芒果中4个MiTFL1基因的过表达延迟了转基因拟南芥的开花时间

背景

顶花1（TFL1)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族，在一些植物中参与花序分生组织发育并抑制开花。在目前的研究中，有四个TFL1从芒果中克隆出基因(Mangifera籼L.)品种“SiJiMi”并命名MiTFL1-1，MiTFL1-2，MiTFL1-3而且MiTFL1-4．

结果

序列分析表明，编码的MiTFL1蛋白含有一个保守的PEBP结构域，属于TFL1族。表达分析表明MiTFL1基因不仅在营养器官中有表达，在生殖器官中也有表达，且表达水平与花的发育有关。过度表达的四种MiTFL1转基因基因延迟开花拟南芥．此外,MiTFL1-1而且MiTFL1-3改变一些转基因植物的花形态。酵母双杂交(Y2H)分析表明，几种应激相关蛋白与MiTFL1蛋白相互作用。

结论

这四个MiTFL1基因表现出相似的表达模式，在拟南芥导致开花延迟。此外,MiTFL1-1而且MiTFL1-3过度表达影响花器官发育。此外，MiTFL1蛋白可与bHLH和14相互作用-3 - 3蛋白。这些结果表明MiTFL1基因可能在芒果开花过程中起重要作用。

花的转变是高等植物生命周期中的一个重要阶段。植物由营养期向生殖期转变的过程受到复杂的内部信号和外部环境因素的调控[1，2］．不同的开花响应途径，如光周期、春化、赤霉素、自主、环境温度和年龄相关的途径，已经确定在模式植物拟南芥［3.］．许多基因在这些过程中起着至关重要的作用，所涉及的相互作用决定了分生组织的命运[4］．君士坦斯（有限公司)含有锌指结构和CCT结构域，激活转录开花位点t（英国《金融时报》)基因通过与英国《金融时报》启动子区，以及英国《金融时报》蛋白质从叶组织移动到茎尖，开始植物从营养生长到生殖生长的转变[5，6］．的花位点c（方法)基因在植物的春化过程中起着核心作用，即诱导植物开花[7，8，并通过结合来抑制开花英国《金融时报》，开花位点d（FD),constans1过表达抑制因子（SOC1)，并抑制这些基因的表达[9］．花分生组织特异性基因多叶的（LFY),APETALA1（AP1)直接诱导茎尖分生组织分化，促进植物进入花期，然后这些基因被激活英国《金融时报》或SOC1［10］．

顶花1（TFL1)，该蛋白属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族，首次在拟南芥［11］．TFL1而且英国《金融时报》是具有高度同源序列但功能相反的基因。TFL1编码具有保守的His88和Asp144残基的蛋白质，以及典型的氨基酸三联体模块EYD, YFG和END [12］．FT蛋白不具有这种结构，这是这两个基因功能相反的关键原因[13］．TFL1基因作为开花抑制因子，决定了顶端分生组织转变为花序分生组织的时间和花序的分支模式[14］．在拟南芥,AtTFL1基因不仅维持茎尖分生组织和花序分生组织的无限生长，而且参与花的形成[15］．在大多数果树中，…的功能TFL1同源基因是延缓开花的，功能类似AtTFL1．例如，的函数PmTFL1(从李属却已)，即延迟开花，详见transformed拟南芥［16］．之间的拮抗作用英国《金融时报》而且TFL1表现出与竞争有一定的关系FD［17，18］．的TFL1基因抑制的表达LFY而且AP1的下游英国《金融时报》基因，通过结合到FD并抑制开花[19］．此外,LFY而且AP1调节的表达TFL1以相反的方式使基因:LFY作为一种活化剂，AP1是一个抑制基因，这两个基因形成了一个不明确的反馈回路。植物的开花取决于花期的比例TFL1来LFY基因的表达。高的比例使植物处于开花抑制期，而低的比例使植物处于花期早期[20.］．

与一年生植物相比，木质果树的幼年期较长，严重影响了育种。多项研究表明，过表达或沉默开花相关基因可以缩短花期，促进开花。例如，BpMADS4来自白桦的基因在苹果中构成性过表达，转基因植株表现出明显缩短的幼花期和花期[21］．PcTFL1-1而且PcTFL1-2利用RNAi技术对欧洲梨进行了沉默处理，植株表现出开花早、幼花期短的特征[22］．

芒果(Mangifera籼L.)是一种世界著名的木质果树，广泛生长在热带和亚热带地区。影响芒果开花的环境因素包括低温、水分胁迫和碳水化合物。外源喷施硝酸钾、多效唑和乙烯利可促进开花，而喷施赤霉素则抑制开花[23］．芒果基因组的发表为开花基因的挖掘提供了有价值的信息[24］．近年来，在芒果中分离并鉴定了数个开花调控基因，其中包括促花基因MiSOC1［25),两个MiAP1基因(26),三MiFT基因(27]，以及一种抑制开花的基因(MiCO) [28］．的功能MiTFL1在该植物中尚未发现。在目前的研究中，有四个MiTFL1同源基因，即MiTFT1-1，MiTFT1-2，MiTFT1-3而且MiTFT1-4，是从m .籼l .简历。“SiJiMi”。四种表达模式MiTFL1对不同组织和不同花期的基因进行了分析。MiTFL1构建基因过表达载体，通过基因转化确定基因的功能拟南芥．通过酵母双杂交(Y2H)试验筛选与MiTFL1蛋白相互作用的蛋白。结果表明，这四个MiTFL1基因抑制芒果开花。

分离和序列分析MiTFL1基因

四个TFL1从‘SiJiMi’芒果的转录组和基因组数据(未发表数据)中鉴定出同源基因。我们通过RT-PCR进一步验证了这些序列，结果表明这些序列与从转录组数据中获得的序列一致。这四个基因被命名MiTFL1-1，MiTFL1-2，MiTFL1-3而且MiTFL1-4， DNA序列长度分别为1175 bp、1054 bp、962 bp和1299 bp。所有的四个MiTFL1基因包含4个外显子和3个内含子(图;1a).序列比对分析显示，四种基因的第一个外显子长度不同MiTFL1基因中，第二和第三外显子长度相同;在所有基因中，第4外显子长度为215 bpMiTFL1-2，长度为218 bp。这四个的完整编码序列MiTFL1基因编号为516 bp、525 bp、519 bp和510 bp，分别编码172 aa、175 aa、173 aa和170 aa。氨基酸序列比对分析表明，MiTFL1-3与MiTFL1-4的相似性比MiTFL1-1与MiTFL1-2的相似性(70%)高90%。MiTFL1-1、MiTFL1-2、MiTFL1-3和MiTFL1-4蛋白的氨基酸序列与AtTFL1 (NP_196004.1)的序列相似性分别为68.9、69.1、62.9和60.1%拟南芥,分别。此外，所有的MiTFL1蛋白都被鉴定为含有TFL1样蛋白关键的保守氨基酸残基的TFL1蛋白(图1)。1b)，即85位的组氨酸(H85)和140位的天冬氨酸(D140)。

PEBP基因家族分为TFL1，英国《金融时报》而且分区,亚科。根据系统发育树分析(图;2)， MiTFL1-1、MiTFL1-2、MiTFL1-3和MiTFL1-4蛋白与其他种的TFL1蛋白聚在一起。在所研究的蛋白中，MiTFL1-1蛋白与苹果、梨、杏、李、核桃、枣等芸香科果树和玫瑰植物的TFL1蛋白密切相关。MiTFL1-2蛋白与桂圆和葡萄的TFL1蛋白、苹果和可可的CEN蛋白密切相关。MiTFL1-3和MiTFL1-4蛋白聚在一起，与开心果的PvCEN蛋白密切相关。

表达分析MiTFL1基因

的表达模式MiTFL1用qRT-PCR方法对芒果不同组织(包括花、叶和茎)中的基因进行了检测。3.一个)。MiTFL1-1，MiTFL1-2，MiTFL1-3而且MiTFL1-4在花，叶和茎中表达。MiTFL1-1而且MiTFL1-4在叶片中表达量高于其他组织。MiTFL1-2在花中高度表达，而MiTFL1-3在茎中高度表达。

的表达模式MiTFL1芒果不同开花发育阶段的基因m .籼l．简历．从营养生长期到开花结果期(2020年11月- 2021年5月)采集“四稻”叶片，分析结果如图所示。3.B.的表达模式MiTFL1-1而且MiTFL1-2基因相似。这两个基因在花诱导期的表达量显著高于其他阶段。的表达级别MiTFL1-3基因在营养生长期高，花诱导期显著降低，花分化期显著升高。花期表达量最低，果实发育期叶片表达量较高。表达水平MiTFL1-4在花诱导期先下降后上升，在花分化期达到峰值，随后下降，最终在果实发育期趋于稳定。

MiTFL1蛋白的亚细胞定位

为了检测MiTFL1蛋白的亚细胞定位，将35S::GFP-MiTFL1-1、35S::GFP-MiTFL1-2、35S::GFP-MiTFL1-3、35S::GFP-MiTFL1- 4和35S::GFP- p1300分别转化为洋葱表皮细胞(图2)。4)．在整个细胞内观察到空载体35S::GFP-P1300的荧光信号。35S::GFP-MiTFL1-1、35S::GFP-MiTFL1-2、35S::GFP-MiTFL1-3和35S::GFP-MiTFL1-4融合蛋白仅在细胞核中可见，并用DAPI染色。

的表型分析MiTFL1超表达在拟南芥

MiTFL1基因延缓植物开花拟南芥

的功能MiTFL1-1，MiTFL1-2，MiTFL1-3而且MiTFL1-4在芒果开花过程中，构建pBI121-MiTFL1单个过表达载体，分别转入WT中答:芥．对t3代纯合子植株进行表型观察，WT和pBI121空载体表达拟南芥作为对照。

四个独立的线路MiTFL1-1(OE-1#13, OE-1#22, OE-1#25和OE-1#29)和三个独立的行MiTFL1-2选择过表达(OE-2#24, OE-2#45和OE-2#55)进行功能分析。半定量RT-PCR分析显示MiTFL1-1而且MiTFL1-2在转基因株系中大量表达，但在空表达载体的转基因或WT植株中不表达(图2)。5A1和B1)。所有的独立线MiTFL1-1而且MiTFL1-2表现为抽苔和开花延迟:这些过程在这些品系分别发生在28.7-32.5天和33.3-42.2天，在对照品系分别发生在24.9-25.3天和28.5-28.8天。5A B和桌子1)．所有的变换线MiTFL1-1而且MiTFL1-2表现出与WT植株相似的正常抽苔现象。此外，与野生型植物的高度相比，野生型植物的高度较低MiTFL1-1而且MiTFL1-2除OE-1#13、OE-1#29和OE-2#45外，其余植株的莲座叶均未受显著影响(表2 - 4)1)．

三个独立MiTFL1-3过度表达(OE-3#19, OE-3#23和OE-3#42)MiTFL1-4选择过表达系(OE-4#24、OE-4#45和OE-4#55)进行功能分析。半定量RT-PCR分析证实MiTFL1-3而且MiTFL1-4在转基因株系中大量表达，但在WT和pBI121转基因株系中不表达拟南芥植物(图。6A1和B1)。在长日(LD)条件下，过表达mitfl1 -3和过表达mitfl1 -4的转基因植株的抽苔时间明显延迟。6ab和表格2)．抑制作用MiTFL1-4开花时间较其他三株弱MiTFL1基因。一些植物的高度MiTFL1-3而且MiTFL1-4转基因株系表现出显著差异，但部分植株高度与对照株系差异不显著。任何一种植物的莲座叶均未受显著影响(表2)2)．

MiTFL1-1而且MiTFL1-3影响花的表型拟南芥

mitfl1 -1过表达(图;7b)和过表达mitfl1 -3的转基因株系(图;7c)表现出与WT系相似的异常表型(图;7a).在转基因植株中，部分心皮发育成新的花序(图;7B-a和C-a)，一些花结构缺乏花瓣(图。7B-b和C-b)，与WT植物的结果相反(图。7A-a -b)。与野生型植株相比，在转基因植株中发现了两种类型的角果变异(图2)。7A-b, A-c):在一些硅果中，果柄在形成过程中继续从花中延长(图。7B-c和C-c);其余的果柄呈弯曲生长，果柄较短(图2)。7B-c和C-c)高于WT植物。此外，由于花形态的变化，转基因植物的花序与野生型植物有显著不同(图2)。7A-d, B-e和C-e)。此外，转基因植株的侧枝上生长出轮生叶拟南芥但在对照植物中没有。7A-e, B-f和C-f)。

转基因内源基因的表达模式拟南芥表达MiTFL1基因

以确定是否MiTFL1转基因中的基因过表达拟南芥改变了一些与开花有关的基因的表达，比如AtFT，AtFD,AtAP1同源染色体在拟南芥， T3代全地上部分纯合转基因答:芥在种植后30天采集，进行qRT-PCR分析(图;8)．AtACTIN2作为内参基因。也发现了类似的表达模式AtFT，AtFD,AtAP1记录在拟南芥在过度表达这四个之后MiTFL1基因(图。8模拟)。的表达水平AtFT而且AtAP1基因在所有的MiTFL1-过表达转基因株系．然而，表达的AtFDmitfl1 -2基因在许多转基因株系中均显著增加，但在过表达株系OE-2#45中无显著增加。

与MiTFL1蛋白相互作用的蛋白质

采用Y2H体系筛选与MiTFL1蛋白相互作用的蛋白，验证其相互作用。通过双酶切构建诱饵载体pGBKT7-MiTFL1，未检测到自活化和毒性(见图)。S2)．将含饵质粒的酵母细胞与“四吉米”cDNA同质化文库结合，筛选阳性克隆。经过Y2H分析，我们获得了9个与MiTFL1-1蛋白相关的候选蛋白，7个与MiTFL1-2蛋白相关，6个与MiTFL1-3蛋白相关，7个与MiTFL1-4蛋白相关(表1-4)S1)．从候选蛋白中筛选出3个胁迫或开花相关蛋白，在DDO/X和QDO/X/A培养基上进行进一步点对点验证。这三种蛋白分别为碱性螺旋-环-螺旋蛋白13 (bHLH13)、bHLH162和14-3-3D，如图所示。9．pGADT7重组载体中含有候选蛋白bHLH13的细胞在QDO/X/A固体培养基上呈蓝色，生长正常，表明该蛋白与MiTFL1-2和MiTFL1-3蛋白相互作用。bHLH162与MiTFL1-1、MiTFL1-2和MiTFL1-4互作，而14-3-3D仅与MiTFL1-1和MiTFL1-2互作。

英国《金融时报》而且TFL1编码一对属于PEBP家族的开花调节因子，并在从营养生长到生殖发育的转变过程中发挥关键作用[19］．英国《金融时报》而且TFL1具有高同源性，表现为高核苷酸和氨基酸序列的一致性，但具有相反的功能。英国《金融时报》促进生殖发育和开花的过渡，而TFL1抑制开花[19，29］．我们之前的研究确定了三种英国《金融时报》来自芒果的基因进一步证实了这一切英国《金融时报》基因显著促进转基因植物开花[27］．在目前的研究中，有四个TFL1从“SiJiMi”芒果的转录组和基因组数据分析中获得基因(未发表数据)，并对其命名MiTFL1-1，MiTFL1-2, MiTFL1-3而且MiTFL1-4．序列分析表明，4TFL1“SiJiMi”芒果的基因与“Alphonso”的核苷酸序列高度一致(图2)。S3)．

副本多份TFL1在其他植物中也发现了同源基因，如大豆[30.]、毛竹[13]和枇杷[31]，三个矮牵牛花[32]，四个棉质[33]五分之一橡胶树取代巴西橡胶树［34］．在之前的研究中，只有两个TFL1基因,即MiTFL1而且MiTFL1a,是在另一种芒果品种中发现的。”阿方索，对应于MiTFL1-2而且MiTFL1-1，在本研究中，[35］．MiTFL1基因包含四个外显子和三个内含子。不同基因间第二、第三外显子核苷酸长度高度一致MiTFL1基因(图。1a).在这四种MiTFL1蛋白中也发现了TFL1蛋白的关键氨基酸His88和Asp144(图。1b).构建的系统发育树显示，这4个MiTFL1蛋白属于TFL1蛋白分支。在树状图中，MiTFL1-1和MiTFL1-2距离较近，而MiTFL1-3和MiTFL1-4距离也较近。2)．

的TFL1大多数果树的基因表达模式与花的发育有关．柑橘类CsTFL1只在花器官中表达[36］．P. mume PmTFL1在幼年期在叶、茎和根中表达，而PmTFL1只在成熟阶段的叶芽和嫩叶中发现[16］．的PpTFL1桃的基因主要在成熟嫩叶中表达，而在成熟叶片和花器官中均无表达[37］．EjTFL1-1主要在根和叶芽中表达，但在芽、花芽和花中表达量低。EjTFL1-2主要在叶芽、花和果实中表达，在其他组织中不表达[31］．在本研究中，MiTFL1与上述报道的基因表达模式不同。组织表达分析表明MiTFL1-1，MiTFL1-2，MiTFL1-3而且MiTFL1-4在营养组织和生殖组织均有表达，但表达水平不同。我们的结果与其他芒果品种“Alphonso”和“Ratna”的结果相似[35］．这些结果表明，在组织表达模式TFL1不同种间基因差异显著。

一些研究表明，蛋白的表达模式TFL1在花发育的不同阶段，基因是不同的。例如，在梨、苹果和榅桲中TFL1-1而且TFL1-2花分化前基因在花蕾中高表达，花分化后基因表达呈下降趋势[38］．在h .取代巴西橡胶树，HbTFL1-1，HbTFL1-2而且HbTFL1-3在花序发育过程中，表达量逐渐增加HbCEN1而且HbCEN2在此期间持续减少[39］．表达水平EjTFL1-1而且EjTFL1-2花芽分化前逐渐减少，开花期又开始增加[31］．芒果的种类阿方索”,MiTFL1在开花诱导期表达增加，随后减少，而MiTFL1a在花期表达量仍然很低[35］．在本研究中，表达的MiTFL1芒果中的基因与上述报道的相似。MiTFL1-1而且MiTFL1-2花诱导期在叶片中高表达，而MiTFL1-3而且MiTFL1-4在花分化期叶片中均有高表达。

TFL1同源基因在许多物种中具有相似的功能，这些功能包括延迟开花时间和通过抑制花序分生组织来维持花序分生组织AP1而且LFY表达式[15］．苹果的过度表达MdTFL1在拟南芥延迟开花时间，抑制其表达MdTFL1基因通过RNAi技术获得早花性状[34，40］．日本杏PmTFL1［16]和橡胶TFL1基因在转基因中表现出相同的功能拟南芥［39］．在目前的研究中，有四个芒果MiTFL1转基因基因具有相同的延迟开花时间的功能拟南芥．此外,MiTFL1-1而且MiTFL1-3转基因株系表现出花瓣缺失、心皮发育为新花序、荚果弯曲生长和种子败育等花器官表型异常。这些结果表明MiTFL1-1而且MiTFL1-3参与花器官发育。在菊花中也发现了类似的表型CmTFL1c -而且李属PsTFL1-overexpressing转基因拟南芥行(41，42］．

外生的介绍TFL1基因显著下调了内源基因的表达水平AtFT而且AtAP1在转基因拟南芥，导致花期延迟。例如，过度表达HkTFL1基因萱草属植物延迟开花，和表达水平AtFT而且AtAP1在转基因拟南芥均较WT拟南芥［43］．的菊花CmTFL1c基因通过抑制来负向调控开花AtFT，AtLFY而且AtAP1表达式[42］．黄瓜CsTFL1b也会延迟开花拟南芥的表达水平的降低和增加AtFT而且AtFD，分别[4］．在目前的研究中，我们发现了四个MiTFL1基因表达下调AtFT而且AtAP1表达上调AtFD转基因表达拟南芥．

在水稻中，tfl1样蛋白rice CENTRORADIALIS (RCN)可以直接与14-3-3蛋白相互作用[44］．在本研究中，我们还利用Y2H实验筛选了一些与MiTFL1相互作用的蛋白(表2 - 1)S1)．例如，14-3-3D蛋白被发现与MiTFL1-1和MiTFL1-2相互作用，这一结果与水稻中发现的结果相似。另外两种bHLH蛋白也被发现与不同的MiTFL1蛋白相互作用，并在几个过程中发挥作用，包括生长、发育和对各种应激的反应[45］．此外，还筛选出了其他可能与MiTFL1蛋白相互作用的蛋白，它们也参与了胁迫反应、植物生长发育。然而，这些相互作用的蛋白质必须进一步测试。

在目前的研究中，有四个MiTFL1在芒果中鉴定了基因。这些蛋白同时含有关键氨基酸His88和Asp144。表达分析表明MiTFL1基因表现出相似的表达模式MiTFL1基因在营养组织和生殖组织中均有表达，在开花诱导期和花分化期成熟叶片中表达量较高。过度表达的四种MiTFL1基因在拟南芥导致开花延迟，而MiTFL1-1而且MiTFL1-3过度表达影响花器官发育。Y2H分析表明，MiTFL1蛋白与bHLH和14-3-3蛋白相互作用。这些结果提供了初步证据MiTFL1基因负向调控芒果花诱导，但其相互作用机制有待进一步验证。

植物材料和生长条件

的m .籼l．简历．本研究中使用的“四稻”植物种植在广西南宁(22°502 N, 108°17 e)广西大学的一个果园。为了进行组织表达分析，2021年3月10日采集了17年树龄的叶子、茎和花。为了进行季节表达分析，从2020年11月1日(营养期)到2021年5月1日(果实发育期)，每月收集一次靠近顶芽的叶片。所有样品立即在液氮中冷冻，并保存在−80°C。的拟南芥本实验室保持Col-0生态型。

隔离MiTFL1芒果基因

根据制造商的说明，使用RNAprep Pure Plant Kit (TianGen, Beijing, China)从芒果叶片中提取总RNA。根据制造商的说明，从1 μg总RNA中使用M-MLV逆转录酶(TaKaRa, Dalian, China)合成第一链cDNA。采用CTAB法从芒果叶片中提取基因组DNA。四个TFL1从芒果叶片中获得基因并命名MiTFL1-1，MiTFL1-2，MiTFL1-3而且MiTFL1-4．特异性引物(QTFL1-1u/d, QTFL1-2u/d, QTFL1-3u/d, QTFL1-4u/d;表格S2)被设计用来放大MiTFL1来自基因组DNA和cDNA的基因。聚合酶链反应(PCR)混合液中含有2.5 μl 10× PCR缓冲液(含MgCl^{2 +})、0.5 μl 10 mM dNTPs(生工生物技术，上海，中国)、上下行引物各1 μl (10 μM)、0.15 μl TransTaq-T DNA聚合酶(天根)、1 μl基因组DNA (100 ng/μl)或cDNA (100 ng/μl)作为模板、无菌水(25 μl)。PCR扩增条件为95℃初始变性4 min;38个循环，95°C为40秒，56°C为50秒，72°C为N min (N= 1 min/kb);最后在72°C延长10分钟。将扩增片段克隆到pMD18-T载体(Takara)中进行测序。

序列分析

使用BioXM 2.6软件进行序列分析和氨基酸预测。IBS 1.0版本用于生成外显子-内含子结构。保守域分析使用NCBI BLAST搜索引擎(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)．FT1/TFL1家族氨基酸序列通过GenBank BLAST搜索下载(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)．使用DNAMAN软件分析TFL1蛋白的多个序列比对。采用邻居连接法在MEGA-Χ中构建系统发育树，自举重复1000次。

表达分析MiTFL1基因

的表达式MiTFL1基因采用实时荧光定量PCR检测。根据制造商的说明，使用RNAprep Pure Plant Kit (TianGen)从所有样品中提取总RNA。合成第一链cDNA作为模板。基因特异性引物(qTFL1-1u/d, qTFL1-2u/d, qTFL1-3u/d和qTFL1-4u/d;无花果。S4)，以区分MiTFL1基因。的MiActin1以芒果的基因为内参基因[46］．PCR混合物中含有SYBR Premix Ex Taq II (Takara) 10 μl、cDNA 1 μl (100 ng/μl)、上下行引物0.5 μl (10 μl)、ROX参比染料II 0.8 μl和无菌水，总体积为20 μl。PCR扩增条件为95℃30 s;95°C持续5秒，60°C持续34秒，95°C持续15秒，循环40次;60°C 1分钟;95°C 15 s。相对转录本丰度用2^——ΔΔCt方法(47］．每个样品的分析包括3个生物学重复。

MiTFL1蛋白的亚细胞定位

的完整编码序列MiTFL1将无终止密码子的基因构建到P1300-GFP载体中Xba我和BamHI限制酶的裂解位点。将所构造的向量变换为根癌土壤杆菌EHA105。将GFP融合载体和空载体转化洋葱表皮细胞农EHA105。用4′，6-二氨基苯基吲哚(DAPI)观察细胞核。使用高分辨率激光共聚焦显微镜(TCS-SP8MP;德国徕卡)。

质粒构建与遗传转化

的MiTFL1以CaMV 35S为启动子，将基因克隆到pBI121二元表达载体上，构建OE过表达载体Xba我和XmaI限制酶的裂解位点。将过表达质粒转入农应变EHA105。将过表达向量和空向量转化为WT答:芥采用花浸法[48］．转基因种子在含50 mg/l卡那霉素的1/2 MS培养基上筛选，经基因组PCR鉴定。采用特异性引物MiTFL1-1u/d、MiTFL1-2u/d、MiTFL1-3u/d和MiTFL1-4u/d检测其是否转化MiTFL1基因是成功的。采用纯合子T3转基因植株进行后续实验。

表型分析

野生型和空向量转换拟南芥植物作为对照。测定了抽苔时间、开花时间、抽苔至开花时间、莲座叶数等表型指标。的表达水平MiTFL1基因和一些开花相关基因在转基因和对照植物，30日龄转基因和野生型幼苗拟南芥收集植株进行总RNA提取。提取总RNA，按上述方法合成第一链cDNA。采用半定量RT-PCR法测定各基因的表达水平MiTFL1转基因和对照系中的基因。PCR扩增条件为95℃初始变性2 min;95°C持续30秒，56°C持续30秒，72°C持续30秒，循环30次;最后在72°C下延长5分钟。PCR产物在1.8%琼脂糖凝胶上电泳分离。一些内源开花相关基因在转基因和对照中的表达水平拟南芥采用上述反应体系和条件进行qRT-PCR检测。拟南芥AtACTIN2作为qRT-PCR分析的内参基因。本研究所用引物均列于表中S1．

与MiTFL1蛋白相互作用的蛋白质

cDNA文库m .籼l．简历．利用酵母双杂交文库构建试剂盒(Clontech, Dalian, China)构建四稻叶和开花器官。Y2H测定根据酵母转化系统2协议(Clontech)进行。的完整编码序列MiTFL1基因被插入pGBKT7载体之间濒死经历我和EcoRI限制酶的裂解位点。将pGBKT7-bait质粒转化为Y2H金酵母细胞，稀释10^_1和10^_2并涂有SDO/−Trp、SDO/−Trp/X-alpha-Gal和SDO/−Trp/X-alpha-Gal /AbA介质。用该方法验证了其转录活性和毒性。

在QDO/−Trp/−Leu/−His/−Ade培养基上筛选DNA文库，鉴定相互作用蛋白。提取相互作用蛋白的质粒，用于进一步验证实际相互作用。将含有pGBKT7-bait质粒的Y2H Gold酵母细胞与含有候选猎物的Y187酵母细胞混合，在含2 × YPDA的液体培养基中30°C、200 rpm培养20-24 h。然后将混合物涂敷在DDO/−Trp/−Leu/X和QDO/X/A培养基上，培养3-5天。媒体上的蓝色殖民地表明了一种积极的相互作用。AbA浓度为500 μg/ml, X-α-gal浓度为200 ng/ml。阳性对照为Y2H Gold (pGBKT7-53)和Y187 (pGADT7-T)，阴性对照为Y2H Gold (pGBKT7-LAM)和Y187 (pGADT7-T)。

统计分析

采用SPSS 19.0统计软件(SPSS Inc.， Chicago, IL, usa)进行统计分析。

在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章及其补充信息文件中。本研究生成的数据集可在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)，而登记编号如下:AtTFL1 (NP_196004.1)， CsTFL1 (NP_001275848)， DlTFL1 (AHY24028.1)， JrTFL1 (XP_018811176.1)， MdTFL1 (NP_001280887.1)， PpTFL1 (NP_001289244.1)， VvTFL1A (NP_001267929.1)， MdCEN (np_017973069.1)， PvCEN蛋白1 (xp_012669481.1)， TcCEN (XP_017973069.1)， HmTFL1 (MF374628.1)， GmTFL1.3 (FJ573238.1)， FcTFL1-2 (AB746842.1)， CcTFL1 (XP_006430226.1)， ClTFL1 (AWW25018.1)， FcTFL1 (BAX00857.1)， NsTFL1 (XP_009766168.1)， PmTFL1 (AEO72021.1)， PyTFL1 (aeo72093.1)， VvTFL1C (NP_001267933.1)，ZjTFL1 (XP_015898753.1)， AcFT (AJA40932.1)， AtFT (BAA77838.1)， EdFT (AMB72867.1)， MiFT (AGA19021.1)， VvFT (NP_001267907.1)， AtMFT (OAP13671.1)， ClMFT (AWW25016.1)， DlMFT (AUG98253.1)， VvMFT (NP_001267935.1)。

CTAB:

Hexadecyltrimethylammonium溴化

存在:

定量逆转录聚合酶链反应

DAPI:

6-diamidino-2-phenylindole

X-Alpha-Gal:

5-bromo-4-chloro-3-indoxyl -α-D-galactopyranoside

阿坝:

Aureobasidin一

不适用。

国家自然科学基金(31860541和31660561)、广西科技重大专项(GuiKeAA17204026和GuiKe AA17204097)、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室(SKLCUSA-c201901)和广西芒果产业创新团队(nycytxgxcxtd- 07-02)资助。资助者在研究的设计中没有任何作用;数据的收集、分析和解释;并为手稿的撰写提供了资金支持。

作者指出

1. 王懿涵和何新华对这项工作做出了同样的贡献。

从属关系

1. 广西大学农学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004

   王怡涵，何新华，于海霞，莫晓，范燕，范志毅，谢晓杰，刘源，罗聪

贡献

CL和XHH为这项研究设计并获得了资金。YHW进行实验。HXY, XM, YF, ZYF, XJX和YL参与了实验和数据分析。YHW和CL撰写了手稿。所有作者都已阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应到丛罗．

伦理批准并同意参与

本项目的所有资料均由广西大学(中国南宁)提供。本研究中对植物进行的实验研究符合机构、国家和国际准则。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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