Pará橡胶树(h .取代巴西橡胶树)乙烯刺激下的幼苗

背景

天然橡胶(独联体-1,4-聚ioprene, NR)是一种不可或缺的工业原料，从Pará橡胶树(h .取代巴西橡胶树)．天然橡胶因其优越的回弹性、弹性、耐磨性、高效散热性和抗冲击性而不能被合成橡胶化合物所取代。在天然橡胶生产中，乳胶是通过定期敲取树干树皮而获得的。乙烯增强和延长乳胶流动和乳胶再生。乙烯利是一种乙烯释放化合物，在攻胶前涂在树干上，通常会使乳胶产量增加1.5- 2倍。然而，过度轻拍和/或乙烯利过度刺激对树皮组织的强烈机械损伤会导致乳汁管细胞严重的氧化应激，这通常会导致轻拍面板干燥(TPD)综合征。为了在不引起TPD的情况下提高NR的产量，需要进一步了解Pará橡胶树中乙烯反应的分子机制。因此，我们以Pará橡胶树幼苗为模型系统，研究乙烯利处理下的基因表达。

结果

经乙烯利处理后，3270个基因的表达量与模拟处理相比有显著差异。与类胡萝卜素、类黄酮和脱落酸生物合成相关的基因在乙烯利处理后显著上调，这可能有助于增加乳胶流量。与次生细胞壁形成相关的基因下调，这可能是由于糖的供应减少。由于蔗糖是生产NR的重要分子，在NR的生产和植物生长的细胞壁形成和攻丝板伤口愈合之间可能会产生权衡。

结论

基因表达的动态变化发生在乙烯利处理的反应中。确定的某些基因可能有助于乳胶生产或TPD抑制。这些数据为理解乙烯刺激的机理提供了有价值的信息，并将有助于改进管理措施和/或分子育种，以从Pará橡胶树获得更高的乳胶产量。

天然橡胶(独联体1、4-polyioprene;NR)具有优越的回弹性、弹性、耐磨性、高效的散热性和抗冲击性，是合成橡胶无法替代的重要工业原料[1］．2019年天然橡胶产量占世界橡胶产量的47.2%(超过1360万吨，数据来自Statista网站[2])。几乎所有的商用NR都来自Pará橡胶树(h .取代巴西橡胶树)，种植于世界各地的热带和亚热带地区，但主要分布在东南亚。全球对橡胶的需求不断增加，促进了NR产量的增加。考虑到由于与其他重要作物的生产竞争和自然雨林的保护，很难扩大种植面积，需要进一步提高天然橡胶的单位面积产量。

乳胶是一种含有橡胶的细胞质成分，由乳汁管产生，乳汁管是高度分化的细胞，在Pará橡胶树的内部树皮中合成和存储乳胶。在天然橡胶生产中，乳胶是通过定期敲打树干树皮获得的。敲敲引起的树皮损伤诱导内源性乙烯的产生。乙烯是一种气体植物激素，参与调节植物的各种生物化学、生理和发育过程。乙烯在植物对伤害、草食和病原体感染的防御反应中的作用已被广泛研究[3.，4］．乙烯利是一种乙烯释放剂，可有效提高Pará橡胶树的胶乳产量，乙烯增产在世界各地橡胶树种植园中普遍采用[5］．在树皮上应用乙烯利可增强和延长乳胶的流动和再生，通常可使乳胶产量提高1.5- 2倍[5］．然而，过度轻拍和/或乙烯利过度刺激对树皮组织的强烈机械损伤会引起乳管细胞严重的氧化应激，这往往会导致Pará橡胶树的轻拍面板干燥(TPD)综合征。在TPD下，乳胶流动停止，橡胶颗粒原位凝固或组织深度退化可观察到[6，7，8，9］．TPD综合征的特征是两种类型的生理症状:乳胶流动的暂时停止和树皮的组织学变形。乳汁流动的停止是由乳汁管细胞中的活性氧(ROS)引起的，并在休息期间得到缓解[10］．树皮的变形严重影响乳胶的流动[11］．乙烯刺激对提高乳胶产量当然是有效的，而TPD是不可取的，因为它会导致乳胶产量严重降低。TPD的易感性是可变的和克隆相关的;乳胶产量低的无性系可能会受到乙烯的有效刺激，并耐TPD，而乳胶代谢高的无性系则更容易受TPD影响[11］．因此，需要一种攻丝和乙烯刺激的方法，以最大程度地诱导乳胶产量，而不引起TPD。为此，需要进一步研究Pará橡胶树乙烯反应的分子机制。

包括转录组分析在内的几种方法已被用于探索Pará橡胶树对乙烯反应的分子机制[11，12，13，14，15，16，17，18］．转录组分析是理解基因调控机制的有力手段。然而，先前的研究仅提供了关于Pará橡胶树中乙烯特异性事件的有限信息，因为乙烯利在一个种植园的成熟树木的敲除面板上使用了敲除前或敲除后，因此没有排除伤害的影响[15，19］．因此，必须建立一个适用于乙烯特异性反应分析的实验系统。本研究采用Pará橡胶树幼苗进行乙烯利处理和模拟处理，以获得具有时间依赖性的基因表达谱作为模型系统。与人工林中的成熟树种相比，Pará橡胶树的大量幼苗可以在温室和实验园中方便栽培，并且可以均匀处理。乙烯利处理后，基因表达谱发生了动态和特异性的变化。该研究为Pará橡胶树对乙烯的生化和代谢反应提供了有价值的信息，此外还建立了一个有助于研究胶乳生物学和橡胶生物合成的模型实验系统。

植物材料

Pará橡胶树(h .取代巴西橡胶树克隆PB260)种子采集于印尼北苏门答腊岛Serbalawan的PT.普利司通苏门答腊岛橡胶种植园。这些种子是在印度尼西亚坦格朗塞拉坦的技术评估和应用机构(BPPT)的实验温室中发芽和培育的。实验用的是大约6周大，约50厘米高的幼苗。在茎尖以下2-5厘米的茎区用2.5%乙烯利®(含24%乙烯利;)或蒸馏水(模拟对照)使用小刷子在9点左右在温室。在处理后的3个时间点(6、24和48小时)，收集处理后的茎区(3厘米长)，放入小塑料袋中，立即在液氮中冷冻，并在−80°C保存，直到用于RNA提取。

RNA提取，逆转录(RT)和定量RT- pcr

为了提取RNA，将茎段用臼和杵在液氮中研磨。研磨样品在含2% CTAB、2.5% PVP-40、100 mM Tris-HCl (pH 7.5)、25 mM EDTA (pH 8.0)、2 M NaCl和2% 2-巯基乙醇的CTAB试剂中均质，然后用氯仿:异戊醇(24:1,v/v)处理。水相与3 M LiCl在4℃下孵育过夜，然后RNA沉淀，溶液在4℃下13000 rpm离心20分钟。按照制造商的说明，用Plant RNeasy Mini Kit (QIAGEN)纯化颗粒。为了降解基因组DNA, RNA被重组DNA酶I (TAKARA Bio)处理。RNA的质量用安捷伦2100生物分析仪分析，使用RNA 6000 Nano Kit(安捷伦)。1微克RNA和2.5 μM oligo(dT)引物使用PrimeScript®RT试剂Kit (TAKARA Bio)进行反转录。将cDNA适当稀释，用Power SYBR®Green PCR Master Mix和Applied Biosystems 7300 Real - Time PCR System(赛默飞世尔科学公司)进行定量RT-PCR分析。用于每个基因的引物集列于表S1．

微阵列和数据分析

200纳米克RNA用于微阵列分析使用定制的微阵列h .取代巴西橡胶树根据制造商说明克隆PB260 (8 × 60k)(安捷伦)。使用单色法对每个样品进行3个生物重复分析。总信号值除以所有探针的中值，用于微阵列数据的全局归一化。使用Welch 's方法检验乙烯利和模拟处理之间差异的统计显著性t以及。差异表达基因(DEGs)被选为在乙烯酮处理的样品中诱导10倍以上的基因P在任意时间点< 0.01。相应的问值(20.]为0.0279、0.0155、0.0506;因此，我们认为错误发现率已经得到了充分控制。将收集到的3270个基因分为6组k-means默认设置下Cluster3软件的聚类[21］．在拟南芥TAIR10编码序列数据集上，通过BLASTX搜索将收集到的3270个基因定位到1775个非冗余的拟南芥基因座上，截断e值为0.00001 (https://www.arabidopsis.org/)，因为橡胶树中的基因注释信息不够充分。然后，利用R软件的二项检验功能，在内部数据库系统中安装自制程序，对拟南芥特定基因本体术语的丰富程度逐一进行评估。https://www.r-project.org/)．的P小于0.05为有统计学意义。所有自定义微阵列数据，包括平台数据已存入NCBI的Gene Expression Omnibus，注册号为GSE174832。

样品制备

对乙烯或乙烯利(乙烯释放化合物)反应的基因表达，此前已在成熟Pará橡胶树的胶乳或树皮中进行了分析[11，13，14］．然而，乙烯或乙烯酮特异性基因在未成熟树中的表达尚未见报道。相比之下，Duan等人(2010)用乙烯气体对3个月大的幼树进行无伤处理，分析了一组25个选定基因的表达[12］．在目前的研究中，我们使用了大约6周大的幼苗，通过微阵列分析来检测乙烯处理后基因表达谱的变化。橡胶树茎用乙烯利或水擦洗(模拟对照)。在处理后6和24小时，没有观察到明显的变化，而一些叶子在处理后48小时变黄和脓肿。这种反应被解释为乙烯诱导的衰老，是植物中典型的乙烯反应[22］．在处理后6、24和48小时，收集处理后的茎段进行微阵列分析。乙烯酮处理过的茎的乳胶渗出量远远高于模拟对照组(数据未显示)。综上所述，这些结果表明实验系统至少部分地成功模拟了乙烯刺激的生理和生化反应。

差异表达的基因集

在本研究中，我们使用自定义微阵列，每个转录本包含61657个探针，其中41656个探针与拟南芥基因序列同源。我们比较了乙烯利和模拟处理在每个采样时间点的表达水平，以评估乙烯利处理后基因表达谱的变化。结果表明，3270个基因在乙烯利处理和模拟处理之间表达差异显著(|倍变化|≥10在任何时间点;p< 0.01)。为了表征deg，我们将基因分为6组(G0 - G5组)K -方法聚类，并使用基因本体术语进行富集分析(图。1,表2)．大约三分之一的DEGs在乙烯利处理后上调，并被分为G0组或G1组。在乙烯利处理后6或24小时至48小时，G0基因表达持续上调，而G1基因从6小时开始表达上调，但随后在48小时几乎下降到对照水平。蛋白质激酶、应激反应和转录因子的基因在这些组中富集。在实验结束前持续下调的基因分为G2和G3。这些组含有许多与叶绿体相关的基因，并参与细胞生长。在治疗后48小时出现显著下调的基因被归类为G4。参与次生细胞壁生物合成或角质层发育的基因在该组中富集。最小的组是G5。该组基因在乙烯利处理后立即表达下调，在处理后24、48 h表达量基本下降至对照组水平。 Genes involved in amino acid transport and metabolic processes were enriched in G5. We examined the expression of the DEGs more extensively in the following analyses.

橡胶生物合成基因

天然橡胶主要由独联体-1,4-聚异戊二烯，这是一种由异戊二磷酸盐(IPP)衍生的异戊二烯基单元的聚合物。IPP是由胞质甲戊酸(MVA)途径和塑性2-合成的C-甲基- d -赤藓糖醇4-磷酸(MEP)通路[23］．前者被认为主要为Pará橡胶树橡胶生物合成提供IPP [18，24，25］．据报道，乙烯利处理不会刺激MVA途径，因此，乙烯利处理对提高产量的作用很小[5，26］．不出所料，未发现编码MVA通路相关酶的基因。某些基因，包括3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶还原酶，在乙烯利处理后略有下降，这与之前的报道一致[16］．然而，在MEP途径中，编码1-脱氧-d -木糖5-磷酸合成酶(DXS)和4-(胞苷5 ' -二磷酸)-2-的基因C-甲基- d -赤藓糖醇激酶(CMEK)在乙烯利处理后显著上调(图。2)．MEP途径被认为有助于类胡萝卜素生物合成中IPP的供应[24，27]，而DXS在这一过程中发挥了重要作用[28］．Upregulation的dx而且CMEK在遭受TPD的橡胶树中观察到，ROS在TPD下积累[17］．类胡萝卜素被认为具有抗氧化剂的作用，并被认为是ROS诱导的氧化应激的传感器或信号[27］．乙烯利处理后MEP通路基因的上调可能是为了产生清除ROS的类胡萝卜素。此外，植物产生其他抗氧化剂并控制ros清除系统以维持氧化还原稳态[29］．目前的微阵列数据揭示了超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽的phi和theta家族的下调年代-转移酶(GST)基因(表1)．为了克服氧化应激，GSTs是重要的，应该丰富。因此，编码GSTs植物特异性tau家族成员的基因在乙烯利处理下被高度诱导(表1)．GSTs的tau家族被认为与非生物胁迫反应有关，这些基因的过表达赋予了耐盐和耐渗透能力[30.，31］．这些结果表明，乙烯利处理诱导了氧化应激耐受的特定通路。

由MVA衍生的IPP聚合成独联体1,4-聚异戊二烯是由独联体-prenyltransferases(部署)。已有研究表明，cpt定位于橡胶粒子的表面[32］．此外，橡胶生物合成的两个重要蛋白群位于橡胶颗粒表面:小橡胶颗粒蛋白(SRPPs)和橡胶延伸因子(REFs) [33］．迄今为止，已经对两个橡胶树基因组进行了测序(Reyan7-33-97 in Tang et al. 2016;Lau等人的RRIM 600。2016)[18，25，每个蛋白质组的所有成员都已被揭示[18，25］．我们首先确认了这些基因对应的探针集包含在本芯片中，因为我们是根据橡胶树克隆PB260的完整cDNA测序数据设计的探针集，这与用于基因组测序项目的克隆不同。在我们的探针集中，CPT1、CPT2、CPT9、CPT11、REF2、REF4、REF6和SRPP10对应的探针由于这些基因的表达水平相对较低而没有被包括在内[25］．我们观察到只有一个基因SRPP4［25]被乙烯利处理诱导，而在DEGs中没有检测到编码CPT、SRPP或REF蛋白的其他基因(表S3.)．的基础表达水平SRPP4是低和乳汁分泌特异性基因(REF1，REF3，REF7,SRPP1)，其转录本在乳胶中含量丰富，占表达的96.8%裁判/SRPP乳胶中的基因[25]，未被乙烯利处理诱导。综合来看，结果表明乙烯利处理可能对橡胶的生物合成几乎没有直接影响，这与之前的报道一致[5，19，25］．

乙烯的生物合成和信号传递

在植物中，乙烯诱导乙烯生物合成相关基因的表达。例如，据报道，1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶基因的表达受正反馈机制的调控[34］．目前的微阵列数据揭示了基因的上调年代-腺苷-蛋氨酸合成酶和ACC合成酶在乙烯利处理后48 h表达量恢复到对照水平。目前的数据支持乙烯处理后乙烯生物合成的正反馈调节(表2)．

ABA的生物合成

目前的结果表明，在乙烯利处理后，MEP通路被激活，并为类胡萝卜素的生物合成提供IPP，这些类胡萝卜素可能有助于防止ROS。脱落酸(ABA)源自类胡萝卜素[27］．我们观察到乙烯利处理诱导了参与ABA生物合成的基因的表达，并抑制了参与ABA分解代谢的基因的表达(图。2)，这表明ABA的生物合成和积累从头开始。先前的研究证明乙烯诱导ABA生物合成[35，36］．因此，乙烯利处理产生的类胡萝卜素不仅可以提供抗氧化剂，还可以提供ABA的前体。众所周知，ABA诱导叶片脱落，乙烯在ABA存在时加速了这一过程[37，38］．我们观察到一些叶子在乙烯利处理后48小时发生脓肿(数据未显示)，这可能是由诱导的ABA引起的。

转运蛋白

脱落酸是在干旱胁迫下合成的，可以诱导气孔关闭，防止蒸腾引起的水分流失。先前的实验表明，ABA信号通路诱导了某些水通道蛋白，从而导致水导率和水势的增加[39，40，41，42］．乙烯利处理的一个显著反应是乳胶的延长流动。乳液流动时间延长可能是因为水通道蛋白介导的流入乳管细胞的水增加了[14，43，44，45］．在本研究中，乙烯利处理诱导了编码质膜固有蛋白(PIP) 1;2和1;5的基因表达，而PIP2;7和液泡体固有蛋白(TIP) 1;1的表达降低(表2)3.)．pip将水导入乳汁管细胞，因此乳汁管细胞的膨压增加[44]，而TIPs维持类酮膜的稳定性和/或细胞渗透平衡[46］．目前的研究结果表明，在乙烯利处理后，细胞内的水状态可能发生了显著的变化。

蔗糖是橡胶生产的重要分子，因为它是IPP的独特前体，预计会从周围细胞输入到乳汁管细胞中。先前的研究表明，乙烯诱导糖转运体的表达，这有助于提高乳胶产量[47，48，49］．从Pará橡胶树中克隆了6个编码蔗糖转运蛋白(SUTs)的基因[47，48，49］．我们观察到探针集与这些基因具有高的核苷酸序列一致性(~ 99%)。尽管之前的研究报道了某些SUT乙烯基因[47，48，49]，目前的微阵列分析检测到两个这样的基因下调(表3.)．此外，一些编码葡萄糖和/或蔗糖外排转运蛋白家族(SWEET)的基因被下调(见表3.)．除了这些转运蛋白外，编码一种糖转运蛋白(STP)和一种多元醇转运蛋白(PLT)的基因在乙烯利处理后被上调。stp是单糖/H⁺外质体和摄取己糖从外质体空间通过质膜进入细胞[50］．在高等植物中，蔗糖是用于碳源和碳汇之间分配的主要分子，并被直接运输到碳汇细胞中。其他情况下，蔗糖被细胞壁型转化酶(INVs)裂解为葡萄糖和果糖，这些单糖通过stp运输到细胞内[51，52］．目前的微阵列数据揭示了一种编码细胞壁型INV的基因的上调3.)，这表明在单糖摄取过程中可能共同上调stp和INVs。基因编码PLT，即多元醇/H，显著升高并持续诱导⁺在乙烯利处理的反应中，观察到定位于质膜或液泡体的转运体3.)．两个HbPLT基因(HbPLT1而且HbPLT2)已被鉴定出来，并已证实其对乙烯利反应的表达模式[53]，但目前的微阵列数据没有检测到这些基因的表达有显著变化。这些数据表明，在Pará橡胶树中，PLT基因对乙烯反应的表达可能存在组织和/或年龄依赖机制。

ABC转运蛋白是植物中最大的蛋白质家族之一，在拟南芥基因组中预测了130个基因[54］．鉴于ABC转运蛋白可转运多种类型的物质，包括无机化合物、植物激素、初级产物和脂类，植物ABC转运蛋白被认为在植物生长发育、解毒、响应非生物胁迫和抵抗病原体等方面发挥重要作用[54，55］．在遭受TPD的橡胶树中，ABC转运蛋白家族的许多成员被诱导表达[17］．我们在Pará橡胶树转录组中检测到46个ABC转运蛋白基因，其中4个已知被乙烯利处理后上调[56］．虽然没有观察到这些基因的表达有显著变化，但目前的结果显示，其他ABC转运蛋白的表达对乙烯利处理幼苗有高度反应(表2)3.)．一些编码假定定位在质膜上的ABCB蛋白的基因被下调，而编码假定定位在液泡膜上的ABCC蛋白的基因被上调(表3.)．属于ABCC群的转运体将叶绿素分解产物运输到液压层[57，58］．目前的微阵列数据显示，编码叶绿素酶(催化叶绿素降解的第一步)的基因强烈上调，参与光系统和叶绿素生物合成的基因下调(或不诱导)(图。3.、表4)．定量RT-PCR分析表明，所有模拟样品中与叶绿素酶对应的转录本均低于检出限。这些数据表明，乙烯利处理会导致叶绿素的降解和光合作用的抑制。3.)．大量的这些叶绿素分解产物将被ABCC蛋白运输到液压层。在乙烯诱导的衰老过程中，编码ABCC蛋白和叶绿素酶的基因协同调控可能有助于叶绿素的高效降解。

一些编码ABCG蛋白的基因被上调或下调(表3.)．拟南芥ABCG40 (At1g15520)，参与ABA的摄取[59，是由乙烯引起的[60］．一定的橡胶基因对应ABCG40乙烯利处理可上调基因表达;这种反应可能与ABA生物合成和积累相关基因的上调有关(图。2)．

类黄酮生物合成

在黄酮生物合成途径中，黄酮醇合成酶和二氢黄酮醇4-还原酶基因下调(图1)。4)．为了验证微阵列数据，用定量RT-PCR分析这些基因的表达。黄酮醇合成酶在模拟样品中表达量随模拟处理时间的增加而增加，而在乙烯利处理48 h后，黄酮醇合成酶表达量维持在较低水平，几乎没有增加。这些结果表明，乙烯利可以增加二氢槲皮素(DHQ)的产量。DHQ是一种强抗氧化剂，由于其抗氧化特性，增加了液泡膜的稳定性，并通过抑制离子通道降低膜的通透性[61］．因此，DHQ可能在对渗透胁迫特别敏感的类酮膜的稳定中起作用。轻敲引起的水流入乳汁管细胞，导致类糖酮破裂并释放其内容物;随后，橡胶颗粒和受损的类lutoids发生凝固，这将导致Pará橡胶树中用于伤口愈合和恢复的乳胶流动停止。因此，类酮的稳定性影响乳胶的流动[62］．然而，DHQ抑制膜氧化导致H⁺atp酶(61］．在本微阵列分析中，几个编码H⁺-ATPases被观察到(表5)．假设液泡体H⁺- atp酶被乙烯利处理激活[63]，目前的结果是合理的。H⁺- atp酶在类酮膜中发挥重要作用，在活跃的碳水化合物代谢过程中，通过将胞浆中的质子泵入类酮，维持适合于依赖于pH的酶(如INV)的细胞pH值，为乳胶生物合成提供碳源[63，64］．高产橡胶无性系具有较高的H⁺lutoids中的- atp酶[64］．这些反应将是防御和从敲击造成的伤害中恢复的自然机制。综上所述，乙烯利处理诱导的DHQ生物合成的增强可能通过激活橡胶生物合成的底物供应和通过稳定类酮膜和抑制凝血从而延长乳胶渗出来提高乳胶产量。基于这一假设，过量的开采和/或乙烯刺激可能会导致TPD的灾难性变化。

转录因子

在乙烯反应过程中，植物中各种基因的表达发生动态变化[65］．转录因子控制基因转录响应各种环境线索和发育因素。在目前的微阵列分析中，2641个探针检测到转录因子基因，其中236个位于DEGs(表S4)．某些转录因子家族，包括ERF、NAC和WRKY家族，参与了应激反应，乙烯利处理影响了这些基因的表达。

ERF家族是AP2/ERF超家族的主要组成部分，是一个庞大的植物特异性转录因子家族，成员被分为10个类群[66］．微阵列数据显示，属于IX组的基因在乙烯利处理后被高度上调2)．此外，第6、7、8、X组基因表达上调，第3、V组基因表达下调。

WRKY转录因子家族是植物特异性转录因子家族，参与非生物/生物胁迫反应，以及多种发育和生理过程[67，68］．在拟南芥中，ABA诱导两个WRKY转录因子(WRKY18和40)在生物和非生物胁迫下发生生理和功能上的相互作用[69，70］．在本研究中，乙烯利处理诱导WRKY18和40对应基因的表达(表6)．这一发现与基因表达的变化一致，表明乙烯利处理可能增加Pará橡胶树的ABA含量(图1)。2)．此前对拟南芥的研究表明，多个WRKY转录因子参与了叶片衰老的促进(WRKY6、53和75)或延缓(WRKY54和70)。WRKY75在衰老的叶片中诱导表达和敲除WRKY75结果表明WRKY75在拟南芥中表现为延迟衰老表型，这表明WRKY75是叶片衰老的正向调控因子[71］．目前的微阵列分析检测到WRKY53、70和75对应基因的上调。特别是对应的基因表达WRKY75乙烯利处理显著增加，并持续上调48 h(表6)．

NAC转录因子家族是一个植物特异性转录因子家族，由许多成员组成。NAC转录因子参与许多发育过程，包括应激反应和次生细胞壁形成[72］．的表达ANAC029是由叶片衰老诱导和基因直接调控的吗AAO3拟南芥中的表达[73，74］．增强表达AAO3增加ABA含量，可能导致叶片衰老过程中的叶绿素降解[74］．我们观察到乙烯利处理的反应中有类似的表达谱(图。2而且3.、表7)．调控次生细胞壁形成的NST1和SND2编码基因[75]，在乙烯利处理后表达下调(表7)．它们的下游基因，包括不规则的木质部（IRX)，也被下调了(表8)．因此，乙烯利处理可能会阻止茎的生长，包括木质部和/或纤维细胞的发育。

本研究的目的是评估Pará橡胶树对乙烯刺激反应的分子机制，目的是通过抑制TPD来提高胶乳产量。我们用幼苗建立了一个实验系统，并在治疗反应期间获得了全面的转录组数据。基于目前的结果，我们提出了乙烯利处理反应事件的示意图模型(图。5)．乙烯利处理诱导与类胡萝卜素产生相关的基因表达变化。类胡萝卜素及其下游产物ABA可诱导PIP基因的表达[27，38，39，40]，将水导入乳汁管细胞，从而增强乳汁的流动。此外，还观察到参与类黄酮生物合成的基因的表达变化，特别是与DHQ生成相关的基因。鉴于DHQ被认为有助于lutooid膜的稳定[61]时，胶乳渗出时间会延长，可能会抑制橡胶颗粒的凝固。这一系列分子事件可能与乙烯刺激引起的乳胶产量增加有关。鉴于类胡萝卜素和DHQ是已知的ROS清除物，乙酚诱导的参与它们生物合成的基因上调可能增强防御反应，有助于预防TPD。需要注意的是，乙烯是在Pará橡胶树受伤后产生的;因此，这些事件可能在敲击时自然发生，作为防御反应或伤口愈合。

乙烯利处理引起叶绿素降解，这是叶片衰老最典型的事件[76］．在本研究中，乙烯刺激48 h后，部分叶片变黄并脱落;因此，乙烯利处理可能导致叶片衰老。在受到过度敲打或乙烯过度刺激的tpd影响的树木中，可以观察到许多与衰老相关的基因的诱导[9，77］．因此，参与叶绿素降解的基因的上调可能是乙烯过度刺激引起的TPD综合征的一个指标。防止叶绿素降解和维持光合作用是蔗糖生产的重要环节，影响天然橡胶的生物合成。

结果表明，乙烯利处理可能影响形成层和/或乳汁管细胞的生长和/或分化。在本研究中，我们观察到与次生细胞壁形成相关的基因在乙烯利处理后48小时被高度下调。在木本植物中，次生细胞壁是重要的碳汇[78］．因此，这些结果表明，橡胶生物合成和乙烯刺激后的二次细胞壁合成之间存在碳供应的权衡。否则，次生韧皮部中次生细胞壁的形成或生物合成可能被异常调节，因为次生韧皮部坏死和次生韧皮部和薄壁组织中异常的细胞层也被观察到是不可逆TPD的症状[79，80］．

在这项研究中，我们证明了乙烯利处理引起了代谢、防御反应、生长和发育相关的多种基因表达的显著的积极和消极的变化。这表明，乙烯利处理除了引起与橡胶生产呈正相关的变化外，还引起了与橡胶生产负相关的变化和调节橡胶生产与其他事件之间的权衡。这些变化可能导致TPD的诱导，可由过度轻叩和/或乙烯刺激触发。研究结果为理解乙烯刺激机理提供了有价值的信息，并将有助于改进管理实践和/或分子育种，以从Pará橡胶树获得更高的乳胶产量。

本研究中分析的所有数据均可根据要求提供。所有自定义微阵列数据，包括平台数据已存入NCBI的Gene Expression Omnibus，注册号为GSE174832。

阿坝:

脱落酸

ACC:

1-aminocyclopropane-1-carboxylic酸

CMEK:

4 -(2 -胞嘧啶核苷5 ' -diphospho)C-methyl-D-erythritol激酶

CPT:

独联体-prenyltransferase

度:

差异表达基因

DHQ:

Dihydroquercetin

DSX:

1-deoxy-D-xylolose 5-phosphate合酶

GGPPS:

Geranylgeranyl二磷酸合酶

销售税:

谷胱甘肽年代转移酶

发票:

转化酶

IPP:

Isopentenyl二磷酸

议员:

2 -C-methyl-D-erythritol 4-phosphate

MVA:

甲羟戊酸

NR:

天然橡胶

皮普:

质膜内蛋白

PLT:

多元醇运输车

裁判:

橡胶延长因子

ROS:

活性氧

SOD:

超氧化物歧化酶

SRPP:

橡胶小颗粒蛋白

STP:

糖转运蛋白

SUT:

蔗糖转运蛋白

提示:

液泡膜内在蛋白

一系列问题:

开发板干燥

我们感谢Y. Takiguchi女士在微阵列分析方面的技术支持，以及BPPT工作人员在植物护理和技术支持方面的协助。我们感谢Edanz集团(https://en-author-services.edanz.com/ac)，以编辑此手稿的草稿。

不适用。

从属关系

1. 生物生产研究所，国家先进工业科学技术研究所(AIST)，筑波，茨城县，305-8566，日本

   中野吉美，三田信孝和铃木薰

2. 普利司通公司，东京讲堂，187-8531，日本

   井光平，森天培和渡边纪

3. 生物技术评估和应用机构，技术评估和应用机构，630号楼，印度尼西亚，西拉坦，丹格朗，普斯皮佩泰克区，15314

   Farida Rosana Mira & Syofi Rosmalawati

4. 日本先进工业科学技术研究所计算生物大数据开放创新实验室(CBBD-OIL)，东京，169-8555

   Kaoru铃木

贡献

YN, KI, FRM, SR, NW和KS设计了研究。YN、KI和FRM分别进行乙烯处理和样品采集。KI, TM和NW设计了微阵列。YN制备材料，YN和NM进行微阵列分析和数据分析。YN, NM和KS撰写了手稿。所有作者已阅读并认可最终稿。

相应的作者

对应到Kaoru铃木．

伦理批准和同意参与

所有方法都符合相关的机构、国家和国际准则和立法。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

开放获取本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献放弃书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

再版和权限