Marasmius山岳女神凝集素增强拟南芥对植物寄生线虫和食草昆虫的抗性

背景

植物寄生线虫和草食昆虫对全球作物生产产生了重大的负面影响。保护农作物免受这些害虫侵害的一个成功方法是在足底线虫毒或昆虫毒蛋白的表达，如晶体蛋白苏云金杆菌（英国电信)或植物凝集素。然而，这种方法的有效性受到线虫和昆虫种群对这些蛋白质抗性的威胁。为了解决这一问题，需要新的线虫毒蛋白和昆虫毒蛋白。在过去的二十年中，从蘑菇中发现了几种具有杀线虫和杀虫活性的细胞质凝集素。在这项研究中，我们测试了Marasmius山岳女神凝集素(MOA)为拟南芥提供了对三种重要经济作物害虫的抗性:两种植物寄生线虫异皮线虫属schachtii而且有隐姓埋名的女人还有草食性小菜蛾小菜蛾．

结果

MOA的表达不影响植物在无菌条件下的生长，这是转基因作物工程中的一个重要参数。转基因拟南芥表现出几乎完全的抗性h . schachtii，每cm根雌、雄线虫数分别比WT降低了86 ~ 91%和43 ~ 93%。m .隐姓埋名的女人转基因株系对MOA蛋白的敏感性较低，虫瘿和线虫卵团分别减少了18 - 25%和26 - 35%。食草动物的幼虫p .蛾采食moa表达系的相对增重(22 ~ 38%)和成活率(15 ~ 24%)均低于采食野生型植物。

结论

我们的研究结果在足底实验表明真菌凝集素MOA对重要的农业害虫具有很强的杀线虫和杀虫活性，可用于作物保护。

植物在其环境生境中会受到地上和地下害虫的各种生物胁迫，如以笋食和以根食的食草动物和以根食的线虫[1］．昆虫食草动物和线虫因其丰富、适应性和多样性而成为植物生存的最重要威胁之一[2，3.］．估计12.3%(157生物。美元)的全球作物产量因植物寄生线虫而损失[4］．此外，全球作物产量的10 - 16%是由于收获前的虫害和收获后类似程度的损害而损失的[5］．

使用农用化学品(除草剂和杀虫剂)防治害虫已经非常成功并被大量使用，但这种方法存在问题，因为这些化合物会污染环境，其中许多化合物对包括人类在内的非目标生物也是有毒的[6］．在作物生产中使用农用化学品的另一种方法是使用抗虫害和病原体能力增强的基因工程(转基因)作物在足底异源昆虫毒和线虫毒蛋白的表达[7，8］．然而，对这类生物农药耐药性的出现降低了这种方法的效率。例如，在表达杀虫蛋白的作物中，已经报道了田间进化的各种害虫抗性苏云金杆菌（英国电信) [9］．为了解决这一问题，新的昆虫毒蛋白和线虫毒蛋白被广泛应用在足底表达，为植物提供增强的抗虫害能力，是需要的[8］．这种蛋白质的一个有吸引力的来源是凝集素。凝集素是一组广泛存在的蛋白质，可与糖表位可逆结合而不改变其化学结构[10］．它们参与广泛的细胞内和细胞外功能，包括天然植物防御和免疫[11］．因此，本文讨论了异种植物凝集素在转基因作物中的表达，并已应用于病虫害防治[12，13］．除植物外，蘑菇的子实体(孢子粒)富含具有昆虫毒和线虫毒活性的凝集素。这些细胞质定位蛋白，也称为子实体凝集素，被认为是真菌抵御捕食者和寄生虫的先天防御系统的重要组成部分[14，15］．其中一些凝集素被证明可以识别食真菌动物消化道中的糖蛋白或糖脂的聚糖[14，16］．例如，半乳糖凝集素CGL1和CGL2Coprinopsis灰质显示对线虫的毒性秀丽隐杆线虫，蚊子埃及伊蚊和变形虫Acanthamoeba castellanii［16］．类似地，CCL2是一种β-三叶二聚体凝集素，来自同一蘑菇，表现出对秀丽隐杆线虫，果蝇黑腹果蝇还有食真菌线虫Aphelenchus avenae而且Bursaphelenchus okinawaensis［17，18，19］．CCL2对动物寄生线虫也有毒性Haemonchus contortus［20.］．我们最近证明了CCL2在拟南芥中的表达可以保护植物免受植物寄生线虫的侵害异皮线虫属schachtii．有趣的是，表达ccl2的植物也表现出对真菌和细菌病原体的抗性。此外，CCL2的表达促进了植物的生长，这表明CCL2除了直接与拮抗剂中的糖表位结合外，还能够通过与内源糖表位结合来提高植物的抗病性和生物量产量[21］．这些结果促使我们评估另一种蘑菇凝集素的毒性，Marasmius山岳女神凝集素(MOA)，对两种不同的植物寄生线虫和一种昆虫食草动物。m:山岳，被称为仙女环蘑菇，生长在草坪、公园、牧场和草地上，产生许多生物活性化合物，如氰化氢、聚乙炔和几种倍半萜[22］．MOA是一种嵌合凝集素，其n端含有蓖麻毒素b型(β-三叶)凝集素结构域[23，24］．凝集素结构域与galα 1,3 galβ 1,4 glcnac特异性结合，后者也被称为猪异种移植表位，存在于B血型抗原[25］．MOA的c端结构域由一个钙依赖性半胱氨酸蛋白酶组成，属于木瓜样半胱氨酸蛋白酶家族(PLCPs, EC3.4.22) [26］．MOA对线虫的毒性既取决于n端碳水化合物结合活性，也取决于c端半胱氨酸蛋白酶活性秀丽隐杆线虫已鉴定为糖鞘脂上的gal α 1,3gal β 1,4glcnac表位，类似于细菌晶体毒素Cry5B [27，28］．

本研究旨在评价MOA对3种重要植物病虫害的保护作用。用甜菜囊线虫攻击表达moa的拟南芥植株h . schachtii，根结线虫m .隐姓埋名的女人，以及小菜蛾小菜蛾．结果表明，MOA基因在转基因植物中的表达可以增强植物对这些害虫的抗性。

拟南芥中MOA的表达

在CaMV-35 S启动子的调控下，在拟南芥(Col-0)中表达了携带c端FLAG表位标签的MOA35 S:: MOA-3xFLAG．拟南芥转化后获得42个初级转化子(T1)。从T3代开始，选择3个MOA高表达的株系进行线虫和虫害生物测定。与野生型植物相比，MOA在拟南芥中的表达并没有改变转基因株系的大小和形态(通过莲座和根结构判断)。1a).这些结果表明，MOA的表达不影响植物的适应性。用免疫印迹法分析了三个独立转基因株系的根和叶中MOA的表达水平(图2)。1b).结果表明，所有样本的表达水平相似。

表达moa的拟南芥对甜菜囊线虫的抗性更强异皮线虫属schachtii

囊肿线虫h . schachtii还有根结线虫m .隐姓埋名的女人感染大多数植物物种的内寄生线虫是否静止不动拟南芥［29，30.］．评价MOA的毒性h . schachtii将moa表达系和WT植株分别接种于植物的二期幼体(J2s)中h . schachtii以接种14 d后每cm根雌雄数(dpi)评价线虫侵染率。的数量h . schachtii与WT相比，所有3个表达moa的株系每厘米根雌株数量均显著降低(L1: 87%保护性;L2: 91%;L3: 86%;无花果。2a).与WT相比，表达moa的株系每厘米根的雄性线虫数量也大幅减少了55% (L1)， 93% (L2)和43% (L3)(图3)。2b).综上所述，这些结果表明，MOA的表达可以保护拟南芥植物免受h . schachtii．

表达moa的拟南芥植株对根结线虫的敏感性较低有隐姓埋名的女人

根结线虫m .隐姓埋名的女人是专性生物营养性寄生虫，渗透植物根部并劫持植物养分[31］．将moa表达系和野生型植株接种于水稻的第二阶段幼体(J2s)m .隐姓埋名的女人．以每株虫瘿数和虫卵质量作为侵染指标。结果表明，与野生型植物相比，这三个转基因株系的瘿数分别减少了18%、26%和18%。3.a).卵团数量分别减少了26%、35%和25%(图。3.b).这些结果表明，moa表达系在一定程度上保护了拟南芥根系不受害虫的寄生隐姓埋名的女人。然而，这种保护作用要弱得多h . schachtii．

MOA增强拟南芥对昆虫食草动物的抗性小菜蛾

食草昆虫，如小菜蛾小菜蛾，导致全球作物产量估计损失15% [32］．5周龄moa表达植株和WT植株暴露于p .蛾对幼虫饲养一周、幼虫相对增重和成活率进行分析。结果表明，所有moa表达系的相对质量增重均低于野生型。幼虫增重L1组减少38%，L2组减少27%，L3组减少22%(图2)。4a).同样，与WT植物相比，以L1至L3为食的幼虫存活率分别低24%、18%和15%(图2)。4b). MOA- oe L1在叶片中表达量最高，对食叶虫的抑制作用强于L2和L3。经过处理的植株的表型表明，WT植株完全被幼虫吃掉，而转基因植株对幼虫侵袭表现出一定的抗性(图2)。4c).结果表明MOA在控制虫害方面的潜力p .蛾．

在本研究中，我们检测了蘑菇凝集素MOA [24]因为它能够增强工程转基因拟南芥植物对两种不同的植物寄生根线虫和食草性芽虫食草动物的抗性。抗性基因的表达对植物生长有负面影响。例如，植物抗草甘膦基因的表达会导致适应度成本[33］．我们的研究结果表明，MOA的表达并不会降低拟南芥在免生条件下的适应度(图2)。1a).在这方面，与许多植物凝集素相反，蘑菇凝集素是在细胞质中产生的，细胞质是内源性糖缀合物非常少的隔室，这可能是一个优势。

植物寄生线虫对农业产生重大负面影响，每年造成超过1000亿美元的损失[3.］．由于这些寄生虫的部分生命周期是在植物组织内度过的，因此使用化学农药进行控制具有挑战性。因此，在植物组织中表达生物农药的转基因植物的应用是一种有价值和更有效的替代方法。我们的结果表明，表达moa的拟南芥植株在很大程度上受到了囊线虫的保护h . schachtii(无花果。2)．3个品系每厘米根的雌、雄线虫数量均显著减少。我们之前已经证明了表达ccl2的拟南芥植物对h . schachtii与野生型植株相比，表达ccl2的株系每厘米根的雌性数量减少了35%。MOA的保护效果(降低88%)比CCL2高60%。

MOA转基因株系对根结线虫的敏感性也有所降低m .隐姓埋名的女人尽管程度比to要低得多h . schachtii(无花果。3.)．这种差异可能是由于较低的敏感性m .隐姓埋名的女人或由于生命周期的差异，线虫暴露于凝集素的程度较低。我们的结果与Ripoll等人的结果一致。[34]，表达了一种来自雪花莲植物的甘露糖结合凝集素GNA (雪花莲)，在拟南芥和暴露于m .隐姓埋名的女人j2。9个品系中只有3个品系的瘿数明显低于WT株系(20 - 50%)。此外，另一种真菌凝集素(SRL)的表达最近被证明可以为番茄植株提供保护m .隐姓埋名的女人［35］．在转基因番茄系中观察到的瘿虫和雌线虫数量的减少与我们的结果相似。

食叶虫的危害p .蛾它是十字花科蔬菜中最具破坏性的害虫之一，每年造成的损失估计超过50亿美元[36，37］．因此，控制这些害虫需要特别注意，以维持和提高粮食生产。结果表明在足底MOA的表达具有保护作用p .蛾幼虫。幼虫易受MOA的影响，与wt喂养的幼虫相比，它们体重增加较少，死亡率较高。到目前为止，抗小菜蛾的转基因作物是基于转基因技术的苏云金芽孢杆菌cryIA(b)基因(38]但哺乳动物和病毒的凝集素已被证明对这种害虫有一定的毒性[39，40］．据我们所知，我们的研究是真菌凝集素毒性的第一个证据p .蛾．这些结果与其他真菌凝集素的报道一致。辣椒凝集素(RSA;β-三叶型凝集素)和美国rolfsii植物血凝素(SRL;放线菌孔蛋白型凝集素)，对农业上重要的草食性昆虫如棉叶虫有很大的毒性Spodoptera littoralis而且美国litura［41，42］．有趣的是，表达srl的植物也表现出对吸吮和咀嚼昆虫的抗性美国litura而且Myzus persicae［43］．因此，转srl的棉花表现出较高的抗性蚜虫棉(人口减少69%)和美国litura(幼虫死亡率100%)[44］．这些研究表明，MOA可能提供保护，以抵御其他昆虫食草动物。

需要进一步的实验来阐明MOA的作用机制和特异性。毒性秀丽隐杆线虫依赖于凝集素和嵌合凝集素的蛋白酶结构域[27］．发现植物寄生线虫和食草昆虫的作用机制是否相同将是有趣的。在这方面，丝氨酸蛋白酶Sep1从芽孢杆菌firmusDS-1最近被证明具有杀线虫活性m .隐姓埋名的女人．在500µg/ml时，纯化蛋白对J2动物的死亡率为50.36% [45］．为了确定特异性，将moa转基因植物暴露在更广泛的昆虫食草动物中，如咀嚼树叶和吸吮汁液的昆虫。

综上所述，我们的研究结果表明，表达moa的拟南芥植物对几种重要经济害虫的抗性增强:毁灭性的植物寄生线虫h . schachtii而且m .隐姓埋名的女人还有食草昆虫p .蛾．我们认为，蘑菇凝集素MOA在抗虫/线虫转基因作物工程中具有很高的应用潜力。

植物生长条件

野生型拟南芥Columbia-0 (Col-0)从英国诺丁汉拟南芥种群中心获得。野生型和转基因植物被播种到Jiffy人造土壤(Jiffy International AS，挪威)。在4°C下分层3天后，将植物转移到以下条件下的生长室:22.5°C/19°C昼夜温度，光照16 h(光子通量密度为100 μ mmol m)⁻²年代⁻¹)，相对湿度为60%。为了评估转基因植物的根结构，对种子进行表面消毒[46]，在上述条件下，在含有3%蔗糖的1 / 2 Murashige和Skoog (MS)培养基上生长。移栽至MS培养基14天后拍照。

植物表达载体的构建

利用Gateway R克隆技术(美国赛默飞世尔科学公司)，在CaMV 35s启动子的控制下，构建了一个表达c端flag标记的MOA。使用pET-22b(+)质粒(Merck Millipore Novagen, USA)的基因特异性引物(MOA- fw: 5 ' - caccatgtctctgcgacggg -3 '和MOA- rev: 5 ' -GTAGAAGGCCATGTAGCTGTC-3 ') pcr扩增MOA的开放阅读框。将PCR产物导入pENTR载体(pENTR™/D-TOPO™Cloning Kit, Thermo Fisher Scientific, USA)，将反应产物转化为具有化学活性的TOP10大肠杆菌细胞。菌落PCR检测阳性菌落(Biometra，德国)。DNA序列经测序确认(Eurofins Genomics, Germany)。将获得的入口质粒重组到二进制Gateway表达载体pB2GW7 [47]，利用LR反应(Gateway™LR Clonase™II酶混合物，赛默飞世尔科学，美国)。经菌落pcr鉴定的二元表达质粒(35 S:: MOA-3xFLAG)变成了根癌土壤杆菌冻融法分离菌株GV3101 [48］．

拟南芥中MOA的表达

根癌土壤杆菌利用花浸法进行WT植物的-介导转化，如所述[49］．转化植株在含15µg mL的MS培养基上鉴定⁻¹(Basta®，拜耳作物科学公司，德国)。将健康的幼苗移栽到土壤中，用标准免疫印迹法测定蛋白质表达水平。简单地说，收集了30毫克四周树龄的植物组织，并在液氮中冷冻。在1.5 ml Eppendorf®试管(Eppendorf，德国)中冷冻组织，包含两个3毫米的玻璃微珠，用搅拌机(Retsch®MM400, Retsch Technology GmbH，德国)以30 Hz调磨3分钟。随后，在试管中加入90µL预热的Laemmli缓冲液(375 mM Tris-HCl, pH 6.8, 37%甘油，0.06%溴酚蓝钠盐，12%十二烷基硫酸钠和5% β-巯基乙醇)。样品在95°C下搅拌(1400rpm)孵卵10分钟，并以最大速度(14000 rpm)离心10分钟。蛋白质浓度由Pierce™BCA蛋白检测试剂盒(美国赛默飞世尔科学公司)估算。10µL上清液(2µg mL⁻¹为粗提物)用于SDS-PAGE。分离的蛋白质用Mini Trans-Blot®Cell (Bio-Rad Laboratories, California, USA)转移到硝化纤维膜(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)。用于免疫印迹，用3%牛奶在TBST缓冲液(150 mM NaCl, 10 mM Tris, 0.1% (v/v) Triton X-100, pH 7.6)中阻断膜。抗flag一抗(1:1000;单克隆抗flag M2-过氧化物酶(HRP)克隆M2， (Merck KGaA, Germany)用于检测flag标记蛋白。使用Pierce™ECL Western Blotting底物(美国赛默飞世尔科学公司)和辣根过氧化物酶(HRP)进行印迹发育。信号检测采用ImageQuant Las 4000 (GE医疗生命科学，美国)。转基因种子表面消毒[46］．种子在½Murashige和Skoog培养基(MS)上生长，并添加适当的选择标记，在所述条件下培养。从培养基中取出3周大的幼苗，用30mg新鲜组织按上述方法测定各株系叶片和根中的表达水平。从42株转基因植物中，选择了3个独立的系进行进一步实验。选用草甘酸铵代T3植株进行表达分析和抗病试验。

异皮线虫属schachtii砧木培养和侵染试验

拟南芥种子(Col-0和MOA L1-3)在70% (vol/vol)乙醇中表面消毒1 min，在2.8% (w/v)次氯酸钠中浸泡8 min，然后在无菌蒸馏H中洗涤3次3 min₂晾干了一夜。在添加3%蔗糖和10 mg L的选择性MS培养基上培养⁻¹该方法。WT植株在缺乏草甘酸铵的MS培养基上生长。5天后，将健康的幼苗移至含有0.2浓度、添加2%蔗糖的改良Knop培养基[29]并转移到24°C光照18小时的生长室中，再培养7天(共12天)。每行6个板，每板8株。实验重复了三次。

h . schachtii感染试验如前所述进行[50］．囊肿的h . schachtii都是从在体外在含2%蔗糖的0.2浓度Knop培养基上生长的芥菜根(Sinapsis alba ' Albatros ')的砧木培养[29］．用3mm ZnCl浸泡包囊刺激2期幼鱼(J2s)孵化₂．幼体用0.05% HgCl表面消毒₂2分钟，在无菌H中洗涤三次₂O和重悬在0.7% (w/v) Gelrite (Duchefa，荷兰)。接种前，按所述方案估算各株系的总根长[51］．为了进行侵染试验，每株植株用30只刚孵出的幼虫侵染12天大的植株，随后在黑暗中过夜，转移到21°C的生长室，昼夜循环12小时/12小时。接种线虫14 d后评价线虫侵染情况。计算总雌、雄数，计算每根cm的雌、雄数。

有隐姓埋名的女人培养和感染试验

m .隐姓埋名的女人以番茄饲养(茄属植物lysopericum简历。奥斯卡)植物[52]在温室条件下生长，昼夜周期为15:9 h;24±2°C，相对湿度60%。在去除番茄根部的沙土后，在雾室中刺激J2s孵化并提取。孵化的J2s收集超过一周，并保存在4°C。在倒置光学显微镜上使用40倍放大倍数进行J2定量和线虫悬浮液的制备。

拟南芥种子(Col-0和MOA L1-3)在含15µg mL的MS培养基上预发芽⁻¹该方法。将健康的幼苗移栽到含有银砂:土壤(4:1;v/v)，生长条件为22°C，相对湿度为60%，昼夜循环为16:8 h。用水为1:1000 h的高压自来水₂O:肥料稀释度(v/v;Wuxal, Hauert，瑞士)。三周大的植物暴露在200 J2s的m .隐姓埋名的女人．在35dpi时，仔细清洗根以去除底物，在1%食用色素Ponceau 4R (E 124)中孵育10分钟，在自来水中鄙视15分钟。在立体声双目解剖显微镜下以30倍放大倍数计数卵块[53］．同样的根被评估为胆的形成。实验重复了两次，得到了相似的结果。

昆虫食草动物毒性试验

以叶类草食动物为实验对象，研究了MOA对其食性的影响。小菜蛾．以转基因植株和野生型植株为饵料，评价了幼虫的生长性能和成活率。p .蛾鸡蛋由先正达(瑞士先正达作物保护公司)提供。鸡蛋用人工饲料饲养，饲料中含有;16%甜菜粘虫饲料，1%美国农业部维生素预混料，金四环素200µg mL⁻¹(美国前沿农业科学)和1%琼脂(Merck KGaA，德国)，在24°C, 60%相对湿度，16小时光照/ 8小时暗光周期的条件下。为了进行食虫试验，转基因和野生型植物分别在土壤(Klasmann-Deilmann GmbH, 49，德国)中单独盆栽(盆栽Ø 6厘米，5.5厘米高;Pöppelmann，德国)在22.5°C白天/19°C夜间温度和18 h光周期下(光子通量密度100 μ mmol m⁻²年代⁻¹)，相对湿度为60%。5周龄植株(每系8株)与5个预称重的二龄幼虫接触一周。然后，收集幼虫并称重，以确定它们的存活率和个体相对增重。实验重复了三次。

统计分析

使用Microsoft Excel和GraphPad Prism 8.0.2版(GraphPad Software, Inc.， USA)进行统计分析。进行单因素方差分析，以确定处理与对照组之间的显著差异。Dunnett 's检验被用于在不同品系和处理之间进行多次比较。星号表示差异有统计学意义(*** .;P≤0.001，**P≤0.01，*P≤0.05)，ns(不显著)表示P> 0.05。

本研究结果的原始数据可向通讯作者索取。

英国电信(Bt):

苏云金杆菌

农业部:

Marasmius山岳女神凝集素

CGL1:

Coprinopsis灰质Galectin1

CGL2:

c .灰质Galectin2

CCL2:

c .灰质lectin2

PLCPs:

类木瓜半胱氨酸蛋白酶

口号:

细菌晶体毒素

OE:

超表达

J2:

阶段的青少年

李:

行

WT:

野生型

玲娜:

雪花莲植物血凝素

RVL:

Remusatia只植物血凝素

生存研究实验室:

美国rolfsii植物血凝素

RSA:

辣椒凝集素

AM获得了瑞士政府外国学者优秀奖学金(瑞士国家教育、研究和创新秘书处)的支持。我们非常感谢伯尔尼大学植物科学研究所的园丁克里斯托弗·鲍尔和贾斯敏·塞库洛夫斯基对植物的照顾。我们也感谢Chiara Durrer的技术支持。

FM是由瑞士国家科学基金会(批准no。31003 a_129696)。MK是由瑞士国家科学基金会(批准no。31003 a_173097)。CR是由瑞士国家科学基金会资助的。310030 _189071)。KW由奥地利科学基金(FWF, no.;29620页- b25)。

从属关系

1. 瑞士弗里堡大学生物学系

   Aboubakr Moradi & Felix Mauch

2. 奥地利维也纳自然资源与生命科学大学作物科学系植物保护研究所

   Tina Austerlitz & Krzysztof Wieczorek

3. 瑞士果蔬生产中的植物保护、植物病理学和动物学研究部，农业镜，Wädenswil

   保罗Dahlin

4. 瑞士伯尔尼大学植物科学研究所

   Christelle AM Robert, Corina Maurer, Katja Steinauer, Cong van Doan和Paul Anton Himmighofen

5. 气候变化研究中心，伯尔尼，瑞士

   克里斯特尔AM罗伯特

6. 瑞士ETH生物学系微生物研究所Zürich, Zürich

   马库斯Kunzler

贡献

AM: MOA表达转基因拟南芥植株的制作、项目策划、数据分析、稿件撰写;PD:疾病抗性试验m .隐姓埋名的女人；KW和TA:抗感染试验h . schachtii；CR, CM, KS, CD, PA和AM的饲喂试验p .蛾；MK:提供MOA cdna;项目策划及稿件撰写;FM:项目督导、策划、稿件撰写。作者阅读并批准最终的手稿。

相应的作者

对应到Aboubakr Moradi或马库斯Kunzler．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有利益冲突。

出版商的注意

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