小麦主要农艺性状相关遗传位点的鉴定(gydF4y2Ba小麦gydF4y2BaL.)基于全基因组关联分析gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

面包小麦(gydF4y2Ba小麦gydF4y2BaL.)是食用最广泛的谷类作物之一，但其复杂的基因组使研究重要农艺性状的遗传效应变得困难。全基因组关联(GWA)分析是识别控制复杂表型性状的遗传位点的有效方法。通过基于rna测序的基因表达分析，可以提出调控重要农艺性状的候选基因，并开发分子标记。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们观察了小麦的主要数量农艺性状;对来自不同国家的287份小麦材料的冬存活率(WSR)、离抽穗天数(DTH)、离成熟天数(DTM)、茎长(SL)、穗长(SPL)、芒长(AL)、升重(LW)、千粒重(TKW)和每穗粒数(SPS)进行了分析。根据群体结构分析，小麦基因型可划分为3个亚群体。预测了不同环境下各性状基因型效应的最佳线性无偏预测值(BLUP)，并将其用于基于混合线性模型(MLM)的GWA分析。通过对小麦参考基因组和RNAseq数据的检索，共鉴定出254个高度显著标记-性状关联(mta)，并预测出与显著标记紧密定位的28个候选基因。此外，有利或不利等位基因的积累对表型性状有显著影响。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

从本研究中，新发现的MTA和农学上的有用基因将有助于研究各表型性状的分子机制。此外，本研究发现的农艺优势等位基因可用于培育具有优良农艺性状的小麦。gydF4y2Ba

面包小麦(gydF4y2Ba小麦gydF4y2BaL.)是全球消费最广泛的谷类作物之一，为人类提供约30%的膳食能量[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．自从大约1万年前小麦首次被种植以来，它已遍布各大洲，这主要归因于它对各种环境的广泛适应性[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．此外，在1900年孟德尔遗传定律被证实后，植物育种的发展促进了小麦的成功。特别是1965年至1985年的“绿色革命”，通过引入高产的半矮秆小麦品种，大幅提高了小麦产量[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．2020年美国冬小麦产量为3.42吨/公顷，几乎是50年前的两倍[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

传统育种依赖于通过表型筛选优良品种，而近年来，随着测序技术的发展，分子育种开始利用品种间的遗传多样性。许多分子标记如简单序列重复(SSR)、随机扩增多态性DNA (RAPD)和限制性片段长度多态性(RFLP)已被用于植物育种[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．然而，由于下一代测序(NGS)的成本已经开始降低，单核苷酸多态性(SNPs)现在正成为最常用的标记，因为它们在所有植物物种中都很丰富[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

全基因组关联选择(GWAS)是一种有用的方法，通过测试群体中标记类型与个体表型之间的关联来识别解释表型性状的候选基因[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．作为GWAS的基因分型工具，基因测序分型(GBS)是一种流行的方法，基于阵列和基于ngs的全基因组高通量基因分型平台已经开发了许多作物，如玉米[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)、大米(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba和大麦[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．对于小麦，已经开发了几个SNP基因分型阵列，包括9k [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba， 15k [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba， 35k [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]和90k [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]数组。其中，利用19个面包小麦和18个硬粒小麦开发的90 K iSelect SNP基因分型阵列是最可靠和应用最广泛的工具之一，以及与籽粒大小等重要农艺性状相关的多个SNP [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，粮食产量[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，以及穗相关性状[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，已经使用数组进行了标识。此外，随着最近小麦参考基因组的公布[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，每个SNP附近基因的功能注释已经可用。gydF4y2Ba

在本研究中，我们观察了287份不同来源、不同环境的小麦材料的9个表型性状。对表型资料进行统计分析，阐明各性状之间的关系。利用小麦90 K iSelect SNP基因分型阵列对小麦材料进行基因分型，并对GWA进行分析。通过GWA分析，提出了与表型性状相关的重要遗传位点和候选基因，为小麦农艺性状强化的研究提供了依据。gydF4y2Ba

表型数据及相关性分析gydF4y2Ba

对287个小麦品系的9个农艺性状在2 ~ 4个不同的环境中进行了观察和分析gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1和表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．根据CV, WSR变异最大，DTH和DTM变异最小。gydF4y2BaHgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在0.051 ~ 0.848之间，LW和DTH分别为最小和最大。来自方差分析(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S2)，发现基因型之间存在显著差异(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)和环境影响这些性状(基因型*环境gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)。计算除WSR外，各观察性状BLUP之间的Pearson相关系数(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．DTH与DTM、SL、SPL、AL、SPS正相关，DTM与SPL、SPS正相关。SPL与AL、TKW、SPS、AL与TKW呈显著正相关，SL与SPS、LW与SPS呈显著负相关。gydF4y2Ba

SNP标记的全基因组分布gydF4y2Ba

在用于基因分型的小麦90k iSelect阵列的81587个SNP标记中，在去除小等位基因频率< 0.05和缺失数据10%的标记后，剩下30218个SNP标记gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S3)。snp分布在所有染色体上，共有5496个;5853;3984;2565;4313;3935;1-7号染色体上分别有3900个。共有172个snp没有物理映射到小麦参考序列上。在亚基因组比较中，标记多位于A和B基因组上，分别有13408和12629个，而在D基因组上只有4009个标记。 The range of the locations of the markers on the chromosomes was diverse, with the smallest for 1D from 31.5 to 498,397 kb and the largest for 3B from 240.2 to 851,642 kb.

人口结构与连锁失衡(LD)gydF4y2Ba

采用ΔK方法对287个小麦基因型的群体结构进行了调查，并通过主成分分析(PCA)和近邻亲缘关系矩阵分析(neighbor-joining亲缘关系矩阵)进行了验证。3次分析的结果表明，根据基因型的不同可将基因型分为3个亚组(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。最大组(G1)含有168个基因型，G2和G3分别含有72和46个基因型。来自同一原产国的小麦基因型通常属于同一亚群。来自澳大利亚、奥地利、保加利亚、加拿大、埃塞俄比亚、匈牙利、印度、乌克兰和乌兹别克斯坦的小麦属于G1，来自阿富汗、阿根廷、哥伦比亚和俄罗斯的小麦属于G2。一些来自中国、日本、墨西哥、朝鲜和美国的小麦同时属于G1和G2。韩国的品种被分为3个亚群，但以“金刚”小麦为祖先的品种大多属于G3。gydF4y2Ba

从LD衰变分析，临界rgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba通过取系数平方的第95百分位(在附加文件中用红色虚线表示)，确定所有小麦基因型的值为0.34gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:图S4)。配对标记最多的是A基因组(44%)，其次是B基因组(42%)和D基因组(14%)。如图所示，D染色体的LD衰减距离比A和B染色体的LD衰减距离要长。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba．用染色体距离和临界r构建LD衰变gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba值作为LD衰变长度的阈值，整个基因组达到250kb。gydF4y2Ba

全基因组关联与基因表达分析gydF4y2Ba

采用K + Q或K + P传销法对9个农艺性状的mda进行鉴定，然后对Q-Q小区和曼哈顿小区进行检验。mta带有-loggydF4y2Ba_10gydF4y2BaP > 3被认为是显著的，在K + Q和K + P分析中确定的mta是相同的。通过K + Q分析得到mta的曼哈顿图，SNPs的Q - Q图和MAF图如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:分别为图S2。WSR、DTH、DTM、SL、SPL、AL、LW、TKW和SPS在各农艺性状中鉴定出的显著mta数量分别为63、20、17、31、23、40、24、31和6gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S4)。每个性状中mta的染色体分布在染色体之间是不同的，如附加文件所示gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S4。gydF4y2Ba

使用IWGSC Wheat RefSeq v1.0对位于每个显著位点250 kb内的基因进行搜索和注释。根据公开的RNAseq数据，共选取了28个基因在冷处理下表达量增加2倍以上或具有相关组织特异性表达的基因(TablegydF4y2Ba2gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S3)。对于WSR, 10个位于显著mta附近的基因对低温有反应。大部分基因位于5号染色体上，每个基因分别位于2号和4号染色体上，2个基因位于7号染色体上。对于DTH，选择了在茎轴、旗叶或花梗中特异性表达的三个基因，并分别位于染色体2、6和7上。对于DTM，筛选出9个高表达基因，其中3个位于染色体4上，1个和5个分别位于染色体5和染色体6上。在SL中，发现了两个在节间和花梗中有特异性表达的基因，分别位于染色体4和染色体5上。在SPL中，有一个基因在2号染色体上高表达。对于AL，在第2染色体上观察到一个F-box家族蛋白编码基因在小穗和芒中高表达。对于SPS，发现了两个专门在谷物中表达的基因，位于染色体2和3上。gydF4y2Ba

Real-time PCR检测候选基因的表达。每个性状至少随机选择两个基因，观察基因表达。WSR,gydF4y2BaTraesCS5A01G391700gydF4y2Ba，gydF4y2BaTraesCS5A01G394900gydF4y2Ba,gydF4y2BaTraesCS5B01G454100gydF4y2Ba在冷处理后24小时，12小时和12小时，基因表达增加(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:图S5)。对于对数,gydF4y2BaTraesCS6D01G212200gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTraesCS7A01G484300gydF4y2Ba分别在茎和花序梗中表达高，或仅在花序梗中表达高(图。gydF4y2BaS6gydF4y2BaDTM的)。gydF4y2BaTraesCS4B01G225800gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTraesCS6A01G407500gydF4y2Ba高表达于穗(图。gydF4y2BaS6gydF4y2Ba为SL, B)。gydF4y2BaTraesCS4B01G052400gydF4y2Ba在花梗中有高表达gydF4y2BaTraesCS5A01G320500gydF4y2Ba在茎、花梗和穗中均有高表达(图5)。gydF4y2BaS6gydF4y2Bac).对于SPL和AL，gydF4y2BaTraesCS2D01G036800gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTraesCS2D01G064400gydF4y2Ba在穗叶和旗叶中分别高表达。gydF4y2BaS6gydF4y2Bad和e)。SPS,gydF4y2BaTraesCS2B01G087000gydF4y2Ba代表了spike中最高的表达式，和gydF4y2BaTraesCS01G311000gydF4y2Ba在穗中也有高表达(图。gydF4y2BaS6gydF4y2Baf)。gydF4y2Ba

等位基因对农艺性状的影响gydF4y2Ba

为了研究等位基因对农艺性状的影响，比较了具有不同有利或不利等位基因数量的小麦基因型在不同环境下的表型数据分布(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．本研究认为冬成活率高，离抽穗和成熟天数短，茎长、穗长、芒长短，升重、千粒重重大，穗粒数多是有利条件。除WSR、SPL和SPS的不利等位基因和DTH、SL、AL和TKW的有利等位基因外，绝大多数情况下，有利/不利等位基因的数量对各农艺性状均有显著的正或负影响，而DTH、SL、AL和TKW的有利等位基因均不存在同时具有5个不利或有利等位基因的小麦基因型。此外，除E3中对SL有利的等位基因和E4中对LW有利/不利的等位基因外，其他农艺性状的等位基因效应均不受环境影响。gydF4y2Ba

在这项研究中，在2到4个不同的环境中观察了小麦的9个表型性状，并将其用于GWA分析(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。在四种环境中观察到WSR;然而，在E3和E4中，由于气候条件温暖，基因型之间的差异很小，因此从分析中删除了这些。DTH和DTM随环境的不同表现出较大的变化。结果表明，低温环境(E1)比温暖环境(E4)有更高的值。在各表型性状之间的Pearson相关分析中(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)， DTH和DTM之间高度相关，与SPL和SPS也呈正相关。这与之前的研究一致[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，这可能表明在较长的营养发育过程中，营养吸收导致穗长较大，最终导致每穗种子数量较大。此前的一项研究也发现AL与TKW呈正相关[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，仍需进一步研究。gydF4y2Ba

通过结构亚群体分析、主成分分析和亲缘关系矩阵三种不同的方法分析基因型之间的关系。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。所有三次分析都得到了相同的三个亚群体，这证明了基因型分析的可靠性。由此可见，遗传型多分为G1和G2两个亚群体，G3多由ku发育系组成，母系为“金刚”。由于G3小麦的表型性状是多样化的，对这些品系的集中研究将有助于在相似的遗传背景下确定一个主要的QTL。gydF4y2Ba

LD分析表明，配对标记在D染色体中相对较少，LD衰变距离在D染色体中也特别长(图1)。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)．这一现象在之前的一项研究中被观察到[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．这可能是由于iSelect 90k芯片中D染色体的SNPs数量较少，这是由于小麦基因型之间D基因组的多态性很少造成的[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．这被认为是很自然的，因为D基因组是在A和B基因组混合之后才被并入小麦基因组的。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba所以D基因组与A和B基因组相比几乎没有分化的机会。估算的LD衰减距离为250kb，高于[74.7 kb]。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]及低于393 kb的[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

GWA分析和MTA候选基因搜索确定了一些与表型性状相关的功能基因(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S3)。发现了10个WSR基因。10个基因中有6个位于5号染色体的长臂上gydF4y2BaFr-1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaFr-2gydF4y2Ba基因座，控制耐寒性[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．一项早期关于耐寒性的GWAS研究也报告了显著的mta大多位于5号染色体的长臂上[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．他们在gydF4y2BaCBFgydF4y2Ba调节冷反应途径的重要转录因子基因[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，但MTAs关于gydF4y2BaCBFgydF4y2Ba在这项研究中没有发现基因。相反，根据之前的研究，5号染色体上的其他假设候选基因被提出。gydF4y2BaTraesCS5A01G359900gydF4y2Ba(磷酸酶2C家族蛋白)属于植物中蛋白质磷酸酶的主要类群，在植物的多种代谢中起多种作用。研究发现，水稻PP2C负向调控ABA信号通路，增强非生物胁迫的耐受性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS5A01G360000gydF4y2Ba低温盐反应蛋白(低温盐反应蛋白)在低温下表达极高，且该蛋白在多种物种中保存较好;但其功能仍有待进一步阐明[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS5A01G391700gydF4y2Ba（gydF4y2BaVrn-A1gydF4y2Ba)控制开花时间，位于gydF4y2Ba霜Resistance-1gydF4y2Ba（gydF4y2BaFr-1gydF4y2Ba)位点，该位点被报道为耐寒性的主要QTL [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]，现在被认为对这两个性状都有多效性[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS5A01G394900gydF4y2Ba(udp -葡萄糖6-脱氢酶)参与蔗糖/多糖代谢和细胞壁生物合成，并从gydF4y2Ba落叶松人工林gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba增强耐寒性[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS5B01G397500gydF4y2Ba(ABC转运蛋白B家族蛋白)是一种大型ABC转运蛋白家族蛋白，其功能是一种质膜修饰剂，可激活生物和非生物应激反应[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS5B01G454100gydF4y2Ba(蛋白激酶家族蛋白)参与多种植物代谢途径，一些蛋白激酶如钙依赖性蛋白激酶(CDPK)、cbl相互作用蛋白激酶(CIPK)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)已被鉴定为调节不同植物物种的耐寒性[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．其他染色体上的候选基因也被提出。gydF4y2BaTraesCS2D01G032800gydF4y2Ba(groes样锌结合醇脱氢酶家族蛋白)是小麦中的一个醇脱氢酶家族，此前曾预测该基因家族可能在厌氧内涝胁迫中发挥重要作用[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS4A01G469900gydF4y2Ba(Homeobox BEL1样蛋白)是一种BEL1转录因子，与knoted蛋白相互作用，并对伤口反应作出反应，如在马铃薯中研究[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS7A01G389900gydF4y2Ba细胞外配体门控离子通道蛋白(CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}细胞内离子的增加被认为是冷反应途径的一个触发因素[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，这使得它成为钙离子通道的假设gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}涌入。gydF4y2BaTraesCS7D01G357200gydF4y2Ba(跨膜蛋白)没有特异性，但细胞膜是冷感知的关键细胞器[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]和一些跨膜蛋白已被证明可以控制耐寒性[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

对于DTH和DTM，分别提出了3个和9个假设基因。DTH和DTM是高度定量性状，受生长环境影响显著。不同的研究小组早前已经进行了关于潜深和DTM的GWAS研究[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]，但没有重叠的候选基因，并确定了许多mta。我们建议的候选基因已知具有与开花和成熟相关的功能，但与之前的研究重叠的基因也没有被发现。gydF4y2BaTraesCS2D01G468900gydF4y2Ba(淀粉合成酶家族蛋白)在茎轴和花梗中有高表达;该基因控制淀粉颗粒中直链淀粉的合成，有人认为该基因可能在花过渡时增加糖的动员，从而参与成花信号的传递[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS6D01G212200gydF4y2Ba(苯丙氨酸解氨酶)主要参与木质素的生物合成途径，但其敲除gydF4y2BaBrachypodiumgydF4y2Ba突变体显示晚开花表型[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，这可能与植物的开花时间有关。gydF4y2BaTraesCS7A01G484300gydF4y2Ba(受体样激酶)也代表花梗特异性基因表达。一些受体样激酶已被发现通过与主要的开花调控因子相互作用而参与开花[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，这需要对该基因进行进一步的研究。gydF4y2BaTraesCS4B01G129300gydF4y2Ba(exostsin家族蛋白)主要在穗和花药中表达。该基因在植物中的功能尚未阐明，但其在番茄雌蕊中的表达[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba和在玉米花过渡期的叶子中[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]被观察到，这意味着它参与了开花调控。gydF4y2BaTraesCS4B01G225800gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTraesCS4B01G226000gydF4y2Ba编码在刺突中特异表达的富含脯氨酸的蛋白质。研究表明，番茄杂交富脯氨酸蛋白通过控制乙烯反应调节番茄花脱落[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，这也应该在小麦中进行研究。gydF4y2BaTraesCS5B01G356300gydF4y2Ba(UTP——葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶)在花药和籽粒中表达，被认为是一种营养和生殖阶段速率限制因子gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS6A01G117600gydF4y2Ba(同型盒蛋白)在发育的籽粒中表达，而水稻中过表达的WUSCHEL同型盒转录因子OsWOX13揭示了早开花表型[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS6A01G406900gydF4y2Ba，gydF4y2BaTraesCS6A01G407000gydF4y2Ba，gydF4y2BaTraesCS6A01G407500gydF4y2Ba,gydF4y2BaTraesCS6A01G407600gydF4y2Ba编码在穗或粒中高度表达的F-box家族蛋白质。已知F-box蛋白参与多种分子途径，其对开花和穗发育的调控已在许多植物物种中被观察到，包括小麦[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

对于SL，两个MYB转录因子，gydF4y2BaTraesCS4B01G052400gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTraesCS5A01G320500,gydF4y2Ba在花梗和节间均有高表达。小麦株高的主要控制因子是gydF4y2Ba减少高度gydF4y2Ba（gydF4y2BaRhtgydF4y2Ba)基因，通过调节激素、活性氧和细胞壁结构的途径[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．之前的研究表明了可能参与下通路的多个候选基因gydF4y2BaRhtgydF4y2Ba基因，如生长素结合蛋白和蛋白激酶[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，锌指蛋白[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]、bHLH74、gdp -甘露糖转运蛋白等[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba我们认为MYB转录因子是这样的候选基因。关于小麦MYB转录因子的研究多集中在不同的非生物胁迫耐受性[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．然而，有报道称，新的MYB-like转录因子OsMPH1(植物高度1 MYB-like gene of Plant Height 1)调控节间细胞大小并最终调控株高。未来应进一步研究MYB转录因子在株高调控中的作用。gydF4y2Ba

两个单基因被鉴定为分别在调节SPL和AL中具有假定的作用。小麦穗的形态由至少三个位点控制，分别位于染色体5A、2D和3D上的Q、C和S [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．这些基因影响各种穗性状，包括穗长，穗形态，粒大小和形状，但由于所有已知的普通小麦gydF4y2Ba质量控制gydF4y2Ba基因型，很可能有其他基因有助于穗的形态[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．对于芒长，三种主要的芒长抑制剂，gydF4y2Ba连帽gydF4y2Ba（gydF4y2Ba高清gydF4y2Ba)，gydF4y2BaTipped1gydF4y2Ba（gydF4y2BaB1gydF4y2Ba),gydF4y2BaTipped2gydF4y2Ba（gydF4y2BaB2gydF4y2Ba)，但它们的功能尚未被表征[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS2D01G036800gydF4y2Ba(Cullin-associated nedd8 -游离蛋白1)尚未得到广泛研究，但在番茄中，抑制该基因会导致多种表型变化，包括矮化、早开花和种子萌发抑制[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．它在小麦中的作用，特别是对穗发育的调控作用还有待进一步研究。gydF4y2BaTraesCS2D01G064400gydF4y2Ba(F-box家族蛋白)如前所述参与植物的多种代谢，但其在芒长中的作用尚未见报道。然而，另一项小麦GWAS研究表明，两种MYB转录因子可能是芒长的调节因子[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]，这可能暗示了MYB转录因子的另一种未特征性作用。gydF4y2Ba

对于SPS，两个在籽粒中高表达的基因被认为是候选基因。SPS与每穗小穗数呈正相关[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]，而且它受到生物或非生物胁迫的高度影响，这使得很难找到决定其性状的遗传因素。在之前的研究中发现了许多mta或候选基因，mta位于染色体2A、4A [gydF4y2Ba58gydF4y2Ba), 7 b (gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]和第5D染色体上的bhlh编码基因[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．我们的分析显示，在2B染色体和3A染色体上分别有两个基因。gydF4y2BaTraesCS2B01G087000gydF4y2Ba响应调节器1是一种功能未知的信号转导响应调节器。其中的一种反应调控因子，磷酸盐饥饿反应调控因子PHR1，被认为是植物中磷酸盐饥饿反应的调控因子gydF4y2BaTa-PHR1-A1gydF4y2Ba通过增加每穗粒数提高粮食产量[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．gydF4y2BaTraesCS3A01G311000gydF4y2Ba(细胞分裂素氧化酶/脱氢酶)通过控制植物细胞分裂素的水平来调节植物的生长发育。以往的研究发现，细胞分裂素氧化酶基因的表达水平gydF4y2BaTaCKX2.1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTaCKX2.2gydF4y2Ba与每穗粒数相关[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba),gydF4y2BaTaCKK2.4gydF4y2Ba-沉默的小麦品系每穗粒数显著增加[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

GWA分析使用来自组合环境或来自单独环境(E1到E4)的BLUP值。如附加文件所示，验证了mta的一致性gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S4。然而，一些性状的标记如E1的DTM、E4的AL和E4的LW在组合环境中未显示出来。这可能是因为这些性状比其他性状在不同的环境中变化更大，而且在不同的环境中所调查的接入数也不同，所以每个标记在其他环境中的意义可能不同。gydF4y2Ba

Real-time PCR检测候选基因的胁迫响应或组织特异性基因表达gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2BaS5gydF4y2Ba而且gydF4y2BaS6gydF4y2Ba)．与WSR相关的候选基因对冷胁迫反应明显。gydF4y2BaS5gydF4y2Ba)，其他基因表达的组织特异性与RNAseq数据基本一致(图1)。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)．特别是,gydF4y2BaTraesCS2B01G087000gydF4y2Ba其在穗中的表达量是叶片的约140,000倍，这使其成为SPS的候选基因(图1)。gydF4y2BaS6gydF4y2Ba然而,f)。gydF4y2BaTraesCS2D01G064400gydF4y2Ba表达在组织间没有显示出很大的差异，这可能是因为实时PCR分析中没有检测芒状组织(图5)。gydF4y2BaS6gydF4y2Bae).需要进一步的实验来表征的功能gydF4y2BaTraesCS2D01G064400gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

观察各农艺性状中mta的等位基因效应(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．有利等位基因的积累与较高的WSR、较短的DTH、DTM和SL、较长的SPL和AL、较高的LW、TKW和SPS呈正相关，而不利等位基因的积累与这些性状呈负相关。除SL在E3中，LW在E4中外，大多数环境中都观察到了等位基因效应。这可能部分是由于低gydF4y2BaHgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在LW(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，这意味着这些性状在很大程度上受环境的影响，而不是受基因型的影响。gydF4y2Ba

本研究对田间小麦9个表型性状进行了GWA分析，预测了冬季存活率、成熟期天数、茎长、穗长、芒长、升重、穗粒数等7个性状的254个显著mta和28个候选基因。我们观察到先前识别的具有已知功能的基因，并在每个性状中发现了几个可能具有未特征功能的新基因。对这些候选基因的进一步研究和SNP标记的利用，将有助于验证它们在相关性状中的分子功能，并有助于开发农艺性状改良小麦。gydF4y2Ba

植物材料和表型测量gydF4y2Ba

本研究在2018-2019年(E1)和2019-2020年(E2)生长季，在德苏地区(N37.35°，E127.14°，海拔= 62 m)高丽大学试验田站种植了287个小麦品种和优良品系。在位于全州的国立作物科学研究所(E3;N35.50°，E127.02°，海拔= 32米)和晋州庆尚南道农业研究推广服务(E4;N35.12°，E128.06°，海拔= 20 m)。现场试验按照韩国政府当地法规进行。在“原产国”一栏中注明“在堪萨斯大学开发”的小麦系是在高丽大学开发的育种系。凡在“IT编号”栏中注明编号的均为韩国农村振兴厅国家农业生物多样性中心提供的种质资源gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。这些材料分别于2018年10月4日、25日、29日在德苏、全州、晋州种植，并于2019年6月成熟后收获。在德玉所的2019 - 2020年生长季节，小麦于2019年10月17日种植，并于2020年6月收获。每个种质中5克种子，每排1.2 m，间隔40 cm，在每个区域按α格设计进行两次重复试验。gydF4y2Ba

表型测量方法如下。耐寒性以代表每种基因型植物存活率的整数的冬季存活率进行评估，其范围从0(0 - 10%)到9(90-100%)。当每个种质的一半穗分别出现或变成棕色时，记录抽穗和穗成熟日期。DTH和DTM是用种植日期减去种植日期计算的。随机选择3株植物，从地面到穗底端测量SL。随机选取3个植株的主穗，从轴基部到最顶端的小穗测量SPL，并测量AL。每个种质中有3个穗数为SPS。在低w条件下，测量每一行种子重200 mL，并乘以5。对于TKW，每品系计200粒种子，重量乘以5。gydF4y2Ba

表型数据分析gydF4y2Ba

所有表型数据分析使用R version 4.4.0 (R Core Team)进行。计算每个环境中定量数据的平均值、标准差、中位数和变异系数(CV)。对于每次加入，使用" lme4 "包计算所有环境的BLUP(最佳线性无偏预测)值[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba和广义遗传力(gydF4y2BaHgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)是根据以下V的入口均值估计的gydF4y2Ba_GgydF4y2Ba/ [VgydF4y2Ba_GgydF4y2Ba+ (VgydF4y2Ba_EgydF4y2Ba/ y) + VgydF4y2Ba_{错误gydF4y2Ba}), VgydF4y2Ba_GgydF4y2Ba是基因型方差VgydF4y2Ba_EgydF4y2Ba是环境方差。VgydF4y2Ba_{错误gydF4y2Ba}为残差方差，y为环境个数。将基因型、环境、基因型与环境的相互作用作为随机因素进行方差分析。使用“cor”函数和“PerformanceAnalytics”包计算所有BLUP性状的皮尔逊配对相关[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba在R。gydF4y2Ba

基因分型和SNP呼叫gydF4y2Ba

为了进行基因分型试验，从德okso田间的小麦孕穗期前的叶片中取样，并在- 80°C保存直到使用。根据美国农业部指导手册，使用CTAB方法从每个种质的单个植物中提取DNA [gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．DNA被送到位于法戈市的美国农业研究署小谷物基因分型中心(gydF4y2Bahttps://wheat.pw.usda.gov/GenotypingLabs/fargogydF4y2Ba)用于Illumina iSelect 90 K SNP检测。SNP等位基因聚类和基因型调用使用genomic estudio Module Polyploid基因型2.0软件(gydF4y2Bahttps://support.illumina.com/downloads/genomestudio-2-0.htmlgydF4y2Ba)．去除等位基因频率< 0.05和缺失数据> 10%的标记，共获得30218个高质量SNPs用于群体结构分析和全基因组关联(GWA)分析。gydF4y2Ba

人口结构与联系失衡gydF4y2Ba

基于模型的贝叶斯聚类分析程序STRUCTURE v2.3.4 [gydF4y2Ba65gydF4y2Ba用来推断种群结构。总共1万个磨合周期，然后进行10万个从K = 2到K = 12簇的马尔可夫链蒙特卡洛(MCMC)迭代，以确定最优簇(K)。为每个K生成3个独立运行。一个临时数量统计量ΔK，基于连续K值之间数据的日志概率的变化率[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]被用来预测亚种群的真实数量。使用TASSEL v5.2.57进行主成分分析[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

使用TASSEL v5.2.57，滑动窗口截断100，估计30218个SNP标记对之间的连锁不平衡(LD)。根据物理距离分析LD衰减，根据[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．简单地说，LD分别估计为未连接的位点和同一染色体上的位点(未连接的gydF4y2BargydF4y2Ba^2gydF4y2Ba和syntenicgydF4y2BargydF4y2Ba^2gydF4y2Ba分别)。SyntenicgydF4y2BargydF4y2Ba^2gydF4y2Ba与染色体上的物理距离作图，并使用" ggplot2 "包绘制一条平滑的线[gydF4y2Ba69gydF4y2BaUnlinked- .gydF4y2BargydF4y2Ba^2gydF4y2Ba估计是平方根变换，然后超过参数分布的第95百分位很可能是由遗传连锁引起的。平滑线与共线的交点gydF4y2BargydF4y2Ba^2gydF4y2Ba这一基线被认为是对染色体LD程度的估计。gydF4y2Ba

全基因组关联分析gydF4y2Ba

利用残差极大似然(REML)算法拟合混合线性模型(MLM)，计算该模型对不同环境下的表型数据进行分析，并估计每个个体的均值。使用GAPIT包v3执行关联测试[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]， MLM模型利用具有种群结构和PCA的性状数据寻找标记-性状的关联。用K + Q(亲缘关系和种群结构)或K + P(亲缘关系和主成分)对每个性状进行两次分析，并进行比较。一个阈值gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value of 0.001(−log . log .gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(P) = 3)用于声明GWAS结果的显著SNPs和具有的SNPsgydF4y2BaPgydF4y2Ba-value小于0.001。此外，整个分析在每个不同的环境中进行，以验证标记-特征关联的一致性表现。分位数-分位数图是根据观测和预期测井绘制的gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(P)值。gydF4y2Ba

为了识别与每个农艺性状相关的基因，在每个鉴定的MTA(标记-性状关联)近端±250 kb处的高置信度注释基因从(gydF4y2Bahttp://plants.ensembl.org/index.htmlgydF4y2Ba)，每个基因的注释遵循国际小麦基因组序列联盟(IWGSC)小麦RefSeq v1.0。此外，利用公共RNA-seq数据观察检索基因的基因表达。对于wsr相关基因，2周冷处理小麦幼苗的RNAseq可在小麦表达浏览器(gydF4y2Bahttp://www.wheat-expression.com/gydF4y2Ba)，那些增加2倍以上的基因被检索出来。除LW和TKW外，其余农艺性状的基因在小麦eFP浏览器(gydF4y2Bahttp://bar.utoronto.ca/efp_wheat/cgi-bin/efpWeb.cgigydF4y2Ba)，去除TPM (Transcripts Per Million) < 5的基因。利用Heatmapper (gydF4y2Bahttp://www.heatmapper.ca/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，为了验证等位基因对各农艺性状的影响，我们检索了各性状中五个最显著的mta的有利和不利等位基因。然后，比较每种有利或不利等位基因具有1 ~ 5个的品系在不同环境下的表型数据分布。利用R对有利/不利等位基因数与各表型数据进行回归分析，利用R中的“ggplot2”包建立箱图。gydF4y2Ba

实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

候选基因在特定组织或低温条件下的表达。从小麦抽穗期的第一个叶片、茎、花序梗、旗叶和穗中提取RNA。为了观察低温下的基因表达，将生长在25℃的小麦三叶期幼苗暴露在4℃的环境中。RNA提取使用TRIzol (Thermo Fisher Scientific Co.， USA)， cDNA合成使用PrimeScript™第一链cDNA合成试剂盒(Takara Bio Inc.， Japan)，分别根据制造商手册进行。每个基因特异性PCR引物采用NCBI引物- blast (gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?gydF4y2BaLINK_LOC = BlastHome)(表gydF4y2BaS5gydF4y2Ba)．在CFX-96实时PCR仪(Bio-Rad, USA)中使用BrightGreen 2X qPCR MasterMix (ABM, Canada)进行实时PCR。每个基因的Ct值根据内部基因控制归一化，相对基因表达量用2gydF4y2Ba^{−ΔΔCTgydF4y2Ba}方法，如前面所述[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．用R进行统计分析，用Student 's t检验或单因素方差分析(方差分析)评估基因表达差异，然后用Tukey事后检验。gydF4y2Ba

本研究期间产生或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。gydF4y2Ba

GWA:gydF4y2Ba

全基因组关联gydF4y2Ba

对数:gydF4y2Ba

天的标题gydF4y2Ba

DTM:gydF4y2Ba

天到期gydF4y2Ba

SL:gydF4y2Ba

阀杆的长度gydF4y2Ba

SPL:gydF4y2Ba

穗长gydF4y2Ba

艾尔:gydF4y2Ba

芒长度gydF4y2Ba

LW:gydF4y2Ba

升重量gydF4y2Ba

TKW:gydF4y2Ba

千粒重gydF4y2Ba

SPS:gydF4y2Ba

每穗的种子数gydF4y2Ba

BLUP:gydF4y2Ba

最佳线性无偏预测gydF4y2Ba

传销:gydF4y2Ba

混合线性模型gydF4y2Ba

MTA:gydF4y2Ba

Marker-trait协会gydF4y2Ba

苏维埃社会主义共和国:gydF4y2Ba

简单序列重复gydF4y2Ba

RAPD:gydF4y2Ba

随机扩增多态DNAgydF4y2Ba

RFLP:gydF4y2Ba

限制性片段长度多态性gydF4y2Ba

门店:gydF4y2Ba

新一代测序gydF4y2Ba

SNP:gydF4y2Ba

单核苷酸多态性gydF4y2Ba

简历:gydF4y2Ba

变异系数gydF4y2Ba

方差分析:gydF4y2Ba

方差分析gydF4y2Ba

密度:gydF4y2Ba

马尔可夫链蒙特卡洛gydF4y2Ba

主成分分析:gydF4y2Ba

主成分分析gydF4y2Ba

REML:gydF4y2Ba

剩余最大似然gydF4y2Ba

IWGSC:gydF4y2Ba

国际小麦基因组序列联盟gydF4y2Ba

TPM:gydF4y2Ba

记录每百万gydF4y2Ba

CDPK:gydF4y2Ba

Calcium-dependent蛋白激酶gydF4y2Ba

MAPK:gydF4y2Ba

增殖蛋白激酶gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

这项工作是在“农业与技术发展下一代生物绿色21计划(项目编号:PJ015666)“农村发展局，韩国食品、农业、林业和渔业技术规划和评价研究院(IPET)通过农业生物产业技术发展计划，由韩国农业、食品和农村事务部(MAFRA)(318088)资助和高丽大学的赠款。资助机构参与了材料创作、研究设计、数据分析和撰写手稿。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 高丽大学植物生物技术系，韩国首尔02841gydF4y2Ba

   Woo Joo Jung & Yong Weon SeogydF4y2Ba

2. 高丽大学生物技术系，韩国首尔02841gydF4y2Ba

   李永进&徐永元gydF4y2Ba

3. 韩国完州55365，农村发展局国家作物科学研究所gydF4y2Ba

   Chon-Sik康gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

所有作者都对研究的构思和设计做出了贡献。用WJJ进行DNA提取、基因分型和数据分析。表型数据管理由WJJ和YJL完成。表型数据观察采用WJJ、YJL、CSK和YWS。手稿的初稿由WJJ撰写，随后由YWS进行审阅和编辑。所有作者已阅读并认可最终稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba勇Weon SeogydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和知情同意gydF4y2Ba

所有的植物实验都是按照高丽大学的指导方针进行的。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba