比较转录组和微生物群落测序提供了对黄叶表型的深入了解山茶

背景

叶色变异是植物的一种常见性状，在许多植物中都有广泛分布。在本研究中，一个叶片颜色突变山茶以马古仙子(Maguxianzi, M)为材料，通过生理、细胞学、转录组和微生物组分析揭示叶片颜色变化的机制。

结果

泛黄的c .粳稻(M)的色素含量低于亲本(华芙蓉，H)，尤其是叶绿素(Chl)和类胡萝卜素，叶片光合作用较弱。透射电镜(TEM)结果显示，M叶绿体中有破碎的类囊体膜，降解的类囊体粒，并充满许多囊泡。此外，比较转录组测序发现了3298个差异表达基因(DEGs)。KEGG注释分析结果显示，69个显著富集的DEGs参与了Chl生物合成、类胡萝卜素生物合成、光合作用和植物-病原相互作用。在此基础上，我们对H和M叶片的微生物多样性进行了测序。测序结果表明DidymellaM叶的细菌含量显著高于H叶的细菌含量，说明M叶可能被细菌侵染Didymella．

结论

因此，我们推测Didymella同时通过破坏叶绿体结构降低Chl和类胡萝卜素含量，改变光合作用强度，从而引起叶片黄变现象c .粳稻(M).本研究将对叶片颜色变化机制提供新的认识，为植物育种和分子标记奠定理论基础。

山茶(山茶L.)是该属的一种常绿灌木山茶花并广泛分布在世界各地。c .粳稻，是一种木质油料植物，主要用作食用油加工的原料[1］．山茶提取物广泛用于医学，常被用作抗氧化剂[2，抗肿瘤[3.]，抗菌[4]及抗病毒药物[5，6］．它能维持正常的胆固醇水平，保护肝脏[7］．山茶花是中国十大国花之一，因此，山茶树常用于园林绿化[8］．作为一种重要的观赏植物，C．粳稻有着悠久的人工驯化历史，经常被用作户外灌木和家庭盆栽植物。目前，据报道，全世界有32,000种栽培茶花[8，9］．一般来说，山茶的观赏价值主要归因于其独特的花瓣结构(单瓣、半重瓣和重瓣花)[10，11］．此外，茶花品种的叶子也用于观赏。

在高等植物中，绿叶的形成主要是由于叶绿素(Chl)的大量积累。高等植物Chl的合成受多个基因的控制，这些基因的突变导致各种叶片颜色突变体[12］．例如，豌豆的类囊体膜发育不良和叶片黄色表型是由病毒诱导的沉默引起的CHLI而且CHLD基因(13］．在过去的几十年里，叶子变黄的突变体，如Cucumis巨大成功［14，15，玉米[16，大米[17，小麦[18，19),茶树［20.),芸苔属植物拉伯［21),而拟南芥［22，23]，已在许多植物中被发现。这些突变体已广泛应用于基础研究。例如，利用Chl突变体分析基因功能，揭示叶绿体的发育机制、光合特性以及叶绿体与核之间的信号通路[24，25］．

随着育种技术的发展，绿化树木已远远不能满足园林工程的需要。彩叶树种，如紫荆黄花带着紫色的叶子[26),Lagerstroemia籼有黄色的叶子[27]，被广泛应用于园林中，以提高园林的观赏效果。具有彩色叶片的树种种质资源实际上仍然匮乏;因此，它们的繁殖和开发是一个亟待解决的问题。作为彩叶树的主要来源之一，叶色变化对改善景观生态建设至关重要。例如，“皇室”的品种马吕斯海棠有明显的紫色叶子，这是不同于许多观赏海棠品种。因此,米．“皇室”经常被用作繁殖彩色叶子后代的亲本材料[28］．在本研究的早期阶段，一种新的c .粳稻品种‘麻古仙子’(M，品种证书见附加资料1:图S1)，叶片为黄色，从亲本中选育c .粳稻M的叶片呈金黄色甚至黄色斑驳，具有很高的观赏价值，有望成为一种新的彩叶园林乔木(图1)。1A).考虑到该品种具有明显的性状，M适合用于街道绿化、庭院装饰、公园绿化等景点。可以预见的是，M可能扩展为c .粳稻新鲜市场的各种兴趣。此外，应用M，作为一个新品种c .粳稻，将增加该行业的竞争力，并大幅提高利润率。

在本研究中，两个品种c .粳稻(H和M)作为试验材料，通过比较两个品种叶片叶绿体的微结构和超微结构，测定叶绿体色素含量、光合作用参数和Chl荧光参数等生理指标。通过比较转录组分析，确定H和M的差异表达基因(DEGs)。在此基础上，通过微生物多样性测序，对其微生物种类及其丰度进行了比较，筛选出了感染该菌的候选微生物c .粳稻叶片和导致黄叶表型的筛选。本研究结果为阐明植物叶片颜色的生理和分子变异机制提供了理论依据c .粳稻．

黄叶的生理变化

通过比较M和H叶片光合作用参数、叶绿素荧光参数、Chl和类胡萝卜素含量的差异，探讨H和M叶片生理生化指标的差异。结果表明:净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO₂M的浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)和水分利用效率(WuE)均显著低于H1)．两个品种叶绿素荧光参数的对比分析表明，M型叶片的最大光化学效率(Fv/Fm)显著低于H型叶片(表1)1)．M叶中Chl a、Chl b、总Chl和类胡萝卜素含量显著低于H叶(表2)1)．

黄叶的细胞学变化

微观结构的对比分析表明，M叶的蜡层厚度和上/下表皮厚度均显著高于H叶的蜡层厚度。1E, G, H)。超微结构分析结果表明，H叶片叶肉细胞叶绿体结构正常，含有小淀粉粒、典型的类囊体膜和间质片层(图1)。2E, F)。相比之下，在M叶片中，叶绿体的类囊体膜破裂，没有典型的或缺乏类囊体粒，有几个排列不规则的囊泡(图1)。2B, C)。在M叶片中，叶绿体中存在着许多液泡，这表明叶绿体的液泡化和叶绿体结构的降解(图1)。2A, B)。M叶片细胞中叶绿体的大小和数量显著低于H叶片细胞中叶绿体的大小和数量(图5)。1F和2D, E)。

转录组测序概述

根据上述表型、超微结构和生理的变化，黄叶叶绿体发育和色素合成相关基因的表达模式发生了推测的变化。因此，本研究对M和H叶片进行了比较转录组分析。利用Illumina HiSeq 2500平台对6个cDNA文库(H1、H2、H3、M1、M2、M3)进行测序，获得28649万个原始reads和42.97 Gb的原始碱基。经过数据过滤，获得了27429万个clean reads和41.14 Gb clean base。所有库中的干净读取的比例超过总读取的94%(附加文件2:表S1)，清洁读取保存在NCBI序列读取归档(SRA登录号:PRJNA577010)中。Q30在这些库中超过94%，GC内容在45.44- 47.42%的范围内(附加文件2:表S1)。利用HISAT v2.0.4软件将clean reads映射到内参基因数据库c . sinensis［29］．样本cDNA文库的匹配率为65.49% ~ 69.24%3.:表S2)。这些样本中超过53%的reads可以与参考基因组的外显子区域进行比较4表S3)。各样本表达水平的相关性分析显示出良好的重复性(附文件5:图S2)。总体而言，Illumina的高通量测序数据的质量足以满足转录组数据的要求。因此，这些数据可以用于进一步的DEG分析。

DEGs的功能注释与分类

从H和M叶中共得到3298个deg。在这些deg中，1812个deg被上调，1486个deg被下调6:图S3和附加文件7:图S4)。根据样本中差异基因的表达，K-means聚类分析表明差异基因被分为6个聚类(附加文件8:图S5)。

对所有DEGs的功能和分类进行了COG、GO和KEGG注释。共对3298个deg进行了功能注释，并划分为24个COG大类，包括细胞结构、生化代谢、信号转导等(图1)。3.A).在这些分类中，一般功能预测组含有最多的DEGs(245个，7.43%)，其次是碳水化合物运输组(137个，4.15%);转录(119,3.61%);复制、重组和修复(113,3.43%)以及翻译后修饰、蛋白翻转和伴侣蛋白(108,3.27%)。

GO注释结果显示，3298个deg主要分配给48个功能项(图1)。3.B).在细胞成分中，DEGs主要集中在细胞部分(1968,59.67%)、细胞器部分(1035,31.38%)和膜部分(848,25.71%)。在生物过程中，大多数DEGs参与细胞过程(1509,45.76%)、代谢过程(1305,39.57%)和应激刺激过程(698,21.16%)。在分子功能上，大多数DEGs集中在结合活性(1545,46.85%)和催化活性(1544,46.82%)上。

KEGG注释显示在123个KEGG通路中富集了3298个DEGs。在这些途径中，DEGs在植物-病原体相互作用和类胡萝卜素生物合成途径中富集最为显著(图。3.C).根据KEGG注释结果，我们选择了5条DEG显著富集的KEGG通路进行后续分析，分别是卟啉和Chl代谢(map00860)、类胡萝卜素生物合成(map00906)、光合作用-天线蛋白(map00196)、光合作用(map00195)和植物-病原相互作用(map04626)。

与叶片色素合成有关的DEGs

在转录组数据中，我们分析了控制Chl生物合成的卟啉和Chl代谢途径中的DEGs。KEGG注释结果表明三个deg参与了Chl的合成(图。4A).在这些deg中，glutamyl-tRNA还原酶（丙烯酸-),血红素加氧酶（HMOX的表达显著增加，而叶绿素酶（CLH)与H相比，M显著降低。

在M叶片中，12种DEGs在类胡萝卜素生物合成途径中显著富集。其中5种deg被下调，即，Z-iso, cyp450-bch, zep, nced3,NCED4(无花果。4B).这一发现与M叶类胡萝卜素含量显著低于H叶的结果是一致的。

在叶片中与光合作用有关的DEGs

在光合-天线蛋白通路中，两个DEGs的表达水平(LHCA2而且LHCB3)显著高于H叶。相比之下，两种DEGs的表达水平(PsaO而且PsbY)在光合途径中，M叶中的表达明显低于H叶中的表达(图5)。4C)。

叶片中与植物-病原相互作用有关的DEGs

KEGG注释结果显示，植物-病原相互作用途径中富集了50个DEGs(图5。5一个和3.B).在这些DEGs中，有19个在M叶中上调，主要包括RPM1，RIN4，肌酸磷酸激酶，BAK1，PTI1而且PR131个州下调了监管。进一步对50个DEGs的功能分析表明，位于细胞膜上的特异性识别受体(即，BAK1而且FLS2)显著高于H叶。此外，植物抗性基因的表达水平PR1的表达显著上调(图。5A和B)。

叶片微生物群落的丰富度和多样性

转录注释结果显示植物-病原相互作用途径中DEG差异最大。因此，M的叶片变黄可能是由叶片内的内生微生物引起的。因此，我们对两组叶片的16s和ITS多样性进行了测序，比较了H和M叶片中原核和真核微生物的种类和丰度，筛选了参与M叶片颜色变化的候选微生物。测序结果表明，16s rRNA和ITS多样性测序分别获得224,313和214,939条有效序列reads。在原核生物中，OTUs的总数为670个，两组共检测到441个共享OTUs(图1)。6A).在真核生物中，检测到的OTUs总数为1278个，其中318个OTUs为两组共有(图1)。6B)。

对于原核生物，M和H叶的群落分类和丰度差异不显著(图5)。6C).而对于真核生物，分类结果显示OTUs属于8门159属。对这些真核生物的丰度进行进一步的比较分析表明，它们的平均丰度DidymellaM叶(2.4% ~ 5.2%)显著高于H叶(0.0 ~ 2.4%)。6D).通过Galaxy在线分析平台对两组样品真菌群落相对丰度的LEfSe差异分析(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)．结果表明，该类群真菌群落的丰度较高Dothideomycetes，Pleosporales，Didymellaceae,DidymellaM高于H(图。7A).进一步构建基于分类层次树的分类单元图，寻找候选真菌引起的黄叶，结果表明真菌群落在科、目、纲中的丰度DidymellaM的隶属度高于hDidymella可能与黄叶的c .粳稻(无花果。7B)。

qRT-PCR验证DEGs

我们通过qRT-PCR对两组样本中随机选取的20个DEGs的表达进行验证，以确认RNA-seq数据的可靠性(图1)。8一个日志)。₂采用foldchange计算RNA-Seq与qRT-PCR结果之间的相关性(2^−ΔΔCt) 20度。结果表明，20个deg的qRT-PCR结果与RNA-seq结果呈正相关，说明RNA-seq数据是可靠和准确的(图1)。8B)。

叶绿素合成受阻是导致黄化的重要因素

叶色是观赏植物的重要商业特征。植物叶片的颜色主要取决于Chl、类胡萝卜素和花青素的含量和分布[31］．总的来说，绿色的叶子主要是由高浓度的Chl引起的，而彩色的叶子主要是由类胡萝卜素和花青素含量的变化引起的。M表现出不同于H.绿叶的黄色叶片表型。测定的色素含量表明M .叶片中Chl含量显著降低。转录组KEGG注释结果显示有三个DEGs，即丙烯酸-，HMOX而且CLH，都参与了Chl的生物合成。9)．与Chl含量下降相反，两个关键基因，即，丙烯酸-而且HMOX与H相比，M中显著上调Chl的生物合成[32］．此外,CLH基因在Chl的降解和代谢中起重要作用，其在M叶片中的表达水平低于H [33］．

在自然界中，叶子的颜色是植物进化的结果。叶片缺乏Chl会导致植物生物量、繁殖力和逆境适应性的下降[34，35］．因此，植物有一系列的反馈调节机制来削弱或消除这种影响[36］．参与Chl合成的3个DEGs在M和H叶片中的表达水平与Chl含量的变化相反。这一结果可能是由于表达水平的变化。在M叶片Chl缺乏后，细胞核接受质体传递叶绿体发育和功能状态的反向信号，进一步介导了这一变化。Chl是一种重要的光合色素，缺Chl会导致光合速率下降。同时，在光合作用途径中DEGs的表达量也发生了相应的变化。

类胡萝卜素由一系列从黄色到红色的色素组成，在光合作用中参与光捕获，对保护暴露在过度光下的植物至关重要[37，38］．因此，类胡萝卜素生物合成受损可导致颜色突变表型[39，40］．许多植物的叶片颜色突变与类胡萝卜素的合成和降解有关[41，42］．在本研究中，在类胡萝卜素生物合成途径中，DEGs显著富集。qRT-PCR结果显示有5个DEGs，即Z-ISO，CYP450-BCH，齐柏林飞艇，NCED3,NCED4M叶中类胡萝卜素的生物合成速率显著降低(图1)。9)．最后，M叶变黄了。

叶绿体结构的破坏导致M叶片变黄

叶绿体的发育是高等植物叶片颜色形成的主要影响因素。由叶绿体发育不良引起的各种叶片颜色突变体已在许多物种中报道过，如l .籼［27，茶树[43),而银杏叶［44，45］．总的来说，叶绿体功能异常的突变体叶片表现为Chl缺乏。异常叶绿体的数量和发育可能导致类囊体膜受损，并减少光系统I和II中捕光蛋白的积累[13］．因此，叶片颜色的变化可能反映了叶绿体发育和功能的异常。针对M叶片叶绿体色素明显减少的特点，利用透射电镜对H和M叶片叶绿体超微结构进行了研究。结果表明，M叶片的叶绿体数量显著低于H叶片。叶绿体结构不完整，被许多大小不一的气泡所取代，几乎没有密集的类囊体粒。类囊体在植物光合作用中起着重要作用。光合色素合成和光合电子转移发生在类囊体及其表面周围[46］．同时，Chl嵌入叶绿体的类囊体膜中。超微结构分析结果表明，叶片Chl含量的显著降低是由于叶绿体结构的破坏导致叶片表型变黄所致。

Didymella通过破坏M的叶绿体结构导致叶片变黄

比较转录组分析结果表明，H和M叶片中的DEGs在植物-病原相互作用途径中显著富集(50个DEGs)。此外，模式识别受体，LRR受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(FLS2)和油菜素内酯不敏感1-相关受体激酶1 (BAK1)在M叶中显著上调(图。9)．这些酶与细菌鞭毛flg22形成复合物，激活植物抵御病原体入侵的防御信号[47，48］．的表达水平CML而且肌酸磷酸激酶编码钙的基因^{2 +}与H叶片相比，M叶片中信号通道相关蛋白或蛋白激酶显著增加。Ca^{2 +}通道相关基因在植物抗生物胁迫中发挥关键作用[49］．改变Ca^{2 +}细胞溶质浓度是植物有机体对生物和非生物胁迫的主要反应[50］．Ca^{2 +}通道相关基因在M叶片中显著增加。这些基因可以激活呼吸爆裂氧化酶，并介导活性氧的产生，参与植物的免疫反应[51，52］．

植物通过丝裂原激活蛋白激酶和水杨酸的过程控制先天免疫反应的激活。这些免疫防御包括木质素和胼胝质的沉积在细胞壁，相关抗病基因的转录，抗菌化合物和活性氧的产生[53］．M叶的蜡层和上/下表皮较H叶厚。这一结果是由于木质素沉积在M叶表皮细胞的作用。M叶片表现出chl缺乏表型后，植株通过增加叶表皮和蜡层厚度来增强对病原菌的抵抗力。

许多研究报道了各种植物病原体通过将其不同的III型效应器(T3E)注入植物细胞来促进发病[54］．T3E，通常在两，具有推测的叶绿体靶向序列和J结构域，可激活70 kDa热休克蛋白，从而促进叶绿体类囊体结构重塑和抑制水杨酸积累[55，56］．在本研究中，KEGG注释结果表明植物-病原相互作用途径是一个差异最显著的deg富集途径。同时，微生物多样性测序结果表明Didymella属的含量显著高于H属。因此，真核生物属Didymella与黄叶表型密切相关Didymella可能也有类似的功能p .两，如先前报道。它可能专门针对植物细胞的叶绿体，作用于类囊体，从而导致类囊体粒降解，从而导致M中Chl生物合成和黄叶表型的丧失(图1)。9)．

在黄色的树叶c .粳稻(M)、Chl和类胡萝卜素含量降低，叶绿体超微结构异常，影响光合作用和光合产物的生物合成。通过比较转录组测序分析，共鉴定出3298个DEGs。这些DEGs主要参与植物-病原相互作用、类胡萝卜素生物合成、光合作用和Chl生物合成。此外，微生物多样性分析表明Didymella属的含量显著高于H属。综上所述，我们的数据表明，M的黄叶表型与Chl含量的降低、叶绿体结构的破坏和叶绿素含量的降低密切相关Didymella入侵。最后，我们推测Didymella在M叶中可靶向叶绿体，破坏类囊体结构，从而降解类囊体粒;这种降解降低了Chl和类胡萝卜素的含量，并导致黄叶表型c .粳稻(M)。

植物材料

水稻品种c .粳稻本研究中所用植物均种植于湖北省麻城市乌脑山国家森林公园(N 31°13’44”，E 114°59’17”)。所有样本c .粳稻经麻城五脑山国家森林公园园长许可采集。所有的认证c .粳稻品种由中国花卉协会茶花分会完成，M认证如图所示S1．2017年11月，从15年的M和遗传背景相似的亲本H植株中采集了大小相似的叶片。对照组为H，对照组为M。1A−d)。每个品种设3个生物重复。每轮用30片叶片进行转录组测序、微生物多样性测序和生理指标测定。所有样品在液氮中快速冷冻后保存于-80°C。

Chl、类胡萝卜素、光合作用参数和叶绿素荧光参数的测量

选择遗传背景相近的15年植株M和亲本H，分别用LI-6400XT便携式光合作用测量系统和PAM-2500便携式叶绿素荧光仪测定叶片的光合作用和叶绿素荧光参数。选取M叶和H叶中的黄叶，按照Lichtenthaler等的方法提取Chl a、Chl b和类胡萝卜素含量并测定。[57］．每个处理设3个重复，每个重复选取6棵树的30片叶子。

透射电镜和光学显微镜观察

叶片首先浸泡在2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的混合物中，然后用1%四氧化锇固定(图。1C和D)。随后，标本脱水、包埋、切片、染色并观察[58］．微观结构观察用徕卡RM2265半薄切片机切割0.5 mm厚切片，用徕卡DVM6数码显微镜观察叶片细胞并拍照。随机选取叶片上表皮和下表皮10个位置，利用AutoCAD测量不同处理下叶片上表皮厚度和蜡质层厚度。为了观察超微结构，用Leica EM UC7超薄切片机(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)将叶片切成70 nm厚的切片，然后用3%醋酸铀和6%柠檬酸铅进行染色。利用Tecnai G2 Spirit Bio TWIN对叶片细胞结构和照片进行观察。利用超微结构图像对随机选取的10个细胞的叶绿体进行计数，计算每个细胞中叶绿体的平均数量。

RNA提取和cDNA文库制备

总RNAc .粳稻按照TaKaRa MiniBEST植物RNA提取试剂盒的说明书提取叶片，分别通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000显微分光光度计(IMPLEN, CA, USA)检测RNA纯度和浓度。cDNA文库的构建和测序工作由安诺优德基因技术公司(北京，中国)完成。本研究构建了两组样本，每组有3个重复，30个叶片。构建了6个cDNA文库(H1, H2, H3, M1, M2, M3)，每个文库有30个叶片。利用Illumina HiSeq 2500测序平台对这些cDNA文库进行测序。

Illumina深度测序和数据分析

从原始reads中过滤的Clean reads被映射到茶树参考基因组数据库(tea plant genome database)http://www.plantkingdomgdb.com/tea_tree/)，使用HISAT v2.0.4 [29］．所有的原始读取数据存储在NCBI序列读取存档(SRA登录号:PRJNA577010)中，转录组序列用Trinotate进行注释。功能标注主要使用PFAM、Nr、Swissprot、GO、COG、KEGG等数据库进行。

DEGs的鉴定与功能分析

RNA-Seq的FPKM用于估计基因表达丰度[59］．DESeq242包[60]用于M和H中DEGs的鉴定，用于GO和KEGG富集分析[61，62］．利用KOBAS计算KEGG通路中富集的DEG [63］．

存在分析

从转录组中选择deg进行qRT-PCR分析，并使用Primer 5.0设计特异性引物(附加文件9:表S4)。选择18s作为内参基因[64]，用LineGene 9600 Plus实时荧光PCR仪(杭州Bio-er)和SYBR Green BioEasy Master Mix kit进行DEG的qRT-PCR [65］．所有反应均在3个生物重复(每重复30片叶子)中进行，通过2^−ΔΔCt方法(66］．

叶片微生物多样性测序与分析

使用Omega磁结合土壤DNA试剂盒(Noraville, GA, USA)提取总基因组DNA，并分别使用NanoDrop和1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)和凝集素凝胶电泳测定提取DNA的浓度和质量。利用通用引物构建了微生物多样性库10:表S5)。使用来自Personalbio (Shanghai, China)的Illumina MiSeq平台(PE300, CA, USA)进行多样性文库的构建和测序。本研究从两组样品中构建了8个细菌多样性文库和8个真菌多样性文库。每组设4个重复，每个重复30片叶子。对于原始测序数据，使用QIIME (v1.8.0)和R包(v3.2.0)获得每个样品的代表性OTU分类[67］．所有微生物多样性测序原始数据存储在NCBI序列读取档案中(SRA登录号:bacteria, PRJNA598468;真菌,PRJNA598022)。

数据统计分析

数据用Excel和SAS进行方差分析，然后用SAS (SAS Institute Inc.， Cary, NC, USA)进行Duncan检验(p≤0.05)，差异显著。

本文报道的所有原始数据均已存入国家生物技术信息中心序列读取档案(rna - sequencing accession SRA accession number: PRJNA577010;微生物多样性测序SRA登录号:bacteria, PRJNA598468;真菌,PRJNA598022)。本研究中生成的数据库和使用的材料可根据合理要求从相应的和第一作者处获得(xufeng198@126.com;fumingyue1214@163.com)。

感谢麻城五脑山国家森林公园工作人员在野外实验过程中的帮助。感谢麻城五脑山国家森林公园负责人允许我们采集本次实验的所有样本。感谢中国科学院华南植物园曾少华、徐新兰、邓汝芳在透射电镜实验过程中的帮助。

本研究是由中央政府林业科技示范项目(湖北省林业厅计划，批准号:)资助的。[2017] TG08)。资助机构在研究的设计、收集、分析和解释数据以及撰写手稿方面没有发挥任何作用。

作者指出

1. 傅明月、周忠成、杨旭对本研究均有贡献。

从属关系

1. 长江大学园艺学院，湖北荆州434025

   傅明月，郑家瑞，黄心如，王玲，叶佳宝，张薇薇，廖永玲，徐峰

2. 湖北生态职业技术学院林业生态系，湖北武汉430070

   周忠成、杨旭

3. 武汉生物工程大学园艺与园林学院，湖北武汉430415

   Zhongbing刘

贡献

FX和MYF构思、设计研究并撰写稿件;本文所涉及的实验由MYF、XY、JRZ、XRH和JBY完成。LW和JBY完成了数据分析，ZCZ、ZBL、WWZ和YLL为本研究提供了关键思路和科学指导。FX对手稿中重要的知识内容进行了批判性的修改，MYF对本研究中的所有材料进行了整理和分析。这里列出的所有作者都投稿并批准了稿件。

相应的作者

对应到冯徐．

伦理批准和同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

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