LncRNA tcon_00021861在功能上与水稻的耐旱性相关(gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba通过内源性RNA的竞争性调控gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

水分亏缺是一种非生物胁迫，会阻碍植物生长，使作物生产不稳定。长链非编码rna (Long non-coding RNAs, lncrna)是一类非编码的内源性rna，参与植物的各种细胞过程和应激反应。lncrna具有竞争性内源性rna (competing endogenous RNAs, ceRNA)的功能，代表了一种新的基因调控层。然而，lncrna作为ceRNA在干旱胁迫反应中的调控机制尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，我们对水稻中的干旱响应lncrna进行了转录组范围的鉴定。随后，我们基于ceRNA假设，通过分析mrna与lncrna之间的竞争关系，构建了一个lncrna介导的ceRNA网络。获得了40个lncRNAs, 23个miRNAs和103个mRNAs组成的干旱响应ceRNA网络。网络分析显示，tcon_00021861 /miR528-3p/YUCCA7调控轴是参与干旱响应的枢纽。通过RT-qPCR和RLM-5'RACE验证mirna靶蛋白的表达和相互作用。tcon_00021861呈显著正相关(gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.7102)与YUCCA7呈负相关，与miR528-3p (gydF4y2BargydF4y2Ba= -0.7483)。tcon_00021861的过表达减弱了miR528-3p对YUCCA7的抑制作用，导致IAA(吲哚-3-乙酸)含量增加，生长素过剩表型增加。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

TCONS_00021861可以通过吸附miR528-3p来调节YUCCA7，而miR528-3p反过来激活IAA生物合成途径并赋予水稻抗旱性。我们的发现为lncRNAs作为ceRNAs在水稻抗旱性中的调节作用提供了新的视角。gydF4y2Ba

大米(gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba(L.)是世界上主要的主食作物，而且极易受缺水的影响。干旱胁迫是水稻生产的一个限制因素，在过去的几十年里造成了水稻产量的严重损失。植物可以通过调节多种信号通路来适应胁迫，其中非编码rna起着至关重要的作用[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

长非编码rna (Long non-coding RNAs, lncRNAs)是一种长度大于200 bp且无明显编码潜能的多种ncRNAs。lncrna在植物的几乎每一个生物过程中都发挥着广泛的作用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．RNA测序技术为转录组学研究提供了强大的工具，并揭示了模型植物和作物植物(如拟南芥)的lncrna [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)、小麦(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，玉米[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)、大米(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),gydF4y2BaMedicago truncatulagydF4y2Ba［gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．特别是在水稻中发现了许多应激应答的lncrna。lncrna被发现介导抗病原体免疫[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba以及对干旱等非生物胁迫的反应[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba],盐度[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，重金属[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]营养缺乏[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

竞争性内源性RNA (ceRNA)是一种广泛应用的lncRNA基因调控类型。lncrna作为潜在的ceRNAs，携带microRNA响应元件(MREs)，因此它们与mrna竞争共享的miRNA，从而调节miRNA介导的基因沉默。第一个ceRNA是在拟南芥中报道的，该研究发现了一个内源性的lncRNA, IPS1(由磷酸盐饥饿1诱导)。IPS1作为miR399的目标模拟物，抑制miR399诱导的PHO2裂解，这调节磷酸盐积累[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

许多lncRNA作为内源性miRNA靶模拟物(eTMs)在植物中已经被鉴定出来。lnc_253和lnc_973可能是棉花盐胁迫下miR156e的eTMs [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．在番茄中，lncRNA23468作为ceRNA通过诱骗miR482b调控NBS-LRR基因gydF4y2BaPhytophthora Infestans.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．Feng等人分析了Cd胁迫油菜中的lncrna，并确定了67个lncrna作为36个Cd响应mirna的竞争靶模拟物[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．在豇豆中，lncRNA_1231在开花过程中通过靶拟态的方式隔离miR156b，导致花特异性SPL-12转录因子表达增加，调控花的发育[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．lncRNA39026作为miR168a的eTMs，可能诱导mirna上调SlAGO1，增强对疫霉菌的耐受性[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]．在木薯中，linRNA159和linRNA340被预测为低温胁迫下miR164和miR169的靶模拟物[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．在冬小麦中，发现lncrna与miR398竞争性结合，调节CSD1的表达，提高抗寒性[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]然而，只有一小部分lncRNAs在实验和功能上得到了表征。gydF4y2Ba

在本研究中，我们系统分析了水稻干旱响应lncrna的转录景观，以识别差异表达的lncrna、mirna和mrna。根据ceRNA假设构建了一个去监管lncrna相关的ceRNA网络。一个ceRNA调控三联体被鉴定、验证和功能特征。最后，建立基于lncRNA-miRNA-mRNA-IAA信号通路的假设模型，揭示lncrna在干旱响应中的作用。我们的发现可能为lncrna在干旱响应调控中的作用机制提供了新的思路。gydF4y2Ba

干旱胁迫下水稻的转录组测序gydF4y2Ba

对对照和PEG处理的水稻幼苗进行高通量对端测序(Illumina)。6个样本共获得57864万条原始reads。结果表明，经过筛选筛选，共获得56411万条reads，其中93.79%的reads被定位到参考序列上。cufflink 2.0共重建了301,926个转录本。我们获得了542个高可信度的推测lncrna，包括48个内含子lncrna, 331个反义lncrna和163个基因间lncrna。大多数lncrna位于FPKM值1-10之间。箱形图(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa和c）说明了LNCRNA，mRNA和miRNA的表达水平的总分布。在图2中给出了LNCRNA密度分布。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad.如图所示gydF4y2Ba1gydF4y2Bae中，大部分(93.81%)的lncrna长度为201-1900 bp, 93.47%的lncrna外显子不超过3个(图3)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf).短的转录本长度和低的外显子数是lncrna的两个共同特征。gydF4y2Ba

lncrna, mirna和mrna的表达谱gydF4y2Ba

用截止日志分析了递发表达式gydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC > 1和调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05。DE lncrna、mirna和mrna在火山图中显示(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa)和热图(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).与对照组相比，PEG处理组共鉴定出98个DE-lncRNAs(64个上调，34个下调)，57个DE-miRNAs(34个上调，23个下调)和7020个DE-mRNAs(3222个上调，3798个下调)。gydF4y2Ba

在水稻叶片中构建了ceRNA网络gydF4y2Ba

为了评价干旱胁迫水稻中lncrna相关的ceRNA相互作用格局，我们根据“ceRNA假说”构建了如下的lncRNA-mRNA-miRNA网络:gydF4y2Ba

首先，分别通过核苷酸序列和共表达值预测mirna与靶标的相互作用。共获得4739个miRNA-mRNA和381个miRNA-lncRNA相互作用。根据表达值的Pearson相关系数确定lncRNA - mRNA的相互作用。gydF4y2Ba

接下来，使用ceRNA评分对ceRNA进行过滤，ceRNA评分定义为共享mrna和lncRNA之间的MREs数量与lncRNA MREs总量的比值。对于一个给定的lncRNA-miRNA-mRNA三元组，mrna和lncrna都是靶向的，并且与一个共同的miRNA共同负表达。共鉴定出2727个lncRNA-miRNA-mRNA三联体，由72个lncrna、44个mirna和257个mrna组成。gydF4y2Ba

最后，为了使网络更加简洁和健壮，我们通过文献挖掘和功能注释进一步筛选了103个干旱响应的关键DE mrna。基于选择的参与干旱反应的mrna，我们构建了一个由180个lncRNA-miRNA-mRNA三联体组成的网络，其中包括40个lncrna, 23个mirna和103个mrna(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

具有高连通性的集线器节点对网络非常重要。在我们的分析中，轮毂被定义为具有最高度的节点。发现度最高为15的miR528-3p是网络的核心组件。在miR528-3p参与的mRNA-lncRNA共表达中，相对于YUCCA7 (LOC4331709, indole -3-丙酮酸单加氧酶)的tcon_00021861与YUCCA7 (LOC4331709, indole -3-丙酮酸单加氧酶)的正相关性最显著(gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.89,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.016)。因此，我们选择tcon_00021861 /miR528-3p/YUCCA7三元组进行进一步的功能研究。gydF4y2Ba

RT-qPCR证实了干旱应答lncrna的差异表达gydF4y2Ba

RT-qPCR检测tcon_00021861、miR528-3p和YUCCA7的表达水平。与对照样品相比，经PEG处理的样品中，tcon_00021861和YUCCA7表达下调，而miR528-3p表达上调(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一种）。结果与LNCRNA测序一致。然后，我们评估了TCons_00021861，MiR528-3P和YUCCA7之间的相关性。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab, tcon_00021861与YUCCA7呈显著正相关，与miR528-3p表达水平呈负相关，支持ceRNA假说。gydF4y2Ba

RLM-5'种族证实了miR528-3p对TCON_00021861和YUCCA7的切割gydF4y2Ba

通过RLM-5 ' RACE实验验证了miR528-3p与靶蛋白tcon_00021861和YUCCA7之间的相互作用。对rcm -5’RACE PCR产物进行测序后发现，tcon_00021861和YUCCA7在互补的miR528-3p序列中都有特异性的剪切位点(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac） 。gydF4y2Ba

tcon_00021861特异性隔离miR528-3p，上调YUCCA7gydF4y2Ba

为了验证tcon_00021861是否能够通过诱骗miR528-3p来调控YUCCA7，我们过表达了tcon_00021861 /miR528-3p，同时获得了3个独立的转基因品系。qPCR检测转染效果。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad，过表达tcon_00021861诱导YUCCA7水平升高。而miR528-3p过表达降低了YUCCA7的水平，同时过表达tcon_00021861可以挽救YUCCA7的下降。综上所述，数据表明tcon_00021861通过隔离miR528-3p是YUCCA7的正调控因子。gydF4y2Ba

tcon_00021861与miR528-3p相互作用调控IAA通路gydF4y2Ba

由于已知YUCCA7调控IAA合成，我们推测tcon_00021861可能通过ceRNA参与IAA生物合成途径。为了验证这一假设，我们使用过表达tcon_00021861 /miR528-3p的转基因品系进行IAA含量分析。采用高效液相色谱法测定IAA含量。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2BaE，转基因植物的IAA水平显着增加，其过表达TCons_00021861，但在过表达MIR528-3P的植物中明显降低。然而，在转基因水稻过表达TCONS_00021861和MIR528-3P的转基因水稻中没有观察到明显的IAA变化。gydF4y2Ba

tcon_00021861 /miR528-3p/YUCCA7相关性分析发现IAA含量与tcon_00021861正相关(gydF4y2BargydF4y2Ba = 0.83), YUCCA7 (rgydF4y2Ba= 0.93)，与miR528-3p呈负相关(gydF4y2BargydF4y2Ba= -0.70)(图gydF4y2Ba4gydF4y2Baf).因此，我们假设tcon_00021861在干旱处理下可能起到上调YUCCA7浓度的作用，从而进一步提高IAA水平。gydF4y2Ba

过表达tcon_00021861缓解干旱诱导的生长减少和ROS积累gydF4y2Ba

通过测定植物生长指标，研究tcon_00021861和miR528-3p对水稻抗旱性的影响。用过表达tcon_00021861 /miR528-3p的转基因株系进行生长观察。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA-e，干旱胁迫对植物生长的影响主要表现在叶片和根系长度上。与WT相比，过表达tcon_00021861根干重、叶干重、根长和叶长分别增加10.37%、4.38%、12.19和9.88%。miR528-3p过表达组的指数不变地下降(从7.85下降到18.25%)。而在tcon_00021861和miR528-3p共同过表达时，生长指数由4.05降低至18.76%。gydF4y2Ba

两种主要的ROS, HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba•gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba进行了定量测定。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Baf, PEG处理前，HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba•gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba野生型和转基因株系的积累量相对较低，且差异不明显。而干旱胁迫显著增加了HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，尤其是在miR528-3p过表达谱中。同时过表达tcon_00021861和miR528-3p在HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．在tcon_00021861过表达系中，HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba•gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba积累(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bag)。结果表明，过表达tcon_00021861减轻了ROS物种的积累。gydF4y2Ba

有趣的是，TCons_00021861中增强的IAA含量过表达植物与增强的生长指数和降低的ROS含量一致（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae)，说明tcon_00021861可通过IAA信号通路缓解干旱诱导的生长阻滞和ROS积累。gydF4y2Ba

通过透射电子显微镜（TEM）超微结构gydF4y2Ba

利用透射电镜观察叶肉细胞的超微结构。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA，在对照组中，叶肉细胞的形态似乎是正常的。叶绿体是椭圆形的。基底囊体片材整齐地堆叠并与间质囊体连接，并且包膜完好无损。线粒体的形状是规则的，具有清晰的双膜和管状刺。细胞核与澄清和完整的核仁椭圆形。gydF4y2Ba

然而，在干旱胁迫组，观察到许多典型的损伤迹象（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)特别是在叶绿体、线粒体中，包括细胞和叶绿体膜的破坏、线粒体肿胀、叶绿体球状、类囊体排列紊乱和颗粒堆积厚度减少。原子核相对稳定，变形轻微。部分原子核熔化，变成一个空的原子核。gydF4y2Ba

与干旱胁迫组相比，tcon_00021861过表达组的细胞器受影响较小(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac） .叶绿体的形状略有改变，基粒堆积保持完整，表明TCONS_00021861过表达后细胞损伤减轻。在miR528-3p过表达组（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaD)，细胞和叶绿体膜被扭曲。叶绿体超微结构破坏的迹象是基粒片层解体，嗜锇颗粒增多。tcon_00021861与miR528-3p共表达时，如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2BaE，干旱胁迫下的损伤效果与对照相似，包括线粒体肿胀和叶绿体膜破坏。但与miR528-3p过表达株相比，嗜氧颗粒数量减少，类囊体排列相对正常，损伤程度相对较小。gydF4y2Ba

水资源的减少是水稻生产质量和数量面临的主要挑战。lncrna是应对非生物胁迫的重要调控成分。之前的研究已经通过高通量测序在一组植物物种中明确了lncrna的特征[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

通过靶点模拟分离miRNAs代表了lncRNAs的重要转录后调节功能[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．有报道称几种lncRNA作为eTMs作用于植物在各种非生物胁迫下[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]然而，大多数基因仅仅通过表达相关性和生物信息学预测来鉴定。lncRNAs的详细调控机制仍不清楚。gydF4y2Ba

本研究为lncrna在植物抗旱性调控中的作用提供了系统的视角gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba．通过高通量筛选和生物信息学分析，全面整合lncRNA-miRNA-mRNA相互作用网络。gydF4y2Ba

利用RNA测序技术，我们根据严格的标准鉴定了542个独特的lncrna，这些lncrna构成了一组可信的水稻lncrna。其中，我们鉴定了98个在干旱胁迫下差异表达的lncrna。gydF4y2Ba

为了研究lncrna作为cerna的可能功能，我们考虑了miRNA调控模式的相似性和表达的相似性，构建了lncRNA-miRNA-mRNA的潜在调控网络。然后我们根据文献和功能注释筛选关键DE mrna。结果，一个由40个lncRNAs, 23个miRNAs和103个mRNAs组成的干旱响应ceRNA网络被构建。tcon_00021861 /miR528-3p/YUCCA7三元组位于ceRNA网络的枢纽，相关度最高，正相关最显著。然后我们探讨了tcon_00021861 /miR528-3p/YUCCA7三联体的综合功能景观。gydF4y2Ba

关于miR528和YUCA（YUC）家族成员的抗旱性已有多个报道。miR528被发现解除调控，并参与调控甘蔗对干旱胁迫的防御反应[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]及小裙台[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba].编码黄素单加氧酶样酶的丝兰基因家族介导生长素的过度生产，赋予植物抗旱性。例如，丝兰7的激活增强了植物的耐旱性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]．转基因杨树植物[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]和马铃薯[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba表达YUCCA6表现出高生长素诱导的表型，并增加了对水分亏缺的耐受性。gydF4y2Ba

与之前的研究结果一致，本研究发现lncRNA tcon_00021861和YUCCA7在peg处理的水稻中共同表达并显著下调，而miR528-3p表达较对照组上调。通过RT-qPCR实验验证了它们的差异表达和协同调控(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).此外，tcon_00021861具有很强的正相关性(gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.7102)与YUCCA7呈强负相关，与miR528-3p呈强负相关(gydF4y2BargydF4y2Ba=−0.7483)gydF4y2Ba4gydF4y2Bab). RLM-5’RACE结果显示，tcon_00021861和YUCCA7与miR528-3p具有足够的序列互补性(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac） ，并可能通过共享MRE与miR-528-3p竞争结合。gydF4y2Ba

tcon_00021861 /miR528-3p/YUCCA7调控的可信度在转基因植物中得到进一步表征。tcon_00021861是YUCCA7的正调控子gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba这是因为在过表达tcon_00021861的转基因植株中，YUCCA7的转录水平相对于野生型升高。相比之下，过表达miR528-3p降低了YUCCA7的水平，同时过表达tcon_00021861可以挽救这种降低(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad).这些数据表明，tcon_00021861能够通过海绵化miR528-3p来调控YUCCA7的表达。gydF4y2Ba

IAA是丝兰家族成员合成的一种重要的植物生长素，在许多植物生长发育过程中起着重要作用，可以通过Trp依赖或Trp非依赖途径合成[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．基因组与功能研究gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba已经证明,gydF4y2Ba新创gydF4y2BaIAA的合成主要通过trp依赖途径。越来越多的证据表明YUCCA7参与trp依赖的IAA合成。YUCCA7催化TAM转化为NHT，这是多种植物生长素合成的限速步骤。功能分析显示，tcon_00021861可通过提高IAA的表达水平，诱导特征性生长素过度生产表型，而这一现象可被miR528-3p过表达逆转(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae).这些观察结果表明tcon_00021861在生长素生物合成中的可能作用。与这一观点一致的是，TEM观察到过表达tcon_00021861的转基因植株的叶肉细胞损伤减轻(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

进一步对IAA含量、tcon_00021861、miR528-3p与YUCCA7表达量进行相关性分析，确定其调控关系。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf、 IAA含量与TCONS_00021861以及YUCCA7表达水平之间存在显著的皮尔逊正相关，而miR528-3p则呈负相关，表明TCONS_00021861主要通过诱骗miR528-3p来调节IAA生物合成，并随后增加YUCCA7的水平。gydF4y2Ba

基于以上结果，我们提出了tcon_00021861 /miR528-3p/YUCCA7参与调控trp依赖途径IAA合成的模型(图)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．在这个模型中，干旱诱导了tcon_00021861的过表达，tcon_00021861作为miR528-3p的特异性诱饵，上调了YUCCA7。YUCCA7参与trp依赖的IAA生物合成，作为将TAM转化为NHT的限速步骤。YUCCA7的上调使得水稻在缺水条件下积累了更多的IAA，促进了生长素过剩的表型，最终使水稻具有抗旱性。gydF4y2Ba

综上所述，本研究构建了lncRNA-miRNA-mRNA相互作用的ceRNA调控网络，发现tcon_00021861与miR528-3p相互作用，是YUCCA7基因的正调控子。tcon_00021861的功能阐明，突出了其在调控IAA生物合成应对水分缺乏方面的重要作用，为了解lncrna在干旱响应中的机制提供了基础。gydF4y2Ba

水稻培养和干旱胁迫gydF4y2Ba

水稻品种(gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Bal .无性系种群。粳稻的履历。本研究使用的苏香3)购自中国江苏中农科公司。在光周期16/8 h、温度26°C /18°C(昼/夜)、相对湿度55%、光照强度250µmol m的温室中培养gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．6叶期幼苗在20% PEG 6000胁迫下生长48 h，模拟渗透势为-0.5 MPa的干旱胁迫。对照组在井灌条件下培养。gydF4y2Ba

图书馆建设与排序gydF4y2Ba

使用制造商的协议后，使用TrizoL（Invitrogen）从水稻叶中提取总RNA。对于每个样品，将1.5μgRNA用于随后的分析。Ribo-Zero™磁性套件用于去除RRNA。在Illumina Hiseq 4000平台上为150bp成对末端进行的股线特异性测序库，每个图书馆的深度为120万次。已链接到NCBI SRNA的股线RNA-SEQ数据，并获得了登录号SRP316304。gydF4y2Ba

测序数据分析gydF4y2Ba

从原始序列中去除适配器污染或多聚n和低质量序列(Q20 < 20)后，使用Tophat2将干净序列定位到水稻参考基因组[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，并使用袖扣组装(v2.1.1) [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba来构建转录组。CPAT [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]，CNCI[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]及CPC [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba并用于筛选具有编码潜能的转录本。去掉CPAT=“yes”、CNCI评分>和CNCI评分> 0的编码文本。gydF4y2Ba

RPKM法检测lncRNA和mRNA表达水平，TPM法计算miRNA表达水平。通过DEGseq(调整后)检测各组间差异表达gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value < 0.05和loggydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC > 1)。gydF4y2Ba

Cerna网络的建设gydF4y2Ba

基于核苷酸序列的mirna与靶点的相互作用由miRanda工具使用默认参数进行预测。通过计算miRNA-靶标对的皮尔逊相关系数(PCC)，确定了基于共表达的miRNA-靶标相互作用。PCC<-0.7和gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01进行进一步分析。因此，米兰达和共表达的重叠结果代表了一个候选miRNA‐靶对。gydF4y2Ba

基于ceRNA原理，我们计算一个常见mirna靶向的lncRNA-mRNA对的ceRNA评分，计算公式如下:gydF4y2Ba

使用匹配的lncRNA和mRNA表达谱的PCC分析lncRNA-mRNA的相关性。lncRNA-mRNA与PCC > 0.7和gydF4y2BapgydF4y2Ba < 0.01被认为具有潜在相关性。来自ceRNA评分和共表达的共享对被认为是真正的ceRNAs，然后使用Cytoscape软件（V.3.5.1）绘制[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba以可视化lncRNA-miRNA‐mRNA网络。gydF4y2Ba

中存在gydF4y2Ba

采用qRT-PCR分析miRNA、lncRNA和mRNA的表达水平。肌动蛋白基因作为内部对照，使用2 - ΔΔCt方法量化表达水平。所有PCR反应均经过3个技术重复和3个生物学重复。gydF4y2Ba

RNA连接酶介导的5 ' RACE(RLM-5 ' RACE)gydF4y2Ba

RLM-5 ' RACE使用5 ' -Full RACE试剂盒(Takara，日本)进行。简单地说，将5µg总RNA连接到RNA适配器上，然后使用Oligo (dT)引物和上标逆转录酶进行逆转录。采用3 '基因特异性引物和5 ' adaptor引物进行PCR。PCR产物克隆到pEASY-T1载体上，测序质粒DNA。gydF4y2Ba

载体建设和植物改造gydF4y2Ba

miR528-3p的PCR产物克隆到植物表达载体p1301-35 S-NOS的KpnI和PstI位点。扩增lncRNA全长序列并插入到pEASY-Blunt载体中。Sanger测序后，将正确的片段用XhoI和KpnI酶切，克隆到PMV2载体中。这些质粒通过花浸法转化到水稻植株中[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]．转染整个pMV2质粒作为阴性对照。T0转基因植株成熟。T1种子在含25 mg/L潮霉素的半MS培养基上发芽。采用tcon_00021861和miR528-3p特异性引物对T1代进行PCR分离分析。分别收获孟德尔分离比为3:1的独立T1系的T2种子，在含湿霉素的生根培养基上发芽。以缺失分离模式的T2幼苗为纯合株系，通过RT-PCR进行筛选和验证。在筛选出的T2阳性转化子中，目的转基因(简称LNC)表达量最高的纯合子系gydF4y2Ba_{5-1-4,gydF4y2Ba}米尔gydF4y2Ba_{9-1-2,gydF4y2Ba}信号+米尔gydF4y2Ba_{4-1-1gydF4y2Ba})用于随后的功能分析。gydF4y2Ba

生长指标、ROS、IAA、TEM测定gydF4y2Ba

在胁迫48小时后，根据叶片和根系的伸长和数量来评估生长gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba•gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba内容按照以前的研究方法确定[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]．取5 g叶片匀浆，甲醇和乙酸乙酯萃取，测定IAA含量。采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(250 × 4.6 mm, 5 μm)对提取物进行高效液相色谱分析。根据Ju等人的研究，获得了叶肉细胞的TEM图像(FEI Tecnai Spirit)。gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有数据采用SPSS v22.0进行分析。采用学生t检验比较两组数据的显著性差异。数据以三次重复计算的SD表示。gydF4y2Ba

RNA-seq数据已提交至NCBI SRA数据库，登录号为SRP316304 (gydF4y2Bahttps://trace.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra/?study=srp316304gydF4y2Ba).支持本文结论的其他数据集包含在本文及其附加文件中。gydF4y2Ba

龙头:gydF4y2Ba

内源性RNA竞争gydF4y2Ba

etm:gydF4y2Ba

内源性miRNA靶模拟gydF4y2Ba

国际宇航科学院:gydF4y2Ba

Indole-3-acetic酸gydF4y2Ba

lncRNA:gydF4y2Ba

长链非编码RNAgydF4y2Ba

绝笔:gydF4y2Ba

微反应元素gydF4y2Ba

那么使用RLM 5 'race:gydF4y2Ba

RNA连接酶介导的5'CDNA的快速扩增gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant 31770903) which has supported RNA-Seq analysis, Technology R&D Program of Suzhou (Grant SNG201905) which has supported RLM-5’ RACE analysis and Qinglan Project of Jiangsu Province, which has supported TEM analysis.

从属关系gydF4y2Ba

1. 苏州科技学院化学与生命科学学院，中国苏州科瑞路215011号1号gydF4y2Ba

   陈佳佳、钟玉清、辛琪gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

JC设计了实验并写了稿件。YZ进行了实验。XQ编辑了稿件。所有作者都阅读并批准了其内容。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

给陈佳佳的信件。gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

本研究使用的水稻品种购自中国江苏中农科公司。本研究对植物进行的实验研究符合机构、国家和国际准则。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可证获得许可，该许可证允许以任何媒体或格式使用、共享、改编、分发和复制，前提是您给予原作者和来源适当的信任，提供知识共享许可证的链接，并说明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可证中，除非在材料信用额度中另有说明。如果文章的知识共享许可证中未包含材料，且您的预期用途未经法定法规许可或超出许可用途，则您需要直接获得版权持有人的许可。要查看此许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba