件存在于的启动子中向图书馆但不是NaTPS38可能解释了特定的抑制向图书馆ABA处理对芳樟醇生物合成的影响。这些独联体-acting regulatory elements提示不同的转录因子可以调节HIPV的生物合成与各种环境因素如食草性、光照和内部时钟。

综上所述，本研究揭示了光对于萜类挥发物的充分诱导和glv的抑制是必要的，并与许多其他因素共同调节HIPV基因的转录。

植物材料与生长

本研究中使用的植物种子来自MPICE分子生态学系的种子库(http://www.ice.mpg.de/)．温室实验中使用的转基因株系数量列于表中S1．在田间种植的用于捕食试验的植物是一个先进的交叉重组自交系(AI-RIL)群体的F12代[24]，由Baldwin和他的同事分别从亚利桑那州(AZ)和犹他州(UT)收集的两个自交系杂交而成[79，80］．野外实验在美国西南部亚利桑那州的核桃溪教育研究中心(Walnut Creek Center for Education and Research, WCCER)(34°55′17.8″N 112°50′42.2″W)进行。在田间种植的植物是本地区的原生植物，不是濒危物种，非转基因材料，不受监管。没有从野外采集样本。野外实验得到了WCCER的允许和支持。在Krügel和同事先前描述的条件下，种子在培养皿中的Gamborg B5培养基上发芽[81］．两周后，幼苗转移到泥炭塞中(Jiffy 703，www.jiffypot.com)．在接下来的2周内，幼苗逐渐暴露在室外条件下，随后移植到田间地块。植物由滴灌系统定期浇水[82］．

用于不同光照处理和动态挥发性收集的植物生长在温室中。转基因株系的生成和筛选(见表1)S1)在感光基因和NaMPK4已详细描述[31，34］．幼苗按上述方法发芽，然后移栽到盆栽土壤中(www.klasmann-deilmann.com)装入小盆(TEKU JJP 3050 104盆，Poeppelmann GmbH & Co. KG, Lohne, Germany)中10天，然后移植到1升的盆中，并置于温室(19°C - 35°C, 55%湿度，光照时间:6点- 22点，辅以飞利浦Sun-T Agro 400 W和600 W钠灯照明)[81，83］．如舒曼等人先前所述，植物浇水施肥。[84］．对植物的实验研究和实地研究符合相关机构、国家和国际准则和立法。

m . sexta饲养和反流收集

m . sexta本研究中使用的是在气候室(24°C，光照时段:0:00至13:00，相对湿度:70%)中以人工饲料维持的室内菌落(Bell RA & Joachim FG 1976)。为了收集反流剂，用毛毛虫饲养n attenuata则UT WT植物。反流剂的收集和储存已在前面描述过[78，85］．

W + R处理和顶空采样

选择伸长植株的第一个茎叶，用花样轮诱导损伤，并立即在叶片的穿刺伤口处加入20 μL 20%稀释的反流剂。用干净的手套用手指轻轻摩擦处理过的叶子。这片叶子被封闭在一个通风的PET杯(约650毫升)。根据Kallenbach等人的描述，收集顶空挥发物。[30.]用两根实验用硅胶管(ST, 1mm内径× 1.8 mm外径;卡尔·罗斯，目录号:9555.1;每片5毫米)放入叶子下的杯子中4小时(时间分解)或24小时(长期收集)。为了定量内部挥发物池，将取样的叶片快速冷冻并在N液中研磨₂．将100 mg组织放入1.5 mL玻璃GC瓶(Sigma-Aldrich)和0.8 mL饱和氯化钙₂添加溶液。将一片ST放入小瓶中，充分浸入溶液中，提取游离挥发物[29］．将收集到的挥发物储存在−20°C冷冻的干净玻璃小瓶中。

光剥夺、远红补充和ABA处理

用铝箔包裹收集杯，对诱导出的叶片进行暂时的局部光剥夺。使用PRO-USB-2数据记录仪记录温室、清洁杯和包装杯内的温度和湿度，并带有湿度、温度传感器(RS Components GmbH)。如前所述，提供额外的远红[31]: 5瓦远红色发光二极管(LED, 720±10 nm)被定向到目标叶片的正面。将ABA (Sigma-Aldrich)稀释至2 μM，于上午6时左右喷洒在叶片上。气孔阻力由AP4 Porometer (AP4- um -3, Delta-T Devices)按照制造商的说明进行测量。

TD-GC-QMS分析

采用TD-20热解吸装置(岛津)的四极杆GC-MS-QP2010Ultra分析吸收挥发物的STs。解吸和分析如前所述[30.］．如前所述，使用目标离子和参考离子来整合峰[23]和初步化合物鉴定是基于与内部图书馆的比较n attenuata则在同一实验室制备的挥发物，包括这些挥发物的光谱、保留时间和相对保留顺序，这些挥发物来自标准品和使用相同方法分析的样品。参考文库中挥发物的鉴定基于纯标准物、Kovats保留指数以及光谱与NIST MS文库的比较[30.］．

测量基因转录丰度

转录水平向,NaGPPS1而且NaGPPS2如前所述，在标准光或光剥夺条件下，使用qPCR对叶片中的蛋白质进行定量[23］．使用nuclespin®RNA Plant试剂盒(machery - nagel)提取总RNA。基因组DNA消化后，用PrimeScript™RT reagent Kit (TAKARA)转录1 μg总RNA。引物序列已在前面描述[23qPCR在MX3005P PCR循环仪(Stratagene)中进行。

的识别独联体-作用调节元件

的开始密码子上游的2Kb序列向图书馆，NaTPS38，NaHPL而且NaLOX2从基因组序列中提取n attenuata则［86］．然后这些序列通过植物在线搜索独联体-代理监管元素数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/， Lescot等[2002])。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

阿坝:

脱落酸

隐窝:

隐花色素

杰:

绿叶挥发物

gpp:

香叶酰香叶酰二磷酸合成酶

HIPV:

食草动物诱导的植物挥发物

HPL:

氢过氧化物裂解酶

是:

Jasmonate

LIS):

芳樟醇合成酶

液态氧:

脂氧合酶

惩罚:

甲基jasmonate

MPK4:

丝裂原活化蛋白激酶4

巴:

光敏色素的

、:

光敏色素B

山:

水杨酸

TPS:

萜烯合酶

w + r:

伤害+m . sexta幼虫回流的

作者感谢普雷斯科特学院、北亚利桑那大学、弗拉格斯塔夫植物园、普雷斯科特国家森林和西南实验花园阵列使用核桃溪教育和研究中心的一块田地;R.和N. Carlson和西南实验花园阵列工作人员协助田间种植，X. Wang博士进行讨论和批评意见。

这项工作得到了马克斯普朗克学会和欧洲研究委员会高级基金293926(给I.T.B.)的资助，并得到了德国科学研究院(Deutsche Forschungsgemeinschaft)资助的合作研究中心ChemBioSys (CRC 1127)、中央高校基本研究基金(SWU120067)和重庆海归创业创新支持计划(7820100514)的部分支持。资助者支付了相关的实验费用和出版费用，但在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有任何作用。由Projekt DEAL启动和组织的开放获取资金。

从属关系

1. 西南大学柑橘研究所国家柑橘工程研究中心，重庆市北碚区下马街，400712

   6月他

2. 马克斯·普朗克化学生态研究所分子生态部，Hans-Knöll-Straße 8, 07745，德国耶拿

   何俊，雷科·哈利奇克，梅雷迪思·c·舒曼和伊恩·t·鲍德温

3. 目前地址:苏黎世大学地理与化学系，8057,Zürich，瑞士

   梅雷迪思·c·舒曼

贡献

j.h.， r.h.， I.T.B.和M.C.S.构想了这个项目;r.h.、I.T.B.和M.C.S.管理这个项目并监督研究;I.T.B.和mcs获得了资金和资源;J.H.和R.H.做了调查;J.H.写了初稿，r.h.、m.c.s.和I.T.B.审阅和编辑:所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到6月他或伊恩·t·鲍德温．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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